Troubles musculosquelettiques

Injectées dans le muscle de la patte avec une toxine, la notexine, pour forcer une régénération musculaire, ou avec un virus porteur d'un gène, 268 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par tatouage aux phalanges et génotypées par prélèvement de queue, puis certaines passent cinq séances de mesure de composition corporelle et de test de force entre la quatrième et la douzième semaine. Le porteur indique que ces souris peuvent développer une faiblesse musculaire importante, et affirme que l'injection du virus ne provoque pas d'effets nuisibles notables, en s'appuyant sur ses propres résultats publiés. Toutes sont tuées pour disséquer leurs muscles, analyses présentées comme "indispensables" pour comprendre la myopathie myotubulaire, et le porteur qualifie le modèle murin d'"irremplaçable".

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie génétique néonatale très grave caractérisée par une hypotonie et une atrophie musculaire sévère. C’est une maladie incurable qui conduit au décès des patients par détresse respiratoire dès le plus jeune âge. Le gène responsable de cette maladie code la Myotubularine. C'est une enzyme qui régule une classe de lipides appelée phosphoinositides (PIs). Ce projet a pour objectif de caractériser et d’étudier deux modèles de souris qui reproduisent la dérégulation des lipides contrôlés par la Myotubulaine. Notre but est d’identifier les processus cellulaires ciblés par ces lipides dans le tissu musculaire et comment leur dérégulation impacterait l’apparition et la progression de la maladie. Dans ce contexte, des résultats de l’équipe montrent que l’accumulation les lipides régulés par la Myotubularine régulent le systéme de dégradation des protéines. D’autre part, nos expériences dans des modèles cellulaires dépourvus de la Myotubularine montrent que ces cellules manifestent des défauts de différentiation musculaire. Nous proposons ainsi d’étudier les impactes de la dérégulation des lipides régulés par la myotubularine MTM1 dans le modèle murin (in vivo) spécifiquement dans le muscle squelettique. MODIFICATION L’AJOUT DE LA PROCEDURE 4 NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 44 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de décortiquer dans un contexte intégré et physiologique les effets musculaires de la dérégulation des lipides régules par la Myotubularine et ainsi apportera une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la myopathie myotubulaire liée à l’X. Il permettrait ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette maladie génétique incurable.

Procédures

Injection d'une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelle fibres musculaires: Nombre 72, Durée = 3J ou bien 12J ou bien 24J Post injection (en intramusculaire). Injection d'un viris (l'Adeno-associated virus) pour permettre l’acheminement de gène (non oncogène) dans un tissu afin d'étudier en détail la fonction de ce gène d’intérêt : Nombre 48, Durée 5 semaines post injection (en intramusculaire). Tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste. MODIFICATION : 5 FOIS (SEMAINES 4-6-8-10-12), SUR ANIMAL VIGILE: -MESURE DE COMPOSITION CORPORELLE : CONTENTION DANS L’APPAREIL DE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, 2 MINUTES -TEST DE FORCE:5 X 1 SECONDE, AVEC AU MOINS 1 MINUTE DE REPOS ENTRE 2 ESSAIS

Impact sur les animaux

Les souris concernées dans cette étude peuvent développer une faiblesse musculaire importante. Chez l’homme la pathologie liée à la perte de fonction des gènes étudiées dans ce projet induit une myopathie rare et sévère avec qui entraine le décès chez les nouveau-nés ou à l’enfance. De ce fait on suspecte que les protéines étudiées sont nécessaires au développement du muscle qui démarre pendant la vie fœtale. Afin d’étudier ce process et de s'affranchir de l’analyse des fœtus, on a choisi de reproduire la formation du muscle en injectant une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelles fibres musculaires. Cette injection se fait d’une manière localisée (Tibialis de la souris) mais pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons). La formation de nouvelles fibres musculaire dans le modèle murin se fait assez rapidement au bout d’une vingtaine de jours et le muscle retrouve sa fonction normale. De même, afin d'approfondir le lien entre nos gènes d’intérêt et la régénération musculaire, on propose d’utiliser un outil d’acheminement des gènes pour les exprimer dans un tissu : les Adénovirus associés. C’est une approche fréquemment employée dans le muscle et utilisée dans les thérapies géniques chez l’homme. L’injection de ces virus est localisée (Tibialis) et ne provoque pas d’effets nuisibles notables chez les souris (résultats antérieurs publiés par le porteur du projet). Enfin tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste. MODIFICATION : LA MESURE DE COMPOSITION CORPORELLE INDUIRA UN STRESS DU A LA CONTENTION DANS L’APPAREIL, QUI S’ARRETERA DONC DES LA FIN DE LA MESURE. LA MESURE DE FORCE POURRA INDUIRE UNE FATIGUE MUSCULAIRE LEGERE IMMEDIATEMENT A LA SUITE DU TEST.

Devenir

A l'issue des procédures 1, 2 et 3 (MODIFICATION: "ET PROCEDURE 4"), les animaux sont mis à mort et les muscles sont disséqués et analysés. Ces analyses sont indispensables pour comprendre comment l’altération des phosphoinositides impacte des processus importants de la proteostase musculaire dans le contexte de la myopathie myotubulaire.

