Troubles musculosquelettiques

440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées répétées et jusqu'à sept prélèvements sanguins par semaine, pour tester la tolérance et l'efficacité de molécules visant une maladie de la densité osseuse. Le porteur indique que toutes les souris sont mises à mort pour des analyses ex vivo, quarante-quatre animaux surnuméraires pouvant être réutilisés pour une formation aux gestes techniques. Sur le remplacement, il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'existe.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, l’efficacité́ et la tolérance sur un modèle rongeur (souris) de molécules à visée thérapeutique dans le cadre de traitement des problèmes de fragilité et densité osseuse. Dans ce projet, nous allons tester des molécules candidates en développement qui ont montré un potentiel thérapeutique élevé in vitro.

Bénéfices attendus

Les maladies touchant la densité osseuse sont des pathologies lourdes, pouvant être létales. Elles se caractérisent par des fractures répétées et sévères. On observe chez les patients, de nombreuses complications associées dont des complications respiratoires. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif, c’est pourquoi il est nécessaire de développer de telles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêts pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

- Prélèvement de sang sur animal vigile (maximum 1 fois par semaine pour les prélèvements compris entre 20 et 130µL (pour une souris de 25g) jusqu’à 7 fois par semaine maximum pour des micro-prélèvements

Impact sur les animaux

Seuls des animaux WT seront utilisés dans ce projet, sans phénotype dommageable. Cependant, du fait du peu d’information disponible à cette étape du développement sur la tolérance des molécules testées sur des modèles in vivo, des effets indésirables pourraient être observés. Une attention accrue sur les animaux en cours de traitement sera apportée tout au long de l’étude : comportement, sites d’injection, sites de prélèvement, poids corporel, signes cliniques…

Devenir

Tous les animaux utilisés dans l’étude sont mis à mort afin de réaliser des analyses ex vivo. Les animaux surnuméraires pourront être utilisés dans un projet de formation aux gestes techniques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées dans ce projet auront été auparavant testées in vitro afin de n’administrer que les molécules présentant un potentiel thérapeutiques élevé sur les animaux et ainsi réduire leur nombre. Des groupes de maximum 8 animaux sont réalisés, puisqu’il a été observé lors d’études préliminaires (réalisées dans une autre CRO) que ce nombre permettait d’avoir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Dans un but de raffinement des expériences, nous réalisons une évaluation précise de l’état de santé des animaux au cours des procédures expérimentales grâce à des grilles de suivis et l’établissement de points limites précoces. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le suivi des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (week end & jours fériés inclus) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques, la pesée des animaux après la période d’acclimatation et lors des injections.

Choix des espèces

La finalité de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’une thérapie sur un modèle animal récapitulant la pathologie. Ce modèle est en cours de « réalisation » et s’agira de souris transgéniques, c’est pourquoi cette espèce WT est utilisé dans ce projet visant à évaluer dans un premier temps la tolérance de molécules sélectionnées au préalable. Les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines d’âge minimum et jusqu’à 14 à 16 semaines. En effet le pic de densité osseuse chez les souris C57Bl6/J (maturité du squelette) est atteint à l’âge de 4 mois. Nous choisissons d’évaluer l’efficacité des molécules sur la densité osseuse sur des animaux entre 8/10 et 14/16 semaines (durée du traitement) afin d’inclure la période de puberté. Lors d’une étude pilote (réalisée dans une autre CRO), il n’y a pas eu d’effet observé de cette classe de molécule sur des souris jeunes (2 semaines) contrairement à l’utilisation de souris de 8 semaines.

80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.

Réduction

Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.

Raffinement

Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.

Choix des espèces

Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.

15 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont élevées pour porter des maladies osseuses humaines comme le syndrome de Marfan ou l'ostéogénèse imparfaite, qui provoquent selon le porteur fractures spontanées, déformations de la colonne, dilatation de l'aorte et mort prématurée. Les seuls gestes décrits sont une biopsie d'oreille pour le génotypage et un tatouage, la souffrance venant surtout de la pathologie que ces lignées expriment. Le porteur indique que les animaux sont tués faute de pouvoir se reproduire ou être adoptés, et qu'aucune analgésie particulière n'est prévue.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des souris atteintes de pathologies osseuses dans le but d'étudier ces pathologies : Dysplasie congénitale spondylo épiphysaire (SEDc), Syndrome de Marfan, Aggrécanopathies, Ostéogénèse Imparfaite, Dysplasie Diastrophique et Syndrome d'osteolyse carpotarsien multicentrique (MCTO).

Bénéfices attendus

Ce sont des maladies rares sévères pour lesquelles il n’existe pour l’heure actuelle peu ou pas de traitement. Si ces approches fonctionnaient cela permettrait de développer des traitements efficaces pour les patients et apporter un bénéfice éventuel à long terme pour les patients.

