Troubles immunitaires

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est infecté par le virus de l'immunodéficience simienne, puis subit une quinzaine d'anesthésies générales, une quinzaine de prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse et environ sept ablations chirurgicales de ganglions lymphatiques, avec un hébergement individuel une fois infecté. Le porteur attend de l'infection une perte de poids, des diarrhées, une chute des lymphocytes, des nodules palpables et des lésions cutanées, et prévoit de compléter l'alimentation si les anesthésies répétées coupent l'appétit. Il affirme que le macaque est le seul modèle animal reproduisant la maladie humaine et qu'il n'existe "pas d'autre modèle animal" pour le sida, l'objectif restant de comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires échouent à contrôler le virus.

Objectifs

Malgré des décennies de recherche, il n'existe toujours pas de vaccin ni de traitement curatif contre le VIH/SIDA. Pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans le contrôle de l'infection, nous utilisons deux modèles animaux primates non humains (il s’agit d’animaux d’élevage) infectés par le virus d’immunodéficience simienne (VIS) : • Le singe vert d’Afrique, naturellement infecté par le VIS sans développer la maladie, • Et le macaque cynomolgus, chez qui l’infection par le VIS est pathogène, comme chez l’humain. Un intérêt particulier est porté à un type de cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles (NK, natural killers), qui jouent un rôle crucial dans la réponse antivirale, notamment au sein des tissus lymphoïdes secondaires . Ces tissus, comme les ganglions ou la rate, sont les lieux stratégiques où les cellules immunitaires se rencontrent et s’activent pour organiser la défense de l’organisme. Parmi ces cellules, on retrouve les cellules T, des globules blancs spécialisés qui reconnaissent spécifiquement un agent infectieux et coordonnent la réponse immunitaire. Tout comme elles,ces cellules NK peuvent acquérir des caractéristiques de mémoire et s'adapter fonctionnellement. Il a été d’ores et déjà montré chez le singe vert d’Afrique que les cellules NK adaptatives fortement différenciées se développent dans les tissus lymphoïdes secondaires et contribuent à un contrôle efficace du virus. Il n’y a pas de contrôle chez le macaque cynomolgus. Pour comprendre l'absence de contrôle du virus chez ce dernier, cette étude sera menée sur six macaques infectés par le VIS. Cette étude se concentre sur l’analyse de la charge virale ainsi que l’évaluation de l’ensemble des caractéristiques phénotypiques, tel que leur apparence ou les molécules présentes à leur surface et fonctions des cellules NK dans divers tissus. L’objectif global est de comprendre les conditions qui favorisent ou empêchent la génération de cellules NK efficaces, et d’identifier des éléments précis du système immunitaire sur lesquels on peut agir afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur le modèle macaque vise à mieux comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, sont dysfonctionnelles et incapables de contrôler l'infection par le virus VIS, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur ce modèle, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles sont régulées. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules dans l’infection. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui pourraient rendre ces cellules NK particulièrement efficaces pour éliminer les cellules infectées. Nos résultats pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus VIS (une fois, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection: Perte de poids, diarrhée, baisse importante des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’ablation de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où sont activées les cellules NK.

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le modèle primateest, pour toutes ses similarités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que celui-ci. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est pathogène, comme chez l’humain, nous permet d'analyser et de comparer, en absence de traitement, les réponses cellulaires dans différents tissus en plus du sang, notamment la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, l’intestin, le foie et la rate qui jouent un rôle dans la pathogenèse. Le modèle du macaque cynomolgus permet donc d’analyser les interactions hôte/virus dans des contextes contrôlés (virus, timing) facilitant ainsi l’identification des caractéristiques propres à l’organisme qui influencent sa réponse face au virus. Par ailleurs, seul le modèle animal permet d’analyser les interactions virus/hôte dès les premiers jours post-infection (période qui généralement est impossible à étudier chez l’humain infecté par le VIH), or il est connu que les temps précoces suites à l’infection sont fortement impliqués dans la régulation des réponses immunes et l’établissement des réservoirs viraux. Il est donc très important d’étudier cette période précoce pour mieux comprendre les facteurs responsables de l’induction d’un contrôle viral efficace.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale avec un soutien thermique pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (patés pour singe, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. En cas d’apparition de réaction locale, un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe. Les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Le macaque est le seul modèle animal, qui, lorsqu’il est infecté par le SIV présente une physiopathologie comparable à celle observée chez l’humain infecté par le VIH. C’est le modèle animal le plus pertinent pour étudier et comprendre les mécanismes de transmission du virus et de développement du SIDA chez l’Humain. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier pourquoi le système immunitaire est dysfonctionnel pour lutter contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