Remplacement

En dépit de l’exitance de modèles cellulaires (cellules musculaires de souris dépourvus de l’expression de MTM1 et de Fbxw7) développés par le porteur du projet, ces modèles ne traduisent pas la physiopathologie de la maladie. En effet, cette myopathie apparait dès la naissance chez l’homme et s’aggrave progressivement en touchant spécifiquement le muscle (la fibre musculaire formée qui ne peut pas être reproduite en culture cellulaire). Cette particularité rend l’exploration des cellules musculaires en culture très limitante (restreint aux aspects moléculaires et cellulaire de la perte de l’expression de la protéine MTM1) pour étudier la physiologie de la maladie et envisager des solutions thérapeutiques. De même, il n’existe pas à ce jour des systèmes cellulaires plus intégré (type organoïde) pour étudier le muscle qui est un organe complexe soumis à l’innervation et la contraction. En ce qui concerne la régénération musculaire, c’est un processus complexe qui met en œuvre l’ensemble des cellules résidentes dans le muscle (fibres musculaires, cellules immunitaires, cellules de soutiens du stroma, cellules nerveuse…) et de ce fait impossible à reproduire dans un système in vitro/in cellulo ou ex vivo). Ainsi, le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est 8 animaux pour les lignées sans intervention et 6 animaux pour les mêmes lignées avec intervention. Deux animaux en plus par groupe seront inclus afin d’anticiper des pertes. Ainsi le nombre de souris/groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes statistiques dans les publications scientifiques, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité entre individus et entre groupe experimentaux.

Raffinement

L’effet de la réexpression de MTM1 et de Fbxw7 dans le muscle des deux modèles étudiés par l’outil AAV fera l’objet d’un suivi. Dans les deux cas, afin de restreindre la réexpression de MTM1 et Fbxw7 dans les cellules musculaires et minimiser au maximum des effets indésirables potentiels, les deux gènes seront sous contrôle d’un promoteur musculaire (expression restreinte au muscle squelettique). La procédure de suivi des animaux injectés par la Notexin ou des Adeno associated virus consistera à faire des observations quotidiennes. Tout effet indésirable peu importe son degré fera l'objet d'un suivie. Une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Le poids qui traduit entre autres la masse musculaire (atteinte musculaire suite à la délétion des gènes d’intérêt) sera mesuré dès la naissance et tous les 3 jours. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents, tunnel ou d'igloo). Pour les animaux qui développeront une faiblesse musculaire (myopathie), l'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité en plaçant des croquettes humidifiées et de l'hydrogel dans la cage. Des points d'alertes et des points limites sont fixées par le responsable afin d'entreprendre l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris parce que le modèle animal de la perte fonctionnelle de la Myotubularine reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine et permet ainsi de se rapprocher le plus de la physiopathologie de la maladie. Le modèle Fbxw7 n’est disponible que chez la souris. D’autre part, l’étude de la myogenèse in vivo après la régénération musculaire a été trés bien décrite chez la souris. C’est un processus conservé et de ce fait traduit ce qui se passe chez l’homme. Il n'existe pas de modèles alternatifs et accessibles pour induire et suivre la myogenèse au cours du temps. Les cultures primaires de cellules satellites isolées de souris de 2 semaines présentent l'avantage de reproduire la différenciation musculaire ex vivo et de complémenter les résultats acquis in vivo, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les souris sans intervention seront utilisées entre 2 et 20 semaines selon le besoin (survie du phénotype). Un lot de souriceaux âgés de 2 semaines sera utilisé afin d’établir des cellules primaires et compléter l’étude in vivo après régénération (diminuer le nombre de souris). Cet âge est la meilleure fenêtre de prélèvement pour isoler les cellules souches du muscle (cellules satellites).

Sur 410 souris, 130 ne servent qu'à entraîner les expérimentateurs aux techniques d'injection intramusculaire, intrathécale et intraveineuse. Les 280 autres reçoivent un vecteur viral, 80 d'entre elles deux jours après leur naissance, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à huit semaines pour l'histologie des tissus. Entre sept et huit semaines, chaque souris passe dix tests : agrippement, suspension, tapis roulant, barre crantée, immersion de la queue en bain-marie, sensibilité au froid, plaque froide, réactivité cutanée, enregistrement de l'activité pendant 22 heures et électromyographie sous anesthésie. Le porteur écrit qu'aucun analgésique ne sera administré pendant cette phase parce qu'il fausserait les mesures de sensibilité, et qu'une souris montrant des signes persistants de souffrance sera tuée plutôt que soignée.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester une approche de modulation génique prometteuse pour la maladie rare de Charcot- Marie-Tooth (CMT), une neuropathie périphérique entraînant des troubles moteurs et sensitifs. Cette pathologie provoque une perte progressive de force et de coordination, et aucune thérapie curative n’existe actuellement. Nous utilisons des souris reproduisant fidèlement la maladie humaine pour évaluer si la réduction du gène d’intérêt permet d’améliorer la fonction musculaire et nerveuse. Cette stratégie sera testée soit par croisement génétique, soit par thérapie génique utilisant des vecteurs viraux (AAV). Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie et la validation d’une approche thérapeutique innovante, transposable ultérieurement à l’Homme. Tous les tests sont conçus pour limiter au maximum la douleur et le stress des animaux. Les critères de bien-être sont surveillés quotidiennement et toute souffrance incompatible avec le maintien dans le protocole entraîne l’arrêt immédiat et l’euthanasie de l’animal.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable

Procédures

Une partie des animaux (130) sera utilisée pour un entrainement aux différentes techniques d’injection (intramusculaire, intrathécale, intraveineux). Les autres animaux (280) seront répartis comme suivant : 200 animaux seront injectés durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno- associés ; 80 animaux seront injectés au 2ème et jour après la naissance et 120 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 8 semaines, les animaux seront soumis à une série de 10 tests comportementaux : test d’aggrippement (durée 3x20s) - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x30s max en tout), -test sensibilité au froid (3 mesures par patte, 30s max par patte) -mesure de réactivité sur plaque froide (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité des souris par des capteurs (durée de 22h) ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le phénotype général des souris a été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Dans cette étude, nous utiliserons des souris mâles et femelles issues des croisements pour maximiser les informations obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux. Chaque souris sera suivie longitudinalement, c’est-à-dire qu’elle sera étudiée à plusieurs moments au cours de sa vie, afin de mesurer l’évolution des symptômes musculaires et nerveux. Grâce à cette approche, nous pourrons obtenir des résultats fiables tout en appliquant le principe de réduction : utiliser le moins d’animaux possible pour répondre aux questions scientifiques.

Raffinement

Les nouveau-nés seront avec leurs parents jusqu’au sevrage. Après cette période, les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 5 par cage, dans un environnement ventilé. La température sera maintenue constante et un cycle lumineux de 12 heures jour/nuit sera respecté. Chaque cage sera équipée de nids et les animaux auront un accès illimité à l’eau et la nourriture. Un tube par cage sera également disposé. Les souris CMT présentent des difficultés au temps de suspension, de la nourriture en gel ainsi que des pellets seront donc directement placés dans la cage afin de soulager l’animal dans son accès à la nourriture. À partir du moment où les animaux seront au phénotypage (semaine 7 et 8), ils seront contrôlés du lundi au vendredi lors des tests afin de pouvoir détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance ou de stress comme un pelage ébouriffé ou terne, un dos voûté, de l’apathie, des comportements répétitifs (léchage excessif, tourner en rond), une maigreur visible (pesée lundi semaine 7 et semaine 8), ou encore une agressivité envers les congénères. Si un de ces signes se présente de manière sévère ou persistante, l’animal sera euthanasié et retiré de l’étude afin de lui éviter toute souffrance, cette décision est justifiée par le fait que l’administration d’analgésiques pourrait altérer les paramètres comportementaux ou sensoriels étudiés (baisse de la sensibilité), compromettant ainsi la validité scientifique des données. Cependant, un antalgique sera administré en sous-cutanée au niveau de la nuque avant l'injection d'AAV afin de ne pas induire de douleur. La zone d’injection sera régulièrement inspectée pour détecter tout gonflement ou changement de couleur pouvant indiquer une infection.

Choix des espèces

La souris est utilisée comme modèle pour étudier la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), car son système musculaire et nerveux est suffisamment proche de celui de l’humain pour reproduire les principaux aspects de la pathologie. Les autres espèces présentent des différences trop importantes, et les modèles cellulaires ne permettent pas d’observer les effets à l’échelle de l’organisme, notamment sur la fonction musculaire et la conduction nerveuse. Les animaux sont étudiés à l’âge de 7 à 8 semaines, correspondant à un stade où le phénotype de la maladie est pleinement exprimé. Cela permet d’évaluer de manière pertinente les effets de la pathologie ainsi que l’efficacité de la thérapie.

4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse unique d'un mélange de vecteurs viraux, puis quatre prélèvements sanguins sur animal vigile, douze pesées et sept prises de température rectale, parfois en chaise de contention. La mise à mort sert à prélever le cœur, le foie, le muscle et le cerveau pour y mesurer la diffusion des vecteurs. Le porteur affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" au développement des thérapies géniques et que seul le primate fournit des données transposables à l'humain.

Objectifs

Les virus adéno-associés recombinants (AAV) sont devenus la référence pour le transfert génique, en raison de leur efficacité, de leur sécurité favorable, de la capacité de production à grande échelle et de leur capacité à assurer une réponse durable. Cependant, certains défis, tels que le coût élevé de fabrication, parfois une faible spécificité pour la cible d’intérêt et les barrières immunitaires, continuent de limiter l’accessibilité, l’efficacité et la sécurité des traitements. De plus, la population est régulièrement exposée aux AAV. Elle peut ainsi développer une immunité dirigée contre ces AAV via la production d’anticorps neutralisants capable de détruire les produits construits avec des AAV, les empêchant d’être efficaces. La présence de ces anticorps excluent une grande partie des patients des thérapies géniques actuellement disponibles. L’objectif de cette étude est d’évaluer la biodistribution de plusieurs vecteurs AAV conçus pour éviter la réponse immunitaire chez des animaux séronégatifs ou faiblement séropositifs pour les AAV ciblés. En évaluant la transduction dans différents organes d’intérêt (muscle, le cœur, le foie, le cerveau, etc.), et en combinant ces données avec celles obtenues précédemment (non publiées) sur les capacités de production, l’efficacité de transduction et l’évitement des anticorps in vitro, le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble de ces propriétés. Si les résultats s’avèrent concluants, ces vecteurs pourraient constituer une approche thérapeutique pertinente pour le traitement des maladies génétiques notamment les troubles musculosquelettiques, avec des améliorations significatives en termes d’accessibilité, de sécurité, de spécificité et d’efficacité.