Procédures

1 Biopsie d’oreille sur animal vigile pour le génotypage (10s) ; 1 Tatouage sur les coussinets plantaires sur animal vigile (30s)

Impact sur les animaux

Les modèles de souris utilisés sont malades. En effet, les animaux atteints de collagénopathies présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris Marfan, ce modèle présentent des troubles cardiovasculaires, en particulier une dilatation progressive de l’aorte (entraînant une baisse significative de l’espérance de vie), une hyperlaxité des articulations et une déformation de la colonne vertébrale et du thorax. Ces symptômes sont également associés à des troubles de la vision. En ce qui concerne les souris Aggrécanopathies, d’après leur description scientifique, les souris présentent avec le temps des difficultés pour s’alimenter à cause d’un mauvais alignement des vertèbres cervicales. En ce qui concerne les animaux Ostéogénèse imparfaite, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une diminution de la densité osseuse provoquant des fractures spontanées. En ce qui concerne les souris MCTO, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une perte osseuse progressive, concernant généralement les os des pattes, entraînant une déformation et un handicap, ainsi qu'une insuffisance rénale chronique dans de nombreux cas. En ce qui concerne les souris Diastrophique dysplasia, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une ostéoporose des os longs, une déformation de la colonne vertébrale sévère entraînant une posture caractéristique avec tête fléchie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car ils ne seront plus en âge de reproduire et le fait que les lignées soient génétiquement modifiées et mutantes empêche tous replacement/adoption.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements nécessaires à l’expérimentation (qui fera l’objet d’un autre PEA) et leur optimisation se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Cependant, l’utilisation du modèle murin de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Plusieurs de ces modèles étant nouveaux, il est possible que le nombre d’animaux nécessaire pour les expérimentations soit amené à changer et donc en conséquence le nombre d’animaux nécessaire en élevage.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance inattendue, les animaux seront mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Les modèles de souris choisis ici sont tous détaillés dans la littérature scientifique pour mimer la maladie humaine. Les croisements seront effectués à partir de 8 semaines d’âge (âge de maturité sexuel). Les femelles seront gardés jusqu’à 10 mois et les mâles 12 mois.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal, juvénile de 2 à 3 ans, reçoit une injection d'un vecteur de thérapie génique dérivé du VIH et subit des imageries sous anesthésie, des prélèvements sanguins répétés et deux ponctions de moelle osseuse que le porteur présente comme le seul acte douloureux, avant une mise à mort au pentobarbital à six semaines. Le projet compare deux voies d'injection en vue d'un éventuel passage chez des patients atteints d'une maladie osseuse rare. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il est "nécessaire" d'administrer le produit à un "organisme entier" et que le primate non-humain fournit les données les plus transposables à l'humain.

Objectifs

La Dysplasie Spondyloépiphysaire Congénitale (DSEC) est une maladie osseuse génétique rare, présente dès la naissance et associée à des déformations du squelette qui s'aggravent avec l'âge, certaines pouvant mettre la vie en danger et nécessiter des interventions chirurgicales répétées. Il s'agit d’un trouble du collagène de type II, causé par des mutations dans le gène COL2A1, qui empêche les os et les autres tissus conjonctifs de se développer correctement. Le produit thérapeutique à tester dans cette étude est un vecteur de thérapie génique de type lentiviral, conçu pour restaurer la fonction du gène COL2A1 dans les chondrocytes et les plaques de croissance osseuses. Leur accès par des injections directes dans le cartilage n'est pas possible en raison de leur grand nombre dans tout le corps, de la douleur de telles injections et du risque supplémentaire d'inhibition de la croissance osseuse suite à la rupture du cartilage et de l'augmentation des réponses inflammatoires locales. L’injection systémique du vecteur thérapeutique est donc la voie d'administration proposée. Des études réalisées avec ce vecteur thérapeutique dans un modèle de souris spontané de la DSEC, ont montré son efficacité avec une correction à long terme des anomalies histologiques, radiographiques et cliniques. L'innocuité et la biodistribution du vecteur thérapeutique a également été montrée sur des mini-porcs. Une observation intéressante et inattendue, tant chez la souris que chez le mini-porc, est que la voie d'administration systémique du vecteur thérapeutique semble avoir de l'importance : une administration intrapéritonéale (IP) améliore la distribution du vecteur thérapeutique dans les plaques de croissance (les tissus ciblés), alors que, au moins chez le mini-porc, elle réduit d'environ 100 fois sa distribution dans le foie et la rate (des tissus non ciblés), par rapport à une administration intraveineuse (IV) classique. Il n'existe aucune description publiée de l'administration IP de vecteurs lentiviraux dans des modèles animaux de grande taille. Avant un transfert en clinique, il est donc important de documenter, dans le modèle de primate non humain (PNH) proche de l’Homme au niveau phylogénétique et anatomique, si la supériorité du vecteur thérapeutique par voie IP par rapport à la voie IV est confirmée. Outre la biodistribution du vecteur, l’utilisation du modèle PNH nous permettra également d’évaluer la biosécurité et l'immunogénicité du vecteur thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le DSEC est le trouble du collagène de type II le plus courant, entraînant une petite taille disproportionnée et plusieurs autres complications graves, notamment une croissance osseuse irrégulière, une insuffisance respiratoire, des douleurs articulaires, des déformations de la hanche et de la colonne vertébrale et l'apparition précoce de l'arthrose. Aucun traitement n'est actuellement disponible pour la DSEC. Le traitement des complications nécessite des interventions chirurgicales pour réduire le risque de paralysie et la mise en place de soins à long terme pour réduire la douleur et restaurer la fonction. Cette prise en charge précoce et prolongée est très lourde pour les patients, et ne fait que limiter les gage d’une évolution ralentie. Par rapport aux thérapies classiques, la thérapie génique permet de cibler directement le gène défectueux (COL2A1) responsable de la pathologie. Cette étude pilote a pour but de mesurer la biodistribution, la bio sécurité et l'immunogénicité post-aiguës du vecteur de thérapie génique chez les PNH après administration IP ou IV. Les résultats permettront de choisir la voie d'administration IP ou IV pour les études toxicologiques réglementaires ultérieures et le développement clinique de ce produit de thérapie génique pour le traitement des patients atteints de DSEC.