60 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à douze injections d'une protéine musculaire accompagnée d'un adjuvant, en quatre points du corps et à trois reprises espacées de quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer une nécrose ou un durcissement de la peau, et que les souris développent pendant douze semaines une faiblesse musculaire et une mobilité réduite. Un électromyogramme sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal closent l'étude, avant la mise à mort de tous les animaux pour collecte des organes. Le projet construit le modèle de myasthénie MuSK qui servira ensuite à sélectionner des médicaments, et le porteur présente comme un bénéfice pour les souris le fait d'améliorer les conditions de l'expérience qu'il leur impose.

Objectifs

La Myasthénie Gravis (MG) est une maladie auto-immune qui perturbe la communication entre les nerfs et les muscles, qui a pour conséquence une faiblesse musculaire et une fatigabilité impactant fortement la qualité de vie des patients pouvant aller jusqu’à l’isolement social. L’incidence de cette maladie est estimée entre 3 et 28 personnes sur 1 million avec plus de 700000 patients atteints dans le monde. Les traitements actuels sont essentiellement des immunosuppresseurs qui nécessitent des mois de traitements et qui sont souvent associés à des effets secondaires lourds. De plus, 10 à 15% des patients sont résistants à ces traitements. La MG est causée par la production d'auto-anticorps attaquant les molécules de la jonction neuromusculaire, perturbant la transmission des signaux entre nerfs et muscles. La plupart des patients produisent des auto-anticorps contre le récepteur de l’acétylcholine (AChR), mais certains présentent des auto-anticorps ciblant la kinase spécifique du muscle (MuSK), essentielle pour une bonne communication nerveuse et musculaire. Ce projet vise à développer un modèle de MG forme MuSK chez la souris, car aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité biologique de cette pathologie. Le projet consiste à administrer aux souris tout ou une partie de la protéine MuSK pour que leur système immunitaire produise des anticorps contre cette protéine, perturbant ainsi la communication nerf/muscle et reproduisant la pathologie observée chez les patients. Pour induire une réaction immunitaire, un adjuvant est ajouté, optimisant la production de ces auto-anticorps. Les études réalisées dans le cadre de ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes en fin d’étude pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces études seront réalisées sur des souris génétiquement modifiées ou non pour un gène/cible d’intérêt impliqué dans la maladie. Nous prévoyons une étude de mise au point du modèle en comparant le protocole bibliographique à un protocole apportant des améliorations éthiques (adjuvant) (36 souris). Dans un second temps nous souhaiterions adapter ce protocole sur une souris génétiquement modifiée (sans phénotype dommageable) d’intérêt pour un de nos projets et tester l’intérêt d’immuniser avec tout ou partie du domaine extracellulaire de la protéine MuSK (24 souris) soit 60 souris au total pour ce projet.

Bénéfices attendus

Dans le processus de développement d’un nouveau médicament, ce type d’étude se fait après des tests en laboratoire sur des cellules et des simulations informatiques. L'objectif est de mettre au point un modèle murin de MG forme MuSk en apportant des améliorations éthiques au protocole de référence. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Affiner le modèle de la pathologie MG forme Musk sur les souris, en réduisant au maximum leur souffrance et en améliorant les conditions des expériences. 2. Proposer un modèle permettant de sélectionner les médicaments qui ont un effet positif sur les mécanismes de la MG forme Musk, avant de passer aux essais cliniques, et offrir ainsi une nouvelle option de traitement.

Procédures

- Immunisation par l’agent inducteur (protéine + adjuvant) de la pathologie/du modèle : l’immunisation se fait 4 fois par jour (4 injections à 4 sites différents), 1 jour toutes les 4 semaines, et cela jusqu’à 3 fois, moins de 30 secondes pour chacune des 4 injections - Administration d’un anti-douleur au préalable des immunisations par l’adjuvant le nécessitant (30 secondes par administration) - Prélèvement de sang (faible volume, moins de 30 secondes) avec une fréquence en accord avec les recommandations de la structure de Bien-Etre Animal : jusqu’à 3 prélèvements sur les 13 semaines que dure l’étude - Electromyogramme (étude de la fonction des nerfs et des muscles) sous anesthésie générale avec utilisation d’électrodes musculaires réalisé une seule fois par souris (en fin d’étude) - Prélèvement de sang terminal sous anesthésie générale et analgésie (une seule fois, 30 secondes) - Pour la 2ème phase du projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées élevées et commercialisées par un éleveur : préalablement à leur expédition dans notre établissement utilisateur, elles auront eu un prélèvement de tissus (biopsie de l’extrémité de la queue) pour confirmer leur modification génétique.

Impact sur les animaux

Selon les données de la littérature, les nuisances estimées sont les suivantes : 1. Administration de peptide avec adjuvant (4 sites d’administration, jusqu’à 3 jours d’immunisation espacés de 4 semaines) : moins de 30 secondes par injection, 3 fois. Risque de nécrose ou durcissement de la peau (douleur modérée) dans les jours suivant les administrations et dépendant du type d’adjuvant (risque accru avec l’adjuvant de l’article de référence pondéré par l’administration préventive 5 minutes avant d’un antalgique). 2. Prélèvements de sang : 30 secondes maximum 3 fois. Stress et douleur ponctuels (douleur légère). 3. Développement de myasthénie gravis sur maximum 12 semaines : Faiblesse musculaire et réduction de la mobilité (souffrance modérée), sans atteindre des signes cliniques sévères 4. Electromyogramme : 5 électrodes sous anesthésie gazeuse en fin d’étude : Stress léger (une fois, 10 minutes) 5. Prélèvement de sang terminal sous anesthésie et analgésie : Sans réveil, donc sans douleur post-procédure.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus nécessaires pour les analyses in vitro des échantillons (immunohistochimie, etc) nécessaires à la caractérisation complète du modèle.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. Néanmoins, l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est pas possible de modéliser complètement in vitro, c’est pourquoi nous souhaitons établir ce modèle vivo.

Réduction

Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, et un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour de futures études (sur une nouvelle DAP ultérieurement). La technique de micro-prélèvement décrite en 5.10.3 pour réaliser les prélèvements sanguins permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet.

Raffinement

Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique de micro-prélèvements de la souris, réalisable plusieurs fois sur un même animal en respectant les bonnes pratiques, les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. L’adjuvant de référence (dont le but est d’activer le système immunitaire et le rendre plus sensible à l’agent qui va induire le modèle) sera associé à l’administration d’un antidouleur 5 minutes avant l’administration de l’adjuvant. Nous évaluerons cependant un second adjuvant, jamais utilisé dans ce modèle, mais connu pour être mieux toléré, dans l’optique de raffiner ce modèle. L’alternative d’immunisation en sous cutanée dans le mollet plutôt que dans la voute plantaire sera mise en place dès la première étude afin de diminuer le risque de douleur. Des points limites spécifiques à ce modèle ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

L’espèce murine est exclusivement utilisée dans la bibliographie pour reproduire ce type de pathologie de par sa transposition à l’homme et la possibilité d’utiliser des souris transgéniques permettant d’évaluer la cible humaine. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle (en comptant les premières étapes de pesées avant le début d’induction de la pathologie à 8 semaines).