Bénéfices attendus

En cas de succès, le vecteur pourra être utilisé comme « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles et ainsi traiter des maladies génétiques et notamment celles liées aux troubles musculosquelettiques. Le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble des proriétés évaluées (ten particulier la transduction dans les tissus cibles).

Procédures

Tous les animaux du projet auront la même procédure. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant plus d’un mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) d'environ 2 semaines avant le début du projet. Les animaux vigiles recevront une administration unique du pool de vecteurs par voie IV (moins de 1 minutes si bolus ou moins de 30 min si IV lente sur siège). Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de moins de 3 ml, pour un volume total prélevé de 12 ml sur 4 semaines. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Le suivi des poids (12 fois) et de la température corporelle (7 fois) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance.

Impact sur les animaux

La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux pourront être placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les pesées (12 fois) ainsi que les mesures de température rectale (7 fois) peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et de mesurer la transduction des transgènes dans différents organes

Remplacement

Les études de biodistribution chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique ainsi que le taux de transduction. Cette étude aura lieu chez le primate car cette espèce apporte les meilleures données transposables à l’homme notamment concernant la transduction avec les vecteurs AAV et l’évitement de la réponse immunitaire. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro et justifie le recours à des animaux.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 4 primates répartis en 2 lots (1 lot séronégatif et un lot légèrement séropositif). Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Le choix d’inclure deux animaux par groupe nous permettra d’apprécier la variabilité interindividuelle tout en gardant le statut préliminaire de l’étude. L’utilisation de deux animaux par groupe permet également de distinguer un effet lié au traitement d’un événement isolé ou accidentel, limitant ainsi le risque de devoir refaire l’étude et, in fine, à l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation specifique au projet d’environ 40 jours sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, chaise à contention si besoin). Durant les administrations, les animaux pourront être assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

Les singes cynomolgus constituent un modèle animal privilégié pour l'optimisation des protocoles d'administration de gènes par les vecteurs viraux avant les essais cliniques chez l’homme. En effet, la proximité anatomique, physiologique et immunologique des primates avec l’être humain signifie que les profils de biodistribution, de tropisme des tissus, de réponse immunologique aux capsides AAV et d’efficacité de transduction sont plus prédictifs de ce qui pourrait être observé chez l’humain, comparés aux modèles rongeurs. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux. Aussi l’utilisation d’animaux jeunes est justifiée par une probabilité plus élevée de séronégativité ou faible séropositivité vis-à-vis des virus adéno-associés (AAV). En effet, l’exposition naturelle aux AAV et le développement d’anticorps neutralisants augmentent avec l’âge, ce qui rend les animaux plus âgés plus susceptibles d’être séropositifs.

Pour tester des dispositifs censés éviter l'accumulation de liquide après une ablation du sein, 450 rats subissent une mastectomie chirurgicale de 60 à 90 minutes, puis l'implantation du dispositif pendant plusieurs semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, l'analyse histologique des tissus étant présentée comme la méthode de référence. Échographies répétées sous anesthésie courte, pansements, hébergement individuel jusqu'à quatorze jours, hématomes, œdèmes et douleurs post-opératoires figurent parmi les effets attendus. Le nombre d'études dépend, écrit le porteur, des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux, à raison d'environ une étude par an sur cinq ans.

Objectifs

Le sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire (jusqu’à 85 % après mastectomie), résulte de la formation d’un espace vide sous-cutané favorisant l’accumulation de liquide. Cela entraîne inconfort, soins prolongés et risques infectieux pour les patients. Ce projet vise à évaluer la tolérance (sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) de dispositifs médicaux visant à réduire cet espace et parsuite réduire l'accumulation de liquide. Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à garantir, avant la mise sur le marché, que l’utilisation du produit de santé n’altère ni l’état clinique ni la sécurité des patients, conformément aux exigences des autorités réglementaires. Cette démarche s’inscrit dans une volonté de garantir un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité, pour les patients. Les résultats obtenus à l’issue des études seront intégrés aux dossiers de soumission auprès des autorités de santé compétentes, en vue de la mise sur le marché ou du maintien de l’autorisation du produit à court terme. Le nombre d’études et de dispositifs testés dans le cadre de ce projet dépend directement des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux. Toutefois, il est raisonnablement anticipé la réalisation d’environ une étude par an, ce qui correspondrait au développement et à l’évaluation de cinq nouveaux dispositifs sur une période de cinq ans.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale consistant à une mastectomie (retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de sérome post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de séromes post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire). Un dispositif visant à réduire cette formation de liquide est implanté dans l’espace créé et est laissé chez l’animal pendant plusieurs semaines. La durée de la chirurgie est estimée entre 60-90 minutes selon la complexité du modèle. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (inhalée ou injectable) et accompagnées d’une analgésie pré- et post-opératoire adaptée. Des examens d’imagerie non invasifs (échographie) pourront être réalisés pour évaluer la présence et le volume du sérome, avec une anesthésie courte ( 4 semaines), étant donné qu’il s’agit d’un examen court et non invasif, cet examen pourra être renouvelé chaque semaine selon les besoins, à condition que l’animal soit en bon état général.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : - Stress lors des manipulations pour l’anesthésie et pouvant aller jusqu’à 14 jours si présence d’un pansement et mise en place d’un hébergement individuel - Douleur suite à la chirurgie. – Gêne modérée : En cas de mise en place de pansements ou de dispositifs de protection post-opératoires, pouvant limiter temporairement la mobilité ou provoquer une gêne locale - Perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie, de la chirurgie et/ou du dispositif implanté, à court terme - Hématome, œdème ou sérome non résorbé au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur.

