Troubles musculosquelettiques

Soumises pendant six mois à des entraînements de course sur tapis de 45 minutes trois fois par semaine, plus force et équilibre, 108 souris de 50 semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever sang, muscle, foie et tissu adipeux. Elles passent sept séries de tests de performance qui les fatiguent, sept mesures de composition corporelle avec contention et jeûne allant jusqu'à quatorze heures, et un transport de 15,3 kilomètres entre deux établissements. Le protocole vise à démontrer que des protéines de ténébrion valent des protéines laitières pour accompagner la reprise du sport chez les personnes vieillissantes. Le porteur écrit d'emblée penser démontrer l'effet attendu, et destine les résultats au développement de nouveaux produits alimentaires.

Objectifs

Ce projet se fera sur 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Notre objectif est de tester l’impact d’une approche combinant une complémentation nutritionnelle en protéines d’insectes (Ténébrion) et en vitamine D avec un programme d’activité physique adaptée dans le but de limiter la perte de fonction musculaire au cours du vieillissement chez la souris en surpoids. Les critères principaux d'investigation sont les performances physiques, la composition corporelle, la synthèse protéique musculaire, l'inflammation et le métabolisme de la vitamine D. A l'issue du projet, plusieurs dosages biochimiques (protéines circulantes relarguées) seront effectués au niveau circulant et au niveau du muscle squelettique, du foie et du tissu adipeux. L’objectif final de ce projet est de démontrer que la qualité nutritionnelle des protéines d’insectes est compatible avec la pratique sportive dans un contexte de veillissement.

Bénéfices attendus

Nous pensons démontrer par ce protocole qu’une complémentation combinée de protéines et de vitamine D a un effet anabolique musculaire plus fort qu’une complémentation protéique simple ou qu’une situation sans complémentation. Nous nous attendons à ce que la vitamine D puisse potentialiser l’effet anabolique des protéines, et puisse favoriser la restauration de l’homéostasie glucidique et lipidique, limiter l’inflammation du tissu adipeux et l'infiltration lipidique dans les tissus. Nous attendons également que la complémentation en protéines de ténébrion ait des effets anaboliques comparables aux protéines laitières (protéines de référence) afin de démontrer que cette source de protéines présente une bonne digestibilité et est aussi efficace qu’une protéine laitière au cours de la récupération sportive. En perspective à long terme, ce projet apportera des données scientifiques pour le développement de nouveaux produits alimentaires destinés aux personnes (âgées) souhaitant un accompagnement nutritionnel lors de la reprise d'activité physique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des entrainements d’endurance (45 min 3x/sem), de force (15 min 1x/sem) et d’équilibre (15 min, 1x/sem) ainsi que des tests de performances physiques (vitesse maximale de course, force d’agrippement, équilibre) chaque mois (15 min par tests) pendant 6 mois à l’EU1 pour suivre leurs capacités locomotrices. Les animaux seront soumis de manière non invasive à une estimation de leur masse maigre et grasse par résonnance magnétique 1x/mois et à une estimation de leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (2x) pendant 6 mois à l’UE2 pour suivre l’évolution de leur composition corporelle et leur dépense énergétique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront souris à un protocole d’activité physique modérée de 16 semaines (course sur tapis, entrainement en résistance et équilibre) qui entrainera la prise en main quotidienne des animaux. Le personnel impliqué dans les mesures est formé à la contention low stress. Les animaux seront soumis à des tests de performances physiques (vitesse de course, force, équilibre) répétés 7x sur la durée du protocole (24 semaines) qui entraineront de la fatigue suivie d’une période de récupération. Des mesures de composition corporelle (7x) nécessiteront une contention des animaux d’une durée inférieure à 2 min et une mise à jeun des animaux d’une durée inférieure à 14h. Pour la mesure de la synthèse protéique musculaire (mesure unique en fin de protocole), les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée. La piqure d’aiguille pour l’injection est réalisée sur animal vigile en contention et entrainera une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de prélever les tissus nécessaires aux analyses biochimiques (sang, muscle, tissu adipeux, foie).

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément l’évolution de la fonctionnalité musculaire (masse et force), de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant. Il est difficile de suppléer l’activité physique par des systèmes in vitro même si des systèmes de stimulation électriques de cellules musculaires existent, ils ne remplacent pas les adaptations cardio-respiratoires à l’exercice. Ce projet requiert une analyse multi-tissus du métabolisme de la vitamine D afin de comprendre pourquoi la déficience en vitamine D est si importante chez l'homme. Pour effectuer une télle étude chez l'homme, il faudrait pratiquer des biopsies tissulaires du foie, du tissu adipeux et du muscle squelettqiue. Ces techniques restent trop invasives à mettre en place chez un même volontaire sain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires est calculé pour une différence attendue de 25% pour la synthèse protéique musculaire entre les souris nourris avec les régimes non supplémentés en protéines et les souris nourris avec les régimes supplémentés en protéines (protéines de lactosérum ou protéines d’insectes). Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à l'âge, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 108.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6 dans des cages de dimension conforme à la réglementation comportant à mimina une maison en carton à double entrée, des batonnets en bois, et des ficelles de carton pou la nidification . Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes 1 et 2. Pour le transport des animaux à l'EU2, les animaux seront placés dans des cages de transport agrées opaques avec nourriture + eau gélifiée + enrichissement. Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 15.3 km).

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris car cette espèce a montré une très bonne compliance à la course sur tapis dans nos études antérueures. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Notre protocole vise à freiner une diminution de la fonction musculaire avec l’âge (sarcopénie). Nous utiliserons donc des souris de 50 semaines à l’entrée dans le protocole. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 74 semaines ce qui est suffisant pour obersver une baisse de la force musculaire et des performances physiques dans les groupes non supplémentés et non entrainés.

Une injection dans l'abdomen déclenche chez les souris une spondylarthrite qui gagne les poignets et les chevilles, avec des douleurs, une perte de poids et un rythme jour-nuit désorganisé. 218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit les gestes en secondes, l'injection dure moins de dix secondes, les contentions hebdomadaires quelques minutes, quand la maladie installée, elle, dure des semaines. Il écrit lui-même que les symptômes avancés ne permettent pas une vie dans de bonnes conditions, ce qui justifie selon lui la mise à mort de tous les animaux, par ailleurs commandée par les examens post mortem.

Objectifs

Les spondylarthrites sont un groupe de maladies inflammatoires qui comprennent l’arthrite réactionnelle, rhumatisme déclenché à la suite d’infection bactérienne (Chlamydia …), la spondylarthrite ankylosante (rhumatisme caractérisé par une ankylose progressive du rachis), le rhumatisme psoriasique et d’autres. Les spondylarthrites touchent 0,5 à 2 % de la population mondiale et se manifestent par des inflammations rachidiennes, articulaires, et extraarticulaires : psoriasis, uvéite et maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Une inflammation intestinale infraclinique a été décrite chez près de 60% des patients avec une spondylarthrite ankylosante. Nos objectifs scientifiques à long terme sont de mieux caractériser les mécanismes de l'immunité mis en oeuvre lors de la progression de la maladie, de proposer et de valider de nouveaux moyens de traitement. A plus court terme, nous étudions l'effet du microbiote et de l’immunité intestinale sur la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

Le mécanisme des spondylarthrites humaines implique une interaction entre des prédispositions génétiques et des facteurs déclencheurs durant la vie comme des infections. Les bactéries de l'intestin produisent des substances qui modifient les cellules de l'immunité impliquées dans la spondylarthrites. Afin d’explorer les relations de cause à effet entre les bactéries du tube digestif, les prédispositions génétiques et la progression des spondylarthrites, nous utiliserons des aliment avec prébiotique. Nous explorerons l'immunité de nos souris. Cela permettra à long terme la recherche de nouveaux moyens de prévenir ou traiter les spondylarthrites.

Procédures

L’induction de la maladie se fait par une injection dans l’abdomen qui prend moins de 10 secondes lors d'une contention de moins d'une minute. Il pourra y avoir jusqu’à deux prises de sang la première semaine et une les semaines suivantes, avec la même durée que pour l'injection précédemment décrite. La pesée, le prélèvement de crottes, la mesure du diamètre des articulations demandent des contentions une fois par semaine de quelques minutes.

Impact sur les animaux

La progression des lésions d’arthrite, principalement au niveau des poignets et des chevilles entraine des douleurs et des contraintes de niveau modéré, accompagnés d’une perte de poids et d’une perturbation du rythme d’activité entre le jour et la nuit. L’induction de la maladie se fait par une injection sous cutanée ou dans l’abdomen. Il pourra y avoir jusqu’à deux prises de sang la première semaine et une les semaines suivantes, avec des douleurs et contraintes qui durent quelques minutes. La pesée, le prélèvement de crottes, la mesure du diamètre des articulations demandent des contentions une fois par semaines de quelques minutes. Les études sur le microbiote peuvent provoquer des désagréments digestifs.

Devenir

La très grande majorité de nos expériences comprennent des examens post mortem afin d'obtenir le maximum d'information des expériences. De plus les symptômes de la spondylarthrite avancée ne permettent pas une vie dans de bonnes conditions. Donc la mise à mort concerne tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Comme remplacement partiel, les effets de la prédisposition génétique sont étudiés ex vivo sur des prélèvements post-mortem de souris issues de notre élevage et auxquelles nous n’avons induit la maladie. Une partie des effets des produits des bactéries est étudié in vitro, avec un fermenteur de bactéries et des cellules de l'immunité en culture. Enfin, la mise au point des tests enzymatiques et bactériens pour l’analyse des échantillons se fait in vitro. Sinon, les spondylarthrites sont des maladies complexes qui font intervenir des facteurs génétiques, un déclencheur, et un emballement immunitaire qui s’attaque aux organes ciblés dont les articulations. Ce processus ne peut pas pour l’instant être modélisé en dehors d’un animal.

Réduction

Dans nos expériences avec un suivi clinique, grâce à des calculs basés sur nos données statistiques passées, nous incluons le nombre minimal d’animaux qui permette de détecter avec des chances raisonnables l’effet d’un traitement par nos tests. Le geste technique de mesure des diamètres des articulations est toujours réalisé par la même personne afin de réduire la variabilité de cette mesure. Pour nos expériences courtes qui explorent des mécanismes avec des effets de type tout-ou-rien, le nombre de répétition est réduit entre 4 et 6, en accord avec le type de test statistique utilisé pour valider.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires contrôlées qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. Seuls les prélèvements, injections et tests en rapport avec la question scientifique seront faits durant une expérience, et ils seront couplés de façon à ne manipuler les souris qu'un nombre minimal de fois par semaine. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale volatile ou après administration d’un antalgique. La manipulation de nos animaux avant l’induction de la maladie nous permet de les habituer à la pièce d'animalerie, à notre passage et aux manipulations. Cela permet d’avoir des données de références, de diminuer le stress de nos animaux lors des contentions et aux animaux de s’adapter à leurs nouveaux locaux. Les souris sont ramenées dans leur litière et groupe d'origine après chaque intervention. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation contraignante et afin de réduire cette durée de contention. Des points limites sont mis en place et des mesures de raffinements sont mises en place selon des critères intermédiaires de cette grille. Notamment, selon ces critères, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles.

Choix des espèces

Notre modèle de souris est celui est qui reproduit le mieux les symptômes de l’arthrite réactionnelle et de la spondylarthrite ankylosante de l’homme. L’âge des souris enrôlées dans cette étude est compris entre 5 et 15 semaines au moment de l’induction. Cet âge permet d’avoir une maturité immunitaire.

210 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour que leur articulation du genou soit analysée au micro-scanner. Un chirurgien rompt le ligament croisé antérieur de chaque animal pour provoquer une arthrose, sous une anesthésie de 45 minutes à une heure quinze, puis jusqu'à six injections sont pratiquées dans le genou lésé, avec des prises de sang hebdomadaires sur animal vigile. Le porteur prévoit une mobilité altérée, des douleurs articulaires, une inflammation du genou et une possible ouverture de la plaie opératoire. Ces arthroses provoquées servent à tester jusqu'à cinq produits candidats en vue d'une mise sur le marché, le porteur affirmant qu'aucune méthode alternative ne modélise de façon fiable le comportement d'un produit injecté dans un "organisme entier vivant".

Objectifs

D’après l’organisation mondiale de la santé, l’arthrose est une des dix maladies les plus invalidantes dans les pays développés. A l’échelle mondiale, 9.6% des hommes et 18% des femmes âgés de 60 ans en souffrent. Dans les prochaines décennies, le vieillissement de la population couplé à des facteurs de risques tels que l’obésité laisse suggérer que le nombre de personnes atteintes d’arthrose va continuer d’augmenter. Grâce à de nombreuses études, les connaissances sur l’arthrose se sont améliorées. Désormais, cette pathologie n’est plus considérée comme une maladie associée seulement à des lésions du cartilage mais comme une maladie provoquant des anomalies pathologiques au niveau de nombreuses structures telles que les muscles périarticulaires, les ligaments, la synovie, le système neurosensoriel et l’os. Ces nouvelles données permettent la création de nouvelles molécules cibles permettant de prévenir le développement de l'arthrose. Ce projet consiste à évaluer l'efficacité de produits à visée anti-arthrosique, destinés aux traitements préventifs ou curatifs, sur un modèle d’arthrose du genou induit chirurgicalement (rupture du ligament croisé antérieur) chez le lapin. Les produits à tester pourront être administrés par voie intra-articulaire dans le genou lésé. Au maximum 5 études seront réalisées afin de tester plusieurs produits et/ou posologies.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux produits anti-arthrosiques offrant des traitements plus efficaces et mieux tolérés contre l’arthrose.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale permettant la mise en place du modèle d’arthrose. La procédure chirurgicale durera entre 45 minutes et 1h15 (durée de l’anesthésie). À la suite de cette procédure, des administrations d’analgésique, anti-inflammatoire et antibiotique seront administrés à raison de 1 à 2 fois par jour pendant 3 jours. Ces injections sont très rapides réalisés en 2 minutes. Les animaux seront soumis à 1 à 6 injections des produits tests. Ces injections seront réalisées en environ 15 minutes (anesthésie comprise). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile, en environ 2 minutes à une fréquence maximale d’une fois par semaine.

Impact sur les animaux

En raison du caractère invasif de la procédure chirurgicale, des complications post-opératoires pourraient survenir telle qu’une baisse de la consommation alimentaire et hydrique pouvant entrainer une perte de poids ou une ouverture de la plaie opératoire. Ce modèle d’arthrose peut également altérer la mobilité de l’animal, générer des douleurs articulaires et une inflammation locale du genou. D’autres effets indésirables sont liés aux anesthésies, aux prélèvements sanguins (hémorragie, hématome) et aux injections intra-articulaire (hématome, inflammation locale). Un stress inhérent à toute manipulation des animaux est également attendu mais sera limité grâce à une phase d’acclimatation et un hébergement collectif.

Devenir

Las animaux seront euthanasiés en fin d’étude car des prélèvements de l’articulation du genou seront réalisés pour analyse par micro-scanner et histologique.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants et l’activité de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude et par groupe a été évalué en fonction de l’objectif du projet. De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux et éviter l’utilisation de groupe contrôle non injecté, chaque animal sera son propre témoin, à partir des données du genou sain et de données récoltées avant administration des produits à tester (prises de sang, poids). Ainsi, un minimum de 6 animaux par groupe sera utilisé. Les études comprendront au minimum 2 groupes : soit un groupe injecté avec le produit à tester (produit préventif ou curatif) et un groupe injecté avec un produit contrôle (adjuvant, produit déjà sur le marché, …), soit des groupes recevant une posologie de produit à tester différente.

Raffinement

Une période d’acclimatation de minimum 10 jours sera respectée pour les lapins. Les animaux seront hébergés avec les enrichissements appropriés (plateforme et cachette, bâtonnet de bois à ronger, balles (jeux) et galet de foin), autant que possible en groupe sociaux de 2 à 5 individus en parcs ou en cages En cas d’animaux hébergés de manière individuelle chez le fournisseur, les animaux subiront une période de sociabilisation durant la période d’acclimatation afin de pouvoir les héberger collectivement dans nos locaux. Les animaux seront observés quotidiennement. Des pesées et un suivi avec grille de scoring permettant d’observer à la fois l’état général des animaux et leur mobilité, afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type désinfection de plaies, hydratation, isolement etc. ou bien mise à mort en cas d'état de santé considérablement dégradé et irréversible) seront réalisées quotidiennement en post-opératoire puis au minimum 1 fois par semaine (fréquence pouvant être augmentée en fonction de l’état de santé des animaux). De plus, un suivi post-opératoire (poids, suivi de la consommation de nourriture et d’eau, suivi de la zone opérée, traitements analgésique, anti-inflammatoire, antibiotique) sera effectué sur chaque animal pendant au minimum 5 jours. Pendant ce suivi, des médicaments visant à soutenir les fonctions digestives pourront être administrés aux animaux en fonction de leur état clinique. Lors de l’anesthésie, une attention particulière sera portée pour éviter l'hypothermie : mise en place de tapis chauffant et/ou réveil des animaux sous lampe chauffante. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux de l’animal pendant l’anesthésie pour éviter le dessèchement cornéen. Un protocole analgésique, antibiotique et anti-inflammatoire sera mis en place avant la procédure chirurgicale et poursuivi jusqu’au minimum 2 jours après chirurgie. Les lapins seront habitués à la contention. Pour cela, la contention sera réalisée plusieurs fois en amont de l’étude sans réalisation de geste technique. Une récompense pourra être apporté à l’animal. La chirurgie sera réalisée par un vétérinaire spécialisé en chirurgie et maitrisant ce modèle.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce couramment utilisée pour réaliser un modèle arthrose du genou. En effet, l’anatomie du genou du lapin est proche de celle de l’homme et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. L'âge des lapins sera choisi en fonction de la visée thérapeutique des produits testés. Généralement, on utilisera des lapins âgés entre 22 et 32 semaines lors de la chirurgie afin de s'affranchir de la croissance osseuse.

Une injection dans le muscle qui commande le mouvement de l'œil, une autre dans une patte arrière : 40 rats de 24 mois subissent ces deux gestes sous anesthésie générale, avant des injections abdominales quotidiennes pendant deux semaines. Avec 40 rats plus jeunes soumis à quatre prélèvements sanguins en huit heures sur animaux éveillés, 80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs tissus. L'objet est de tester si la forskoline, une molécule végétale repérée en étudiant la résistance des muscles oculaires, améliore la régénération musculaire chez des animaux âgés. Le porteur retient le rat pour sa proximité évolutive avec l'être humain et pour une longévité qu'il juge compatible avec l'étude du vieillissement dans un délai raisonnable.

Objectifs

Dans certaines maladies musculaires graves, comme les dystrophies musculaires, les cellules souches musculaires — responsables de la réparation des fibres — vieillissent trop vite et perdent leur capacité de régénération. Avec l’âge, un phénomène similaire se produit également dans les muscles sains, qui deviennent progressivement moins capables de se réparer. Des recherches récentes menées sur un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne ont montré que la forskoline, une molécule d’origine végétale, peut activer une voie biologique permettant de restaurer partiellement la fonction réparatrice des cellules souches. De façon remarquable, cette substance a été identifiée grâce à l’étude des muscles extra-oculaires (les muscles qui bougent les yeux). Ces muscles sont connus pour être étonnamment résistants, aussi bien au vieillissement qu’aux dystrophies musculaires, suggérant qu’ils disposent de mécanismes naturels de protection. Le présent projet vise donc à comparer les mécanismes de vieillissement normal et ceux liés aux maladies musculaires au niveau des cellules souches, et à tester si la forskoline (ou une molécule analogue) peut également améliorer la régénération musculaire chez des animaux âgés. L’objectif final est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques permettant de préserver la force et la masse musculaire au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables du vieillissement prématuré des cellules souches musculaires. Cette connaissance est essentielle pour développer, à terme, de nouvelles approches pharmacologiques visant à limiter la perte progressive de masse et de force musculaire liée à l’âge. Plus largement, l’étude pourrait mettre en évidence des mécanismes naturels de protection des cellules souches musculaires, en complément de ceux déjà connus et activés par la forskoline. L’identification de tels mécanismes ouvrira la voie à la découverte ou au développement de nouvelles molécules capables de retarder la sénescence des cellules souches et de renforcer la capacité de réparation des muscles.

Procédures

La première moitié des animaux (40 animaux au total, âgés de 2-3 mois) sera traitée une seule fois avec l’une des 4 molécules d’intérêt et le véhicule, via une injection dans la zone abdominale. Des prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés à quatre reprises, réparties sur les 8 heures suivant l’administration des molécules (volume total prélevé de 2 mL). La durée estimée de chaque prélèvement est d’environ 5 minutes par animal. Toutes ces interventions seront effectuées sur des animaux éveillés. La seconde moitié des animaux (40 au total, âgés de 24 mois) sera soumise à une injection dans un muscle d’une patte arrière et d’un œil (dans le muscle que permet le mouvement de l’œil). Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale et ne dépassera pas 3 minutes par animal au total. Un traitement médicamenteux contre la douleur sera administré par une injection 30 minutes avant de l’injection dans le muscle, puis toutes les 12 h pendant 2 à 3 jours (5 à 6 injections avec la molécule contre la douleur par animal, d’une durée inférieure à une minute chacune). Deux jours plus tard, les animaux — éveillés — seront soumis à des injections quotidiennes dans la zone abdominale (avec le véhicule ou la molécule d’intérêt), chacune durant moins d’une minute. Les animaux seront répartis en deux groupes (20 par groupe) : le premier avec un point de terminaison au jour 6, impliquant 4 injections (jours 2, 3, 4 et 5), et le second avec un point de terminaison au jour 30, impliquant 12 injections (du jour 2 au jour 14 inclus).

Impact sur les animaux

Dans le cas des injections dans la zone abdominale et des prélèvements sanguins répétés, la piqûre de l’aiguille et la contention peuvent provoquer un inconfort passager chez les animaux. Chez les animaux âgés (40 rats, âgés de 24 mois), une sensibilité accrue aux manipulations et aux conditions environnementales est possible, ce qui peut renforcer la gêne ressentie lors des injections. Par ailleurs, les injections dans le muscle (patte arrière et œil) peuvent provoquer une douleur temporaire ainsi qu’un léger malaise ou une gêne passagère dans la mobilité. Ces effets sont généralement transitoires et disparaissent en deux à trois jours, grâce à la mise en œuvre systématique de mesures antidouleur et à un suivi clinique attentif.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les étapes qui pouvaient être réalisées sans recours aux animaux ont été effectuées en amont de ce projet. Ainsi, l’efficacité des composés a d’abord été testée in vitro. L’innocuité dans un organisme de mammifère a été validée, étape indispensable pour évaluer la toxicité éventuelle des produits administrés ainsi que celle de leurs métabolites issus de la transformation par les organes, en particulier le foie. Sur cette base, ce projet vise à comparer les similitudes et les différences dans le processus de détérioration des cellules souches musculaires entre le vieillissement naturel et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), en s’appuyant sur les résultats déjà obtenus dans un projet précédent. Cette étude cherche à répondre à une question qui ne peut être abordée qu’in vivo, dans un organisme entier où tous les organes interagissent en permanence : la perte de fonction des cellules souches musculaires observée lors du vieillissement est-elle liée aux mêmes mécanismes que ceux altérés dans un contexte de déficience en dystrophine (comme dans la DMD) ? De plus, la forskoline ou ses analogues conservent-ils leur capacité à stimuler efficacement les cellules souches musculaires et à favoriser la régénération dans un muscle sain mais âgé ?

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, une optimisation préalable du plan expérimental a été réalisée. Les analyses statistiques ont montré qu’un effectif de 8 animaux par groupe était suffisant pour obtenir des résultats fiables dans le cas des animaux jeunes ou adultes. Ce nombre a déjà été validé dans des projets similaires, avec des résultats significatifs. Pour les animaux âgés (plus de 20 mois), un effectif légèrement plus élevé (10 par groupe) est prévu afin de compenser le risque accru de mortalité spontanée. Enfin, les animaux dystrophiques (DMD) ne seront pas inclus dans cette étude, car ils ont déjà été étudiés dans un projet précédent, ce qui permet de réduire davantage le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués hebdomadairement (ou quotidiennement si nécessaire, week-ends et jours fériés inclus) en observant individuellement les animaux. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère appartenant à la même classe que l’être humain, présentant de nombreux aspects anatomiques et physiologiques en commun, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes, ainsi que pour les processus métaboliques. Cette proximité évolutive en fait un modèle très apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis de faire du rat un modèle de choix pour l’analyse des troubles musculaires. Les modèles de rat reproduisent ce type de maladies humaines de manière très fidèle, tout en conservant les atouts propres aux rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable et longévité compatible avec l’étude des effets à long terme dans un délai raisonnable, en particulier chez les individus âgés.

Les souris utilisées portent une ostéogenèse imparfaite, la maladie des os de verre, et s'exposent donc à des fractures spontanées accompagnées de douleurs modérées. 800 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant onze injections et deux radiographies sous anesthésie. Le médicament testé vise à corriger la petite taille associée à la maladie, que les bisphosphonates prescrits aux patients ne traitent pas. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'étudier la croissance dans un "organisme entier", et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

L'ostéogenèse imparfaite, ou « maladie des os de verre », est une maladie génétique rare caractérisée par une fragilité osseuse. Les personnes atteintes se fracturent des os facilement tout au long de leur vie. Cette fragilité osseuse est due à l'anomalie d'une protéine essentielle à la structure des os. Quand cette protéine est défectueuse, les os deviennent plus fragiles et moins résistants aux chocs. Les personnes atteintes sont souvent de plus petite taille que la moyenne, et mesurent entre 92 et 108 cm à l'âge adulte. Les causes de cette petite taille ne sont toutefois pas encore comprises. Pour traiter cette maladie, la plupart des patients reçoivent des médicaments appelés bisphosphonates. Ces médicaments aident à limiter les fractures en réduisant la perte osseuse. Cependant, ils ne favorisent pas la croissance des os ni leur bonne qualité. De plus, environ 20 % des patients ne réagissent pas à ce traitement. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements qui favorisent la croissance et la solidité des os. Ce projet vise à tester un nouveau médicament sur des souris atteintes d’ostéogenèse imparfaite, afin de déterminer s’il améliore la croissance des os, en particulier dans la zone responsable de l’allongement des os longs. Parallèlement, l’étude portera sur l’évolution du cartilage dans cette zone afin de mieux comprendre les mécanismes responsables de la petite taille observée chez les personnes atteintes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont au nombre de deux : - mettre en évidence un traitement permettant de corriger la petite taille observée chez les patients atteints d'ostéogénèse imparfaite - comprendre comment la plaque de croissance est altérée suite à une anomalie de la protéine

Procédures

Contention et injection : 5 secondes, 11 fois/souris. Radiographie : 5 minutes, 2 fois/souris.

Impact sur les animaux

- La contention peut causer un stress léger de courte durée - Injections causent un stress léger et une douleur légère de courte durée - Risque de fractures spontanées avec douleurs modérés dû à la pathologie.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever leurs organes et de les étudier.

Remplacement

La croissance est un phénomène dynamique impliquant plusieurs types cellulaires. Or, à ce jour, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la croissance dans son ensemble. Il est donc impératif d'étudier ce processus au sein d'un organisme entier afin d'étudier les communications entre ces différentes cellules, plutôt que de se limiter à l’étude d’un seul type cellulaire.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les radiographies et les injections seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter tout stress supplémentaire pour l'animal. Des points limites spécifiques ont été définis. Toutefois, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

La croissance chez la souris est très similaire de celle chez l'homme. Le mécanisme de croissance est un processus dynamique faisant intervenir plusieurs types cellulaires et donc il est indispensable de pouvoir l'étudier dans un organisme entier. Les analyses seront réalisées à deux âges clés : à 5 semaines, correspondant à la fin de l’enfance chez l’être humain, à 11 semaines, correspondant à la fin de l’adolescence et donc à la fin de la croissance. Certaines souris seront étudiées à différents moments de la formation de la plaque de croissance, afin de mieux comprendre son développement et son rôle dans la croissance osseuse.