Troubles musculosquelettiques

Une injection de staphylocoques directement dans la rotule, sous contrôle radiologique, provoque chez 84 porcs une infection osseuse chronique. Âgés de deux à trois mois, ils sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous mis à mort en fin de protocole pour le prélèvement de leurs rotules. Deux angiographies sous anesthésie générale suivent, à une semaine pour administrer des bactériophages et à deux semaines pour vérifier le résultat, l'objet déclaré étant de traiter localement les infections sur prothèse résistantes aux antibiotiques. Le porteur énumère la boiterie, la fièvre, la perte de poids, la fatigue et l'œdème du genou parmi les effets attendus, et conclut qu'il n'y aura pas de nuisance supplémentaire en dehors du stress de la prémédication.

Objectifs

L'ostéomyélite chronique (infection de l'os), peut durer très longtemps, parfois des années, et provoquer des douleurs récurrentes. Son traitement est compliqué, car il repose souvent sur des cures longues d’antibiotiques. Ces traitements peuvent avoir des effets secondaires et, avec le temps, les bactéries deviennent parfois résistantes, en particulier les staphylocoques. Une alternative prometteuse est l'utilisation de bactériophages, des virus ciblant spécifiquement certaines bactéries. Cette méthode suscite un intérêt croissant en France, particulièrement pour traiter les infections osseuses liées aux prothèses (comme les prothèses de genou ou de hanche). Cependant, l'administration intraveineuse actuelle des bactériophages conduit à une concentration insuffisante au sein des os infectés. Une administration locale pourrait pallier ce problème, mais sans garantie d'une diffusion adéquate en profondeur. Dans ce contexte, notre projet vise à intégrer les techniques de radiologie interventionnelle (imagerie vasculaire) utilisées pour boucher des vaisseaux dans différentes régions anatomiques, avec le développement d'un nouveau dispositif médical associant des bactériophages. L'objectif est donc de créer un modèle porcin d'ostéomyélite infectieuse du genou pour mieux comprendre cette pathologie et tester l'efficacité de dispositifs médicaux innovants permettant une administration ciblée et efficace de bactériophages dans la zone infectée.

Bénéfices attendus

Ce projet se positionne à l'avant-garde de la recherche en infectiologie et orthopédie. Il a l'ambition de développer un modèle expérimental chez le cochon pour étudier les infections osseuses. Ce modèle se distingue par son choix judicieux du cochon, un organisme dont la proximité immunologique et physiologique avec l'humain fournit des connaissances précieuses. Un aspect particulièrement innovant de ce projet réside dans le choix de la rotule comme site d'étude, un os facilement accessible et doté d'une vascularisation simplifiée. Cette approche ouvre des perspectives enrichissantes pour l'étude de nouveaux vaisseaux apparaissant au cours de l'infection et pour l'évaluation de nouvelles stratégies de traitement injectés localement. L'objectif est double : approfondir notre compréhension des mécanismes de l'ostéomyélite et élaborer des traitements plus précis et efficaces, surtout face au problème grandissant des bactéries résistantes aux antibiotiques. Ainsi, ce projet ne vise pas seulement à enrichir les connaissances actuelles, mais également à ouvrir des voies prometteuses pour des interventions cliniques améliorées et plus ciblées.

Procédures

Le 1er jour, les animaux seront anesthésiés sur une courte durée pour l'induction d'une infection au niveau du genou, par injection d'une bactérie directement dans la rotule sous rayons X (30 min maximum). Après une semaine environ, réalisation d'une angiographie (examen d'imagerie d'environ 1 heure) afin de valider la présence de l'infection, l'apparition de nouveaux petits vaisseaux sanguins (marqueurs d'une inflammation locale), et traitement avec des bactériophages (virus s'attaquant aux bactéries responsables de l'infection). Après deux semaines, réalisation d'une angiographie pour vérifier la réussite du traitement. L'angiographie est une méthode mini-invasive non chirurgicale, qui permet de cibler un lieu d'injection en passant par les vaisseaux sanguins. Elle se réalise sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

D'un point de vu clinique, le projet visant à provoquer une infection au niveau du genou, l'apparition d'une gêne ou d'une douleur peut être envisagée, associée à un changement de comportement de l'animal qui se préservera de déplacements inutiles (apparition de boiterie par exemple). De même, des signes généraux directement liés à l'infection pourraient être observés : fièvre, perte de poids, fatigue, œdème du genou, rougeurs. Lors des sessions d'imagerie interventionnelle, les animaux seront anesthésiés et préservés de la douleur par l'administration de traitements adéquates. Il n'y aura donc pas de nuisances supplémentaire en dehors du stress qui pourrait être ressenti lors de la prémédication.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour permettre le prélèvement des rotules qui seront ensuite analysées.

Remplacement

Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de vérifier l'efficacité et la précision d'une technique interventionnelle, permettant de cibler précisément une zone à traiter. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques chez l'humain. Les expériences faites en laboratoire sur des cellules, bien qu'utiles pour certaines études préliminaires, ne parviennent pas à reproduire de manière adéquate les interactions dynamiques entre les organismes entiers et les bactéries, ni la complexité des vaisseaux sanguins dans l'os. De même les simulations informatiques, bien qu'avancées, ne peuvent pas encore imiter de façon exhaustive les réponses complexes de l'organisme vivant.