Devenir

Afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet, des observations post-mortem sont indispensables. Pour cela, des prélèvements ciblés des tissus sont réalisés afin de procéder à des analyses histologiques, qui constituent la méthode de référence pour détecter des effets locaux tels que l’inflammation, la fibrose ou la nécrose. D'autres examens spécifiques sur les tissus prélevés, comme une observation macroscopique ainsi que la mesure du volume de sérome peuvent aussi etre réalisées. Compte tenu de la nature des interventions et des objectifs du projet, il n’est pas possible de maintenir les animaux en vie après la phase expérimentale. L’euthanasie est donc pratiquée conformément aux normes éthiques et réglementaires en vigueur.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux reste indispensable dans le cadre de l’évaluation préclinique des dispositifs médicaux, car requis par les exigences réglementaires. À ce jour, aucune méthode alternative validée (In-Vitro ou In-silico) ne permet de reproduire de manière fiable les conditions mécaniques et biologiques nécessaires à l’étude de la performance et de la tolérance locale de dispositifs destinés à un usage humain, en particulier dans le contexte de la prévention ou du traitement du sérome. La formation de sérome est un phénomène complexe impliquant des interactions mécaniques, tissulaires et immunitaires, difficilement reproductible in vitro. Les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler la dynamique de l’espace vide sous-cutané, ni les processus de drainage, d’inflammation ou de cicatrisation associés. Donc le mécanisme de formation du sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire, reste difficile à modéliser. Les modèles animaux offrent ainsi une approche essentielle pour étudier ce phénomène dans des conditions réalistes. Parmi les espèces disponibles, le rat représente un modèle pertinent pour ce type d’étude en raison de sa taille adaptée, de sa bonne tolérance aux procédures chirurgicales, et de la disponibilité de données comparables dans la littérature scientifique.

Réduction

La réglementation demande d’avoir à minima 10 produits implantés par condition. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : Mutualisation des groupes contrôle : Un même groupe témoin (utilisant un produit de référence) peut être utilisé pour comparer plusieurs groupes test recevant des produits différents. Études pilotes : Réalisées sur un nombre restreint d’animaux, elles servent à orienter les choix de développement (produit, matériel, technique chirurgicale) avant de passer à des études réglementaires plus étendues. Quand cela est possible ; implantation de plusieurs dispositifs sur le même animal réduisant de moitié le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles afin de respecter leurs besoins comportementaux et de favoriser leur bien-être. Un hébergement individuel est uniquement instauré en cas de nécessité médicale, notamment en présence d’un pansement, et limité à la durée strictement nécessaire à la cicatrisation. Les installations permettent le maintien des contacts visuels, olfactifs et auditifs entre congénères. Des enrichissements adaptés à l’espèce sont fournis de manière systématique. L’environnement est contrôlé afin de limiter le stress (ambiance sonore adaptée, manipulation douce, surveillance régulière). Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie préventive et multimodale, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, afin de prévenir toute douleur, souffrance ou détresse. La profondeur anesthésique et les paramètres respiratoires font l’objet d’une surveillance continue pendant toute la durée de l’intervention. Des mesures spécifiques sont mises en œuvre pour limiter les risques per- et post-opératoires : maintien de la température corporelle à l’aide d’un dispositif chauffant, protection oculaire, réalisation des actes en conditions aseptiques strictes sur une zone préparée, et administration d’un agent de réversion en fin d’intervention afin de favoriser un réveil rapide et sécurisé. Une analgésie post-opératoire adaptée est systématiquement mise en place et ajustée en fonction de l’évaluation clinique quotidienne des animaux. La durée du traitement est modulée selon l’état général et les signes de douleur observés.Les animaux sont observés au minimum quotidiennement par un personnel qualifié et toutes les observations sont tracées. La fréquence de suivi et la surveillance sont approfondies en cas de signes cliniques. Lors des examens d’imagerie, une anesthésie adaptée est administrée afin de garantir l’immobilité et le confort de l’animal. Une analgésie complémentaire peut être mise en œuvre si la situation clinique le justifie.

