Troubles immunitaires
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- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude de l’interaction entre le dysfonctionnement métabolique et l’inflammation chronique dans un modèle murin de la dégénérescence maculaire liée à l’âge
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
6 500 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six électrorétinogrammes de 30 à 45 minutes et six imageries de la rétine sous anesthésie générale, 500 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 1 750 modéré et 4 250 léger. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes entiers. Un lot est hébergé jusqu'à quatre mois sous lumière intense, cotons de nidification retirés de la cage pour les empêcher de se cacher de la lumière, un autre subit l'ablation du nerf vague combinée ou non à celle de la rate, un autre des injections dans l'œil au risque d'inflammation et de micro-saignements. Le porteur écrit avoir limité les effectifs au maximum et fixe cinq animaux par groupe comme minimum statistique, sans expliquer par quel enchaînement de groupes on parvient à 6 500 souris.
Objectifs
La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la partie centrale de la rétine, qui apparaît le plus souvent à partir de 65 ans. En France, environ 1,5 million de personnes seraient atteintes de DMLA. Dans cette pathologie, un processus inflammatoire caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires et un processus de dysfonctionnement métabolique participent de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Ce projet permettra de comprendre comment ces processus essentiels interagissent, améliorant ainsi notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA. De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA (dégénérescence maculaire liée à l’âge). De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Procédures
Un lot d’animaux subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera hébergé sous une lumière intense (jusqu’à 4 mois maximum) et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux subira une chirurgie d’ablation du nerf vague combinée ou non à une ablation de la rate (durée de l’intervention 10 minutes) sous anesthésie générale et analgésiques administrés en préopératoire et postopératoire. Un lot d’animaux recevra des régimes alimentaires spécialement formulés pendant 4 semaines et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera soumis à une injection de molécules thérapeutiques par voie intraoculaire sous anesthésie générale avec analgésique (durée : moins de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Lors des anesthésies, il y a un risque de mauvaise réaction à l’anesthésiant (difficultés respiratoires, anxiété), un risque d’hypothermie ainsi qu’un risque d’arrêt cardiaque. Lors des injections intraoculaires, il y a un risque d’inflammation localisée (œil rouge) et de micro saignements visibles instantanément lors du geste. Lors de la procédure d’illumination, les animaux peuvent ressentir un stress lié à l’exposition à une lumière de (animaux agités pendant moins d’une heure), et leurs fonctions visuelles peuvent baisser au cours du temps. Lors des imageries de l’œil, les animaux peuvent également ressentir un stress lié à la préhension et contention lors de l’administration des collyres (durée de quelques secondes seulement). Lors du changement d’alimentation (mise à disposition des croquettes spécifiques à notre projet), les souris peuvent subir une perte de poids transitoire en réponse au changement de nourriture. Une hémorragie peut se produire au cours des chirurgies, ce qui peut entrainer le décès de l’animal. Après les chirurgies, les sutures pourraient s’irriter ou être retirées prématurément par l’animal. Après l’opération, il peut y avoir des douleurs postopératoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. Cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux, car nous avons besoin de prélever des organes entiers pour les analyser dans leur globalité.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cellules isolées.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser 6500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 5 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables, selon nos expériences antérieures. Pour les injections intraoculaires, nous prévoyons d’injecter le traitement dans un œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle ce qui permettra de limiter la variabilité entre animal et de réduire ainsi le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observent une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant d’entrer en expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation pour l’espèce concernée (cages ventilées standard avec enrichissement). Le nombre de souris par cage est limité à 5 individus adultes. Lors de la mise des animaux sous illumination, les animaux sont placés dans une pièce différente, mais restent dans leurs cages de stabulation normale, selon les mêmes conditions, hormis la luminosité et les cotons qui sont retirés pour éviter que les animaux ne se cachent de lumière. Ils auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par les membres de la structure bien-être de notre établissement utilisateur. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Le personnel assure le suivi du bien-être des animaux à l’aide d’un système d’étiquettes et de pastilles. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale de la cornée et l'humidité cornéenne sera maintenue à l'aide d'une goutte de gel ophtalmique. Après la chirurgie nous mettons à disposition une gelée post-opératoire nutritive avec des croquettes mouillées dans le fond de la cage pour aider à l’alimentation et à l’hydratation. En plus de l’analgésie préopératoire, des injections d’analgésiques postopératoires seront administrée après la chirurgie pour toute douleur postopératoire potentielle. Le poids corporel des animaux sera mesuré la veille, deux jours après et une semaine après la chirurgie. Une grille de scoring a été créée pour suivre les poids des animaux et les autres observations postopératoires. Le poids des animaux nourris avec des croquettes formulées avec un composé sera également surveillé chaque semaine pendant toute la durée de l’alimentation (mise en place d’une fiche de suivi pour vérifier ce paramètre).
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Nous utilisons des modèles génétiquement modifiés qui sont plus susceptibles à l’induction d’une inflammation pathogène, mimant la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Les animaux sont âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie étudiée.
MISE EN PLACE D’UN MODELE MURIN DE MYASTHENIE GRAVIS (FORME ACHR) ET EVALUATION DE CANDIDATS MEDICAMENTS AVEC CE MODELE
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Créer chez la souris une maladie auto-immune qui n'y existe pas, pour y faire ensuite passer des candidats médicaments : 1 248 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La myasthénie leur est induite par des injections répétées d'un fragment de récepteur avec un adjuvant qui peut provoquer une nécrose ou un durcissement de la peau, puis elles reçoivent jusqu'à trois administrations quotidiennes pendant onze semaines et un électromyogramme sous anesthésie. La faiblesse musculaire et la perte de mobilité attendues sur dix semaines sont classées en souffrance modérée, le porteur précisant qu'elles n'atteindront pas de signes cliniques sévères. L'effectif se décompose en 48 souris pour mettre le modèle au point et jusqu'à vingt études d'efficacité de 60 souris chacune, sans que ce nombre d'études soit rattaché à autre chose qu'un plan sur cinq ans.
Objectifs
La myasthénie gravis (MG) est une maladie auto-immune qui perturbe la communication entre les nerfs et les muscles, entraînant une faiblesse musculaire et une fatigabilité. Cette condition affecte la qualité de vie des patients et peut mener à l'isolement social. L'incidence de la MG est estimée entre 3 et 28 personnes par million, avec plus de 700,000 patients dans le monde. Les traitements actuels sont principalement des immunosuppresseurs, nécessitant des mois de traitement et souvent associés à des effets secondaires graves. De plus, 10 à 15 % des patients sont résistants à ces traitements. La MG est causée par la production d'auto-anticorps qui attaquent les molécules de la jonction neuromusculaire, perturbant la transmission des signaux entre les nerfs et les muscles. La majorité des patients (85 %) possèdent des anticorps contre le récepteur de l'acétylcholine (AChR), une protéine essentielle pour une bonne communication nerveuse et musculaire. Ce projet vise à établir un modèle murin de la forme la plus courante de la MG chez l’homme (AchR), car aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité biologique de cette pathologie. Ensuite, il s'agit d'évaluer l'action de candidats médicaments sur le développement de cette maladie. Pour ce faire, des souris recevront une petite partie de la protéine AchR (peptide) afin que leur système immunitaire produise des anticorps contre cette protéine, perturbant ainsi la communication nerf/muscle. Comme pour toute immunisation, un adjuvant sera ajouté pour optimiser la réaction immunitaire et la production d'auto-anticorps. Les études prévues dans ce projet incluent des évaluations cliniques et biologiques, comme des prélèvements sanguins pour mesurer la présence d'anticorps et des prélèvements d'organes pour valider l'expression des cibles thérapeutiques. Ces études peuvent être réalisées sur des souris génétiquement modifiées ou non pour un gène d'intérêt impliqué dans la maladie. Nous prévoyons 48 souris pour la mise au point du modèle. Puis, sur 5 ans, jusqu’à 20 études d'efficacité ou d’évaluation de l'effet dose de candidats médicaments, nécessitant chacune un maximum de 60 souris (maximum 5 groupes de 12 souris par étude).
Bénéfices attendus
Dans le processus de développement d’un nouveau médicament, ce type d’étude se fait après des tests en laboratoire sur des cellules et des simulations informatiques. L'objectif est de choisir les candidats médicaments qui peuvent réduire l'activité du système immunitaire dans la Myasthénie Gravis. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Affiner le modèle de test pour cette pathologie sur les animaux, en réduisant au maximum leur souffrance et en améliorant les conditions des expériences. 2. Améliorer la qualité de vie des patients en sélectionnant les médicaments qui ont un effet positif sur les mécanismes de la myasthénie gravis, avant de passer aux essais cliniques, et offrir ainsi une nouvelle option de traitement.
Procédures
- Immunisation par l’agent inducteur (peptide + adjuvant) de la pathologie/du modèle : 3 injections sous-cutanées par jour (sur 2 jours à 4 semaines d’intervalle), moins de 30 secondes pour chacune des 3 injections - Administration des candidats médicaments / produits évalués (>1min) avec au maximum 3 administrations quotidiennes sur une durée maximum de 11 semaines. - Prélèvement de sang : (faible volume, moins de 30 secondes) avec une fréquence en accord avec les recommandations de la structure de Bien-Etre Animal : 2 prélèvements sur les 11 semaines que dure l’’étude - Electromyogramme : étude de la fonction des nerfs et des muscles sous anesthésie générale avec utilisation d’électrodes musculaires réalisé une seule fois par souris (en fin d’étude) - Prélèvement de sang terminal sous anesthésie générale et analgésie (une seule fois, 30 secondes) - Certaines études d’efficacité pharmacologique pourront nécessiter l’utilisation de souris génétiquement modifiées élevées et commercialisées par un éleveur : préalablement à leur expédition dans notre établissement utilisateur, elles auront eu un prélèvement de tissus (biopsie de l’extrémité de la queue) pour confirmer leur modification génétique.
Impact sur les animaux
Selon les données de la littérature, les nuisances estimées sont les suivantes : 1. Administration de peptide avec adjuvant sous-cutané (3 sites d’administration, 2 jours d’immunisation) : Moins de 30 secondes par injection, 2 fois. Risque de nécrose ou durcissement de la peau (douleur modérée) dans les jours suivant les administrations et dépendant du type d’adjuvant (risque accru avec l’adjuvant de l’article de référence, pondéré par l’administration préventive d’un antalgique 5 minutes avant). 2. Microprélèvements de sang : 30 secondes maximum, 2 fois. Stress et douleur ponctuels (douleur légère) . 3. Développement de myasthénie gravis sur 10 semaines : Faiblesse musculaire et réduction de la mobilité (souffrance modérée), sans atteindre des signes cliniques sévères 4. Administration de candidats médicaments : Stress et douleur passagers pendant l’administration, avec un maximum de 3 injections par jour sur une période de 11 semaines (douleur modérée). 5. Electromyogramme : 5 électrodes en sous cutané via de très fines aiguilles hypodermiques sous anesthésie gazeuse : Stress léger (une fois, 10 minutes) 6. Prélèvement de sang terminal sous anesthésie et analgésie : Sans réveil, donc sans douleur post-procédure.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus nécessaires pour les analyses in vitro des échantillons (immunohistochimie, etc) nécessaires à la caractérisation complète du candidat médicament
Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. Néanmoins, l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Pour ce projet spécifiquement, le modèle présenté permettrait d’évaluer différents mécanismes cellulaires impliqués dans cette pathologie dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré après la première étude afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe. La technique de micro-prélèvement décrite en 5.10.3. pour réaliser les prélèvements sanguins permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet.
Raffinement
Lorsqu’on utilisera l’adjuvant de l’article de référence, l’administration d’un antidouleur sera effectuée 5 minutes en amont. Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique de micro-prélèvements de la souris, réalisable plusieurs fois sur un même animal en respectant les bonnes pratiques, les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. L’adjuvant de référence (dont le but est d’activer le système immunitaire et le rendre plus sensible à l’agent que va induire le modèle) sera associé à un antidouleur car il peut être mal toléré pas la souris. Nous évaluerons cependant un second adjuvant jamais utilisé dans ce modèle mais connu pour être mieux toléré. Les cages d’hébergement en cours d’études pourront selon les études être placées sur un portoir connecté permettant d’obtenir des données complémentaires en termes d’activité locomotrice des groupes de souris de manière non invasive ni stressante. Si grâce à ces cages connectées, nous voyons un impact sur la locomotion des souris non visible par l’expérimentateur ou par le test d’effort, ces mesures pourraient remplacer le test d’effort.
Choix des espèces
L’espèce murine est exclusivement utilisée dans la bibliographie pour reproduire ce type de pathologie de par sa transposition à l’homme. De plus, la souche de souris que nous utiliserons dans ce projet est un fond génétique largement utilisé dans les modèles de Knock in (changement du gène murin d’intérêt par le gène humain) nous permettant d’évaluer la cible humaine dans un modèle animal. Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle (en comptant les premières étapes de pesées avant le début d’induction de la pathologie à 8 semaines).
Etude pré-clinique in vivo d’efficacité et de sécurité d’une nouvelle thérapie cellulaire innovante (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
63 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont irradiées, puis reçoivent sans anesthésie une injection de cellules sanguines humaines qui déclenche une maladie du greffon contre l'hôte, atteignant la peau, le tube digestif et le foie, avec une perte de poids progressive sur quatre à six semaines. Une leucémie humaine leur est également greffée, puis suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à un volume tumoral fixé à l'avance. L'objectif immédiat est le dépôt d'un dossier non clinique auprès de l'ANSM, le porteur affirmant qu'aucune simulation informatique ne reproduit ces interactions et que le modèle murin reste "le seul modèle validé".
Objectifs
La greffe de cellules sanguines issues d'un donneur volontaire sain est considérée comme le seul traitement permettant d’obtenir la guérison de certains cancers du sang chez l'Homme. La greffe permet que le système immunitaire du donneur reconnaisse comme étrangères les cellules cancéreuses du receveur et les tue : c’est ce qu’on appelle l’effet anti- tumoral (ou anti-leucémique) du greffon. Toutefois, les cellules du système immunitaire du donneur sont incapables de faire la différence entre une cellule cancéreuse et une cellule saine du receveur. L’attaque des cellules saines du receveur par le système immunitaire du donneur s’appelle la maladie du greffon contre l’hôte. Une stratégie prometteuse qui permettrait de moduler la maladie du greffon contre l’hôte sans altérer l’effet l’effet anti- tumoral du greffon est la thérapie cellulaire, notamment avec les cellules myéloïdes régulatrices (MDSCs). Notre objectif est de développer un médicament de thérapie innovante pour moduler les conflits hôtes/greffon dans le contexte de la transplantation de cellules sanguines à partir d’un donneur volontaire sain. Nous avons développé une méthode pour obtenir rapidement des "MDSCs" obtenues à partir d’un échantillon de greffon de donneur sain, conduisant au dépot d'un brevet. Précedemment, nous avons identifié la dose injectée minimale pour obtenir une diminution de l'incidence et de la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte dans un modèle pré-clinique murin. L'objectif de ce projet est triple 1/Reproductibilité de l'efficacité des MDSCs injectées au moment de la transplantation, en injectant des MDSCs issues de 3 lots différents de production. 2/L'évaluation de la dispertion des cellules dans les organes cibles et l'infiltration/différenciation des cellules injectées dans ces organes. 3/ L'absence d'effet néfaste de la thérapie notamment de l'absence de favorisation de cellules leucémiques. Il s’agit d’un projet multisite dans deux EU différents.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus à moyen terme de ce projet sont de déposer un dossier technique complet (dossier non clinique) auprès de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) afin de proposer un jour notre thérapie cellulaire chez l’Homme. Le projet va permettre de 1/ de confirmer chez l'animal l'efficacité du produit de thérapie cellulaire. 2/Etudier la répartition tissulaire des cellules après l'injection. 3/ Vérifier l'absence d'aggravation de la leucémie (leucémie, principale indication actuelle en clinique pour la greffe de cellules sanguines humaines à partir d'un donneur sain). A plus long terme, si ce produit de thérapie cellulaire est efficace et peu toxique dans la greffe de cellules sanguines, il pourrait s'étendre à d'autres applications comme la transplantation d'organes solides pour moduler les conflits hôte/greffon.
Procédures
-Une irradiation faible dose, de chaque animal pour 63 souris réalisée une seule fois (durée d'environ 2 minutes sur une journée).: -Une injection intraveineuse sur animal conscient (non anesthésié) de cellules sanguines humaines, une seule fois en début d’expérience pour 63 souris (dure environ 5 secondes sur une journée). -Une anesthésie générale répétée (X4 maximum) pour 63 souris (anesthésie générale de 15 à 30 minutes maximum sur une journée). L'anesthésie générale est prévue soit 4 fois dans 1 semaine pour suivre par imagerie la dispertion et répartition tissulaire des cellules une fois par semaine (maximum 4 semaines) pour le suivi de la leucémie.
Impact sur les animaux
-la douleur légère induite par la piqure d’aiguille à l’injection des cellules (J0) -stress modéré lors de la procédure d'irradiation à faible dose, -Potentielles mais rares lésions d'inflammation de la muqueuse de la bouche après irradiation (pendant 3-5 jours) -Stress lié aux injections et aux anesthésies générales -Potentiels signes de maladie du greffon contre l’hôte (atteinte de la peau, du tube digestif et/ou du foie), avec une sévérité habituellement modérée. Les souris vont alors très progressivement (sur 4 à 6 semaines) perdre du poids et montrer des signes de fatigue et d’altération de l’état général. -Développement leucémique lent infiltrant la rate, le foie et les ganglions. Cette infiltration leucémique des organes est contrôlé par l'imagerie hebdomadaire basée sur la bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) qui permet d'arrêter l'expérimentation à un volume tumoral cible sans laisser se développer les symptômes terminaux de la leucémie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour confirmer les données cliniques et de bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) par des données microscopiques. Tâche1: prélèvement des organes cibles de la maladie du greffon contre l'hôte (peau, tube digestif, foie) pour analyse au microscope de la sévérité de la maladie développée. Tâche 2: prélèvement des organes cibles dans lesquels patrouillent les MDSCs pour observer par microscopie la localisation exacte et le devenir des MDSCs. Tâche 3: prélèvement des organes envahis par la leucémie pour explorer d'éventuels contacts cellulaires entre les cellules leucémiques et les MDSCs.
Remplacement
Nous avons optimisé in vitro nos connaisances sur le mécanisme d'action des MDSCs. Toutefois, pour proposer les MDSCs comme médicament de thérapie innovante chez l'Homme, une étude pré-clinique robuste dans un modèle murin est indispensable. En effet, dans les cancers liquides, aucune simulation informatique ("modèle in silico" )ne permet aujourd'hui de reproduire en laboratoire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules en thérapie. A ce jour, le seul modèle validé est le modèle murin.
Réduction
Nos études antérieures ont révélé un effet important de nos traitements, aboutissant à des différences significatives entre des groupes même avec un faible nombre d'animaux (n=3). Ainsi pour chaque tâche expérimentale, des groupes de taille minimale de trois animaux seront constitués.Des analyses statistiques seront réalisées pour interpréter les résultats. Afin de prendre en compte une viariabilité liée au donneur (variation d'efficacité d'un produit cellulaire en fonction du donneur humain d'origine), chaque tâche sera repétée trois fois avec des cellules issues de trois donneurs différents.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un secteur spécifique pour les animaux avec une déficience profonde de leur système immunitaire, en animalerie exempte d'organisme pathogène spécifique. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Les expérimentations d'imagerie seront atourées d'une anesthésie. Les points limites sont clairement identifiés : des signes généraux sur l'évaluation clinique de l'état général de la souris et le développement de signes cliniques de conflits hôte/greffon) et des signes spécifiques de chaque expérimentation ( suivi de la croissance tumorale), conduisant à un arbre décisionnel pour l'arrêt anticipé de la souffrance.
Choix des espèces
La modèle animal murin utilisé est un modèle mondialement reconnu pour étudier la greffe de cellules sanguines humaines. Ces souris n'ont pas de système immunitaire fonctionnel capable de rejeter des cellules sanguines de l'Homme (ce qui permet une étude à long terme des cellules sanguines humaines injectées). En revanche elles ont des cellules présentatrices d'antigènes qui peuvent activer les cellules sanguines humaines acceptées. Ainsi, ce modèle reproduit la maladie du greffon contre l'hôte couramment observé chez les patients greffés. On observe une réactivité des cellules sanguines humaines contre les organes cibles de la souris ( la peau, le tube digestif et le foie), ce qui mime ce qui est observé chez l'Homme. D'autre part, la greffe de cellules sanguines d'un donneur sain vers un patient est en général indiquée pour véhiculer un effet du greffon contre la leucémie. Or l'adjonction de lignées leucémiques humaines dans ce modèle de souris reproduit le contexte leucémique d'un patient. Notre projet vise à étudier l'administration d'un nouveau médicament (produit à partir de cellules du greffon du donneur) dans ce contexte de greffe de cellules sanguines. Nous devons étudier l'impact de ce nouveau médicament sur l'incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte et l'absence d'effet qui pourrait favoriser la leucémie. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe de cellules humaines est meilleure dans cette période de vie
Etude des déficits immunologiques dans un modèle de souris mutantes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
36 souris vont être utilisées pour une seule prise de sang d'une minute chacune, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées ensuite pour prélever leur moelle osseuse. Elles portent une mutation qui reproduit le syndrome de Hermansky-Pudlak, donc un déficit immunitaire et un défaut des plaquettes qui expose à un saignement prolongé au moment même du prélèvement. Le geste se fait sur animal éveillé, le porteur prévoyant de comprimer le point de ponction avec un hémostatique. Il indique que le déficit immunitaire ne s'exprime pas ou peu grâce aux barrières sanitaires de l'élevage, ce qui fait dépendre la gravité déclarée du maintien de ces conditions d'hébergement.
Objectifs
Les maladies rares d’origine génétique peuvent nous en apprendre beaucoup sur le fonctionnement du corps humain. En les étudiant, les chercheurs découvrent des informations précieuses sur les gènes, les protéines et les mécanismes essentiels de la vie. Ces découvertes peuvent aussi aider à mieux comprendre des maladies plus courantes. Dans notre recherche, nous nous intéressons à une maladie appelée syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP). C’est une maladie rare qui touche plusieurs organes et se manifeste notamment par une forme d’albinisme (peau et yeux très clairs) et une tendance aux saignements. Chez certains patients atteints de cette maladie, nous avons découvert des anomalies dans un gène. Ces anomalies pourraient expliquer certaines difficultés de défense contre les infections (déficit immunitaire) ainsi que des troubles du sang, en particulier un manque de plaquettes – des cellules qui aident à arrêter les saignements – et des problèmes dans leur fonctionnement. Le but de notre projet est d'étudier les effets de cette anomalie génétique, en utilisant un modèle de souris spécialement conçu pour porter cette mutation. Nous allons nous concentrer sur l’étude du sang, et plus particulièrement sur les plaquettes. Pour cela, nous réaliserons des prises de sang sur des souris saines et sur des souris porteuses de la mutation, afin d’analyser les différences et mieux comprendre les conséquences de cette modification génétique.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude de système immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare, le syndrome de Hermansky-Pudlak. Nous souhaitons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène cible et son effet sur la thrombopénie (réduction de nombre de plaquettes) ainsi que les dysfonctionnements de ces plaquettes.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure, un prélèvements de sang sera réalisé sur chaque animal à 6 semaines d'âges. Ce geste dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction plaquettaire et de la thrombopénie, un risque de saignement prolongé au moment de la prise de sang pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes. Le prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile pouvant induire un stress. Nos souris ont un phénotype dommageable (déficit immunitaire) et sont sensibles aux infections liées aux pathogènes. Cependant, grâce à nos conditions d’élevage avec des barrières sanitaires spécifiques, l'expression du phénotype est limitée voire inexistante.
Devenir
En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte d'organe, de la moelle ossuse, afin de l'analyser.
Remplacement
Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en gardant s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Vu l'expérience que nous avons sur l'étude précédente, 18 animaux mutants et 18 animaux contrôles sont nécessaires pour obtenir des résultats robustes dans l’analyse des populations cellulaires par cytométrie.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, la posture, la présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat (présence de matériel pour la construction du nid et un tube). Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique déterminé par le service vétérinaire pourra être administré. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local afin d’atteindre l’hémostase. Le phénotype étant dommageable (déficit immunologique), les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à leur immunodéficience : ils seront traités en premier en début de journée pour être dans les conditions les plus propres, et pour éviter les contaminations et seront hébergées en cages sur portoir ventilé pour éviter toute infection par un pathogène. Ces conditions permettent d'éviter l’apparition du phénotype dommageable en lien avec l’immunodéficience.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons du modèle porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Le modèle de souris est notamment très utilisé pour étudier les fonctions immunitaires, où un large panel d’outils d’analyse est disponible. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Le prélèvement sera réalisé sur les animaux à 6 semaines car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses. A ce stade, le système immunitaire est mature.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles thérapeutiques dans un modèle d’allogreffe chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
85 souris sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, pour fournir la peau greffée aux autres. 400 receveuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées pour prélever leurs tissus. Chaque greffe de peau pleine épaisseur dure une vingtaine de minutes, suivie de trente jours au plus de traitements immunosuppresseurs testés, de clichés sous anesthésie légère tous les deux jours et d'une imagerie de fluorescence par semaine. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des infections possibles du greffon et des pertes de poids liées aux molécules testées, et conclut que le rôle des souris reste "crucial et irremplaçable".
Objectifs
Le rejet de greffe reste un obstacle central en transplantation, nécessitant des traitements immunosuppresseurs souvent lourds et aux effets secondaires significatifs. Ce projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de greffe de peau pleine épaisseur afin d’évaluer des approches innovantes pour inhiber efficacement le rejet et prolonger la survie des greffes. L’un des objectifs principaux est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et formulations qui ciblent spécifiquement les voies métaboliques critiques des lymphocytes T activés. Ces cellules immunitaires, responsables du rejet, reprogramment leur métabolisme en faveur de la glycolyse, de la phosphorylation oxydative et du métabolisme de la glutamine pour répondre à leurs besoins énergétiques. Ce projet vise à tester des inhibiteurs de ces voies, individuellement ou en combinaison, afin de déterminer leur capacité à moduler la réponse immunitaire et à prolonger la survie des greffes. Une attention particulière sera portée à l’optimisation des conditions d’administration des molécules étudiées. Le projet explorera différentes stratégies de dosage et de fréquence d’administration afin de maximiser l’efficacité tout en minimisant les effets secondaires. Ces efforts visent à établir des protocoles thérapeutiques mieux tolérés par les sujets, garantissant un équilibre entre immunosuppression et tolérance immunitaire. Enfin, ce projet ambitionne d’explorer les interactions potentielles entre les inhibiteurs métaboliques et d’autres approches immunomodulatrices, telles que les traitements par co-stimulation ou la déplétion cellulaire. L’objectif est de développer des combinaisons thérapeutiques capables de générer une immunosuppression robuste et synergique, tout en minimisant les risques de rejet aigu et en favorisant une tolérance durable. À travers cette démarche, ce projet contribuera à l’élaboration de stratégies novatrices et transposables en clinique, offrant des perspectives prometteuses pour améliorer les résultats des greffes et la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche ambitionne de transformer la gestion du rejet de greffe en se concentrant sur la découverte de nouvelles approches thérapeutiques. En évaluant des molécules innovantes et en testant des formulations ciblant les voies métaboliques clés des lymphocytes T activés, il vise à élargir le répertoire des traitements disponibles en transplantation. Un des principaux bénéfices attendus est l’identification de nouvelles molécules capables d’inhiber sélectivement les mécanismes immunitaires responsables du rejet, tout en limitant les effets secondaires courants associés aux traitements immunosuppresseurs conventionnels. Ces découvertes permettront de mieux comprendre les interactions complexes entre métabolisme cellulaire et réponses immunitaires, ouvrant ainsi la voie à des interventions plus spécifiques et efficaces. Ce projet se distingue également par son approche novatrice de combinaison thérapeutique. En explorant les synergies potentielles entre deux molécules ou plus, il sera possible de maximiser l’effet immunosuppresseur tout en réduisant les doses nécessaires, diminuant ainsi la toxicité et les risques pour les patients. Cette démarche pourrait générer des stratégies thérapeutiques robustes et durables, adaptées à des contextes cliniques variés. Enfin, l’optimisation des doses et des schémas d’administration constituera un bénéfice clé. Grâce à une évaluation rigoureuse des relations dose-réponse, ce projet permettra d’identifier les protocoles les plus sûrs et les plus efficaces, minimisant les complications et maximisant les chances de succès des greffes. En résumé, ce projet s’inscrit dans une dynamique d’innovation centrée sur la découverte et l’optimisation de traitements de nouvelle génération, offrant des perspectives prometteuses pour améliorer la gestion du rejet de greffe et la qualité de vie des patients transplantés.
Procédures
Les animaux donneurs seront prélevés selon une procédure chirurgicale sans réveil durant approximativement 20 minutes, puis seront mis à mort. Les animaux receveurs recevront les gerffes de peaux des donneurs lors d'une procédure chirurgicale durant approximativement 20 minutes, puis seront suivis pendant une période pouvant aller jusqu'à 30jours. Les animaux seront surveillés journalièrement la 1ère semaine, puis tous les 2 jours pour évaluer leur état et réaliser un scoring de prise de greffe. les animaux seront traités avec des traitements de référence et des traitements tests pour comparer l'efficacité de nouvelles thérapeutiques. L'évaluation de la prise de greffe se fera aussi par imagerie non invasive (prise de clichés sous anesthésie légère tous les 2 jours et imagerie de fluoresence une fois par semaine).
Impact sur les animaux
Ce projet, bien que conçu pour minimiser l'impact sur les animaux, peut entraîner certaines nuisances ou effets indésirables inhérents à la mise en œuvre d’un modèle de transplantation cutanée et aux traitements testés. L’intervention chirurgicale nécessaire pour réaliser les greffes de peau constitue une source potentielle de douleur et d’inconfort postopératoires. Cependant, ces effets seront atténués grâce à une prise en charge rigoureuse, incluant l’utilisation d’anesthésiques pendant l’opération et d’analgésiques (par exemple, la buprénorphine) pour soulager la douleur après l’intervention. Des complications locales, telles que des infections au site de greffe ou un retard de cicatrisation, peuvent survenir. Ces risques seront contrôlés par des mesures prophylactiques, comme l’administration d’antibiotiques, et une surveillance attentive des animaux pour détecter rapidement toute anomalie. Les traitements administrés dans le cadre de l’étude (inhibiteurs métaboliques ou molécules immunosuppressives) pourraient entraîner des effets secondaires dose-dépendants, tels qu’une perte de poids, une fatigue ou des altérations métaboliques. Ces manifestations seront étroitement surveillées grâce à un suivi clinique quotidien des animaux, incluant l’évaluation de leur comportement, de leur alimentation et de leur état général. Des ajustements de dose seront effectués si nécessaire pour limiter ces effets.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux donneurs seront mis à mort. A l'issue de chaque procédure, les animaux receveurs seront mis à mort afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo.
Remplacement
La recherche menée dans ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour inhiber le rejet de greffe, en s’appuyant sur un modèle murin de transplantation cutanée. Bien que le recours aux animaux soit limité aux cas où aucune alternative équivalente n’existe, leur utilisation demeure essentielle pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les modèles in vitro et les simulations informatiques constituent des alternatives précieuses et seront exploitées dans les phases préliminaires. Les cultures cellulaires, par exemple, permettront d’évaluer les interactions moléculaires et les effets directs des traitements sur les lymphocytes T. De même, des outils de modélisation informatique seront utilisés pour prédire les propriétés pharmacocinétiques et les interactions potentielles entre les molécules. Ces méthodes contribueront à réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant en amont les composés inefficaces ou toxiques. Cependant, ces approches ne peuvent pas reproduire les processus biologiques complexes d’un organisme vivant, tels que les interactions immunologiques, la vascularisation des greffes ou les effets systémiques des traitements. Le rejet de greffe implique des mécanismes dynamiques qui ne peuvent être modélisés de manière fiable qu’en étudiant un système immunitaire fonctionnel dans son intégralité. Les souris, grâce à leur génétique bien caractérisée et leur similitude immunologique avec les humains, constituent le modèle le plus adapté pour explorer ces phénomènes de manière rigoureuse et reproductible. En outre, le modèle murin de greffe de peau permet une observation directe et précise des effets des molécules testées, notamment par l’évaluation visuelle et histologique des greffes. Ce niveau de précision est indispensable pour garantir la robustesse et la transposabilité des résultats à un contexte clinique. Enfin, l’utilisation des animaux sera strictement encadrée par des protocoles respectant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Tous les efforts seront faits pour réduire leur nombre au strict minimum nécessaire et pour limiter leur inconfort par des soins appropriés et des critères d’arrêt clairs. Ainsi, bien que des alternatives soient intégrées au projet pour limiter l’utilisation des animaux, leur rôle reste crucial et irremplaçable pour répondre aux questions scientifiques complexes liées au rejet de greffe et au développement de traitements innovants.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d’analyses statistiques rigoureuses. Les tests utilisés incluent des méthodes telles que l’analyse de puissance statistique, permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux avec une probabilité donnée (généralement 80 %) et un seuil de signification de 5 %. Ces calculs tiennent compte de la variabilité attendue des réponses, basée sur des études antérieures dans le domaine de la transplantation.
Raffinement
Raffinement des conditions d’hébergement et de manipulation : Les souris sont maintenues dans des conditions optimales, adaptées à leur statut sanitaire : Utilisation de cages spécifiques avec filtration d’air pour réduire le risque d’infections. Température (20-24 °C) et humidité (40-60 %) contrôlées, essentielles pour éviter les perturbations cutanées. Enrichissement environnemental adapté (matériaux stériles comme tunnels ou abris) pour éviter tout traumatisme mécanique sur les greffes. Minimisation de la douleur et de la détresse : Anesthésie générale des animaux lors des chirurgies et analgésie préventive et postopératoire : Administration d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et antibiothérapie. Techniques chirurgicales optimisées : Utilisation d’instruments microchirurgicaux pour minimiser les traumatismes tissulaires et surveillance stricte de l’asepsie pour prévenir les infections postopératoires. Monitoring du bien-être : Mise en place d’une grille d’évaluation régulière incluant des paramètres comportementaux, physiologiques (perte de poids, température corporelle), et spécifiques (aspect de la greffe). Suivi longitudinal par imagerie non invasive : Utilisation de technologies telles que la fluorescence ou la tomographie optique cohérente (OCT). Ces outils permettent de suivre en temps réel l’état des greffes sans euthanasier les animaux à différents temps.
Choix des espèces
Le modèle murin a été retenu pour ce projet en raison de ses nombreux avantages scientifiques et pratiques. Les souris possèdent un système immunitaire bien caractérisé et similaire à celui des humains, permettant une extrapolation pertinente des mécanismes immunologiques étudiés. La disponibilité de lignées inbred et transgéniques facilite l’exploration des réponses immunitaires spécifiques et des mécanismes d’action des molécules testées. La transplantation cutanée chez la souris est un modèle robuste, largement documenté et reproductible, idéal pour évaluer le rejet de greffe. La petite taille des souris et leur gestion pratique réduisent les coûts et permettent des études efficaces avec un nombre minimal d’animaux. Malgré l’utilisation d’alternatives in vitro pour réduire leur nombre, les souris restent indispensables pour étudier les réponses immunitaires systémiques et les interactions complexes in vivo, essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement est privilégié car il correspond à la maturité immunologique, nécessaire pour étudier les mécanismes de rejet de greffe et les réponses aux traitements immunosuppresseurs. Les souris adultes présentent des systèmes immunitaire, métabolique et vasculaire pleinement fonctionnels, ce qui garantit la fiabilité des résultats et leur transposabilité aux humains. De plus, à cet âge, les animaux sont suffisamment robustes pour supporter les procédures chirurgicales tout en minimisant les risques de complications liés à l’immaturité ou à la sénescence. L’utilisation de souris au même stade de développement permet également de réduire la variabilité des résultats, en limitant les différences physiologiques liées à l’âge.
Etude de l’effet anti-inflammatoire d’un traitement par des microbulles d’oxygène
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées en fin d'étude pour récupérer dans des conditions stériles le liquide accumulé dans leur ventre, 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit deux à quatre injections destinées à déclencher une inflammation du péritoine, puis une gêne abdominale que le porteur qualifie de transitoire. L'objet réel est de tester des microbulles d'oxygène censées calmer les cellules immunitaires du sang, les retombées annoncées pour les malades chroniques étant renvoyées à des traitements futurs. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit cette complexité et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Les maladies chroniques inflammatoires représentent aujourd’hui une des plus grandes menaces pour la santé humaine selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS). Environ 5 % de la population mondiale en est atteinte. Ces maladies provoquent des poussées inflammatoires qui nuisent fortement à la qualité de vie et peuvent mettre en danger la santé à moyen et long terme. Malgré de nombreux traitements disponibles, ces poussées restent difficiles à contrôler et les médicaments actuels ont souvent des effets secondaires importants. Une piste prometteuse réside dans la régulation du métabolisme des cellules immunitaires, en particulier des monocytes, des cellules du sang qui jouent un rôle clé dans l’inflammation. Quand elles manquent d’oxygène, comme c’est souvent le cas dans le sang, ces cellules adoptent un comportement pro-inflammatoire. Leur fournir de l’oxygène pourrait donc permettre de limiter leur activité inflammatoire. Mais distribuer de l’oxygène aux bonnes cellules est complexe. Les méthodes actuelles sont peu efficaces, peu ciblées ou présentent des risques. Notre projet propose une solution innovante : utiliser de petites bulles d’oxygène compatibles avec l’organisme. Ces bulles, conçues pour rester dans le sang et être reconnues par les monocytes, pourraient leur fournir de l’oxygène de manière ciblée. En les absorbant, les monocytes réduiraient ainsi leur capacité à entretenir l’inflammation.
Bénéfices attendus
1_ Réduction ciblée de l'inflammation : Diminuer les poussées inflammatoires en agissant directement sur les cellules en partie responsables (les monocytes). 2_Moins d'effets secondaires : Limiter les effets indésirables grâce à une approche localisée. 3_Nouvelle stratégie thérapeutique : Ouvrir la voie à des traitements innovants pour les maladies inflammatoires chroniques résistantes aux thérapies actuelles.
Procédures
les souris vont être soumises aux interventions suivantes : injections (1 minute 2 à 4 fois).
Impact sur les animaux
un stress léger pourra survenir lors de la prise en main des animaux pour les injections. Une douleur légère et passagère pourra survenir sur la zone d’injection et une gêne abdominale transitoire due à l'irritation.
Devenir
La mise à mort des animaux en fin d’étude est indispensable afin de récupérer le liquide dans le ventre dans des conditions stériles et optimales, permettant une analyse précise de la réponse cellulaire inflammatoire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo l’impact d’une modulation métabolique ciblée des monocytes au cours d’une inflammation systémique. Ce type de réponse immunitaire est complexe, impliquant des interactions dynamiques entre cellules circulantes, tissus, médiateurs inflammatoires et des facteurs généraux comme l’oxygène ou les nutriments. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement cette complexité dans un organisme vivant. Des modèles cellulaires sont utilisés en parallèle pour affiner nos hypothèses, mais le recours à l’animal est indispensable pour valider l’efficacité, la spécificité et la tolérance d’une délivrance ciblée d’oxygène via microbulles dans un contexte physiologique pertinent.
Réduction
Le protocole est conçu pour utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire à la significativité statistique. Des pré-tests in vitro ont permis d’optimiser les formulations, doses et modalités de délivrance avant toute expérimentation animale. Des groupes témoins strictement limités sont prévus pour permettre une comparaison pertinente (thioglycollate seul, traitement sans microbulles, etc.). Des réplicats biologiques et des analyses croisées (biomarqueurs, cytométrie, histologie) sont mutualisés pour maximiser les données obtenues par animal. De plus, si dans la première phase du projet nous avons 100% d'inflamation homogène, nous n'utiliserons que 10 souris par groupe dans la seconde phase.
Raffinement
Tout a été mis en œuvre pour minimiser la douleur, le stress et les effets secondaires induits par les manipulations : L’injection de notre produit est une méthode standardisée et maîtrisée. Les animaux sont manipulés par un personnel formé et expérimenté. Le volume et la concentration du produit injecté ont été choisis pour provoquer une inflammation modérée, sans provoquer de souffrance prolongée. Une grille de suivi clinique est mise en place, avec des points limites définis. Une surveillance rapprochée est assurée. Les microbulles sont conçues pour être biocompatibles et non toxiques.
Choix des espèces
La souche de souris choisi est une souche de référence dans les études immunologiques et inflammatoires : son profil immunitaire est bien caractérisé. Cette souche est largement utilisée dans les modèles de péritonite, avec une cinétique bien connue de recrutement des cellules immunitaires, notamment des monocytes/macrophages, qui sont la cible principale de notre stratégie. À 7 semaines, les souris sont jeunes adultes : leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour étudier une réponse inflammatoire reproductible et physiologiquement représentative. De plus, la plupart des études publiées sur le modèle d’inflammation dans le ventre utilisent des souris de 6 à 10 semaines, ce qui garantit la comparabilité de nos résultats avec les données existantes.
Étude de l’activation des mastocytes sur l’activité sécrétrice des plexus choroïdes et sur le développement de la fonction du cerveau
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
4 003 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certaines femelles gestantes subissant une laparotomie de quarante-cinq minutes suivie d'injections toutes les douze heures pendant deux jours en cas de douleur. Des nouveau-nés sont injectés directement dans le cerveau. Les souris menées jusqu'à l'âge adulte passent trois tests cognitifs de vingt minutes sur une à trois semaines, avant une chirurgie terminale sans réveil par perfusion, l'objet étant de savoir comment une réaction allergique induite après la naissance modifie les plexus choroïdes et le développement du cerveau. Le porteur justifie les effectifs par des groupes de cinq à sept animaux répétés en triplicat sur cinq stades de développement, sans détailler comment on parvient à 4 003 animaux.
Objectifs
Le cerveau a longtemps été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, notamment par les cellules immunitaires. Parallèlement, certaines barrières du cerveau ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes.
Bénéfices attendus
Cette analyse permettra de mieux comprendre comment la mise en place physiologique du système immunitaire après la naissance façonne le développement de la fonction cérébrale via les cellules étudiées. Plus particulièrement, le but de notre projet est d’identifier comment une réaction inflammatoire de type allergique au cours du développement post-natal, modifie la physiologie des cellules étudiées, altère la composition de certains tissus et entraîne l’apparition de maladies neurodéveloppementales. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que sont les cellules étudiées et qui reste encore très peu étudiée, particulièrement au cours du développement après la naissance. Cette analyse permettra d’identifier les facteurs produits par les cellules étudiées et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité cérébrale au cours d’une réponse de type allergique et favoriser à terme la mise au point d’immunothérapie permettant de mieux lutter contre les maladies neurodéveloppementales.
Procédures
Une injection (quelques secondes) sera réalisée aux souris 16h avant une autre injection (quelques secondes). Une laparotomie sur femelles gestantes (environ 45 min de chirurgie) sera réalisée sous. A leur réveil, de nouvelles injections seront réalisées 6h après l’intervention puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. 1 à 3 injections de quelques secondes seront réalisées en l’espace de 24h. Sur certains des animaux une injection supplémentaire de quelques secondes aura été réalisée 6 jours auparavant. Les animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte seront testés pour leur capacité cognitive (30min-1h/jour). Trois tests de 20min chacun seront réalisés, à raison d’un test maximum/jour sur une période d’1 à 3 semaines. A la fin de la procédure, dans les heures suivants la dernière injection ou plusieurs semaines plus tard, la procédure s’achèvera par une dernière injection. Des injections dans le cerveaux des nouveaux nés seront réalsiées. Une chirurgie terminale sans réveil sera réalisée (perfusion).
Impact sur les animaux
Les injections en elles-mêmes pourront causer un peu de stress aux animaux mais peu ou pas de douleur. L’induction d’une inflammation de type allergique par les molécules injectées pourront augmenter le niveau d’anxiété des animaux dans la première demi-heure après injection ainsi qu’une légère hypothermie avant de revenir à la normale au bout d’une heure. Les chirurgies pourront s’accompagner d’une douleur légère à modérée pendant 4 à 5 jours, d’un inconfort et d’une légère augmentation du stress des animaux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par à la fin de chaque procédure soit pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition, soit car les effets de la procédure que les animaux ont subie pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable/confondre les résultats de toute étude ultérieure.
Remplacement
Notre but est d’étudier comment certaines cellules agissent sur le développement du cerveau après la naissance. Le recours à l’animal est nécessaire car il n’existe aucun système in vitro qui puisse reproduire la complexité cellulaire de l’interface barrière du cerveau que nous étudions : les cellules étudiées sont en effet composées de plusieurs types cellulaires et tissus en intéraction. De plus, la fonction sécrétrice de l’épithélium des cellules étudiées est modulée par l’activation des cellules que nous cherchons à étudier varie avec l’âge et la réponse immunitaire locale et périphérique, et est spécifique de la première semaine après la naissance et ne peut être reproduites et étudiée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu dans ce projet se base sur notre précédente expérience et des tests statistiques. Un des tissus étudiés est très petit et ne peut être utilisé que pour une seule analyse à la fois. Les analyses de la composition d’autres tissus et zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les même animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte). Nous prévoyons pour chaque groupe de souris nouveau-nées 5 animaux par analyse, et 7 animaux adultes pour les tests de comportement, mâles et femelles. Des tripliquas d’expérience seront réalisés, à l’exception de certaines analyses pour lesquelles nous avons observé que 5 animaux par groupe permettaient l’acquisition de résultats significativement solides. Certaines études seront réalisées en comparant 5 stades de développement (5 variables). Les effectifs proposés (5x3 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet forte à très forte. L’étude de certains effets sur l’activité du cerveau sera réalisée selon les cas en comparant 2 variables (5x3 individus par groupe seront néecessaires) ; en comparant 4 variables et 6 variables (5x3 individus par groupe nouveaux nés ou 7x3 individus par groupe adulte seront nécessaires).
Raffinement
Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Des points limites spécifiques et précoces sont appliqués pour chaque protocole, pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, et nous rechercherons à minimiser la douleur par injection d’antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives car de nombreuses lignées sont disponibles et est génétiquement modifiable. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproduction facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le nombre des cellules étudiées évoluant après la naissance, nous étudierons leur phénotype à différentes périodes du développement post-natal, de la naissance à l’âge du sevrage : P0/P1, P6, P10, P15 et P21. Le phénotype induit par nos expériences n’est analysable qu’au minimum 6-7 jours après injection. Afin d’étudier l’effet sur le développement du cerveau, nous injecterons des souris embryonnaires au stade E14-15 afin d’en étudier les effets chez les souris âgées de 0 à 2 jours, puis chez l’adulte enfin d’en étudier les effets à long terme sur la fonction cognitive.
Test des candidats vaccins dans des modèles murins d’asthme allérgique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Trois vaccinations par injection et deux injections de sensibilisation sous anesthésie, trois prélèvements sanguins, puis trente minutes de mesure des capacités respiratoires : 7 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever leurs organes. Elles sont rendues allergiques puis traitées, afin de tester avant tout essai chez l'humain des vaccins d'immunothérapie contre l'asthme allergique. Le porteur ne détaille pas comment il arrive à 7 200 animaux et se borne à dire que l'effectif tient compte des paramètres analysés, des effets attendus et de la variabilité du modèle. Il décrit les nuisances au conditionnel, des douleurs locales de moins de cinq minutes et une gêne respiratoire qui pourrait durer moins d'une demi-heure, sans préciser ce que produit chez une souris une réaction asthmatique provoquée.
Objectifs
L'organisation mondiale de la santé a classé les maladies allergiques au quatrième rang mondial des affections, considérant que ces pathologies représentent un problème majeur de santé publique en termes de qualité de vie, de perte de jours de travail, de coût médicamenteux, voire de mortalité. Parmi les approches thérapeutiques proposées pour traiter les allergies respiratoires de type I, l’immunothérapie allergique est le seul traitement qui permet de réorienter la réponse du système immunitaire vers un état de tolérance spécifique de l’allergène. Le but du projet proposé est de permettre une évaluation préclinique de l’efficacité des vaccins thérapeutiques et de réaliser des tests de sécurité des produits en développement.
Bénéfices attendus
Ce projet, d'une durée de 5 ans va contribuer, avant toute étude clinique chez l’homme, à la sélection des principes actifs, et des modes d’administration qui composeront les vaccins du futur afin d’induire la tolérance vis-à-vis des allergènes responsables de la maladie chez les patients allergiques.
Procédures
Le projet comporte des gestes ou techniques expérimentales complémentaires. Des vaccinations par injection au nombre de 3 sous anesthésie flash d’une durée de moins de 5 minutes chacune sont réalisées. Une sensibilisation est obtenue par deux injections d’une durée de moins de cinq minutes chacune. Trois prélèvements de sang sous anesthésie sont aussi réalisés, la durée de chaque prélèvement ne dépasse pas quelques minutes. Des mesures des capacités respiratoires des animaux par des méthodes non invasives d’une durée de 30 minutes par protocole sont aussi effectuées pour vérifier l’efficacité des traitements utilisés
Impact sur les animaux
le projet comporte des gestes ou techniques expérimentales comme des traitements par injections dans les muscles et peuvent possiblement causer des douleurs locales d’une durée inférieur à 5 minutes, la mesure des capacités respiratoire des animaux peut possiblement engendrer du stress et une gêne respiratoire de courte durée (moins de 30 minutes). La contention des animaux pour traitement peut possiblement, aussi engendrer du stress de courte durée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés sous anesthesie terminale en fin de protocole pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Il est indispensable de recourir à un modèle animal car il est impossible de reconstruire un processus de sensibilisation/désensibilisation dans des cultures de cellules Seules les études in vivo permettent d'obtenir des résultats sur l'efficacité. Toutes les molécules étudiées ont été présélectionnées en amont avec des méthodes, biochimiques et des tests cellulaires in vitro
Réduction
Des pré-études de caractérisation et des tests in vitro de présélection sont réalisés en amont afin de ne tester sur les animaux que les formulations/traitements validés par ces pré-études. Si un principe actif ou une formulation ne satisfait pas aux exigences du cahier des charges, l’évaluation s’arrête ce qui aura pour conséquence de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’expérimentation. Les études publiées et les directives éthiques recommandent également de réduire au minimum le nombre d'animaux tout en garantissant la validité statistique. Le nombre d’animaux pour le projet a été déterminé en tenant compte des paramètres à analyser, des effets des traitements attendus et de la variabilités liée au modèles animaux, cela permet de s’assurer que l’on ne manque pas de puissance et de fiabilité pour ne pas à refaire les experiences.
Raffinement
Si au cours des experiences, des signes d’alerte, la surveillance sera accrue, les animaux seront pesés et des mesures correctives seront apportées : antalgiques s'il y a des signes de douleurs, séparation et soin local s’il y a des blessures entre congénères. Des anesthésies spécifiques sont utilisées pour limiter le stress et la douleur lors des injections et des prélèvements et des analgiques sont appliqués. Une grille de points limites, spécifique et suffisamment alerte et précoce est aussi élaborée, afin de limiter au minimum la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour ce type d’expérimentation parce que son système immunitaire, très bien décrit est très proche de celui de l’Homme en termes de composition et fonctionnement. Aussi, Il existe une bibliographie très riche sur les modèles d’étude de l’allergie et de son traitement sur laquelle nos protocoles, analyses et interprétations peuvent s’appuyer ; ces études sont reconnus par la communauté scientifique internationale. Nous traillons avec des animaux adulte afin d’étudier les réponses immunologiques sur un système immunitaire mature.
Exposition à la silice et induction d’autoimmunité systémique : modèle de sclérodermie systémique « Modification »
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Jusqu'à cinquante injections intradermiques d'acide hypochloreux à raison de cinq par semaine pendant dix semaines, ou vingt-six injections intrapéritonéales à raison de trois par semaine : 615 souris vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 120 d'entre elles, modéré pour 205 et sévère pour 290. Elles développent une fibrose de la peau au point d'injection et une fibrose pulmonaire, deux expositions respiratoires à de la silice cristalline ou à de la poussière de pierre artificielle leur étant imposées sous anesthésie, et 114 subissent une biopsie cutanée au poinçon de 5 mm. L'objet déclaré est d'obtenir un modèle murin de sclérodermie plus proche de la maladie humaine et de mesurer ce que fait la poussière des plans de travail aux personnes qui la respirent au travail. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, peau, rate, rein et cœur.
Objectifs
Ce projet a 2 grands objectifs qui sont les suivants: 1) optimiser le modèle de souris sclérodermique, qui à ce jour ne reflète pas entièrement la physiopathologie observée chez l’homme (inflammation, autoimmunité et fibrose cutanée et pulmonaire). Nous évaluerons ces paramètres physiopathologiques dans le nouveau modèle que nous proposons et qui sera induit dans des souris génétiquement susceptibles de développer une autoimmunité en présence de la protéine recombinante contre laquelle les auto-anticorps sont dirigés et de silice cristalline utilisée comme adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. En effet, les modèles murins actuels sont soit génétiques soit induits par injection de substances chimiques tels que l’acide hypochloreux (HOCl) ou la bléomycine (BLM); 2) évaluer si une exposition à la poussière de pierre artificielle contenant de la silice cristalline (poussière émise lors de la fabrication et la taille de plans de travail) favorise le développement d'une autoimmunité systémique (production d'anticorps auto-immuns) et si oui, évaluer si cette exposition favorise le développement de la sclérodermie systémique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront : 1) de disposer d’un nouveau modèle de souris sclérodermiques dans lequel seront retrouvés les grands paramètres qui définissent cette maladie : l'inflammation, l’autoimmunité et fibrose cutanée/pulmonaire ; cela permettra d’une part d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiopathologie de cette maladie et d’autres part de disposer d’un modèle pertinent pour tester de nouvelles thérapies; 2) d'évaluer l'importance du fond génétique des souris sur l'induction de la maladie; 3) d’évaluer les risques sur la santé d’une exposition à la poussière de pierre reconstituée à laquelle les travailleurs peuvent être exposés dans leur cadre professionnel et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets (autoimmunité, inflammation et fibrose). Ces informations pourraient à terme permettre de mieux informer les utilisateurs des risques encourus, de contribuer à mieux protéger les personnes exposées et à limiter l’utilisation de cette pierre artificielle.
Procédures
Des souris vigiles (n=100) seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 10 semaines maximum. Des souris anesthésiées (n=467) seront soumises à 2 expositions par voie respiratoire de NaCl ou de particules minérales à 15 jours d'intervalle). Des souris vigiles (n=290) seront soumises à 4 injections sous-cutanées (tous les 15 jours). Des souris vigiles (n=16) seront soumises à 2 injections intra-veineuse d'anticorps (une par mois). Des souris vigiles (n=258) seront soumises à 26 injections intra-péritonéales soit 3 fois/semaine. Des souris anesthésiées (n=114) auront une biopsie cutanée (punch de 5 mm).
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique d'acide hypochloreux (HOCl) peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois une plaie cutanée (au niveau du bas du dos). Les souris exposées à l'acide hypochloreux (HOCl) développent une fibrose cutanée au point d'injections (bas du dos) et une fibrose pulmonaire légère à modérée qui se développe à partir de la 3ième semaine. La fibrose induite est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Les souris exposées par instillations oropharyngées de silice cristalline (SiO2) développent une fibrose pulmonaire modérée qui s'étend à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Il n'a pas été décrit dans la littérature et nous n'avons pas non plus observé dans nos études antérieures de signes de difficulté ou de souffrances respiratoires dans ces deux modèles. Même si nous ne nous attendons pas à avoir d’inconfort ou de souffrance animale avec une exposition à la poussière de pierre artificielle (PA) nécessitant le recourt à des antalgiques, nous serons attentifs sur ce point. D'après la littérature, des injections sous-cutanées répétées à 15 jours d'intervalles n'ont pas non plus montré d'effets indésirables chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de trissus et d'organes (sang, poumons, peau, rate, rein et coeur).
Remplacement
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune (présence d’autoanticorps dans la circulation sanguine), complexe avec des manifestations dans plusieurs organes (peau et poumons majoritairement) qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est important d’avoir un modèle de souris sclérodermique qui se rapproche le plus possible de ce qui est observé chez l’homme (fibrose cutanée et pulmonaire, autoimmunité et inflammation) pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables et obtenir assez d'échantillons biologiques (tissus/organes) permettant de réaliser toutes les analyses biologiques et biochimiques nécessaire pour répondre à nos objectifs. Notre expertise et nos précédents projets sur ces modèles murins nous ont permis de dimensionner nos groupes d’animaux à 8-10 individus afin de garantir l’obtention de données exploitables et de réaliser toutes les analyses nécessaires sur les différents tissus qui permettront de caractériser l’effet thérapeutique obtenu et d’investiguer les mécanismes d’action du traitement testé. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre de 615 souris sera utilisé. Les statistiques seront réalisées à l'aide de tests non paramétriques de Mann et Whitney pour comparer des échantillons deux à deux et de Kruskal-Wallis pour comparer un nombre quelconque d'échantillons.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et de leur permettre de se construire un « nid ». Selon les procédures, un suivi comprenant une évaluation de leur posture et locomotion et de leur comportement (expression faciale) sera réalisée soit au minimum 3 fois/semaine (procédures N° 2, 3 et N°4) soit 5 fois/semaine (Procédures N°1 et N°5) et permettra de contrôler leur état de santé. Le suivi du poids sera également réalisé une fois par semaine. Ces informations sont consignées dans un tableau ou grille de score, et ce suivi hebdomadaire des signes cliniques permettra d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux et à l’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre les effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte des adultes.
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Vingt prélèvements sanguins, un par semaine pendant vingt semaines, et jusqu'à quatre séries d'injections dans les deux muscles des pattes pour chaque souris. 1 840 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs organes et y doser les vecteurs. Ces vecteurs synthétiques doivent transporter des ARN messagers codant des anticorps, avec l'idée de faire produire le traitement par l'organisme lui-même. Le porteur annonce un "tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies", alors que le projet en est à comparer l'efficacité de formulations chez la souris.
Objectifs
La prévention et le traitement des maladies infectieuses ainsi que le développement d’alternatives au antiviraux chimiques limités pourraient voir le jour sur la base de la production d’anticorps neutralisant directement par l’organisme ouvrant ainsi un nouveau paradigme en biothérapie. Le développement d'une plateforme universelle d’ARNm codant pour ces anticorps permettrai de concevoir rapidement des traitements antiviraux, et ainsi d'offrir des solutions thérapeutiques plus confortables et plus efficaces pour les patients et à moindre coût. Cette approche pourrait être un tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies. Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs synthétiques est un élément indispensable à son succès car les molécules d’ARN sont incapables de franchir la membrane cellulaire, étape pourtant indispensable pour la production de la protéine correspondante. Les avancées récentes dans la chimie des vecteurs synthétiques ont permis le développement de vecteurs composés de polymères ou lipides, et qui possèdent des caractéristiques permettant d’envisager le transfert d’acides nucléiques (ARNm) avec des efficacités similaires à celles obtenues avec des vecteurs d’origine virale. Cela permet d’envisager simplement l’utilisation de ce type de vecteur à des fins de vaccinations, ou afin d’induire la production de protéines thérapeutiques in vivo. Les objectifs de ce projet sont de poursuivre l’optimisation de vecteurs synthétiques existants et la découverte de nouveaux, d’optimiser leur développement en évaluant l’efficacité (par dosage dans le sang et les tissus) des vecteurs pour le développement de traitements antiviraux à base d’anticorps produits directement dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra de poursuivre la caractérisation et l’identification des vecteurs synthétiques de nouvelles générations efficaces, simples et non-toxiques. Également, cela permettra d’évaluer l’efficacité de ces vecteurs synthétiques dans le cadre du développement d’alternatives aux anti-viraux chimiques pour lutter contre les maladies infectieuses. - Long terme : en cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des maladies infectieuses ou toute maladie nécessitant la production d’un anticorps thérapeutique, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables et ii) le développement de méthodes de prévention d’infection non chimiques qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels tout en préservant l’environnement de l’accumulation de métabolites chimiques dans l’environnement et (iii) limiter l’utilisation d’antibiotiques qui induisent des résistances. L’impact du succès de ce projet serait de proposer une approche ARNm universelle, immédiatement disponible pour toutes les indications thérapeutiques, offrant une réponse biologique robuste et facilement industrialisable grâce à un outil standardisé et unique quel que soit le produit
Procédures
Les animaux subiront des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie gazeuse de l'animal, placé sur tapis chauffant. La procédure durera moins de 5 min. Au maximum 4 séries d'injections intramusculaires dans les 2 muscles par souris espacées d’au moins 3 jours. Des prélèvements de sang seront également effectués sur animal anesthésié. Des prélèvements sanguins sont prévus avant l'injection puis 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude pour un durée totale de 20 semaines, soit 20 prélèvements sanguins en tout. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus à l’injection ou aux prélèvements de sang. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une inflammation au site de prélèvement sanguin, une léthargie…. Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Inflammation transitoire au niveau du site d’injection; 2) Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang; 3)- Risque infectieux lié à la réalisation du geste invasif (injection et prélèvement).
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs évalués in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, la meilleure efficacité de transfection étudiée ici correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur, donc seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer leur efficacité. En outre, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN dans des cellules en culture, ni même des organoïdes. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteurs a été récemment validée et qui a fait l’objet d’un développement préclinique réglementaire dont le plan d’étude a été validé par l’ANSM et les résultats présentés également à l’ANSM démontrant aucune toxicité ni mortalité.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité autant que possible tout en garantissant l’obtention de résultats interprétables, afin d’éviter la nécessité d’une étude supplémentaire. Un premier criblage in vitro a permis de ne retenir que les vecteurs les plus efficaces. En tenant compte de la variabilité attendue des réponses, un maximum de 10 animaux par groupe a été prévu. Ce seuil permet d'assurer la pertinence des analyses et la fiabilité des comparaisons, tout en respectant le bien-être animal. Le nombre a été déterminé à partir de données historiques et d’une approche statistique, et l'utilisation de chaque animal a été optimisée grâce à des mesures longitudinales et à des études pilotes. L’effectif sera revu à la baisse si les résultats préliminaires d’efficacité le permettent, en visant des données cohérentes et reproductibles entre les individus.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement - tube, frisotis, dôme, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins. Dans le cas de l'observation d'un inconfort liée aux injections intramusculaires, une injection de buprénorphine sera effectuée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sera effectué une fois par semaine. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors des prises de sang), et les injections seront réalisées sous anesthésie et les animaux positionnés sur tapis chauffant.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont été validés in vivo sur la souris. De plus, cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets des vecteurs chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté à aux vecteurs étudiés mais concernera quasi exclusivement des souris adultes d’environ 8 à 10 semaines pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux.
Étude de facteurs de sensibilité aux encéphalites à JEV (Japanese Encephalitis Virus)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une injection intrapéritonéale de virus de l'encéphalite japonaise, à forte dose : 202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne pendant cinq jours. Deux lignées portent des mutations trouvées chez des enfants atteints d'encéphalite grave, et le projet cherche à savoir si ces mutations aggravent l'infection, le virus se répliquant notamment dans le système nerveux central. Le porteur classe la sévérité globale comme modérée tout en annonçant des symptômes neurologiques sévères possibles, dont une paralysie des membres postérieurs, et se limite pour tout raffinement à des gels hydriques, une réhydratation, du chauffage des cages et de l'enrichissement.
Objectifs
Les encéphalites virales chez les enfants sont un problème majeur de santé publique dans la région Asie-Pacifique. Des altérations de la réponse immunitaire semblent entrainer une sensibilité accrue au développement de symptômes neurologiques sévères. Le but de ce projet est d'étudier deux mutations conduisant à l'inactivation de deux protéines distinctes, retrouvées chez des patients souffrant d’une encéphalite au virus de l'encéphalite japonaise afin de savoir si elles sont potentiellement impliquées dans la sévérité de la maladie. L’étude in vivo des infections invasives au virus de l’encéphalite japonaise nécessite un modèle murin pour évaluer l’impact de ces deux mutations génétiques sur la sévérité de l’infection. En effet, le virus est capable d’induire des symptômes sévères et des séquelles à long terme du fait de son neurotropisme, chez la souris comme chez l'homme. Nous utiliserons deux lignées de souris distinctes, dans lesquelles les mutations dans les deux gènes d'intérêt empêcheront la synthèse des protéines à étudier. Lors de l’infection des souris par voie intrapéritonéale, le virus va se disséminer dans la circulation sanguine et se répliquer dans différents tissus notamment le système nerveux central, permettant un suivi de l'infection dans les souris porteuses des mutations comparées aux souris contrôle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise en évidence de facteurs de sensibilité dans le cadre d’encéphalites causées par le virus de l’encéphalite japonaise.
Procédures
Certains animaux recevront une injection quotidienne intrapéritonéale pendant 5 jours (1 injection dure quelques secondes). Les souris recevront une injection intrapéritonéale de virus le jour de l’infection, (1 fois pendant quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré́ de sévérité global dû à l'infection est considéré́ comme modéré pour les animaux contrôle et génétiquement modifiés. Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des procédures expérimentales présentes dans ce projet : • La piqure de l’aiguille lors des injections intrapéritonéales pourra entrainer une douleur faible et de courte durée (quelques secondes) • Du fait des fortes doses de virus injectées dans les souris contrôles et des mutations induites dans les lignées génétiquement modifiées, les animaux seront potentiellement plus sensibles à l’infection et pourront développer des symptômes neurologiques sévères (paralysie des membres inférieurs…).
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort soit pour pour des analyses ex-vivo ou par ce qu’ils sont infectés par le virus de l’encéphalite japonaise.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence des gènes conduisant à une plus grande sensibilité vis à vis de l'infection. Il est encore impossible de reproduire in vitro la complexité de l’organisme et le rôle du système immunitaire. Si des phénotypes sont obtenus dans le modèle murin (sensibilité ou non à l'infection) alors des études sur des cellules en culture (i.e. culture et infection de cellules cérébrales humaines in-vitro) ou des organes sur puce (i.e. développement d’un modèle de « organ on chip ») pourront être effectuées pour caractériser les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie. Ce modèle permet une alternative aux modèles historiques d’études des infections humaines que sont les primates non-humains. En proposant comme alternative la souris, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées grâce à des analyses de variance et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Notre expérience sur la procédure mise en œuvre dans ce projet nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle. Les animaux ne pourront pas être réutilisés puisqu’il est nécessaire de les mettre à mort pour prélever différents tissus.
Raffinement
Des signes cliniques spécifiques et précoces sont définis pour éviter toute souffrance inutile. Des aliments appétents (gel hydrique), la réhydratation, le chauffage des cages ou le renforcement de l’enrichissement sont mis en place pour améliorer le bien-être des animaux infectés.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée. Leur système immunitaire est proche du système immunitaire humain, ce qui facilite l’étude physiopathologique du virus. Elles ont déjà été utilisées pour étudier l'infection qui fait l’objet de ce projet. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre de générer des souches ayant les mêmes mutations que celles mises en évidence chez l’humain et donc d’étudier la sensibilité des ces souches au virus. Les animaux seront utilisés à l’âge de 12 semaines, car à l’âge adulte les souris non génétiquement modifiées sont résistantes à l’infection tandis que les souris modifiées génétiquement sont potentiellement sensibles. Pour voir si les gènes étudiés augmentent la sensibilité à l’infection il est essentiel que les animaux du groupe non génétiquement modifié soient plus résistants que les animaux modifiés génétiquement.
Analyse de la réponse immunitaire, de la protection contre l’infection et de la stabilité d’un candidat vaccin universel antigrippal dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
992 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Toutes reçoivent deux vaccinations intramusculaires dans les pattes sous anesthésie, à vingt et un jours d'intervalle, et 37,5 % d'entre elles sont infectées par le virus de la grippe par inhalation sous anesthésie profonde, puis pesées chaque jour pendant quatorze jours. Le porteur indique que la dose élevée de virus peut provoquer une perte de poids marquée et des signes cliniques, et que les animaux sont mis à mort soit à l'atteinte d'un point limite, soit en fin d'étude pour les prélèvements. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la physiologie d'un "organisme entier" et que le recours à la souris est "nécessaire" pour satisfaire les exigences réglementaires.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aigue, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux circulant dans le monde. Elle provoque chaque année environ 1 milliard de cas, 3 à 5 millions de cas graves (infections respiratoires entraînant des hospitalisations), et entre 300 000 et 650 000 décès particulièrement chez les individus vulnérables (personnes âgées, les enfants et immunodéprimés). Les souches responsables de la grippe, principalement de type A ou de type B, peuvent coexister sur une saison, ce qui rend le taux d’incidence annuel imprévisible. La vaccination reste à ce jour la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle agit en induisant des réponses immunitaires contre la souche virale circulante, ciblant les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins présentent une efficacité limitée : ~32 % pour les personnes âgées et ~43% pour les personnes adultes. Cette efficacité réduite s’explique en partie par les mutations très fréquentes, diminuant la correspondance entre le vaccin en cours et la souche circulante. D’autre part, le virus de la grippe renferme une protéine interne, hautement conservée entre les différentes souches virales. Cette caractéristique fait d’elle une cible pertinente pour de nouveaux vaccins universels capables d’induire des protections plus durables et plus efficace, notamment en cas de pandémies. L’objectif est de renforcer l’efficacité en testant de nouveaux candidats, ciblant la protéine interne, chez la souris. Cela se fait via deux axes principaux : élargir la couverture vaccinale en ciblant simultanément les souches A et B, et renforcer la réponse immunitaire grâce à l’ajout d’un adjuvant. Le second axe vise à étudier si une réponse immunitaire préexistante, induite par des expositions antérieures aux virus grippaux, peut améliorer ou modifier la réponse à une vaccination contre la grippe. Ce projet vise ainsi à contribuer à la mise au point d’un vaccin plus performant et mieux adapté aux défis épidémiologiques posés par la grippe.
Bénéfices attendus
Contrairement aux protéines de surface du virus de la grippe qui mutent souvent, la protéine interne, située à l'intérieur du virus, est beaucoup plus conservée entre les différentes souches de grippe. Cette faible variabilité fait d’elle une cible intéressante pour le développement de vaccins à large spectre, pouvant offrir une protection universelle contre diverses souches grippales contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre d'autres sous types de la maladie actuellement présents chez les espèces aviaires, ayant le potentiel de provoquer une nouvelle pandémie. Le bénéfice attendu du projet est donc d’accroître l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et de garantir une préparation optimale en cas de future pandémie grippale. À l’issue de ces recherches, le candidat-vaccin entrera en phase clinique chez l’humain, avec pour objectif de diminuer la mortalité et l’incidence des formes graves de la grippe, apportant un bénéfice majeur à la santé publique.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 vaccinations, réalisées par voie intra musculaire dans les pattes sous anesthésie générale légère. Ces injections sont espacées de 21 jours et chaque injection dure quelques secondes. Au moment de la mise à mort, un prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie générale légère dans 3 procédures sur 4 (81% des animaux). Les infections virales (représentant 37,5% des animaux) sont réalisées par inhalation et sous anesthésie profonde par injection. Cette injection est réalisée en quelques secondes, 1 seule fois par souris. L’infection est réalisée en quelques minutes pour chaque souris, afin de garantir la réussite du geste et la sécurité de l’animal. Les souris infectées seront pesées tous les jours sur une période de 14 jours.
Impact sur les animaux
Le geste de l'immunisation intramusculaire peut entrainer une douleur locale mais temporaire suite à l’injection. Les formulations utilisées sont à base de solution saline et les volumes injectés limitent fortement les risques de souffrance. L’infection virale par inhalation peut provoquer un stress léger et transitoire. 2 doses de virus seront utilisées en fonction des expériences : - une dose faible à laquelle une légère perte de poids peut être observée dans les quelques jours suivant l’infection, paramètre qui sera surveillé. - une dose élevée pouvant entrainer une perte de poids plus importante avec des signes cliniques (modification du comportement et altération de l’aspect physique. Une surveillance quotidienne rigoureuse sera mise en place pour minimiser la souffrance animale
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mis à mort soit après atteinte d'un point limite défini dans le protocole, soit en fin d'étude pour les prélèvements post mortem nécessaires. Cette approche garantit le respect du bien-être animal tout en se conformant aux exigences réglementaires post-exposition.
Remplacement
La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire dans différents organes de la souris. Aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique. Des études de remplacement sont en cours de développement, mais cela ne permet pas mimer la physiologie d’un organisme entier. L’utilisation de la souris s’avère donc pertinent et est même nécessaire afin de satisfaire les exigences réglementaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est basé sur nos études antérieures et des approches statistiques, afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables et robustes, permettant de détecter des différences significatives entre les groupes. Au sein d’une même procédure, plusieurs candidats vaccins seront testés en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux du groupe contrôle. Le nombre d’animaux estimé correspond au nombre maximum d’animaux pouvant être utilisé dans ce projet. Cependant, durant tout le long du projet, en fonction des résultats obtenus à chaque procédure ou chaque temps points, les nombre d’animaux pourront être réduits et certains temps points supprimés.
Raffinement
Les souris seront acclimatées au minimum durant une semaine avant le début d’une procédure. Dans l’ensemble de nos groupes expérimentaux, un enrichissement de l’environnement est systématiquement mis en place dans les cages des souris afin d’améliorer leur bien-être. Cet enrichissement comprend, par exemple, l'ajout de maisonnettes en carton, de morceaux de bois, ainsi que d'autres éléments favorisant l'expression des comportements naturels des animaux. Ces mesures visent à diminuer le stress et à promouvoir un état émotionnel positif tout au long de l’étude. La vaccination est réalisée dans les pattes de la souris sous anesthésie légère, afin de limiter le stress lié à la préhension et la piqure. Les infections virales par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde. Des surveillances régulières sont assurées après les différentes études de pré-infection ou d’infection. Suivant l’infection, des croquettes et de l’eau pourront être mises à disposition dans la cage pour faciliter leur accessibilité. Une eau gélifié contenant l’équivalent nutritifs des croquettes pourra être utilisé comme substitut et déposé directement dans la cage. Enfin, au moment de l’euthanasie, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie locale (Collyre anesthésique local) et sous anesthésie gazeuse pour minimiser toute sensation de douleur.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques d’autant plus que notre équipe maîtrise les outils et méthodes associés. Le modèle murin est par ailleurs largement documenté dans la littérature, ce qui nous permet de situer et de comparer nos résultats aux données existantes. Cette espèce offre donc tous les critères requis pour atteindre nos objectifs et mettre au point de nouvelles formulations vaccinales contre les infections grippales. Les animaux âgés de 5 semaines seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Nous allons donc utiliser des animaux sevrés de 6 semaines (jusqu’à 12 semaines si besoin). Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge-là et non vieillissant.