Une chirurgie d'une heure et demie sous anesthésie interrompt puis rétablit l'irrigation du cœur de chaque animal, suivie de six injections d'analgésique sur trois jours. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leur cœur soit récupéré et analysé. Le projet cherche à préciser le rôle des macrophages dans la cicatrisation du muscle cardiaque après un infarctus, et notamment dans la résorption de la cicatrice. Le résumé décrit jusqu'à sept injections d'un "produit non douloureux" sans dire lequel, et justifie les effectifs par l'expérience antérieure de l'équipe sans donner de calcul ni de nombre d'animaux par groupe.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier la phase de cicatrisation du muscle cardiaque à la suite d’un infarctus du myocarde en s’intéressant plus particulièrement au rôle des macrophages, une population de cellules immunitaires impliquée à la fois dans l’élimination des cellules lésées et dans les mécanismes de réparation tissulaire. Si la cicatrisation constitue, en principe, un processus bénéfique visant à restaurer l’intégrité tissulaire, elle peut également avoir des effets délétères sur l’organe concerné. Dans le contexte de l’infarctus du myocarde, la formation initiale de la cicatrice permet de contenir les dommages ; toutefois, à long terme, elle peut évoluer vers une fibrose pathologique, caractérisée par le remplacement progressif du tissu musculaire par un tissu fibreux non contractile. Ce remodelage fibrotique altère la fonction cardiaque et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Plus l’étendue de la fibrose est importante, plus la perte de fonction myocardique est sévère. On sait que les macrophages jouent un rôle essentiel, généralement bénéfique, à la fois dans les premières étapes de la cicatrisation, mais aussi dans la phase de résorption du tissu cicatriciel et dans la limitation de la fibrose. Notre objectif est de mieux comprendre, dans le détail, le rôle exact de ces cellules et leur mécanisme d’action. + Quelle est l’importance réelle des macrophages dans la cicatrisation du myocarde à la suite d’un infarctus ? + Les macrophages ne formant pas une population parfaitement homogène, quelles sont les caractéristiques de ceux impliqués dans la résorption de la cicatrice ? + Quels sont les mécanismes cellulaires intervenant dans la résorption de la fibrose par les macrophages ? Ces connaissances fondamentales pourraient, à terme, être appliquées à des objectifs médicaux comme la mise au point de traitements des séquelles cicatricielles de l’infarctus du myocarde.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous approfondirons notre compréhension du rôle des macrophages dans la cicatrisation cardiaque post-infarctus. Nous nous attacherons notamment à distinguer les fonctions spécifiques des macrophages adultes par rapport à celles des macrophages résidents d’origine embryonnaire. Cette étude nous permettra de préciser leur implication non seulement dans le processus de cicatrisation initiale, mais également dans la résorption de la cicatrice, la revascularisation des tissus lésés, ainsi que dans la modulation de l’hypoxie cellulaire associée. Bien que ce projet relève, pour l’instant, principalement de la recherche fondamentale, il s’inscrit clairement dans une perspective médicale. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la guérison du cœur après un infarctus pourrait, à long terme, nourrir des approches plus appliquées en recherche clinique. Actuellement, l’intervention médicale post-infarctus repose essentiellement sur une prise en charge rapide, visant à limiter les lésions aiguës. Cependant, si la cicatrisation qui s’ensuit est indispensable à court terme, elle peut engendrer des effets délétères à long terme, notamment par l’excès de tissu fibreux non contractile. Notre étude pourrait ainsi contribuer, à terme, au développement de stratégies thérapeutiques destinées à contrôler l’extension du tissu cicatriciel et à favoriser la régénération d’un myocarde fonctionnel.

Procédures

1) Injection de produit non douloureux (quelques secondes par animal) entre une et 7 fois (sur une période de 10 jours) 2) Injection de produit non douloureux (une minute par animal) 2 injection 30 mn et 5 mn avant la mise à mort 3) Intervention chirurgicale sous anesthésie provoquant un infarctus cardiaque transitoire. Fréquence et durée :intervention unique, d’environ 1 heure 30 minutes par souris 4) Injections d’analgésie : 6 injections sur 3 jours (toutes les 12 heures) en post-opératoire sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les injections même lorsqu’elles sont répétées, n’entraînent qu’une gêne légère et de courte durée pour les animaux, les produits administrés n’étant pas douloureux. Concernant les interventions chirurgicales, l’ischémie induite au cours de l’intervention est transitoire, et les animaux récupèrent rapidement, généralement dans les 24 heures suivant la chirurgie, sans signes de pathologie ni de souffrance post-opératoire. En conclusion, l’ensemble des procédures envisagées n’induiront qu’un inconfort modéré et transitoire, maîtrisé par des mesures adaptées d’analgésie et de soins post-opératoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer et analyser le cœur.