Choix des espèces

Le choix du rat comme modèle animal repose sur plusieurs critères scientifiques et réglementaires. Il est largement utilisé en recherche préclinique grâce à sa physiologie bien connue et sa facilité de manipulation, avec une littérature abondante facilitant la comparaison des résultats. Sa taille et son anatomie permettent de reproduire des modèles chirurgicaux pertinents, tels que la mastectomie et la création de poches sous-cutanées, utiles pour étudier la formation de séromes. Le rat permet également des évaluations quantitatives fiables, tant macroscopiques qu’histologiques, essentielles pour l’analyse de la biocompatibilité (sécurité et performance). Enfin, son utilisation est acceptée par les autorités réglementaires et il présente une transposabilité partielle aux conditions humaines, notamment en matière de cicatrisation et de réponse inflammatoire. Ces caractéristiques en font un modèle pour ce projet. Il n’y a pas de spécification dans les textes réglementaire, donc des animaux adultes seront privilégié. Si pour un projet spécifique, des animaux plus jeunes seraient nécessaire, le projet sera revu par la SBEA.

Huit passages au scanner sous anesthésie et huit sessions de suivi de la démarche par animal, sur les huit semaines qui suivent l'opération : 36 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Un défaut osseux de 2 mm est percé dans un fémur après ouverture des tissus musculaires et cutanés, pour évaluer la combinaison de deux biopansements déjà testés séparément lors d'un projet précédent. Le porteur indique que la douleur postopératoire peut s'accompagner d'une perte de poids, d'une baisse de mobilité et d'une agressivité accrue envers les congénères pendant la première semaine. Il présente cette étude comme un moyen de réduire ensuite le nombre de rats soumis à un modèle de fracture fémorale complète, qu'il décrit lui-même comme plus invasif et plus douloureux.

Objectifs

Le projet vise à évaluer le potentiel de biopansements actifs (scaffolds) et de différents enrichissements sur l'étude de la cicatrisation osseuse. À la suite d’une lésion osseuse, un processus complexe de régénération se met en place. Dans ce contexte lésionnel, une solution innovante permet d'améliorer la régénration osseuse : les scaffolds. Ces biomatériaux offrent une matrice dont les propriétés physico-chimiques guident et stimulent la croissance cellulaire, favorisant ainsi la reconstruction progressive du tissu osseux. Leur potentiel peut encore être renforcé grâce à l’ajout de molécules bioactives, capables d’accélérer et d’amplifier le processus de cicatrisation. Dans ce volet, le projet souhaite étudier le pouvoir cicatrisant de deux biopansements combinés sur le tissu osseux. Ceux-ci ont déjà été testés et validés par le passé lors d'un précédent projet, de façon indépendante et sans enrichissement. Nous souhaitons aujourd’hui tester leur pouvoir cicatrisant en les combinant sur un modèle plus représentatif des contraintes mécaniques que peut subir le tissu osseux.

Bénéfices attendus

Ce projet ambitionne de valider la combinaison de deux biopansements innovants capables de stimuler fortement la cicatrisation osseuse, y compris dans des contextes lésionnels sévères. Ainsi, deux pansements testés lors d'un précédent projet et qui se sont révélés efficaces sur la régénération du tissu osseux indépendamment, ont été retenus afin d’être combinés sur ce projet pour leur propriétés respectives. Le bénéfice final attendu de ce projet sera la mise au point d'un biopansement combiné capable d'accélérer la réparation de défauts sévères.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1- Procédure chirurgicale osseuse (30 min) sous anesthésie volatile (30 min) avec deux injections sous-cutanées pour l'analgésie et l'antibiothérapie (10 secondes chacune) ; Tonte et aseptie (5 min), ouverture des volets cutanés et musculaires (5 min) avec exposition du fémur (5min). Un défaut osseux sera réalisé dans l'un des deux fémurs (5 min). Les volets musuclaires puis cutanés seront refermés à l'aide de fils chirurgicaux (10 min). Les animaux seront mis dans une chambre de réveil pour faciliter le retour à l'état vigile (30 min). Sur les jours suivants la chirurgie, l'antibiothérapie sera poursuivie sur deux jours (2 injections sous-cutanées) et de nouvelles injections d'analgésique seraient réalisées en cas d'apparition de signes de douleur (10 sec). 2- Suivi de la locomotion par un appareil de suivi de la démarche rongeurs toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal) sans qu'aucune contrainte ne leur soit réalisée. 3- Suivi de la régénération osseuse par imagerie Scanner sous anesthésie volatile (isoflurane) toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal). 4- Mise à mort terminale avec récupération des tissus en fin d'étude (30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des défauts osseux circuclaires de 2mm au niveau des fémurs de rats vont premièrement nécessiter une anesthésie (volatile) et des injections sous-cutanées d'analgésiques. L'anesthésie peut entrainer une hypothermie qui sera à surveiller. Par la suite, ces défauts osseux qui seront induits sont susceptibles d’entraîner des niveaux de douleur modérés. Les nuisances cliniques attendues comprennent notamment une perte de poids et/ou déshydration, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la mobilité, une augmentation du stress (notamment visible par les aspects corporels) ainsi qu’une potentielle agressivité accrue envers les congénères. Des signes d’infection et/ou d’inflammation pourraient également survenir (membre chaud, rouge, glonflé,…) et seront surveillés. Ces manifestations apparaitront principalement au cours de la première semaine suivant la chirurgie et vont tendre à s’atténuer progressivement au fil des semaines.

Devenir

Une mise à mort des animaux est prévue en fin de procédure pour la récupération des fémurs afin de réaliser leur analyse en histologie.