Procédures

Chaque animal de cette étude sera soumis aux interventions suivantes: - Dans les 3 semaines avant injection: . Un examen d’imagerie (CT-scan et radiographie) sous anesthésie (maximum une heure) . Un à 2 prélèvements sanguins et un prélèvement de moelle osseuse, sous anesthésie (maximum 30 à 45min) - La veille de l’injection : . Un traitement immunosuppresseur appliqué par voie IV, sous anesthésie (maximum 30min) - Le jour de l’injection (J0) : . Un traitement immunosuppresseur appliqué par voie IV . Une injection du vecteur thérapeutique, par voie IV ou IP . Un prélèvement sanguin Le tout sous anesthésie (maximum 1h) - Le jour de l’injection (+6h) : . Un prélèvement sanguin, sous anesthésie (maximum 30min) - A J+1, J+3, J+7, J+15, J+30 : . Un prélèvement sanguin, sous anesthésie (maximum 30min) - Entre 5 et 6 semaines post-injection: . Un examen d’imagerie (CT-scan et radiographie) sous anesthésie (maximum une heure) - A 6 semaines post-injection: . Un prélèvement de moelle osseuse . Un prélèvement sanguin Le tout sous anesthésie (maximum 45min), avant euthanasie par injection IV d’une dose léthale de pentobarbital.

Impact sur les animaux

- La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs (imagerie médicale, injection du vecteur thérapeutiques par voie IP ou IV et prélèvements sanguins par ponction veineuse). Ils seront réalisés sur animaux anesthésiés. Le seul acte douloureux par lui-même sera la ponction de moelle osseuse (dans l’os d’une hanche) qui sera réalisé avant injection puis juste avant euthanasie. Cet acte sera également réalisé sous anesthésie, et une injection de morphine sera réalisée avant l’acte afin de garantir une analgésie. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure. - L’injection systémique d’un vecteur lentiviral (dérivé du HIV) peut induire, au moment de son injection, une réaction inflammatoire et allergique transitoire, avec une augmentation légère des enzymes hépatiques, de certaines cytokines circulantes, ainsi qu’une leucopénie transitoire. Une telle réaction a été décrite dans une étude précédemment réalisée dans l’UE. Cette réaction, asymptomatique chez les animaux, est limitée grâce à l’administration d’un traitement immunosuppresseur à base d’un corticostéroïde et d’un antihistaminique. - Enfin, il n’est pas attendu que l’expression de la protéine COL2A1 (exprimée par le vecteur lentiviral thérapeutique) pendant une durée de 6 semaines soit associée à des phénomènes toxiques ou délétères provoquant des symptômes sévères chez l’animal. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.

Devenir

A l'issu des 2 procédures décrites dans ce projet (à 6 semaines post-injection), tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront analysés pour déterminer l'efficacité de la transduction et de l'expression du vecteur dans les différents plaques de croissance osseuses du squelette, ainsi que la biodistribution du vecteur dans les autres tissus de l’organisme, et la potentielle toxicité dans les différents tissus (analyses histopathologiques). Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Compte tenu des objectifs du protocole expérimental portant sur la biodistribution du vecteur de thérapie génique en comparant 2 modes d’administration, il est nécessaire de l’administrer à un organisme entier. Cette étude n’est ainsi pas réalisable sur un modèle in vitro. D’autre part, compte tenu des différences phylogéniques et anatomiques majeures entre les rongeurs et l’Homme, la réalisation d’une étude préclinique relative au mode d’administration ne peut s’envisager chez la rat ou la souris, communément utilisés en laboratoire. Le primate non humain est l’espèce qui apporter les données les plus pertinentes et les plus transposables en termes de biodistribution et de tolérance, permettant d’envisager de futurs essais cliniques chez l’Homme.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux a été réalisée sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique. La constitution de groupes de 3 animaux permettra d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans être excessif. Ce nombre d’animaux permettra une analyse statistique.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L'état de santé des animaux est surveillé tout au long des expériences afin d’éviter l'apparition éventuelle d'une souffrance. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau ad libitum. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant de enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés et l’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris et le porc ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une anatomie comparable à celle de l’homme comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par la proximité phylogénétique et anatomique (bipédie notamment) des macaques fascicularis avec l'Homme, qui les rendent les plus pertinents à l’évaluation de la transduction et de la biodistribution des vecteurs lentiviraux dans l'organisme dans le cadre d’une étude pré-clinique. En effet, les primates (humains et non humains) sont des hôtes naturels du virus HIV, dont est dérivé le vecteur lentiviral utilisé dans cette étude. Finalement, le système immunitaire des macaques fascicularis comparable à celui de l'Homme en fait également l'espèce de choix pour évaluer la tolérance immunitaire au produit de thérapie génique testé. Les animaux seront inclus à un stade juvénile (entre 2 et 3 ans). En effet, le traitement appliqué ciblant les plaques de croissance osseuse et les chondrocytes, l'application du traitement doit se faire avant que la croissance du squelette ne soit complètement achevée. Par conséquent, tester le produit thérapeutique chez des patients adultes serait futile et sans bénéfice direct possible. Par conséquent, la population de patients cible est exclusivement pédiatrique et les études non cliniques se concentrent sur les jeunes animaux pendant la période de croissance du squelette, du néonatal aux individus juvéniles.

199 animaux non-humains, 162 souris et 37 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des matrices implantées sous la peau, les rats une ostéotomie du fémur avec injection d'un gel puis une thoracotomie terminale, pour tester des matériaux à base d'ARNm censés induire la réparation osseuse. Le porteur indique un risque de boiterie après la chirurgie osseuse et décrit la thoracotomie comme une procédure douloureuse réalisée sous fortes doses d'anesthésie en condition péri-mortem. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la réparation osseuse et conclut au recours "nécessaire" à l'animal.

Objectifs

Le processus spontané et naturel de réparation du tissu osseux est pris en défaut lors d’un traumatisme trop étendu, d’une non-consolidation, d’une résection osseuse de grande taille. Dans ces situations, l’autogreffe osseuse est le traitement de référence mais présente des inconvénients de morbidité et de quantité disponible. L’utilisation de biomatériaux est l’alternative usuelle pour la chirurgie orthopédique; néanmoins, ces matériaux inertes sont dépourvus de propriété biologique induisant la formation osseuse (dit ostéo-inductrice) limitant leur efficacité à la réparation de défaut de petite taille. Une approche en médecine régénérative osseuse consiste à rendre ces matériaux implantables biologiquement actifs, en leur associant des molécules induisant la formation osseuse. Les molécules les plus connues pour induire de l’os sont les protéines de la morphogénèse osseuse ou Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). La BMP2 délivrée sous forme de protéine est/a été utilisée en clinique dans certaines pathologies mais se heurte à des effets secondaires importants en raison des fortes doses utilisées ; elle a d’ailleurs été retirée du marché dans de nombreux pays. Il est nécessaire d’évaluer de nouvelles alternatives à l’utilisation de BMP-2 sous forme protéique. Le projet propose d’évaluer le potentiel d’induction de formation osseuse de matériaux chargés non pas de protéines mais d’ARNm codant pour les protéines de BMPs (les ARNm sont des molécules, en principe produites dans les cellules, qui permettent de transformer l’information génétique situé dans l’ADN (dans le noyau) en protéines (cf https://www.afm-telethon.fr/glossaire/arn-messager-2717)); dans ce projet, nous synthétiserons l’ARNm codant pour différentes types de BMP et l’associerons à un gel ; l’utilisation d’ARNm présente de nombreux avantages tels que de délivrer des doses infiniment plus faibles qu'en utilisant des protéines de BMP. Une première étape consistera à évaluer le potentiel de différentes types de BMP (sous forme ARNm) à induire du tissu osseux en site sous cutané chez la souris (potentiel ostéoinducteur) ; cette évaluation se fera sur des animaux mâles et femelles pour évaluer l’impact du sexe de l’animal hôte sur la réponse biologique des BMPs. La seconde étape consistera à valider le potentiel de réparation d’u gel chargé d’ARNm codant pour la BMP la plus efficace dans un grand défaut osseux chez le rat.

Bénéfices attendus

D’un point de vue technologique, notre projet donnera des données quant à l’intérêt de cette technologie à base d’ARNm pour une application d’ingénierie tissulaire. Pour la première fois, nous connaitrons le potentiel ostéoinducteur de différents homo- et hétérodimères de BMP (ces protéines sont composées de 2 sous-unités identiques (homodimère) ou différentes (hétérodimère)) délivrés sous forme d'ARNm en comparaison avec la stratégie actuelle en clinique, mais néanmoins controversée, consistant à utiliser la protéine recombinante rhBMP2. Nous obtiendrons aussi des véritables données sur l'influence du sexe de l’animal receveur (et donc présence ou non d’œstrogènes, hormones qui modulent la signalisation des BMP dans les cellules ostéoprogénitrices) sur la réponse des BMPs. Enfin, d’un point de vue médical, ce projet permettra d’évaluer une nouvelle stratégie pour la réparation de grands défauts osseux.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (4X; durée 15 min) 3- Imagerie en bioluminescence in vivo (8X; durée 40 min) Pour les rats : 1- Osteotectomie diaphysaire fémorale avec injection d’un gel ostéoinducteur (1X, durée 60 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) ; 3- Thoracotomie suivie d'une perfusion intracardiaque d'un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Les implantations sous-cutanées sont généralement bien tolérées chez la souris; il sera en éponge de collagène qui s’écrase. Un effet indésirable est l’élimination des points de suture trop rapidement (le lendemain) ; si la cicatrice est belle, rien ne sera fait ; si la cicatrice est mal fermée (> 2 mm), l’animal sera anesthésié sous isoflurane, et les bords seront recoupés et resuturés. Pour les implantations intra-osseuses, un risque est l’apparition d’une boiterie de l’animal post-chirurgie ; les animaux seront étroitement surveillés durant les 3 jours post-chirurgie. Il peut aussi arriver une faillite de l’ostéosynthèse (vis se dévissant); tous les animaux seront scannés toutes les 2 semaines, permettant de contrôler l’ostéosynthèse ; en cas de faillite, nous surveillerons étroitement la démarche de l’animal ; si une persistance de boiterie apparait, il sera mis à mort. Ce projet comprend aussi une thoracotomie en point terminal (ouverture de la cage thoracique pour accéder au coeur). La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au μCT à une résolution de 9 μm + histologie des explants ou analyses de l'expression génique)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe . Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Les études quantitatives nécessiteront 8 animaux pour obtenir un pouvoir statistique suffisant, compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo. Pour les études en site ectopique 4 implants ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. Pour les études en site ectopique 4 ou 2 implants seront implantés par souris pour diminuer le nombre d’animaux. L’imagerie noninvasive pour petits animaux (suivi de l’expression d’une protéine modèle luciférase par bioluminescence (phénomène d’émission de lumière telle qu’observée chez les vers luisants) et de la formation osseuse par microscanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et permet ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant les 3 premiers jours. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement (2X/j pendant 3 jours, puis 1X/j pendant 3 jours puis finalement 2 X/semaine jusqu'à la fin de l'expérimentation). Pour chaque analyse (micro-scanner ou bio-imageur) les souris seront anesthésiées par inhalation à l’Isoflurane dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris et rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, scorés et reportés sur une feuille de score permettant d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté, boiterie) et en cas d'atteinte des points limites sont listées sur cette feuille de score.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris Swiss. Le modèle souris permet d’évaluer le potentiel ostéoinducteur d’implants chargés d’un facteur de croissance induisant la formation osseuse (en particulier la Bone Morphogenetic Protein 2/ BMP2), aussi bien que le rat ; la souris a l’avantage d’être plus petite et moins chère. La souche SWISS est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin et donc diminuant le biais d’utiliser une population trop homogène ; par ailleurs, son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin. Pour les souris, jeunes adultes de 8 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont le potentiel de réparation osseux est optimal. Pour les rats, jeunes adultes (12 semaines) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne, ils reçoivent des injections répétées derrière l'œil ou dans le muscle de la patte pour déclencher une régénération musculaire et tester la forskoline. Le porteur décrit une perte de masse progressive et un comportement anxieux liés à la maladie, avec des injections d'opioïdes pour contenir la douleur. Il justifie le recours au rat par sa proximité phylogénétique et la fidélité de ce modèle à la maladie humaine, en complément du modèle canin.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire. Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la maladie pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Contrairement à l'ensemble des muscles du corps incluant le diaphragme et le cœur, les muscles extra-oculaires assurant les mouvements des yeux dans toutes les directions sont épargnés. Nous avons en partie identifié la raison sous-jacente à ce mécanisme et proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation du mécanisme protecteur identifié dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Le présent projet vise également à comparer le comportement des cellules souches des muscules extra-oculaires et d'un muscle de la jambe du rat au cours du processus normal de la réparation musculaire. Nous projetons ainsi d'identifier d'autres facteurs de maintien de la capacité régénérative des cellules souches musculaires, ce qui permettra d'ouvrir de nouvelles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

En comparant toutes ces situations à l'échelle moléculaire, nous comptons identifier les mécanismes protecteurs de la mort précoce des cellules souche pour promouvoir leur capacité de réparation du muscle. En comparant ces situations à l'échelle microscopique, nous comptons évaluer l'efficacité de ces processus dans la reconstruction musculaire. Au-delà, nous comptons identifier de nouvelles molécules déjà connues ou à découvrir pour moduler les mécanismes capables d'empêcher ou de retarder la mort précoce des cellules souches musculaires et ainsi, de promouvoir la réparation musculaire des patients atteints de DMD.

Procédures

Les animaux sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie et une fois en arrière de l'oeil ou dans le muscle tibial antérieur pour induire la régénération des muscles que nous souhaitons analyser en détail au cours du temps. Les rats sont préventivement injectés 3 fois par jours pendant 2-3 jours avec une molécule qui supprime la douleur, par voie sous-cutanée, en même temps que l'examen clinique pour éviter de les déranger inutilement. Certains animaux seront en plus injectés tous les deux jours dans le ventre pendant 30 jours avec une molécule que nous pensons protectrice vis-à-vis de la maladie. Cela correspond à une quinzaine d'injections. Chaque injection dure moins de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Physiologiquement, la mort des fibres musculaires induit une amplification de la douleur, via un processus d'origine inflammatoire que nous pouvons éviter. Nous connnaissons bien les conséquences de ce mécanisme temporaire et contrôlable. Nous avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par des injections d'une molécule opioïde à longue action très efficace. Les rats sur lesquels nous travaillons développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de la masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement anxieux des animaux, par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une personne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet incluent des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont limitées et sont facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer les muscles étudiés pour analyse histologique et moléculaire approfondie.

Remplacement

L'efficacité de la forskoline sur le potentiel de régénération des cellules souches musculaires a déjà été confirmée in vitro (article en cours d'évaluation). Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à une question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : la forskoline conserve-t-elle sa capacité de stimulation efficace des cellules souches musculaires pour favoriser le processus de régénération musculaire dans les conditions du muscle dystrophique remodelé ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 5 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux non atteints et DMD traités avec l'excipient, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères non atteints. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux et en cas de mort de l'un d'eux, de ne pas le remplacer. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 5 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils de modification du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, système immunitaire, influence de facteurs d'environnement communs, format). Les muscles des animaux âgés de 5-6 mois sont affectés par la maladie et leurs cellules souches, engagées dans le processus de mort précoce. Il est donc attendu qu'à ce stade, les différences entre animaux non atteints et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité de la forskoline sera pertinente. Nous utiliserons des animaux à l'âge de 5-6 mois. Notre étude de caractérisation ainsi que nos résultats in vitro montrent que la mort prématurée des cellules souches et par voie de conséquence l'anomalie du processus de réparation musculaire, sont significativement augmentées et quantifiables à cet âge. Six mois correspond par ailleurs à la limite au-delà de laquelle le phénotype dommageable des rats DMD évolue vers une perte de masse corporelle. Dans ce projet qui n'est pas une analyse de survie, il est inutile de maintenir en vie des animaux au-delà du stade auquel leurs activités quotidiennes sont compromises par une perte de poids. Le bon état général des animaux à l'âge visé et les mesures pour prévenir ou contrer la douleur pendant et après l'altération des muscles justifient notre suggestion de classer cette procédure en procédure modérée.

640 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe sous la peau une membrane synoviale humaine inflammatoire, puis teste des molécules contre les rhumatismes, une déchirure du tissu cutané pouvant provoquer douleur, prostration et isolement dans les jours suivant la chirurgie. Toutes sont euthanasiées pour prélever les tissus. Il affirme que la culture de membrane synoviale ne suffit pas et que la souris Nude est un "modèle de choix" pour accepter le greffon humain.

Objectifs

Les maladies rhumatismales restent parmi les premières causes d’incapacité au rang mondial. A l’échelle de la France, la Polyarthrite Rhumatoïde est par exemple, le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. L’arthrose quant à elle, est la maladie articulaire la plus répandue et concerne plus de 10 millions de français. Les mécanismes de ces maladies sont encore mal connus et malgré l’existence de traitements qui sont en grande partie symptomatiques, la recherche reste très importante afin d’atténuer ce fléau. C’est dans ce cadre que le projet porte sur l’étude de molécules capables d’inhiber le développement, l’infiltrat de cellules immunitaires et l’inflammation d’un des tissus cibles dans les rhumatismes inflammatoires, qui est la membrane synoviale. En effet, la prise en charge des patients atteints de Polyarthrite Rhumatoïde (PR), Arthrose (OA) ou Synovite VilloNodulaire (SVN) est insuffisante avec de nombreux patients non répondeurs aux thérapeutiques actuelles. Il s’agit ici, de tester l’efficacité de molécules ou d’améliorer les effets de molécules déjà utilisées en clinique, via des modes d’administration différents, chez un modèle de souris immunodéficiente recevant un greffon humain de membrane synoviale inflammatoire, en sous-cutané. En fonction des molécules testées, les voies d’administration recommandées par le fournisseur seront suivies, ou de nouvelles voies seront explorées, afin d’augmenter l’efficacité des traitements tout en diminuant les effets secondaires, pour être proposées dans des essais cliniques humains.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints de Polyarthrite Rhumatoïde, Arthrose ou Synovite VilloNodulaire est insuffisante avec de nombreux patients non répondeurs aux thérapeutiques actuelles. Ce projet permettra de mettre en évidence l’efficacité de nouveaux traitements contre ces maladies rhumatismales mais également d’explorer de nouvelles voies d’administration de composés déjà connus, permettant un effet similaire sur la résolution de l’inflammation synoviale tout en diminuant les effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique chirurgie consistant en une greffe de membrane synoviale humaine sous la peau effectuée dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et traitement anti-douleur pré et post-opératoire. Puis 2 semaines après cette chirurgie, un composé unique sera testé pour un groupe donné de souris. La voie d’administration variera en fonction de la voie de référence fournie par le fournisseur ou pourra être modifiée afin d’évaluer son efficacité par rapport à celle originelle. La fréquence d’administration pourra elle aussi varier et s’effectuera toujours chez des animaux vigiles. Ces traitements seront effectués sur une période de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si de la douleur est ressentie par l’animal celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait être notamment causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant la chirurgie lors de l’introduction du greffon dans la cavité. Cependant, une surveillance quotidienne des animaux pourra permettre de repérer ces comportements et de prolonger le traitement analgésique si nécessaire. De plus, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué, réponse comportementale aux stimuli et évaluation du site chirurgical/injection) seront attentivement pointés.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter des tissus et procéder à des analyses.

Remplacement

Les maladies rhumatismales sont des maladies complexes impliquant différents tissus au sein des articulations concernées à savoir, le tissu osseux, le tissu cartilagineux, la membrane synoviale. Le tissu qui nous intéresse particulièrement ici concerne la membrane synoviale. Bien que celle-ci peut être utilisée en culture afin de tester quelques molécules d’intérêt thérapeutique par diffusion passive, cela ne permet pas de l’intégrer dans un système biologique afin de mesurer son effet selon différentes voies d’administration. Le recours au souris Nude ayant une immunité réduite, est un modèle de choix pour l’acceptation du greffon humain sans souci de rejet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum (8 par groupe) mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives entre les groupes. Les molécules candidates sont préalablement testées in vitro sur des modèles de cellules en culture afin de limiter leur nombre et donc le nombre de groupes de souris.

Raffinement

La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de quelques minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les souris seront ensuite transférées dans une cage également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, au maximum 5 souris seront hébergées par cage afin de leur fournir un espace suffisant pour cohabiter sans encombrement et le milieu sera enrichi de litière mais également de dômes et de papier afin d’y construire un nid. Le suivi de l’évolution de la taille du greffon se fera avec un pied à coulisse et par échographie, de façon précise et reproductible, non invasive pour l’animal. De plus, les administrations orales des composés se feront au maximum par prise spontanée à l’aide de composés appétants afin de limiter le traumatisme éventuel lié au gavage.

Choix des espèces

Les souris NMRI Nude permettent la greffe de tissu humain en évitant les phénomènes de rejet et constituent un modèle reconnu en tant que modèle de xénogreffe (= greffon provenant d’une espèce biologique différente de celle du receveur). De plus, l’utilisation de cette espèce est décrite dans la littérature et a déjà été utilisée et validée au sein de cet établissement utilisateur. Des souris âgées de 8 semaines seront réceptionnées à l’animalerie, considérées comme adultes afin de mimer au mieux les rhumatismes qui se développent chez l’adulte. Après réception, les souris sont utilisées après une semaine d’acclimatation (9 semaines).

50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux interventions chirurgicales créent un défaut osseux dans leur crâne puis y implantent un biomatériau, pour évaluer une méthode de régénération osseuse. Le porteur présente ce test in vivo comme la validation de résultats obtenus in vitro, avant un passage vers un modèle plus proche de l'humain. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la réparation osseuse dans ce contexte.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité sur la régénération osseuse chez le rat d’une méthode originale d’ingénierie tissulaire osseuse utilisant un assemblage tridimensionnel couche par couche de cellules souches mésenchymateuses autologues et d’un biomatériau imprimé en 3D.

Bénéfices attendus

On attend de ce projet qu’il vienne valider les résultats expérimentaux préliminaires obtenus in vitro. On a pu montrer que le matériau utilisé était biocompatible, non cytotoxique et qu’il permettait de guider la néoformation osseuse. Sa dégradation est également compatible avec une utilisation in vivo. Les bénéfices attendus sont donc de valider cette procédure de régénération osseuse dans un modèle de petit animal, avant de pouvoir passer sur un modèle plus proche de la clinique humaine.

Procédures

Selon les recommandations de l’annexe VIII de la directive 2010/63/UE du 22/09/2010, la procédure chirurgicale est considérée comme modérée en termes de souffrance (chirurgie sous anesthésie générale et analgésie appropriée). Les opérations seront réalisées sous anesthésie générale. La réduction de la douleur sera assurée par une analgésie pré-opératoire avec injection sous cutané de 0.05 mg/kg de Buprénorphine et l’injection sous cutané de 1 mg/kg de Meloxicam en post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Le poids des animaux sera relevé en continu. La cicatrisation des plaies sera suivie : en cas de problème, les animaux seront anesthésiés pour effectuer des soins nécessaires : selon la gravité, la plaie sera nettoyée et un traitement antibiotique sera délivré. L’estimation de la souffrance sera réalisée en suivant des critères spécifiques. Au-delà du score limite de 14, l’animal sera euthanasié. Les critères permettant cette évaluation sont l’apparence de l’animal, la prise d’eau et de nourriture, les signes cliniques et les comportements naturels et provoqués (les points limites sont décrits dans la partie 4.2) Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration de Meloxicam pendant 3 jours. La persistance de douleurs malgré ce traitement entraînera la mise à mort de l’animal. Les rongeurs seront maintenus en fratrie (4 à 5 par cage selon la taille des animaux) en respectant la composition du groupe pré-opératoire. Chaque cage sera composée d’un milieu d’enrichissement adapté favorable au bien-être de l’animal. Afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, en prenant en compte le risque de perte d’animaux, nous ferons des groupes de 10 animaux pour chaque condition. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons appariés à l’aide du test de Wilcoxon, le test t de Student, et pour les échantillons non appariés avec le test U de Mann-Whitney. La durée de le pemière procédure (prélèvément de tissu adipeux) est de 10 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil) La durée de la seconde procédure (défaut osseux de calvaria et implantation) est de 15 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux sont principalement en rapport avec la douleur associée aux deux interventions chirurgicales prévues dans le déroulé de l’expérimentation. Comme décrit plus bas, ces douleurs sont de classe modérée et seront prises en charge avec un protocole antalgique déjà validé dans ce modèle chirurgical. Par ailleurs, les activités des animaux ne seront pas modifiées par la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés en fin d'expérimentation car nous devrons prélever les tissus d"intérêt (os de la calvaria et tissus attenants)

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier la réparation osseuse dans ce contexte.

Réduction

Ces expériences sont conçues pour limiter le nombre d’animaux à 10 par temps et pour chacune des conditions expérimentales, en utilisant des tailles de groupes basées sur des travaux antérieurs et permettant des comparaisons statistiques. Du fait des expérimentations prévues, nous envisageons d'utiliser 50 rats.

Raffinement

Une méthode d’analgésie des animaux en pré- et post-opératoire sera réalisée par injection d’analgésique 30 minutes avant l’opération et une injection d’un AINS en post-opératoire. Après l’intervention, les animaux seront replacés en fratrie avec des conditions d’hébergement et un milieu d’enrichissement adaptés, favorables au bien-être de l’animal (litière avec copeaux de peuplier, tuyaux pour jouer).

Choix des espèces

Un test in vivo en site osseux chez le petit animal est indispensable, et constitue la première étape de la démarche scientifique du projet. Le défaut de calvaria chez le rat est un modèle largement utilisé au laboratoire BIOTIS, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. De plus, les cellules souches mésenchymateuses issus de tissu adipeux de rat sont bien décrites dans la littérature. Des modèles autologues ont déjà été utilisés et leur capacité à aider la réparation osseuse également. La souris n’est pas adaptée à la taille des matériaux et à la taille de défaut envisagé. Le lapin n’est pas envisagé pour des raisons de coût et à cause de sa fragilité. Nous avons choisi une souche de rat robuste et adaptée à nos besoins : les rats WISTAR. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.