Réduction

Pour ce projet, le nombre d'animaux a été évalué au minimum tout en gardant un nombre suffisant pour que les résultats restent fiables. Après calcul, nous avons estimé qu’il fallait au moins 12 genoux par groupe pour pouvoir réaliser des analyses solides grâce aux tests statistiques utilisés. Cette taille d’échantillon permet repérer une différence réelle entre les groupes si elle existe, ou de valider un groupe pilote testant un nouveau traitement. L'analyse des résultats sera basée sur l'étude et la comparaison des données qualitatives et des données quantitatives (mesures faites avant et après traitement sur le même genou).

Raffinement

Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine minimum et tout au long de la procédure. Afin de limiter leur stress, les animaux seront hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Pour la phase d'injection dans le genou, une anesthésie courte sera réalisée. Une fois infectés, les animaux seront surveillés pour détecter tout changement de comportement. Le suivi quotidien de la température de l’animal sera un critère de vigilance. En cas de fièvre, un prélèvement sanguin sera réalisé pour vérifier certains marqueurs biologiques, et mettre en place des actions adaptées (points limites). Les gestes interventionnels (angiographie) seront toujours réalisés sous anesthésie générale afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal, de même que la mise à mort. Lors des quelques gestes possiblement douloureux pendant la réalisation de l'angiographie, un antidouleur morphinique sera utilisé.

Choix des espèces

Le porc est un modèle souvent utilisé en recherche sur les maladies infectieuses parce qu'il présente un système immunitaire proche de l'être humain, offrant ainsi un aperçu plus réaliste des réactions aux infections. De plus, le porc est un bon modèle d'étude des vaisseaux sanguins. Ces deux critères réunis, associés à notre expertise sur cette espèce notamment en imagerie interventionnelle, il est un modèle de choix pour réaliser cette étude. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques (poids entre 25 et 35 kg) car sa taille permet de réaliser des gestes et d'utiliser du matériel identique à ceux de la médecine humaine.

Une mortalité de 10 % liée à la chirurgie est fixée comme seuil acceptable, au-delà duquel la procédure serait abandonnée. 154 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une opération de vingt minutes destinée à provoquer une perte osseuse comparable à celle de la ménopause, elles reçoivent une injection tous les deux jours pendant seize semaines au maximum, le plus souvent sans anesthésie, et sont transportées en véhicule personnel sur huit kilomètres entre le site de chirurgie et celui d'imagerie. L'objet du projet est de consolider des données déjà disponibles sur une famille de molécules mise au point par l'équipe, en vue d'en proposer la commercialisation contre l'ostéoporose.

Objectifs

L’ostéoporose est une problématique de santé publique. Cette maladie touche près de 40% des femmes de plus de 65 ans dans le monde. Elle se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures. Il y a donc un important impact pour la société en raison des hospitalisations et médicaments nécessaires à ces patientes. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de l’ostéoporose mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données déjà disponibles sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la qualité osseuse dans un modèle d’ostéoporose induit chez la souris. Ce modèle permet de récapituler les changements majeurs intervenant sur l’os dans le cadre de la ménopause. Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose. Le projet sera réalisé sur deux sites, l’EU1 pour la chirurgie et l’EU2 pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens médicamenteux et non médicamenteux (prise de calcium, une activité physique). Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments qui bloquent la dégradation de l'os, limitant ainsi la perte osseuse, mais cette approche thérapeutique ne permet pas de regagner la densité osseuse perdue car elle bloque également la formation de nouveaux tissus osseux. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés aux différents types de traitements : douleurs, troubles digestifs, risque de nécrose des os de la mâchoire. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets secondaires principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 20 min au sein du premier établissement utilisateur sous anesthésie générale, puis des injections tous les 2 jours pendant 16 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux subiront également un maximum de trois prélèvements sanguins, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire, le second à 4 semaines post-opératoires et le troisième à 8 semaines post-opératoires. Ils seront également soumis au maximum à deux séances d’imagerie de 15 min, sous anesthésie générale, au sein du second établissement utilisateur

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours, avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser un prélèvement sanguin, puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’étude mimétiques d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place du recrutement des cellules qui résorbent l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Des méthodes de réduction (analyse à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience (GO/NO GO)) selon les résultats de projections statistiques) seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 8 à 16 semaines. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Des points limites ont été mis en place afin de suivre le bien-être animal tout au long de la procédure. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie gazeuse. Afin de réaliser les analyses par imagerie sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel (8 km, environ 10 minutes) dans des cages de transport spécifiquement préparées, et remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans ce champ d’application et dans d’autres. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure

88 rats atteints d'une dystrophie musculaire génétique vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun recevant une injection sous la peau ou dans l'abdomen, ou un gavage, tous les jours pendant trois mois. À un mois, deux mois et trois mois, chaque animal passe un test d'agrippement de vingt minutes et un électrocardiogramme, avant un prélèvement sanguin sous anesthésie à la fin du traitement, tous étant ensuite tués pour des analyses histologiques et moléculaires. Le porteur signale que les rats dystrophiques réagissent au stress plus fortement que la normale et se figent plusieurs minutes, et qu'une griffe trop longue peut casser pendant le test d'agrippement. Le composé testé a déjà montré son efficacité sur une dystrophie légère chez la souris, et le porteur écrit espérer que son administration chez les patients réduira la fonte musculaire qui les handicape.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. La dystrophie de Duchenne est causée par des changements dans le gène DMD et touche surtout les hommes. Le gène DMD produit normalement une protéine appelée "dystrophine". Chez les patients, la quantité réduite de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence complète de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Jusqu'à présent, aucun traitement n'a été trouvé pour prévenir la maladie chez les personnes porteuses d'anomalies génétiques. L'objectif de notre étude est d'arrêter la progression de la maladie en utilisant de nouvelles substances qui empêchent la perte musculaire et améliorent la connexion entre les muscles et les nerfs qui déclenchent leur contraction. Il est attendu que ces substances contribueront à une amélioration de la contraction synchronisée des muscles et du cœur.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire évalue des thérapies novatrices que nous testons sur des modèles aussi pertinents que possible. Le composé innovant étudié ici, dont l'efficacité a été démontrée sur un modèle de dystrophie légère chez la souris, sera évalué dans nos modèles atteints de dystrophies sévères, similaires à celles identifiées chez les patients. Ces dystrophies ont des effets dévastateurs sur les muscles et le cœur. Le composé innovant cible plusieurs mécanismes originaux qui, combinés, devraient limiter la perte musculaire et améliorer la connexion entre les cellules. Cela favorisera la contraction harmonieuse des muscles utilisés pour marcher, respirer et faire circuler le sang. Dans l'ensemble, nous espérons que l'administration de ce traitement chez les patients permettra de réduire la fonte musculaire qui les handicape.

Procédures

Avant le début de la procédure, chaque animal sera soumis à deux tests légers : un test d'agrippement et un électrocardiogramme (ECG), chacun durant respectivement 20 et 10 minutes. [MODIFICATION] Ensuite, le traitement sera administré chaque jour par injection sous la peau, ou dans la zone de l’abdomen, ou par la bouche [FIN MODIFICATION]. L'administration dure 15 secondes. Un mois, deux mois et trois mois après le début du traitement, les animaux seront à nouveau soumis à un test d'agrippement et à un ECG. À la fin du traitement, soit trois mois après son démarrage, les animaux seront anesthésiés une ou deux fois par une injection sous la peau (20 secondes). Une fois endormis, les animaux se verront prélevés leur sang au moyen d'un geste de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Un effet indésirable du test d’agrippement est la cassure d’une griffe trop longue lors du saisissement de la barre. Les rats DMD peuvent exprimer une réponse aiguë de stress supérieure à la normale. Ils se figent pendant quelques minutes. Également, de possibles réactions de la peau consécutives aux injections multiples sur un même site.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Tout ce qui pouvait être testé sur l'efficacité des composés sans utiliser d'animaux a été réalisé avant le début de ce projet. Nous avons confirmé l'absence de toxicité des substances et de tous leurs métabolites chez les souris et les rats. Sur la base de ces résultats solides, notre objectif dans ce projet est de répondre à la question qui ne peut être abordée que chez l'animal vivant, avec tous ses organes en interaction constante : est-ce que l'action des substances innovantes testées permettra de ralentir efficacement la progression de la maladie musculaire ? Le cas échéant, par quels mécanismes moléculaires à l'intérieur des cellules ?

Réduction

Notre laboratoire a rassemblé une grande quantité de données à partir des modèles de rats utilisés dans ce projet. Nous avons perfectionné la correction des données avant de les analyser statistiquement. En se basant sur le calcul de la puissance statistique, il est recommandé d'utiliser seulement 8 rats par groupe. Ce nombre a été confirmé par d'autres projets similaires déjà terminés, pour lesquels des conclusions biologiques ont été obtenues. Pour nos analyses, nous employons des méthodes statistiques adaptées selon que nous comparons 2 ou 3 groupes d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les rats ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Les rats sont des animaux sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel compétent capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les rats sont constamment évalués en observant chaque individu, même les week-ends et les jours fériés. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une euthanasie compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, le rat est devenu un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles de rats reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Pour ce projet, les animaux utilisés seront âgés de 3 à 9 mois. À cet âge, l’impact de la maladie sur les muscles est détectable par des analyses de sang, de force, cardiaques et respiratoires. En utilisant des animaux de cet âge, il sera possible de conclure sur l’efficacité d’un traitement à un stade précoce de la malade.

Pour tester si une molécule administrée par la bouche peut renforcer l'enzymothérapie de la maladie de Pompe, 64 souris porteuses du déficit enzymatique vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des organes et du sang. Chacune est contenue deux fois par jour pendant cinq jours pour s'habituer à l'administration orale, reçoit la molécule quatre jours de suite à la micropipette, puis deux injections dans la veine de la queue à quarante-huit heures d'intervalle sous anesthésie gazeuse. Le porteur décrit un raffinement inhabituellement détaillé, excipient sucré présenté au bord de la gueule plutôt que gavage, crème anesthésiante avant l'injection, transfert par tunnel. Il fixe l'âge d'utilisation à six mois, avant que la faiblesse musculaire du modèle ne devienne visible vers huit ou neuf mois, ce qui limite à la fois ce que les animaux subissent du fait de leur maladie et ce que l'expérience peut en montrer.

Objectifs

La maladie de Pompe est une maladie génétique héréditaire liée à un déficit en une enzyme spécifique qui entraîne une accumulation de glycogène dans les lysosomes, ce qui provoque des dommages cellulaires dans différents tissus, particulièrement dans le cœur, les muscles, le foie et le système nerveux. Chez le nourrisson atteint d’une forme grave, le muscle cardiaque est souvent touché ; c’est la cause principale de décès. Chez les patients atteints d’une forme tardive, le système respiratoire et la capacité de déplacement sont généralement les plus affectés par la maladie, nécessitant souvent le recours à un fauteuil roulant et à une assistance respiratoire et pouvant raccourcir l’espérance de vie. Un traitement de remplacement (substitution) de l’enzyme ou enzymothérapie de remplacement est disponible pour la maladie de Pompe, mais présente une efficacité limitée et une réaction immunitaire élevée surtout dans la forme infantile de la maladie. Les défenses de l’organisme neutralisent peu à peu cette molécule au fur et à mesure des administrations. En conséquence, cette approche ne parvient pas à corriger totalement l’accumulation de glycogène pathologique dans le tissu nerveux et les muscles squelettiques. Malgré les nouvelles générations d’enzyme de substitution, les problèmes de sélectivité et de réaction immunitaire persistent. Dans ce contexte, une première étude a été réalisée sur des souris pour identifier des molécules appelées chaperons pharmacologiques présentant une sélectivité élevée pour cettte enzyme déficiente.Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude précédente et permettra de mettre en avant un candidat médicament pour améliorer l’enzymothérapie, principal traitement actuel de la maladie de Pompe. En effet, la molécule chaperon d’intérêt a démontré sa capacité à améliorer l’activité mesurée dans les tissus de souris traitées par enzymothérapie avec cette molécule. En particulier, une augmentation significative de l’activité de l’enzyme spécifique mesurée dans le cœur, le quadriceps et le diaphragme encourage fortement à poursuivre les études pour confirmer l’efficacité de ce composé dans ces tissus mais aussi dans d’autres tissus affectés par les symptômes de la maladie de Pompe.

Bénéfices attendus

L’enzymothérapie se fait en injectant dans une veine (perfusion) une solution contenant l’enzyme de substitution. Cependant, la durée de vie de l’enzyme étant courte dans l’organisme, la perfusion, de doses importantes, doit être répétée toutes les deux semaines. Si le traitement est interrompu, la maladie progresse de nouveau. De plus, certains patients développent une réponse immunitaire c’est-à-dire qu’ils fabriquent des anticorps contre l’enzyme injectée comme si c’était un agresseur pour leur organisme. Les patients qui fabriquent beaucoup d’anticorps deviennent moins sensibles au traitement qui perd de son efficacité (environ 40% des patients). Différentes mutations sont présentes dans la maladie, et toutes ne génèrent pas une absence complète d’enzyme mais parfois la synthèse d’enzymes endogènes malconformées et non actives. Ces patients pourraient potentiellement se passer de perfusion de l’enzymothérapie si leur mutation répond à la molécule chaperon d’intérêt seule. Une évaluation in vitro sur 5 types différents de cellules musculaires de patients a été réalisée et 3 ont répondu à la la molécule d’intérêt. Dans ce contexte, notre étude a pour objectif d’améliorer la qualité de vie des patients atteints de la maladie de Pompe. Ce projet vise à confirmer les premiers résultats prometteurs montrant que la molécule chaperon d’intérêt est un candidat médicament d’intérêt pour le traitement de la maladie de Pompe par voie orale, en améliorant l’efficacité de l’enzymothérapie. La co-administration de cette molécule d’intérêt avec une enzymothérapie pourrait permettre une amélioration de son efficacité, une diminution des doses d’enzyme recombinante à administrer et un espacement des perfusions pour les patients atteints de la maladie de Pompe. Les bénéfices attendus sont une diminution du coût global du traitement, une amélioration de la tolérance au traitement et de la qualité de vie des patients, qui doivent être traités pendant toute leur vie.

Procédures

Lors de cette étude, les animaux seront soumis à des contentions (durée maximale par contention de 30 secondes) 2 fois/jour pendant 5 jours pour une période d’habituation à l’administration orale à la micropipette et 1 fois/jour pendant 4 jours pour l’administration de la substance d’intérêt par voie orale via la micropipette. Ces animaux seront également soumis à 2 injections en veine caudale (durée 20 secondes) à 48h d’intervalle. L’injection sera effectuée sous anesthésie gazeuse de manière à limiter le stress de l’animal.

Impact sur les animaux

Ces expériences étant réalisées sur seulement 5 jours, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus sur les animaux. Les premières expériences réalisées ont montré que les souris se portaient bien pendant toute la durée du traitement et ne montraient aucun effet indésirable ni signe de toxicité de ce type de traitement. Les effets indésirables prévus sont un léger stress lié à la contention pour l’administration par la micropipette et une petite douleur transitoire pour l’injection dans la veine de la queue. Ces souris ayant une faiblesse musculaire débutant à partir de 6 mois, elles pourraient présenter des petites difficultés à se mouvoir. Nous ne nous attendons donc pas à observer ces signes car selon la littérature ces problèmes de locomotion sont cliniquement apparents qu’à l’âge de 8-9 mois.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du projet afin d’analyser différents organes, ainsi que le sang. Les mesures de différents paramètres (enzyme, glycogène notamment) permettront d’évaluer la dose de la molécule d'intérêt la plus intéressante et la plus efficace afin de poursuivre le développement de cette nouvelle molécule en association ou non avec l'enzyme dans le traitement de la Maladie de Pompe.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, des études préliminaires ont été menées in vitro sur des modèles cellulaires pertinents. Ces travaux ont permis d’identifier une molécule chaperon que nous allons étudier ici dans ce projet. Ces résultats encourageants constituent une base solide, mais ne permettent pas d’appréhender la complexité des interactions physiopathologiques impliquées dans la maladie de Pompe. En effet, cette pathologie implique des altérations multisystémiques, affectant notamment les muscles squelettiques et cardiaques. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique nécessite donc d’analyser la réponse globale de l’organisme, incluant des interactions inter-organes, des mécanismes de distribution, de pharmacocinétique et de pharmacodynamie, qui ne peuvent pas être reproduits de manière fiable à ce jour par des modèles in vitro ou in silico. À ce stade du développement, le recours à un modèle animal est indispensable pour évaluer l’impact physiologique global de l’ajout de la molécule chaperon à l’enzymothérapie, et pour valider la pertinence de cette approche avant d’envisager une éventuelle transposition clinique.

Réduction

Le nombre de souris a été évalué au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée et du modèle animal mais aussi des résultats d’études précédentes. Le nombre de souris par lot a été évalué pour permettre de (i) détecter des signaux d’efficacité non négligeable dans les groupes traités avec une probabilité satisfaisante; (ii) documenter une relation dose–effet entre une dose faible proche de l’exposition clinique et une dose forte ; (iii) et disposer d’un contrôle contemporain, tout en limitant au strict minimum le nombre de souris, grâce au recours aux données de contrôles historiques pour compléter l’interprétation. Une réduction supplémentaire des effectifs des groupes traités risquerait de rendre l’étude ininterprétable et pourrait conduire à devoir la répéter, ce qui irait à l’encontre du principe de réduction. De plus, l’évaluation du nombre d’individus par cohorte s’est basée sur le fait qu’il n’a pas été décrit de mort prématuré jusqu’à l’âge de 6 mois. Nous ne nous attendons donc pas à une perte d’animaux lors de cette procédure. Nous procéderons également à l’administration de la molécule chaperon par micropipette, geste technique non invasif sans risque de perte contrairement au gavage. Et nous ne nous attendons pas non plus à un risque lors de l’anesthésie car celle-ci sera légère et de courte durée.

Raffinement

Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 mois, soit avant l’apparition des signes cliniques manifestes observés à partir de 8-9 mois. À ce stade, bien que des altérations musculaires débutantes puissent être présentes au niveau histologique, les animaux ne présentent pas encore de signes de souffrance clinique tels que la faiblesse musculaire marquée ou la réduction significative de la mobilité. Ce choix d’âge permet de minimiser l’impact sur le bien-être animal, tout en garantissant une représentativité suffisante du modèle pour les études biologiques envisagées. Afin de limiter l’apparition de possibles conflits, un apport supplémentaire d’enrichissement (hutte, bâtonnet à ronger, tubes) sera mis à disposition dans les cages. -La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. De plus, les souris seront habituées à la contention en étant manipulées lors de la pesée hebdomadaire puis 2 fois/jour la semaine précédant les 5 jours de traitement. - L’administration de la molécule chaperon sera réalisée non pas par gavage oral mais par micropipette avec un excipient sucré présentée au bord de la gueule de l’animal. L’excipient sucré seul sera proposé 10 fois la semaine précédent le traitement à la souris afin d’habituer la souris à accepter le traitement. - Afin de limiter la douleur et de réduire le stress lors des injections en intraveineuse dans la veine caudale : une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d’injection de la queue, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis. Suite à l’injection, une surveillance des animaux sera réalisée pour détecter toute réaction anormale pendant les 30 minutes qui suivent l’injection et seront de nouveau contrôlées dans leur cage d’hébergement en fin de matinée et dans l’après-midi. Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Des moyens de prévention/correction de la douleur seront apportés en fonction de l’état de l’animal.

Choix des espèces

Nos études sont réalisées afin d’améliorer le traitement de la maladie de Pompe. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec le modèle animal existant de cette maladie. Ces souris offrent un modèle génotype-→-phénotype fidèle, mesurable et modulable, parfait pour créer, comparer et optimiser les traitements de la maladie de Pompe avant le passage en toxicologie réglementaire et en l’essai clinique. Les animaux utilisés seront âgés de 6 mois, comme ceux utilisés lors des études préliminaires. L’âge de 6 mois correspond à l’âge à partir duquel des injections sont possibles au vu des très faibles quantités administrées, mais également à l’âge où la faiblesse musculaire est quantifiable par des marqueurs biologiques. A partir de 6 mois, leur état commence à évoluer, avec une faiblesse musculaire plus marquée lors de tests de comportement et une atrophie musculaire (notamment des membres postérieurs) qui elle sera très marquée vers 8-9 mois avec une marche dandinante. L’utilisation des animaux à l’âge de 6 mois permet ainsi de prévenir toute apparition de signes importants de la maladie sans intervention et d’éviter tout signe d’inconfort potentiels chez les animaux avant traitement.

Livrées à l'animalerie à l'âge de 23 mois, 75 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 91 administrations du composé testé, subit 27 pesées, deux prélèvements sanguins en boîte de contention et trois tests d'endurance de trente à quarante-cinq minutes sur tapis roulant. Le RNT ne précise pas comment les souris sont amenées à courir jusqu'au bout de ces tests. Le porteur écrit que l'étude in vivo est une "étape règlementaire incontournable" pour le dossier de son client avant les premiers essais chez l'humain, et espère une mise sur le marché contre la perte musculaire liée à l'âge.

Objectifs

Le composé testé a été initialement développé comme un médicament visant les fibres musculaires dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire liée à l'âge. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du composé X et de tester notamment ses effets sur la masse et la force musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris âgées.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter la faiblesse musculaire liée à l'âge chez l'humain. Bien que de nombreux traitements aient été testés au cours des vingt dernières années, il n’existe toujours pas de médicament capable de guérir la sarcopénie. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la perte musculaire. .

Procédures

Au cours de l'étude, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (27 mesures ; durée de la mesure : 1 minute) ; 2) Administration du candidat médicament (91 administrations ; durée : 1 minute) ; 3) Analyse non invasive de la composition corporelle (3 mesures ; durée de la mesure : 2 minutes) ; 4) Prélèvements sanguins (2 prélèvements ; durée du prélèvement : 5 minutes) ; 5) Analyse des échanges respiratoires sur un tapis roulant (1 mesure ; durée : max. 48 minutes); 6) Test d'endurance sur un tapis roulant (3 mesures ; durée moyenne : 30-45 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de courte durée. Les tests réalisés sur tapis roulant constitueront une nuisance d'isolement sur les animaux qui garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères. L’anesthésie peut également générer un stress de courte durée chez l’animal.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus près euthanasie pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles musculaires. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel et la prise alimentaire) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages collectives et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront réalisés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans l'appareil de mesure permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures et seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs. Avant chaque test sur tapis roulant, les animaux seront également habitués à être sur un tapis roulant à une faible vitesse. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. A la réception, les 75 animaux seront âgés de 23 mois. Le stade de développement de ces animaux correspond ainsi à la population cible du composé développé.

Les 165 souris de ce projet sont dépourvues de système immunitaire, choisies pour qu'elles ne rejettent pas les cellules humaines qu'on leur greffe. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'hydrogel sous la peau, de vingt à trente minutes, puis des injections d'analgésique toutes les douze heures pendant vingt-quatre heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante-cinq d'entre elles passent cinq séances d'imagerie sous anesthésie sur quatre semaines avant d'être tuées par surdose d'anesthésique injectée dans le cœur, et 120 reçoivent une injection intracardiaque de produit de contraste. Le porteur explique qu'aucune ne peut sortir de l'animalerie du fait de son immunodéficience et du greffon humain génétiquement modifié qu'elle porte, l'enjeu étant de limiter la mort des cellules souches transplantées.

Objectifs

L’objectif du projet est de limiter la mort de différents types de cellules souches, les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (Mo-CSM), ou de tissu adipeux (ADSC) et les myoblastes cellules progénitrice musculaire — après implantation dans un contexte mimant les conditions cliniques de greffe suite à une perte tissulaire importante (musculaire, osseuse ou de tissus mou/adipeux). Actuellement, le comblement de pertes tissulaires majeures repose principalement sur l’autogreffe, qui consiste à prélever le greffon directement chez le patient. Toutefois, cette méthode présente plusieurs inconvénients : nécessité d’une seconde intervention chirurgicale, et quantité ainsi que qualité de tissu prélevé limitées. Une alternative prometteuse consiste à implanter des cellules souches dans le tissu lésé, afin de favoriser la réparation soit par différenciation directe en cellules du tissu cible, soit en stimulant la régénération par les cellules résidentes. Malgré des résultats encourageants, la régénération tissulaire à partir de cellules souches reste limitée, principalement en raison d’une importante mortalité cellulaire post-implantation. En effet, l’environnement dans lequel ces cellules sont greffées est généralement peu vascularisé (environnement ischémique), pauvre en oxygène et en glucose, et caractérisé par une accumulation de déchets métaboliques. Au laboratoire, nous avons démontré que le manque de glucose est un facteur clé de la mortalité des Mo-CSM implantées, ce qui corrobore les résultats de la littérature obtenus avec d’autres types cellulaires. La stratégie développée par le laboratoire consiste à charger les Mo-CSM dans un hydrogel leur fournissant un apport local en glucose, afin de favoriser leur survie grâce à une nutrition in situ. Cet hydrogel est composé de fibrine (matrice de soutien) et de glucose (source nutritive). La preuve de concept de cette approche a déjà été établie, aussi bien in vitro qu’in vivo, avec les Mo-CSM. Nous cherchons désormais à élargir cette stratégie à d’autres cellules souches issues du mésenchyme. L’objectif global du projet est donc de déterminer s’il est possible d’améliorer la survie et la fonctionnalité d’autres types de cellules souches mésenchymateuses (Mo-CSM, ADSC, myoblastes) grâce à cet hydrogel enrichi en glucose.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront dans un premier temps de tester la capacité de notre hydrogel d’assurer la survie de nos différents types cellulaire (Mo-CSM/ ADCS / Myoblaste) transplantés dans un environnement physiologiquement pertinent et plus complexe que ce que permettent les études in vitro. Des résultats positifs permettraient de poursuivre les études en implantant cette fois-ci l’hydrogel au sein d’un défaut de taille critique (chez la brebis, par exemple). L’objectif à long terme est ainsi de proposer une alternative aux greffes autologues qui présentent des limites comme le volume prélevable du greffon, sa qualité lorsqu’il s’agit de patients âgés ainsi que la nécessité d’avoir recours à un 2e site chirurgical. De plus, nos résultats sur 3 types cellulaires permettraient d’entrevoir une réponse plus générale dans un cadre plus général d’ingénierie tissulaire ou de thérapie cellulaire, ce projet apportera une réponse au problème majeure que pose la mort massive de cellules transplantées qui sont confrontées à des conditions ischémiques. (transplantation de neurones dopaminergique pour Parkinson, AVC, les infarctus du myocarde, transplantation de CSM pour les défauts osseux de taille critique)

Procédures

Pour tous les animaux (165 souris) : Les animaux subiront une chirurgie pour l'implantation d’hydrogel sous anesthésie et antalgie (1x, durée 20-30 min) et une injection sous cutanée d'analgésique toutes les 12h pendant 24h. Pour les animaux de l’étude de survie cellulaire (45 souris) : La survie sera suivie au moyen d'une imagerie sous anesthésie. La procédure sera répétée à 5 fois pendant la période d’implantation (5x, durée, variable en moyenne 45 min, sur 4 semaines). Au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés puis seront mis a mort par surdose d’anesthésiant injecté dans le coeur (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude de la formation de vaisseaux sanguin (120 souris) : Les animaux seront mis sous antalgie et anesthésie, et subiront une injection intracadiaque d'un agent de contraste (1X, durée 30 min).

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation en sous-cutané peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. La douleur sera néanmoins prise en charge par un traitement analgésique approprié. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire peut être également observée occasionnellement, mais sans impact sur le bien-être animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire). Enfin, la taille des implants en étude 3 peut entraîner une gêne de l’animal mais qui disparait après court temps d’adaptation. Les anesthésies (gaz anesthésiant) nécessaires à l’imagerie non invasive en fluorescence et en bioluminescence vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil. L’anesthésie gazeuse prolongée peut aussi entrainer une dessèchement oculaire pouvant être prévenue par une bonne préparation des animaux. Les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence.

Devenir

A la suite de nos expérimentations tous les animaux seront mis à mort; en effet leur état immunodéficient ainsi que la présence du greffon cellulaire d'origine humaine génétiquement modifiée par la firefly luciferase et de la Green Fluorescent Protein rend impossible toute adoption hors animalerie de plus des analyses complémentaires engendrent ou nécéssitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’environnement ischémique post-implantatoire est un environnement complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible, à ce jour, de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses interactions cellulaires (avec les cellules vasculaires par exemple) et moléculaires (par l’effet paracrine d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions cellules-cellules, ils n’incluent pas toutes les interactions étant pour le moment limité en termes de type cellulaire et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons, les alternatives non-animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des CSMs en vue d’une étude de leur survie post implantation et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux par procédure, l'étude de la survie cellulaire sera réalisée en imagerie sur les mêmes animaux au fil du temps (et non un animal par unité de temps). Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons sélectionner les groupes présentant une survie améliorée afin de vérifier le potentiel angiogène de nos hydrogels chargés en glucose. Pour maintenir un pouvoir statistique suffisant de nos résultats et en se basant sur les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants par groupe.

Raffinement

Avant le début de l'étude, les animaux bénéficieront d'une semaine pour s'habituer à leur environnement. Ils disposeront dans leur cage de tunnels en plastique translucides permettant une manipulation en douceur. L'intervention chirugicale de greffe réalisée sous la peau pourra provoquer un inconfort temporaire, mais celui-ci sera limité grâce à l'administration d'antalgiques avant et après l'opération. Durant les trois jours suivant l'opération, une alimentation plus facile à consommer leur sera proposée pour favoriser leur rétablissement. Compte tenu de la sensibilité du modèle utilisé, les conditions d’hébergement seront adaptées : les litières seront changées dans un environnement stérile et tous les objets entrant en contact avec les animaux seront stérilisés. Après l’intervention, leur comportement, leur apparence générale et d'éventuels signes de douleur seront observés deux fois par jour pendant les trois premiers jours, puis deux fois par semaine par la suite. Si un animal présente des signes persistants de douleur ou d'inconfort malgré les soins (injection d'antalgique et suivie rapproché de l'animal), il sera retiré de l'étude/et ou mis a mort en fonction de la gravité afin d'éviter toute souffrance inutile. Une anesthésie complète et une prise en charge de la douleur seront assurées avant l'intervention. Les animaux, initialement installés ensemble, continueront à vivre dans les mêmes groupes tout au long du protocole.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris SCID (déficit immunitaire combiné sévère (Severe Combined ImmunoDeficiency)). Le modèle souris est connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non invasive, tel que la fluorescence ou la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes (souris SCID) permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30 g et qui permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 32 administrations d'un composé que le résumé ne nomme pas, subit 21 pesées, deux prises de sang en boîte de contention et douze séances de tapis roulant de vingt à quarante-cinq minutes. Le bénéfice annoncé, limiter la perte musculaire qui accompagne de nombreuses maladies, porte sur un candidat médicament encore en développement précoce. Les femelles sont écartées pour ne pas doubler les effectifs, et le porteur présente l'étude chez l'animal comme une "étape règlementaire incontournable" avant les premiers essais chez l'être humain.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’impact d’un composé sur les biomarqueurs musculaires (structure et composition de la fibre musculaire) en fonction du niveau d’activité physique. Pour cela, l’étude compare les effets du composé chez des souris sédentaires et chez des souris soumises à un programme d'entraînement. Cette approche permettra de déterminer si l’activité physique modifie la réponse musculaire au traitement, et d’identifier d’éventuels effets spécifiques liés à la condition physique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude reposent sur le développement d’un composé innovant destiné à limiter la perte musculaire, un symptôme fréquent et invalidant de nombreuses pathologies chez l’humain. En parallèle, le protocole vise à démontrer que l’association de ce traitement avec un programme d’exercice physique potentialise ses effets, permettant ainsi de réduire plus efficacement la perte musculaire. Cette approche combinée au composé pourrait offrir une stratégie thérapeutique plus complète et plus efficace pour les patients concernés.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (21 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de traitements (32 administrations ; durée : 1 minute); 3) Entraînement physique sur tapis roulant (12 sessions au cours de l'étude ; durée de la mesure : entre 20 et 45 minutes), 4) Prélèvements sanguins (2 prélèvements, durée du prélèvement : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, ainsi que le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de courte durée. L'entraînement sur tapis roulant constituera une nuisance de fatigue et d'isolement sur les animaux qui garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyses histologiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et l'exercice physique. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au sexe mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel et la la masse musculaire) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux sexes. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux sexes.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3 souris/cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Les animaux seront préalablement habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins et seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs. Avant la session d'exercice physique sur tapis roulant, les animaux seront également habitués à trois reprises à être sur un tapis roulant à une faible vitesse. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée .

Choix des espèces

La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. A la réception, les 60 animaux seront âgés de 8 semaines (14.5 semaines à l'issue de l'étude). Le stade de développement de ces animaux correspond ainsi à la population cible du composé développé.

Quatre-vingt-douze des souris utilisées sont dystrophiques, dépourvues de dystrophine, donc atteintes de dégénérescence musculaire, d'inflammation et de fibrose. Avec 32 souris témoins, 124 animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent jusqu'à six électrocardiogrammes sur animal vigile et six échocardiographies sous anesthésie, une partie courant en outre sur tapis roulant et passant des mesures de contractilité musculaire, le porteur indiquant qu'elles peuvent ressentir des douleurs musculaires et se déplacer difficilement en fin de vie. Toutes sont tuées pour prélever plusieurs muscles et le cœur.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, la molécule testée dans ce projet représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce la structure musculaire, la fonctionnalité des mitochondries et réduit l'inflammation. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité de ce traitement dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus à court terme, chez les souris dystrophiques, sont une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris seront traitées avec le candidat médicament. A long terme, cette molécule pourrait être envisagée comme traitement utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une évaluation de la fonction cardiaque par électrocardiogramme sur animal vigile (3 à 5 minutes, 6 fois maximum) et à une échocardiographie sur animal anesthésié (5 à 10 minutes, 6 fois maximum). Une partie des animaux sera soumis à un régime alimentaire particulier en prise spontanée dans l'alimentation (12 semaines). Une partie des animaux sera soumis à des tests d’endurance sur tapis roulant (20 minutes, 2 fois maximum), à des mesures de contractilité musculaire sur animal anesthésié et sous analgésie (20 minutes, 1 fois) et à un prélèvement de sang sur animal anesthésié et sous analgésie (20 secondes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Les souris dystrophiques présentent une atteinte des muscles squelettiques, du diaphragme et du cœur. Elles ont une importante faiblesse musculaire, de l’inflammation, de la fibrose et de l’infiltration de tissu adipeux. Ces animaux peuvent donc ressentir des douleurs musculaires et présenter des difficultés à se déplacer en fin de vie. Les animaux pourront subir un stress de courte durée, lors du transfert d’une cage à une autre et pendant les premiers jours après leur arrivée. Au cours des différentes procédures, les animaux peuvent subir un stress de courte durée au moment des manipulations et lors de l’administration de l’anesthésie gazeuse. Au cours des procédures sous anesthésie, les souris pourraient risquer l’hypothermie. Pour les mesures de performance sur tapis roulant, les animaux peuvent ressentir de la fatigue. Le traitement dans la nourriture pourrait provoquer une diminution de la consommation alimentaire et des dérèglements intestinaux tels que des diarrhées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.

Remplacement

Le but de ce projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la DMD est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent recréer la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu et ne peuvent rendre compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Le modèle utilisé dans ce projet est un modèle de choix pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 8 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable. Nous prévoyons de répéter une deuxième fois les expériences pour confirmation des résultats. De plus, plusieurs muscles ainsi que le coeur seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 92 souris dystrophiques et 32 souris contrôles soit un total de 124 animaux. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Les animaliers procèdent à un contrôle quotidien des cages et à un changement régulier sous hotte aspirante. Les animaux sont 5 par cage maximum et l'hébergement individuel est évité. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent en hébergement individuel (causes: seul mâle d’une portée, agression entre congénères, dernier animal dans la cage..). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage ou en bouillie dans des coupelles. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Une semaine d’acclimatation sera mise en place lors de l'arrivée dans l'animalerie. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris sera maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante à 37 degrés. Lors des mesures de performance et d'évaluation de la fonction cardiaque, une habituation sera réalisée et les mesures se feront dans un environnement calme et par un manipulateur expérimenté. Dès que les animaux émettront des signes de fatigue, les tests seront interrompus et de l'eau sera proposée aux animaux après l'effort. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet a l’avantage de présenter un phénotype semblable aux patients. Les animaux utilisés seront âgés de 5 à 8 semaines en début de procédure et de 17 à 24 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie. Le démarrage du traitement peu de temps après le sevrage des animaux permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.