Remplacement

Les biopansements ici testés ont déjà fait l’objet de tests in vitro et in vivo par le biais d'un précédent projet sur le calvarium de rats. Afin de vérifier le potentiel cicatrisant de la combinaison de ces deux pansements sur un modèle plus sévère, et répondre à cette hypothèse scientifique, un nouveau modèle in vitro serait insuffisant. Ainsi, un modèle animal est ici nécessaire afin d’étudier le processus de cicatrisation osseuse dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir au sein d’un organisme vivant (inflammation locale, vascularisation, remodelage, …). Ceci permettra de garantir la validité, la robustesse et la transposabilité des résultats, condition essentielle pour le développement d’outils thérapeutiques réellement applicables en médecine humaine.

Réduction

Cette étude sera dédiée à la caractérisation de la cicatrisation osseuse dans un modèle de fracture légère. Les données obtenues permettront de valider l'intérêt de ce nouveau biopansement combiné, d’optimiser les paramètres expérimentaux et, surtout, de réduire significativement le nombre de rats utilisés sur le modèle de fracture fémorale complète plus invasive et douloureuse qui viendra compléter cette étude. Ainsi, cette approche progressive contribue directement à limiter l’exposition des animaux aux procédures les plus contraignantes, conformément au principe de Réduction des 3R. Un nombre de 36 rats est prévu sur la procédure, incluant 18 mâles et 18 femelles. Ce nombre a été réduit au maximum afin d’apporter à minima 3 données sur chacun des temps de l’étude tout en gardant une significativité des résultats.

Raffinement

Raffinement de la technique chirurgicale : Des cadavres de rats issus de précédents projets ont été utilisés par le personnel de l’animalerie pour des sessions d’entraînement afin d’affiner et de sécuriser les gestes chirurgicaux de cette procédure. Raffinement des soins pré-per-post opératoires : Tous les rats seront induits en chambre d’induction puis maintenus sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur un plateau chauffant. Ils recevront également une injection sous-cutanée d'analgésique afin d’assurer une prise en charge optimale de la douleur et seront également mis sous antibiothérapie .Après la chirurgie osseuse, l’animal sera placé dans une chambre de réveil offrant des conditions optimales afin de faciliter un retour à l’état vigile dans un environnement sécurisé et confortable. Au cours des premières heures et jours post-opératoires, la surveillance des rats sera renforcée afin de permettre une prise en charge rapide et adaptée dès l’apparition des premiers signes de souffrance. En cas de détection de signes de souffrance, une administration d'analgésique sera effectuée afin de soulager efficacement la douleur des rats. De plus, de l’hydrogel sera ajouté dans chacune des cages afin de faciliter l’hydratation des rats et de contribuer à réduire leur inconfort post-opératoire. Par la suite, les animaux subiront une surveillance quotidienne, permettant d’intervenir le plus rapidement en cas d’apparition de signes de douleur / stress.

Choix des espèces

Le rat est largement utilisé dans la recherche preclinique, notamment sur les modèles chirurgicaux orthopédiques. La souche de rat choisie est réputée robuste et facilement manipulable, ce qui nous permettra un suivi clinique facilité. D’autre part, les structures anatomiques osseuses sont suffisamment proches de celles de l'homme et assez grandes pour être opérées et pour réaliser une perforation de 2mm dans l'un des deux fémurs. Une revue en cours de publication sur le critical-size defect ainsi que les entraînements ex vivo ont permis de déterminer que des rats âgés de 15 semaines constituent le modèle le plus adapté afin d’étudier la régénération osseuse. En effet, à ce stade de développement, la croissance osseuse est fortement réduite (stade adulte) ce qui réduit les interactions avec l’étude. De plus, les fémurs à 15 semaines, que ce soit chez les mâles ou les femelles, présentent la taille suffisante pour les modèles chirurgicaux réalisés.

10 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trente-cinq injections sur animal vigile, une biopsie d'oreille, trois tests de mémoire épisodique, trois tests de mémoire spatiale et un test d'épilepsie de deux heures. Certaines molécules administrées provoquent un état cataleptique et épileptique, et les souris mutantes développent une mâchoire proéminente qui allonge les dents, coupées si besoin. Le projet porte sur un gène du nanisme et sur des molécules candidates, sans qu'aucun élément n'explique comment un effectif de 10 660 individus a été arrêté.

Objectifs

Le nanisme, caractérisé par une petite taille disproportionnée et des difficultés d'apprentissage, est dû à une mutation dans un gène appartenant à une famille de récepteur. L'objectif de ce projet est d'étudier le rôle de ce gène au cours du développement squelettique, du vieillissement et son implication sur la cognition afin de mieux comprendre la pathologie humaine et de tester in vivo des molécules "médicament candidat".

Bénéfices attendus

Les principaux bénéfices attendus pour ce projet sont de proposer aux patients une solution thérapeutique pour traiter le nanisme et de déchiffrer la fonction du gène d'intérêt au cours de la croissance, du vieillissement et son implication dans la cognition.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : injection sur animaux vigiles (35 fois max; 30sec), prélèvement de tissu à l'oreille (1 fois; 5sec), test mémoire épisodique (3 fois;5-10 et 15 minutes),test mémoire spatiale (3 fois;5-10 et 15 minutes), test épilepsie (1 fois;2heures).