Remplacement

L’étude du fonctionnement du cœur et des mécanismes de cicatrisation après un infarctus ne peut être réalisée que sur l’animal vivant, aucun modèle in vitro ne permettant, à ce jour, de reproduire de façon fiable la complexité de ces processus. Il n’existe pas non plus de système artificiel capable de refléter fidèlement le fonctionnement global du système immunitaire d’un organisme adulte. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour cette recherche. Il permet de reproduire de manière réaliste l’interruption de l’irrigation cardiaque, le microenvironnement tissulaire post-lésionnel, ainsi que la réponse immunitaire, à la fois locale et systémique, impliquant le recrutement cellulaire via la circulation sanguine. Ce modèle offre également la possibilité d’étudier directement les interactions entre les macrophages et d‘autres cellules cardiaques.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en s’appuyant sur notre expérience antérieure ; - en fonction de la nature des expériences et des paramètres à mesurer, - en tenant compte de la variabilité attendue de ces paramètres. En particulier, les résultats obtenus lors d’un précédent projet ont montré que les différences observées entre les lots contrôles et expérimentaux étaient importantes et permettaient l’utilisation d’un nombre relativement restreint d’animaux pour chaque lot. Ceci permettra de produire des résultats fiables et interprétables, avec une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Pour la chirurgie, outre l’anesthésie, une analgésie sera effectuée par injection juste avant l’opération et durant les 72 heures suivant l’opération pour limiter au maximum les douleurs post-opératoires. Le réveil se déroulera en cages individuelles, au calme. La cage sera munie d’un tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie post-opératoire. Du gel alimentaire sera ajouté dans la cage pour faciliter la prise alimentaire durant les premiers jours suivant la chirurgie. Les animaux seront suivi de manière régulière pour évaluer leur état de santé. Des points limites spécifiques et précoces seront estimés (apathie, perte de poids, aspect du pelage) pour permettre une intervention rapide afin d’éviter ou de minimiser la douleur, si nécessaire.

Choix des espèces

- Les souris sont des petits mammifères qui partagent de nombreuses similarités avec l’homme. - Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux - On peut utiliser des individus de lignées consanguines, ce qui permet une meilleure homogénéité dans nos populations, et on peut trouver d’énormes bases de données (ex : génétiques) et utiliser de nombreux réactifs spécifiques de cette espèce (ex : anticorps). - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les macrophages. - Les procédures chirurgicales, y compris les médicaments les plus efficaces (anesthésiques et analgésiques) et les doses à injectées, sont parfaitement connus. L’étude des effets de l’infarctus dans les différentes conditions expérimentales se fera à l’âge adulte (après 6 semaines). Le but est de produire un modèle proche de la pathologie humaine qui est une maladie de l’individu adulte. Chez la souris, la maturité sexuelle est atteinte à environ 6 semaines, cet âge est donc considéré comme le début de l’âge adulte.

Rasées sur le dos, puis enduites chaque jour pendant cinq jours d'une crème qui provoque rougeurs, épaississement de la peau et desquamation, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la peau et des organes. Vingt d'entre elles sont gavées trois jours de suite, quarante reçoivent des injections quotidiennes d'un anticorps ciblant la molécule CD146 ou d'un placebo. Le projet cherche à savoir si cette molécule intervient dans le psoriasis et si la bloquer soulage la maladie, ainsi que l'athérosclérose qui l'accompagne souvent. Le porteur cite des études cliniques déjà menées sur des patients psoriasiques, les juge descriptives, et affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'animal" pour étudier cette maladie.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la physiopathologie du psoriasis et à évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Bénéfices attendus

Plusieurs études cliniques portant sur des patients psoriasiques ont été menées antérieurement pour évaluer les niveaux d’expression de la molécule d'adhésion cellulaire CD146/MCAM sur des biopsies de peau, quantifier les concentrations de sa forme soluble dans le sang ou pour étudier les différentes sous-populations leucocytaires exprimant ce marqueur cellulaire dans le sang. Cependant, ces études restent descriptives et ne permettent pas d’évaluer le rôle du CD146 global, du CD146 endothélial ou du CD146 exprimé par certaines cellules du système immunitaire sécrétrices de la cytokine proinflammatoire interleukine 17 dans la pathogenèse du psoriasis. Contrairement à notre projet qui compare des souris mutées ou non pour CD146, ces études ne permettent pas d’étudier les voies de signalisation régulées par CD146. De plus, ces études cliniques n’ont pas évalué l’effet de thérapies ciblant CD146. Ainsi, ce projet permettra d'identifier des mécanismes moléculaires régulés par CD146 dans la pathogenèse du psoriasis. Il permettra aussi d'évaluer dans un modèle murin le bénéfice thérapeutique d'anticorps monoclonaux ciblant CD146 pour traiter le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Procédures

Tous les animaux du projet seront rasés une fois sur le dos (2 minutes par souris). Ils recevront un traitement sous la forme d'une application quotidienne de crème sur le dos pendant 5 jours (30 secondes par application). 20 souris seront gavées avec une solution diluée dans de l'huile de maïs une fois par jour pendant 3 jours (30 secondes par gavage). 40 souris recevront des injections quotidiennes d'un traitement ciblant CD146 ou un placebo pendant 5 jours (30 secondes par injection). Un prélèvement sanguin sera effectué sur toutes les souris (30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

20 souris seront gavées une fois par jour pendant 3 jours avec une solution à base d'huile de maïs. Bien que le gavage ne soit pas douloureux, cela pourrait tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de sa répétition et de la contention. Les souris seront rasées sur le dos, ce qui pourrait générer un stress. L'application d'un traitement à base de crème sur la peau des souris pour induire le psoriasis devrait entraîner une inflammation associée à à l'apparition de rougeurs, un épaississement de la peau et une desquamation en plaques. Ce traitement peut entraîner une déshydratation et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions l'implication de la molécule d'adhésion cellulaire CD146, également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la pathogenèse du psoriasis. Cette pathologie autoimmune implique différents types cellulaires (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, cellules du système immunitaire), avec de nombreuses interactions biochimiques et cellulaires. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle in vitro, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier cette maladie.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires pour générer les effectifs de chaque groupe utilisé dans les procédures expérimentales, nous utiliserons des souris issues d'accouplements homozygotes et nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles, le psoriasis touchant chez l'humain autant les hommes que les femmes. En l'absence de toute étude antérieure sur le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 dans le psoriasis chez la souris, nous évaluerons son implication dans cette pathologie en comparant des groupes de 10 souris entre eux, effectif minimal déterminé par une approche statistique pour mettre en évidence de potentielles différences significatives.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux issus des établissements d'élevage. Les souris seront observées avant d’initier le protocole et les animaux présentant des symptômes type infection seront écartés des protocoles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés. Les animaux seront pesés une fois par jour et observés deux fois par jour pour prévenir tout risque de déshydratation liée à leur traitement. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement. Les animaux disposeront de nestlets, nids à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l ’environnement et matériaux de nidification, ainsi que de tunnels afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, sa manipulabilité génétique permet d'analyser l'effet de mutations du gène cible sur la pathogenèse du psoriasis. La souris permet également d'évaluer l'effet d'un traitement thérapeutique ciblant une protéine d'adhésion cellulaire potentiellement impliquée dans le psoriasis et une comorbidité associée, l'athérosclérose. Les souris utilisées seront âgées entre 8 et 16 semaines. Un âge compris entre 8 et 16 semaines est couramment utilisé dans la littérature pour ce modèle induit de psoriasis car l'épaississement de l'épiderme, l'érythème et la desquamation sont clairement visibles à cet âge là. De plus, cette tranche d'âge a permis de mettre en évidence dans plusieurs études les effets thérapeutiques chez la souris de différents traitements utilisés pour soigner le psoriasis chez l'homme.

2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une réaction allergique leur est provoquée, avec une inflammation locale ou généralisée, un inconfort respiratoire transitoire et une baisse de la température corporelle mesurée trente minutes après chaque administration d'antigène, puis elles reçoivent des substances une à deux fois par semaine pendant cinq à huit semaines et subissent deux à trois prélèvements sanguins. La mise à mort sert à prélever poumons, intestin, peau et ganglions, le porteur indiquant que ces analyses ne peuvent pas être faites sur des animaux vivants. L'objet reste l'optimisation d'une molécule immunomodulatrice, dont il compare plusieurs versions pour la rendre "plus facile à produire", tout en affirmant qu'aucune alternative au modèle murin n'est disponible et que la souris demeure "incontournable".

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre et d’optimiser une approche innovante pour traiter les allergies. Il repose sur trois grands axes : 1.Observer comment une molécule testée agit sur certaines cellules du système immunitaire, en particulier celles qui fabriquent les anticorps. 2.Vérifier si cette approche pourrait prévenir ou soulager les différents allergies, en l’essayant dans différents modèles d’allergie chez la souris. 3.Améliorer cette stratégie en comparant plusieurs versions de la molécule, pour la rendre plus efficace, mieux tolérée, plus stable dans le temps et plus facile à produire.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’explorer une approche immunomodulatrice innovante dans un contexte allergique, et de caractériser de manière approfondie les mécanismes immunitaires sous-jacents, afin de mieux comprendre leur implication dans l’efficacité thérapeutique. Ces pathologies, en forte augmentation dans les pays industrialisés, touchent aujourd’hui jusqu’à 30 à 40 pourcents de la population mondiale et représentent un fardeau important en termes de santé publique et de coût socio-économique (arrêts de travail, baisse de qualité de vie, consommation de soins). En étudiant les effets immunologiques de cette approche, notamment sur la production d’anticorps et la régulation de la réponse immunitaire, ce projet a pour objectif d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus efficaces, mieux tolérées et adaptées aux besoins des patients allergiques. Les retombées attendues concernent principalement la santé humaine, avec un potentiel impact à long terme sur la prévention et la prise en charge des maladies allergiques. Ce projet contribue également à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation immunitaire, ce qui pourrait bénéficier à d’autres pathologies inflammatoires ou auto-immunes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions non chirurgicales, réparties sur plusieurs semaines selon le modèle expérimental. Celles-ci incluent des administrations de substances (1 à 2 fois par semaine, quelques minutes, sur une période totale de 5 à 8 semaines, sur animaux vigiles ou sous anesthésie courte), la mesure des paramètres respiratoires (1 fois pendant le projet, environ 20 minutes, sur animaux vigiles avec contention douce) et des prélèvements sanguins (2 à 3 fois par animal sur l’ensemble du protocole, environ 5 minutes, sur animaux vigiles).

Impact sur les animaux

L’induction d’une réaction allergique chez les souris peut provoquer une réponse inflammatoire locale ou généralisée, pouvant entraîner une gêne physique passagère, ainsi qu’un état temporaire de mal-être. Selon le modèle allergique utilisé, cette réaction peut également s’accompagner d’un inconfort respiratoire transitoire. Par ailleurs, cette phase d’induction est susceptible de provoquer une baisse modérée de la température corporelle (stress thermique), nécessitant une surveillance spécifique. Les nuisances attendues incluent le stress lié à la contention temporaire nécessaire pour les injections et administrations, ainsi qu’à la réalisation de mesures de paramètres respiratoires. Ces manipulations peuvent entraîner un inconfort transitoire, sans conséquences durables pour les animaux. Les prélèvements sanguins répétés, indispensables pour le suivi de la réponse immunitaire, peuvent occasionner une douleur brève ainsi qu’un risque localisé d’irritation ou d’hématome. La contention temporaire nécessaire à ces procédures est également susceptible de générer un stress ponctuel, en raison de la restriction de mouvement qu’elle implique.

Devenir

À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet, qui nécessitent l’étude fine des organes impliqués dans les réponses allergiques (poumons, intestin, peau, ganglions, etc.). Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.

Remplacement

La souris est un modèle valide en immunologie et particulièrement dans les études visant à mieux décrire les mécanismes modulant la réponse immunitaire. Aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'est disponible pour cette recherche. Avant d’avoir recours à l’expérimentation animale, des approches alternatives ont été utilisées en amont du projet, notamment des cultures cellulaires et des tests de stimulation in vitro pour étudier certaines voies de signalisation. Ces modèles ont permis de mieux cibler les conditions expérimentales, de réduire le nombre d’animaux nécessaires et d’optimiser les doses utilisées. Toutefois, ces approches ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale d’une immunothérapie ou l’impact d’une modulation immunitaire dans le cadre d’une pathologie systémique comme l’allergie. La souris a donc été retenue comme modèle, en raison de sa pertinence en immunologie et de la disponibilité de lignées transgéniques bien caractérisées, qui permettent une exploration fine des mécanismes impliqués. Ainsi, malgré les efforts de remplacement mis en œuvre, l’utilisation d’un modèle murin reste à ce jour incontournable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, un total de 2064 souris est prévu sur une durée de 5 ans. Ce nombre représente le minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en respectant le principe de réduction inscrit dans la règle des 3R. Le nombre d’animaux par groupe expérimentale a été défini à partir de calculs de puissance statistique, en se basant sur les données issues de nos travaux antérieurs, afin de garantir une puissance suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures de réduction ont été mises en œuvre : Optimisation des protocoles expérimentaux à partir de données issues de cultures cellulaires et d’études préliminaires in vitro. Planification raisonnée des groupes expérimentaux, en tenant compte à la fois de l’objectif scientifique et des contraintes de stabulation. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux impliqués, sans compromettre la validité scientifique des résultats attendus.

Raffinement

Des mesures spécifiques sont appliquées à chaque étape du protocole pour réduire douleur, stress et souffrance. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, incluant l’observation du comportement dans l’environnement habituel afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Lors de la phase d’induction allergique, une chute de température corporelle pouvant survenir (stress thermique), une mesure systématique est réalisée 30 minutes après l’administration de l’antigène. Un suivi clinique quotidien est effectué. Des critères d’arrêt stricts sont définis. Les prélèvements sanguins répétés sont réalisés à l’aide de techniques peu invasives, et la contention est brève et maîtrisée afin de minimiser la gêne. Les animaux sont hébergés en groupe dans des portoirs ventilés, à température et hygrométrie contrôlées, avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, et un cycle lumineux de 12 heures par jour. L'environnement est enrichi. L’ensemble de ces mesures vise à réduire au strict minimum les contraintes imposées aux animaux, en garantissant leur bien-être tout en assurant la fiabilité et la qualité des données expérimentales. Les procédures peuvent générer un inconfort passager lié à la contention ou aux manipulations, sans effets durables. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel expérimenté, dans des conditions visant à limiter le stress et à préserver le bien-être des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet se justifie par son statut de modèle validé en immunologie, particulièrement adapté aux études portant sur les mécanismes de régulation du système immunitaire et le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie. La souris offre une excellente reproductibilité des résultats, grâce à sa standardisation génétique, à la disponibilité d’outils immunologiques spécifiques, et à l’existence de nombreux modèles expérimentaux bien caractérisés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte jeune, entre 6 et 8 semaines d’âge. Ce choix correspond à un stade de développement où le système immunitaire est pleinement mature, ce qui est essentiel pour étudier les réponses immunitaires induites dans le cadre du projet.

1 214 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 24 injections dans l'abdomen et 40 gavages sur deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent deux instillations dans la gorge sous anesthésie, un prélèvement sanguin, une séance d'imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements. Le porteur indique que le modèle peut provoquer des atteintes cutanées à partir de quatorze semaines, puis une perte de poids et une mobilité réduite, pour étudier une sclérodermie déclenchée par la silice. Toutes sont tuées afin de prélever sang, poumon, rate et peau, une partie l'étant simplement faute de porter le génotype recherché.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques. Une partie des animaux seront euthanasiés car sans génotype d'intérêt.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.