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère et brève. La biopsie à d'oreille entraine une douleur légére et brève. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent provoquer egalement un stress chez l’animal. Certaines molécules causent un état cataleptique et épileptique. Les souris mutantes peuvent avoir une proéminence anormale de la mâchoire vers l’avant avec pour conséquence des dents longues. Les tests de comportement peuvent induire du stress également.

Devenir

Chaque souris sera mise à mort et de nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques.

Remplacement

L'objectif étant de comprendre la physiopathologie du nanisme et d'identifier des molécules susceptibles de corriger un défaut de croissance, seuls les modèles animaux peuvent apporter des réponses à nos hypothèses de travail. La souris est un modèle largement utilisé et pertinent en raison de ses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain. Pour les tests de comportement, il n'existe pas d'alternative à l'utilisation d'animaux décrite actuellement dans la littérature.

Réduction

Chaque souris fournira des données détaillées sur plusieurs aspects de la physiopathologie. En effet, de nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Les effectifs ont été déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique en tenant compte de la variabilité intra-groupe.

Raffinement

Pour les tests de comportement les souris auront 3 jours minimum entre chaque test pour réduire le stress. Les souris seront sous surveillance quotidienne et des points limites ont été établis. Elles vivront en groupe avec des matériaux pour construire un nid. Elles seront anesthésiées avec des produits adaptés. Afin de limiter l'impact de l'avancement des dents, les souris seront observées tous les trois jours et une coupe des dents sera réalisée si nécessaire. La grille des scores est remplie tous les trois jours pour les souris 16,24 et 32 jours et hebdomadaire pour les souris 3,12,18 et 24 mois.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour étudier le développement squelettique. En effet, les processus d’ossification chez l’homme et la souris sont similaires. Le modèle de souris de nanisme utilisé reproduit assez fidèlement la pathologie osseuse et est un modèle de choix pour tester des molécules à visée thérapeutique. Le phénotype squelettique est évolutif au cours du développement d'où la nécessité d'étudier des moments bien précis du développement. Le phénotype osseux sera étudié au cours de la période post-natale à différents stades de la vie des souris (16-24-32 jours et 3 -12-18 et 24 mois). Etude de la plaque de croissance à 16 jours. Etude de l'ossification secondaire à 24 jours. Etude de l'os trabéculaire et cortical à 32 jours. Etude de la formation et résorption osseuse à 3 et 12 mois.- Etude du vieillissement à 2 différents temps: 18 mois et 24.

154 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une opération de vingt minutes reproduisant la perte osseuse post-ménopausique, puis une injection tous les deux jours pendant huit à seize semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins et deux séances d'imagerie, avec des allers-retours en voiture entre les deux établissements. Ce volet est le second d'un projet déclaré en deux parties, chacune portant sur 154 souris et sur la même famille de molécules mise au point par l'équipe. Le porteur écrit qu'à sa connaissance il n'existe "pas d'alternative non animale efficace", que les modèles d'organes isolés ne fourniraient pas de réponse pertinente et que les données disponibles restent "trop minimalistes" pour une modélisation numérique.

Objectifs

L’ostéoporose est une problématique de santé publique. Cette maladie touche près de 40% des femmes de plus de 65 ans dans le monde. Elle se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures. Il y a donc un important impact pour la société en raison des hospitalisations et médicaments nécessaires à ces patientes. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de l’ostéoporose mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données déjà disponibles sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la qualité osseuse dans un modèle d’ostéoporose induit chez la souris. Ce modèle permet de récapituler les changements majeurs intervenant sur l’os dans le cadre de la ménopause. Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose. Le projet sera réalisé sur deux sites, l’EU1 pour la chirurgie et l’EU2 pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens médicamenteux et non médicamenteux (prise de calcium, une activité physique). Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments qui bloquent la dégradation de l'os, limitant ainsi la perte osseuse, mais cette approche thérapeutique ne permet pas de regagner la densité osseuse perdue car elle bloque également la formation de nouveaux tissus osseux. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés aux différents types de traitements : douleurs, troubles digestifs, risque de nécrose des os de la mâchoire. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets secondaires principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 20 min au sein du premier établissement utilisateur sous anesthésie générale, puis des injections tous les 2 jours pendant 16 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux subiront également un maximum de trois prélèvements sanguins, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire, le second à 4 semaines post-opératoires et le troisième à 8 semaines post-opératoires. Ils seront également soumis au maximum à deux séances d’imagerie de 15 min, sous anesthésie générale, au sein du second établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours, avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser un prélèvement sanguin, puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’étude mimétiques d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place du recrutement des cellules qui résorbent l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse

Réduction

Des méthodes de réduction (analyse à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience (GO/NO GO)) selon les résultats de projections statistiques) seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 8 à 16 semaines. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Des points limites ont été mis en place afin de suivre le bien-être animal tout au long de la procédure. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie gazeuse. Afin de réaliser les analyses par imagerie sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel (8 km, environ 10 minutes) dans des cages de transport spécifiquement préparées, et remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans ce champ d’application et dans d’autres. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure