Troubles immunitaires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation des effets de candidats médicaments dans un modèle murin d’encéphalite auto-immune expérimentale.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 014 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 840 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir deux administrations du candidat médicament par jour pendant 25 jours et jusqu'à trois ponctions de liquide céphalo-rachidien espacées de sept jours. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injections sous-cutanées et intraveineuses, ce qui déclenche une paralysie progressive partant de la queue vers les membres postérieurs, avec une perte de poids atteignant 30 % dans les cas les plus sévères. S'y ajoutent des prélèvements sanguins hebdomadaires ou quotidiens et quatre tests comportementaux répétés jusqu'à six fois, dont la durée va d'une minute à quatre heures, sans que leur nature soit précisée. Les bénéfices annoncés portent sur une meilleure compréhension de la sclérose en plaques "à moyen terme", quand la paralysie et les prélèvements incompatibles avec la survie sont, eux, programmés.
Objectifs
La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux centrale (SNC) et qui touche environ 1,8 million de personnes dans le monde selon l’organisation mondiale de la santé. Cette maladie, qui touche souvent les jeunes entre 25 et 35 ans, est connue comme la deuxième cause d’handicap acquis chez les jeunes adultes, après les traumatismes. La SEP se caractérise par la dégradation de la gaine de myéline, qui entoure et isole les fibres nerveuses dans le système nerveux central et qui permet la transmission des signaux nerveux entre les neurones, provoquant des inflammations au niveau des zones endommagées du SNC (plaques ou lésions) et menant ainsi à des perturbations cognitives, émotionnelles, motrices, sensitives ou visuelles. Jusqu’à nos jours aucun traitement ne parvient à guérir de la sclérose en plaque. Toutes les approches thérapeutiques existantes visent à limiter l’intensité et la fréquence des poussées inflammatoires et à soulager les symptômes. Le but de ce projet est de développer, chez la souris, un modèle d’Encéphalite Auto-immune Expérimentale (EAE) devant mimer la forme récurrente-rémittente de la SEP, qui est la forme la plus fréquente chez l'Homme caractérisée par des épisodes intermittents d’apparition de symptômes (poussées), suivis par des périodes plus ou moins longues d’absence de crises cliniques (rémissions), pour ensuite tester de nouvelles approches thérapeutiques qui peuvent être prometteuses dans le traitement de la SEP.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont, à moyen terme, une meilleure compréhension des mécanismes d’action impliqués dans la SEP et le développement de nouvelles molécules et approches thérapeutiques pour traiter cette maladie (= démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée (EAE) et évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phase clinique).
Procédures
Pour l’induction de la SEP, les animaux endormis recevront une ou deux injections en sous-cutané (moins d'une minute) et deux injections abdominales, en intraveineux, après l’induction (jour 0 et jour 2, moins d'une minute). Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (1-2 minutes environ) sur 25 jours pmaximum avec deux administrations maximum par jour. Les prélèvements sanguins répétés seront réalisés sur animaux vigile (environ une minute), à raison d’un prélèvement hebdomadaire ou quotidien en fonction du volume prélevé. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien (liquide dans lequel baigne le cerveau) après endormissement de l'animal (20 minutes) maximum 3 fois au cours de l'expérimentation avec 7 jours d'intervalle minimum. Des tests comportements seront réalisés au cours de l’expérimentation (un passage /test/ stade de développement de la maladie) qui peuvent durer entre 1 minute et 4h. Sur chaque groupe d'animaux, 4 tests maximum seront réalisés et répétés au maximum 6 fois.
Impact sur les animaux
L’induction d’une EAE consiste à déclencher une réaction immunitaire au niveau du système nerveux central avec apparition d’une paralysie progressive mais transitoire allant de la queue vers les membres postérieurs puis dans de rares cas vers les membres antérieurs. Cette procédure engendre, un affaiblissement de l’animal avec une perte de poids transitoire dès le début de l’apparition des symptômes (J9-J10) pouvant atteindre dans les cas les plus sévères jusqu’à 30%. D'autres nuisances sont possibles, en effet, lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie ou l'administration d'un candidat médicament, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. De plus, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, prélever du sang, du liquide céphalo rachidien, administrer les composés à tester et de réaliser les tests de comportement peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.
Devenir
Mise à mort des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe et des fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou mise à mort des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le développement de la maladie ou par le(s) produit(s) testé (s).
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la sclérose en plaque (modèle d’Encéphalite Auto-immune Expérimentale), Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 15 / par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera assuré par un ensemble de mesures visant à optimiser le bien-être animal et à minimiser toute forme de contrainte. Tout d’abord, des procédures rigoureuses seront mises au point et le personnel impliqué recevra une formation spécifique afin de garantir la fiabilité des pratiques et la qualité des soins. L’état de santé des animaux fera l’objet d’un suivi quotidien, permettant une détection précoce d’éventuels signes cliniques et une prise en charge rapide en se basant sur une grille de score définie. L’accès à l’eau et à la nourriture sera facilité (croquettes mouillées, tétine longues, etc) et placé dans les cages. Les interventions expérimentales reposeront sur des techniques aussi peu invasives que possible, et des points limites clairement définis permettront de décider rapidement du recours à une euthanasie lorsque cela s’avérera nécessaire. Par ailleurs, les méthodes d’analyse seront optimisées afin de limiter le volume sanguin prélevé, grâce à une amélioration de leur sensibilité. Le recours à l'anésthésie permettra de diminuer la douleur ressentie lors de certains actes et de réaliser de façon plus précise et plus rapide certains prélèvements biologiques. Enfin, une familiarisation progressive des animaux aux procédures expérimentales sera réalisée, dans le but de réduire leur appréhension et d’améliorer leur confort tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est l’une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Amélioration de la compatibilité donneur/receveur dans un modèle de greffe rénale
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux opérations chirurgicales à une semaine d'intervalle, dix prises de sang et neuf prélèvements d'urine sur animal éveillé : 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont les niveaux de souffrance déclarés vont du léger au sévère, une partie des animaux étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. Une partie est tuée pour fournir des lymphocytes, une autre, transgénique, pour donner son rein, les dernières recevant la greffe puis le traitement à évaluer. L'objet déclaré est de valider une protéine chimérique censée bloquer le rejet humoral et élargir l'accès à la transplantation. Le porteur annonce des complications sévères possibles, mauvaise cicatrisation, saignement, infection du site de greffe, tout en affirmant que le rejet lui-même n'est pas douloureux "étant donné que le greffon n'est pas innervé".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque, respiratoire ou rénale terminale constituent des problèmes majeurs de santé publique. La transplantation d’organe est le meilleur traitement, car elle permet d’améliorer la qualité et la durée de vie des patients. Cependant, la morbidité et la mortalité des patients transplantés restent élevées. Cela s’explique notamment par une forme particulière de rejet d’organe, le rejet humoral. Ce dernier est causé par les lymphocytes B qui produisent des anticorps contre les protéines du donneur, exprimées à la surface des cellules de l’organe transplanté. Certains patients possèdent déjà des anticorps contre ces protéines avant la transplantation, parce qu’ils ont été exposés à du matériel génétique étranger à l’occasion d’une transfusion, d’une grossesse ou d’une précédente transplantation. Ces anticorps préexistants compliquent l’accès à la transplantation pour de nombreux patients. Certaines protéines du donneur, très répandues dans la population, sont souvent en cause, car elles sont communes à une grande partie de la population. Actuellement, la seule prise en charge possible de cette immunisation du receveur contre les protéines du donneur repose sur une immunosuppression globale, visant toutes les sous-classes des lymphocytes. Cette immunodépression massive expose le receveur à un haut risque d’infections et de cancers. En outre, certaines cellules productrices d’anticorps ne peuvent pas être ciblées par les thérapeutiques actuelles, ce qui explique l’efficacité médiocre des protocoles existants. Nous avons donc développé une nouvelle protéine chimérique qui permettrait de cibler toutes les populations de lymphocytes B de façon antigène-spécifique, tout en épargnant les lymphocytes qui ne sont pas impliqués dans la production des anticorps contre les protéines du donneur. Notre preuve de concept est que ce traitement avec la protéine chimérique est capable de cibler cette population cellulaire délétère dans un modèle murin d’immunisation in vivo. Dans la continuité de ce projet, nous allons étudier l’efficacité du traitement pour inhiber la réponse humorale et cellulaire contre le greffon dans un modèle murin de transplantation rénale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront mise à mort pour prelever leur organes (cellules ou rein) pour la greffe ou pour l’analyse après opération.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra la validation préclinique d’une nouvelle thérapie moléculaire visant à prévenir et à traiter le rejet humoral, afin de faciliter l’accès à la transplantation pour les patients sur liste d’attente.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Souris donneuses de Lymphocytes B : 2 injections (15 secondes) et deux prélèvements sanguins (15 secondes) sur souris vigile. - Souris receveuse de lymphocytes B et greffe de rein : 1 injection de cellules (30 seconds), 4 injections de protéine chimérique (15 seconds), 10 prises de sang (10 seconds) et 9 prises d’urines (10 seconds) sur souris vigile, 2 opérations chirurgicales à une semaine d'intervalle (20 minutes chaque opération).
Impact sur les animaux
La greffe d’un organe vascularisé est une procédure délicate. Des complications engendrant des nuisances sévères éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure de greffe, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe. Ensuite, la complication attendue en cas de rejet du greffon est la perte de fonctionnalité de celui-ci, éventualité qui sera monitorée régulièrement et entrainera la fin de la procédure expérimentale. Ce phénomène de rejet de greffe, en l’absence de complications, n’est pas douloureux pour l’animal, étant donné que le greffon n’est pas innervé.
Devenir
Dans le projet décrit, les souris seront reparties ainsi: - 1ere procédure : les souris seront utilisées pour générer les lymphocytes dirigés vers une protéine du complexe majeur d'histocompatibilité humaine et vers l'ovalbumine. Ces souris seront mises à mort pour purifier le lymphocyte à transférer. - 2ème procédure : Souris transgéniques seront mise à mort pour donner leur rein. - 3ème procédure : Souris receveuse de lymphocytes B immunisants et puis de la greffe de rein. Elles seront mises à mort à la fin de l’expérimentation pour analyse ou lors d'un point limite.
Remplacement
Le rejet humoral nécessite le contact entre la circulation sanguine du receveur et le système vasculaire du donneur. Cette interaction ne peut être étudiée in vitro, et nous ne pouvons pas nous affranchir d’un modèle murin pour aller plus loin dans notre étude préclinique.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire et en utilisant des données préliminaires
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 ou 5 selon leur poids et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis. Une attention particulière sera portée au suivi des souris greffées (poids, protéinurie) et à la zone de chirurgie. Lors des chirurgies, les animaux sont injectés avec de la solution saline pour prévenir la déshydratation et un analgésique pour prévenir au mieux les douleurs inhérentes à la procédure de chirurgie. L’ensemble de la procédure de chirurgie est réalisé sur tapie chauffant et avec un champ opératoire et une désinfection préalable et post-chirurgie avec un antiseptique. Lors des mises à mort, une injection préalable de tranquillisant est réalisée pour limiter le stress au moment de la dislocation.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Il s'agit d'un prérequis indispensable à toute application de nos approches à l’Homme. De plus, l'utilisation de souris permet l'accès aux modèles transgéniques qui, ici, nous permettent de répondre à des questions précises. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
Etude de la réponse immunitaire adaptative dans un modèle murin de colite
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Croisées pour être dépourvues de lymphocytes T et B tout en développant une colite chronique à partir de huit semaines, les souris de ce projet sont 1 764, dont 1 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une bague auriculaire et une biopsie de la queue pour le génotypage, et plusieurs centaines subissent des injections répétées de sérum, d'anticorps ou de cellules, avec prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur indique que l'inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou un prolapsus rectal, et que certains traitements testés pourraient l'aggraver. Les souris gardées pour la reproduction sont tuées à huit mois pour renouveler les accouplements, celles dont le génotype ne convient pas à six semaines.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies qui se traduisent par une inflammation durable du côlon, dont les causes exactes restent encore mal connues. Le système immunitaire pourrait jouer différents rôles dans ce contexte : il pourrait être responsable d’une réaction excessive contre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin, mais aussi, au contraire, contribuer à limiter leur passage dans les tissus lésés et à réguler l’intensité de l’inflammation. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires, en particulier des lymphocytes T et B, dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale. Pour cela, nous allons créer un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées. Objectif 1 : Développer des modèles de souris qui présentent une colite avec ou sans système immunitaire adaptatif. Cela permettra de comparer directement l’influence de ce système sur la maladie. Chez les animaux dépourvus de ce type de défense, il sera possible de réintroduire des éléments du système immunitaire (anticorps ou cellules) afin d’évaluer leur rôle. Objectif 2 : Étudier plus particulièrement le rôle des anticorps dans le développement de la colite et tester l’effet de traitements basés sur leur administration. Pour cela, des souris dépourvues de réponse immunitaire adaptative seront reconstituées avec différents composants issus d’animaux immunocompétents, et l’effet de l’injection d’anticorps sera analysé selon différents modes d’administration. Objectif 3 : Évaluer l’impact d’une réponse immunitaire dirigée contre les bactéries intestinales. L’expérience consistera à stimuler le système immunitaire des souris avec des éléments du microbiote afin de voir comment cela influence l’évolution de la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre le rôle du système immunitaire adaptatif dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin à travers la réalisation et l’exploitation d’un nouveau modèle expérimental murin. Ce modèle servira aussi à explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Par exemple, nous évaluerons l’effet de l’injection d’anticorps humains déjà utilisés en clinique dans d’autres maladies, afin de voir s’ils limitent le passage des bactéries et l’inflammation intestinale. Nous comparerons aussi leur efficacité selon différentes modalités d’administration. Enfin, nous testerons une stratégie vaccinale innovante visant à “éduquer” le système immunitaire contre des composants bactériens, dans l’objectif de réduire l’inflammation et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou de futurs marqueurs biologiques utiles pour le suivi des MICI.
Procédures
Tous les animaux (1764 souris) auront une bague auriculaire et une unique biopsie caudale pour le génotypage. Ces gestes, très courts (quelques secondes) sont réalisés sur animal vigile. Quatre-vingts souris recevront deux injections de sérum à 7 jours d’intervalle sous anesthésie légère. L’injection dure environ 5 minutes. Cent-vingt autres souris recevront pendant 5 jours consécutifs une injection d’anticorps sans anesthésie. Chaque injection dure 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés chez ces animaux vigiles. Ce type de prélèvement dure 5 minutes au maximum. Une injection de cellules sera réalisée sur 140 autres animaux légèrement anesthésiés. Un prélèvement sanguin sera aussi réalisé sur ces mêmes animaux vigiles. Deux cents autres souris recevront 3 injections de 200µl de composés à 4, 6 et 8 semaines de vie. Ces injections se feront sur animaux vigiles et durent 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés avant l’immunisation et 1 semaine après la dernière injection chez tous ces animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris dépourvues de défenses immunitaires présentent un risque accru d’infections. Toutefois, elles seront élevées dans des conditions protégées et conformes à la réglementation, dans un environnement exempt de pathogènes, ce qui limite fortement ce risque et ne provoque pas de souffrance particulière dans ces conditions. En revanche, les souris utilisées pour mimer la maladie développent une colite chronique à partir d’environ 8 semaines d’âge. Cette inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou, plus rarement, un prolapsus rectal. Dans ces cas, les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections nécessaires au projet durent moins de 5 minutes et n’entraînent qu’une gêne légère et transitoire liée à la piqûre. Les traitements dureront de 10 jours à 16 semaines en fonction des procédures appliquées. Certains traitements testés pourraient améliorer l’inflammation, tandis que d’autres pourraient l’aggraver en accélérant son apparition et/ou en augmentant son intensité. Pour cette raison, les animaux recevant un traitement feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’intervenir en conséquence.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 5 « génotypage » restent en vie à l’issue de la procédure. A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux ayant le génotype d’intérêt serviront pour la reproduction et l’entretien des lignées et pour certaines autres procédures. Les animaux en reproduction seront euthanasiés à l’âge de 8 mois afin de renouveler les accouplements. Les animaux de génotype inadéquats, donc inutilisables, seront euthanasiés à 6 semaines. Les animaux des autres procédures seront euthanasiés à la fin de l’étude pour réaliser les prélèvements.
Remplacement
Le système immunitaire adaptatif est un processus complexe impliquant différents types de cellules (par exemple, les lymphocytes T et B) qui interagissent entre elles et avec d’autres cellules pour déclencher ou réguler l’inflammation. Dans les maladies intestinales, cette inflammation résulte aussi de relations encore mal connues entre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin (le microbiote), les cellules de la paroi intestinale et les défenses immunitaires. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites uniquement par des expériences en laboratoire sur cellules isolées ou par des modèles informatiques. La création d’une nouvelle lignée de souris combinant deux modèles existants offrira donc une opportunité unique pour analyser plus en détail le rôle du système immunitaire adaptatif dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une gestion rigoureuse des programmes de reproduction. Les croisements seront organisés de manière à obtenir prioritairement les génotypes utiles pour les expériences, tout en réduisant au maximum la naissance d’animaux porteurs de caractéristiques susceptibles d’altérer leur bien-être. Une attention particulière sera portée au suivi des nouveaux génotypes afin d’évaluer précocement leur état de santé et leur qualité de vie, conformément aux recommandations européennes. Pour les expériences, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 10. Ce choix correspond aux standards de la littérature scientifique et permet de tenir compte de la variabilité biologique naturelle, tout en garantissant une solidité statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Cette approche évite de multiplier inutilement le nombre d’animaux en cas d’études inconcluantes, et respecte ainsi le principe de réduction parmi les 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer).
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués progressivement à l’expérimentateur, grâce à une routine d’élevage et à des manipulations douces et régulières, afin de réduire leur stress. Leur hébergement sera enrichi de matériel pour la construction de nids, favorisant leur confort. L’élevage sera maintenu à l’état hétérozygote pour limiter l’apparition d’animaux présentant des caractéristiques potentiellement dommageables. Pour les souris immunodéficientes, un environnement protégé et conforme à la réglementation sera assuré. Les cages seront changées dans des conditions stériles afin de réduire le risque de contact avec des agents infectieux. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés pour garantir le maintien de ces conditions sécurisées. Chez les animaux développant une colite, une surveillance quotidienne sera effectuée par du personnel formé, avec une pesée bihebdomadaire et une observation attentive des signes cliniques (perte de poids, modifications du comportement, état du pelage, posture, cris ou blessures). Les cages de ces animaux présentant une colite seront nettoyées plus fréquemment pour préserver leur confort. Si des signes de souffrance apparaissent, des mesures adaptées de prise en charge de la douleur seront mises en place. En cas de mauvaise tolérance ou de souffrance importante, le protocole expérimental sera interrompu, et les animaux concernés seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car ses mécanismes immunitaires sont très proches de ceux de l’Homme. De plus, des lignées génétiquement modifiées ciblant des gènes clés impliqués dans la réponse immunitaire adaptative et dans le développement de l’inflammation intestinale sont disponibles. Le croisement de ces deux lignées permettra d’obtenir des animaux dépourvus de lymphocytes T et B et susceptibles de développer une colite similaire à celle observée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La souris est également l’espèce la mieux adaptée aux conditions d’élevage de notre animalerie, ce qui permet d’assurer leur bien-être tout en réalisant des expériences scientifiquement pertinentes. Les expériences seront menées sur des souris sevrées, âgées d’au moins 4 semaines. Au-delà de 4 semaines le système digestif et le système immunitaire sont suffisamment matures pour les études prévues. L’âge auquel les animaux seront euthanasiés pour l’analyse des résultats dépendra du type d’expérience réalisée. Cette décision sera basée sur les données de la littérature scientifique et/ou sur les observations préliminaires obtenues lors des procédures expérimentales, afin de garantir la pertinence scientifique tout en minimisant la souffrance animale.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la cytokine IL-34 humaine dans des modèles de maladies inflammatoires chroniques chez la souris NSG humanisée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de système immunitaire fonctionnel par construction génétique, les souris NSG utilisées ici reçoivent des cellules humaines qu'elles ne peuvent pas rejeter. 280 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Irradiation sur animal vigile, injection intraveineuse de cellules humaines, prélèvements sanguins derrière l'orbite de l'œil toutes les deux semaines, instillation intra-rectale d'un mélange de produits, pose de mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale, le suivi courant de la cinquième à la vingtième semaine de vie. Le porteur conclut que le passage à ces animaux dits humanisés est "indispensable" pour évaluer une molécule dont les essais sur cellules humaines ont déjà donné, selon lui, des résultats prometteurs.
Objectifs
L'objectif est d’étudier l’effet thérapeutique d’une molécule régulatrice afin d'approfondir notre compréhension des mécanismes d’action de cette molécule sous sa forme native et de les comparer à des formes modifiées dans des modèles de maladies inflammatoires, dont la composante immunitaire est bien décrite. Ce projet fait suite à de précédents travaux au sein de notre équipe et vise ici à tester la meilleure molécule modifiée et ses versions améliorées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule humaine dans de nouveaux modèles de maladies inflammatoires, ainsi que de confirmer les résultats obtenus précédemment par l’équipe en testant notre molécule modifiée favorite ainsi que ses formes améliorées et optimisées pour une possible utilisation en clinique.
Procédures
Irradiation des souris vigiles (1 fois, 3 minutes/souris) ; Injection des cellules humaines par voie intraveineuse sur souris vigiles (1 fois, 5 minutes/souris) ; Prélèvements sanguins des souris sous anesthésie gazeuse (2 fois les 3-4 premiers mois puis tous les deux semaines, 5 minutes/souris) ; Instillation de mélange de produits en intra-rectal sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes/souris) ; Injection des traitements en intraveineuse (1 fois, 5 minutes/souris) ou en intra-péritonéale (1 fois/jour pendant 10 jours, 2 minutes/souris) sur souris vigiles ; Mise en place des mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés 1. À l'injection de cellules humaines (douleur) ; 2. A l’injection intra-rectale d’un mélange de produits (douleur) ; 3. Intervention chirurgicale pour la mise en place de mini-pompes sous la peau (douleur, saignement) 4. Injection des traitements en intraveineuse ou intra-péritonéale ; 5. Au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l'œil (douleur, saignement). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) et/ou analgésie (pré et post-opératoire pour les mini-pompes) pour pallier aux différentes douleurs rencontrées par les animaux, même si elles peuvent néanmoins conduire à une douleur légère et de courte durée, ainsi qu'à un stress.
Devenir
A la fin de l’expérience, tous les animaux seront autopsiés afin d’effectuer des prélèvements d’organes/tissus ce qui justifie l’euthanasie de chaque souris.
Remplacement
Malgré des résultats prometteurs dans les études fonctionnelles in vitro de la molécule native et des molécules modifiées sur cellules humaines, ceux-ci sont limités par l'absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire. Le passage aux modèles in vivo chez des animaux dit « humanisés » (proche de l’homme, car mimant le système immunitaire humain) est indispensable pour évaluer l’effet de cette molécule humaine et de ces nouvelles formes modifiées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimum d’animaux sera utilisé et analysé par le biais de tests statistiques, permettant d’obtenir des résultats robustes et significatifs. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 280 animaux répartis sur 3 protocoles différents. Si nous n’observons pas d’effet in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des souris ne sera donc pas utilisée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux maximum et auront des formes d’enrichissements à leur disposition (Sizzle nest, tube, dôme) afin de réduire leur stress. Dans tous les protocoles mis en œuvre, les interventions invasives et les interventions chirurgicales plus longues seront effectuées sous anesthésie gazeuse et analgésie ou sous anesthésie générale associée à une analgésie pré et post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement dès le début du protocole, au niveau du poids et de l’apparition de signes cliniques. Enfin, des points limites ont été mis en place et seront appliqués en cas de souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d’étudier une molécule humaine dans une perspective thérapeutique. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal capable d’accueillir des cellules humaines. Nous avons choisi la souris car certaines lignées particulières n’ont pas de système immunitaire fonctionnel, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines sans qu’elles soient rejetées. La souris est également un animal couramment utilisé en recherche, car elle se reproduit facilement, son hébergement est bien maîtrisé et sa manipulation est relativement simple. Les souris recevront les cellules humaines lorsqu’elles auront 4 à 5 semaines, un âge où elles sont assez robustes pour supporter la procédure. Elles seront ensuite suivies jusqu’à environ 16 à 20 semaines, âge auquel leur croissance est terminée et leur poids est stable. Cela facilite les manipulations, comme l’injection des traitements ou les prélèvements d’échantillons, tout en assurant un suivi attentif de leur bien-être.
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Étude des mécanismes des nouvelles thérapies anti lymphocyte B à l’origine de la rémission dans les maladies auto-immunes 1/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
Transportées entre trois établissements utilisateurs au cours du protocole, avec une semaine d'acclimatation à chaque arrivée, 1 930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour une étude approfondie de leurs tissus. Cinquante d'entre elles sont utilisées dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, les 1 880 autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées, un prélèvement de sang à la joue une fois par mois, trois recueils de salive après injection de pilocarpine et des injections de cellules CAR-T ou d'anticorps bispécifiques, l'un des modèles développant une sécheresse buccale et des douleurs articulaires en fin de protocole chez les souris non traitées. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune alternative, organoïdes compris, ne permet d'étudier plusieurs organes cibles à la fois, et revendique un "organisme animal entier".
Objectifs
La maladie de Sjögren est une maladie auto-immune chronique provoquant une inflammation des glandes salivaires et lacrymales, entraînant une sécheresse de la bouche et des yeux. Elle peut aussi toucher d'autres organes (poumons, muscles, nerfs) et augmenter fortement (x20) le risque de développer un lymphome, qui affecte 5 à 10 % des patients. À ce jour, aucun traitement spécifique n’est approuvé. Les lymphocytes B jouent un rôle central dans cette maladie en produisant des auto-anticorps. Ce sont aussi eux qui peuvent évoluer en cancer. Cibler ces cellules constitue donc une approche thérapeutique prometteuse. Si certains anticorps thérapeutiques dirigés contre les lymphocytes B sont déjà utilisés, ils présentent encore de nombreuses limites. De nouvelles approches, comme les cellules CAR-T (globules blancs génétiquement modifiés) ou les anticorps bispécifiques (favorisant le contact entre cellules immunitaires et cellules cibles), ont montré des résultats très prometteurs, allant jusqu’à la guérison dans certains cas rapportés. Notre projet vise à : 1) comprendre comment ces thérapies peuvent éliminer les lymphocytes B pathogènes et potentiellement guérir une maladie auto-immune ; 2) optimiser ces traitements en identifiant les meilleures cibles et stratégies pour limiter les effets secondaires. Nous testerons différentes cibles avec des CAR-T et anticorps bispécifiques dans trois modèles murins complémentaires, où les lymphocytes B jouent un rôle clé. Aucun modèle ne reproduisant parfaitement la maladie humaine, cette diversité permettra une analyse plus fine. Ce projet permettra de mieux comprendre cette maladie chronique et invalidante en explorant ses mécanismes, tout en développant des approches thérapeutiques innovantes. Il aidera à préparer les essais cliniques futurs et à anticiper les effets secondaires. Nous mettrons aussi l’accent sur des traitements plus accessibles économiquement, en valorisant les anticorps bispécifiques, plus simples et moins coûteux que les CAR-T. Ce projet aura lieu dans 3 établissements utilisateurs en raison de contraintes liées au matériel nécessaire et à la place disponible dans les établissements.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes à l’origine l’efficacité chez l’Homme des nouvelles immunothérapies permettra le développement de nouvelles molécules efficaces avec moins d’effets secondaires. En effet les traitements actuellement disponibles pour cibler les cellules B entrainent des effets indesirables sévères (notamment infectieux) et aboutissent à des rechutes necessitant de retraiter les patients continuellement. L’objectif est d’aboutir a une guerison définitive des patients sans traitement. L’identification de la meilleure cible moléculaire et de la meilleure immunothérapie chez la souris, parmi ceux déjà essayés chez quelques patients sélectionnés, pourra permettre la réalisation d’essais cliniques de plus grande ampleur chez l’Homme.
Procédures
-Injections sous cutanées : 3 fois. durée
Impact sur les animaux
1) Douleur et stress de courte duree liee aux prelevements sanguins sur la joue limites par une anesthesie gazeuse. 2) Stress lie a la contention pour le recueil de salive et d’urines limité par l’anesthesie. 3) Développement d’une sécheresse de la bouche pour laquelle nous fournirons aux souris des croquettes humidifiees. 4) Douleurs des articulations possibles pour un des modèles (BAFFtg) en fin de protocole pour les souris non traitées
Devenir
euthanasie avec étude approfondie des tissus
Remplacement
L’étude de nouveaux medicaments utilisant un systeme immunitaire complet et reproduisant la pathologie ne peuvent etre effectues que sur un modele animal. En effet la realisation d’experiences in vitro sur prelevements humains est rendue impossible par la nécessité d’étudier les effets des traitements dans les tissus ainsi que leurs interactions avec les autres cellules et organes. D’autre part, les maladies auto-immunes étudiées sont des maladies multi-systémiques, donc touchent de nombreux organes. Pour évaluer l’efficacité du traitement, nous aurons besoin de mesurer des paramètres cliniques divers (flux salivaire, protéinurie), nécessitant un organisme animal entier. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non animale, tels que les organoïdes par exemple, qui permette l’étude du système immunitaire dans son ensemble comportant plusieurs organes cibles, dans les maladies auto-immunes.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour utiliser le nombre minimal d’animaux tout en ayant des résultats significatifs et interprétables sur le plan scientifique. Un nombre trop faible d’animaux ne permettrait pas de mettre en évidence des différences et de prouver nos hypothèses, rendant ainsi l’expérimentation caduque. Dans le cas où nos résultats seraient meilleurs qu’attendus selon les études préalables, nous réduirons encore au maximum le nombre d’animaux au fur et à mesure des expérimentations.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivee avant de débuter une procedure. Au vu de la longueur des procédures, nous privilégierons des cages de 4 animaux. Pour la réalisation de la procedure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-etre animal (décrits dans la procedure expérimentale). Les points limites seront strictement appliques. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires developpees dans la description de la procédure. Après chaque anesthésie, les souris seront maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, du diet gel est placé dans les cages pendant 48h. Le diet gel sera systématique ajouté en cas de sécheresse buccale significative. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil.
Choix des espèces
La souris a un système immunitaire et une génétique proche de l’Homme et peut développer des atteintes cliniques similaires aux maladies auto-immunes humaines. La facilité d’utilisation et la bonne reproductibilité en fait un modèle de choix. Chaque modèle sera le miroir d’une facette de la physiopathologie des maladies auto-immunes liées aux lymphocytes B. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte après établissement des anomalies cliniques révélatrices de maladie auto-immune.
Induction de la production d’anticorps après immunisation active chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Troubles immunitaires
Immunisées à trois reprises avec un adjuvant qui peut former des abcès au point d'injection, puis greffées de cellules tumorales, 212 souris vont être utilisées, 112 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger. Pendant les quatre semaines de l'expérience, celles qui portent des tumeurs peuvent perdre du poids, cesser de bouger et s'isoler, et toutes sont tuées pour que leurs organes soient prélevés. Le projet cherche des fragments de protéines capables de déclencher une production d'anticorps, première étape avant des essais sur des modèles animaux de cancers, l'élargissement de l'offre thérapeutique aux patients venant au terme d'une longue chaîne d'étapes. Sur l'effectif, le porteur écrit seulement que "les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés", et annonce des points limites "stricts et spécifiques au projet" sans en nommer aucun.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'identifier des fragments de protéines dont l'expression est impliquée dans la progression de certains cancers. Nous espérons identifier des fragments de protéines induisant la production d'anticorps dans le but, par la suite, de tester leur efficacité dans des modèles animaux de cancers ce qui entrainerait à terme un élargissement de l'offre thérapeutique pour les patients.
Bénéfices attendus
Le but est d'identifier des fragments de protéines dont l'expression est impliquée dans la progression de certains cancers chez l'homme et à terme d'élargir l'arsenal thérapeutique pour les patients.
Procédures
Injection de produit : 3 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Injection de cellules: 1 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Injection de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours); durée totale du geste 1-2 min. Prélèvement de sang: 1 fois/souris sur souris anesthésiées ; durée du geste : 1-2 min.
Impact sur les animaux
Les injections répétées peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. L’utilisation de l’adjuvant peut entrainer la formation d’abcès au point d’injection. Afin de réaliser les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress et une douleur légère de courte durée. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 4 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes en vue de l’analyse de la production d’anticorps et de la réponse immunitaire
Remplacement
La réponse immunitaire suite à une vaccination ainsi que les réponses anticorps impliquées dans la réponse immune antitumorale sont complexes. L’efficacité d’un vaccin ne peut être évaluée que dans des organismes entiers et les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à des modèles animaux. Ces modèles sont fondamentaux pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements thérapeutiques. Ils sont un prérequis nécessaire avant le lancement d’essais cliniques chez l’homme.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été déterminés. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous analgésie et anesthésie générale.
Choix des espèces
Afin de développer des vaccins thérapeutiques contre la progression du cancer chez l'homme, les traitements développés doivent préalablement être validés chez l'animal. La souris est un mammifère de choix classiquement utilisé dans la littérature pour les études de production d'anticorps. Il est nécessaire que l'animal soit adulte (âge supérieur à 8 semaines) afin que le système immunitaire soit mature.
Etude d’un modèle murin d’hypofonction des glandes salivaires : évaluation de l’effet d’inhibiteurs épigénétiques et étude d’association avec d’autres pathologies
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 616 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur canule les glandes salivaires sous anesthésie pour y injecter un adénovirus qui provoque un syndrome sec, et une partie reçoit en plus un gavage quotidien cinq jours par semaine pendant quatre semaines pour déclencher une fibrose de la peau. D'autres reçoivent une molécule chimique à trois reprises pour induire un lymphome, puis une stimulation immunitaire mensuelle, avec des prises de sang hebdomadaires et des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'autre modèle que la souris pour le syndrome de Gougerot-Sjögren et la sclérodermie, et qualifie ce modèle d'"indispensable" pour suivre l'apparition des auto-anticorps.
Objectifs
Le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie auto-immune principalement caractérisée par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales responsable d’un syndrome sec. Dans 40% des cas, les patients atteints développent des structures lymphoïdes anormales (ELS) au niveau de leurs glandes salivaires. La présence de ces structures ELS est prédictive d'une expression de la maladie plus aggressive et d'un risque accru de développement de lymphome. Cependant les mécanismes responsables de du dysfonctionnement des glandes salivaires, de la formation des ELS et du développement de l'auto-immunité restent peu connus. Nos collaborateurs ont mis en place un modèle murin de SGS reposant sur la délivrance d'adénovirus non réplicatifs (une fois que le virus a infecté une cellule, aucun autre virus n'est produit) dans la glande salivaire permettant l'induction d'ELS semblables à ceux observés dans le SGS. Tout d'abord, nos objectifs sont donc de mettre en place et caractériser ce modèle murin, ainsi que d'explorer les mécanismes à l'origine du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le SGS et les stratégies thérapeutiques potentielles pour y remédier. Ensuite, nous étudierons le SGS dans le contexte d'autres pathologies puisque les patients atteints de SGS ont un risque accru de développement de lymphome et les patients atteints d'une autre maladie auto-immune, la sclérodermie systémique sont à risque de développer un SGS.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) et pourra permettre d'identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Egalement, nous espérons faire avancer la compréhension du lien entre le SGS et d'autres maladies auto-immunes ou cancers.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie consistant à une canulation des glandes salivaires (l'acte chirurgical ne durera pas plus de 15 minutes) associée à une anesthésie et une administration d'analgésique. Egalement, pour certains animaux : traitement administré 1 fois par jour pendant 5 jours/semaine pour une durée maximale de 4 semaines (durée : 1 minute / administration) afin d'induire la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune caractérisée par le développement anormal d’une fibrose de la peau. Dans d'autres cas (induction d'un lymphome), administration d'une molécule chimique à 3 reprises (durée : 30 secondes / administration) avec 2 jours d'intervalle pour induire l'expression des altérations génétiques associée à une administration mensuelle (durée : 30 secondes / administration) permettant de stimuler leur système immunitaire. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum hebdomadaire et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l'imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration du substrat d'imagerie et une anesthésie gazeuse, la session durera 20 minutes au maximum.
Impact sur les animaux
La canulation des glandes salivaires pour le modèle du Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) résultera d'un syndrome sec, une attention particulière sera donc portée sur la consommation d'eau. L'administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c'est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques du modèle lymphome, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l'Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l'apparition de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Les autres nuisances attendues proviendront de l'administration de l'inhibiteur. Dans le cas de la sclérodermie systémique, les souris développent une fibrose cutanée au point d'injection (bas du dos) et une fibrose pulmonaire modérée à partir de la 2ème semaine. Celle-ci est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l’ensemble du parenchyme pulmonaire ce qui évite les difficultés ou souffrances respiratoires dans ce modèle murin.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.
Remplacement
La compréhension des mécanismes responsables du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren ne peut se faire que partiellement in vitro/ex vivo puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire l'entière complexité de l'environnement des glandes salivaires (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) mais nous travaillons en parallèle à les développer afin d'avoir recours aux animaux uniquement sur les dernières étapes de notre projet. En effet, la première cible thérapeutique que nous allons explorer a été définie grâce à des expérimentations in vitro. Egalement, les autres cibles potentielles seront déterminées grâce à un modèle d'organoïdes mis en place par des collaborateurs.
Réduction
Les expérimentations sont mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. De manière générale, nous nous sommes basés sur les résultats de nos collaborateurs décrivant que la méthode de canulation de la glande salivaire permettait dans 70% des cas le développement des symptômes, ce qui implique la nécessité d'au moins 8 animaux par groupe afin d'obtenir au moins 5 animaux exploitables. Les doses croissantes d'adénovirus déficient seront testées en séquentiel, ainsi si la première dose testée s'avère suffisante les doses supérieures ne seront pas réalisées. De même si la décroissance observée à J23 est suffisante, les études aux temps plus tardifs ne seront pas réalisées. Lorsque une analyse transcriptomique et une analyse par immunofluorescence devront être réalisées, il sera nécessaire de doubler le nombre d'animaux par groupe car ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur les mêmes échantillons. Dans le cadre de l'étude d'association avec le lymphome, les groupes sont dimensionnés grâce à notre expérience précédente nous permettant d'attendre un taux de développement tumoral de 40% (nécessité d'augmenter les groupes à 11 animaux pour avoir des résultats exploitables).
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin de se construire un «nid». Le stress sera également limité au maximum grâce à une habituation progressive à la manipulation. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (apparence physique, comportement) et un suivi bihebdomadaire des signes cliniques permettront d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés (par exemple du spray anti-démangeaisons ayant des propriétés antiinflammatoires si démangeaisons au point d'injection chez les animaux où la sclérodermie sera induite) si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, et à l’euthanasie dès que nécessaire. Le raffinement sera également obtenu par un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire avec des dispositions adaptées (collyres, maintien à 37°C...) pour permettre une bonne récupération des animaux. La technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique du modèle de Syndrome de Gougerot-Sjögren de façon non douloureuse.
Choix des espèces
Pour les maladies auto-immunes, le Syndrome de Gougerot-Sjögren et la Sclérodermie systémique, il n'existe pas d'autres modèles que le modèle murin. Par ailleurs, ce modèle est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Concernant le modèle murin de lymphome, l'utilisation de souris transgéniques permet de reproduire avec pertinence les mécanismes précoces de la lymphomagenèse ce qui n'est pas possible avec les modèles murins de greffes. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 8 semaines d'âge comme cela a été décrit pour ces modèles qui nécessitent un système immunitaire complètement fonctionnel et mature.
Cibler les structures lymphoïdes tertiaires par IRM et IPM moléculaire dans des modèles murins d’inflammation chronique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Un lupus provoqué par une injection unique dans le péritoine, une arthrite par deux injections intradermiques, une colite chimique : 540 souris sont soumises à ces modèles inflammatoires puis à des séances d'imagerie de trente minutes, cathéter posé sous anesthésie profonde, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue. Le porteur veut valider un agent de contraste couplé à un anticorps pour visualiser sans biopsie les agrégats immunitaires qui se forment dans les tissus enflammés. Il décrit pourtant, pour la colite, une diarrhée, des saignements et une souffrance de durée possiblement prolongée sur plusieurs jours, et fixe la mise à mort à plus de 20 % de perte de poids ou à un score de grimace supérieur à 1,5.
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats immunitaires de quelques centaines de micromètres qui se développent dans les tissus sous l'effet d'une inflammation chronique. En temps normal, ces TLS possèdent probablement de nombreux avantages en permettant de générer une réponse immunitaire locale. Néanmoins, dans des situations d'inflammation chronique ces structures entretiennent la pathologie présentée. Il a ainsi pu être démontré chez l'homme que la présence de TLS était associé à un mauvais contrôle de la pathologie au cours de rhumatismes inflammatoires, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou de pathologies auto-immunes. Afin de visualiser l'inflammation en imagerie, il est possible d'utiliser des agents de contraste magnétiques pouvant être détectés par des techniques d'IRM ou d'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite qui repose sur la détection du signal émis uniquement par les microparticules d'oxyde de fer, et qui permet la réalisation d'une étude corps entier, contrairement à l'IRM) et sélectivement dirigées contre un marqueur inflammatoire spécifique de la structure d'intérêt. Les TLS sont entourées de cellules vasculaires très spécialisées, qui expriment un motif appelé PNAd. Ce motif est reconnu par un anticorps spécifique, qu'il est alors possible de coupler à l'agent de contraste afin de permettre la visualisation des TLS par une approche d'imagerie. Un nouvel agent de contraste biocompatible a récemment pu être développé, ouvrant ainsi la voie à une translation à l'homme. Nous souhaitons donc valider cette approche d'imagerie moléculaire des TLS en utilisant ce nouvel agent de contraste couplé à un anticorps dirigé spécifiquement contre PNAd dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Ceci permettrait de valider la possibilité d'une imagerie moléculaire de l'inflammation chez l'homme, par l'utilisation de ce nouvel agent de contraste.
Bénéfices attendus
La présence de TLS au sein des sites inflammatoire a pu être démontrée comme associée à un mauvais pronostic, y compris sous traitement immunomodulateur. L'évolution de la présence et du nombre de TLS a également pu être associée à la réponse thérapeutique. Actuellement, l'identification des TLS au sein d'un organe d'intérêt repose sur l'analyse microscopique du tissu après réalisation d'une biopsie. Cette technique présente de nombreuses limites. Il s'agit en effet d'un examen invasif, avec un risque de complication (hémorragie du site de ponction, perforation...) non négligeable, ce d'autant plus si l'on souhaite évaluer l'évolution des TLS au cours du temps et donc répéter les examens. De plus, l'analyse d'une biopsie n'apporte qu'une information parcellaire et ne permet pas une analyse complète de l'organe d'intérêt. Outre l'absence de vision d'ensemble, le risque de faux négatif est donc important. Enfin, la réalisation d'une biopsie est un examen destructeur, qui empêche donc le suivi d'une structure donnée au cours du temps. Pour toutes ces limites, il apparaît aujourd'hui nécessaire de développer une technique non invasive permettant l'étude, le suivi et la caractérisation des TLS. Le développement et la validation de notre agent de contraste utilisable en IRM dans différents modèles de pathologies inflammatoires permettrait ainsi d'ouvrir la voie de l'imagerie non invasive de l'inflammation en pratique clinique humaine.
Procédures
Les animaux seront suivis aux interventions suivantes : induction d'un modèle de lupus par injection intra-péritonéale unique (30 secondes) ou induction d'un modèle d'arthrite par deux injections intradermiques sous anesthésie profonde (5 minutes chaque) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie avec injection de l'agent de contraste (environ 30 minutes) ; injection d'un traitement par voie intra-péritonéale (30 secondes)
Impact sur les animaux
Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ce modèle et des données de la littérature, nous savons que le modèle de colite est susceptible de produire une diarrhée et des des saignements. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux, un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours). Le modèle de lupus est susceptible d'entraîner une ascite, puis l'apparition de douleurs articulaires. L'effet le plus sévère de ce modèle rapporté dans la littérature est la survenue d'un saignement pulmonaire. Néanmoins, les souris utilisées ici, ne présentant pas ce type d'évènement. Le modèle de polyarthrite est susceptible de produire des douleurs et gonflements articulaires. La réalisation de l'imagerie, accompagnée de la pose d'un cathéter veineux peut se traduire par une douleur au point d'injection, une inflammation, une infection du site, une perte de poids.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant PNAd sur des cultures de cellules endothéliales. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites ci-après sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles de colite, ainsi que selon les données de la littérature et la sensibilité/spécificité des méthodes utilisées. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu (notamment pour les modèles de colite), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps. Pour le modèle de colite, un calcul du nombre de sujets nécessaire a pu être réalisé à partir des données antérieures de l'équipe (8 sujets par groupe, inflaté à 12 pour tenir compte de pertes potentielles ; 16 sujets pour la modulation par un traitement) pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5%. Concernant les autres modèles, l'utilisation d'une telle modalité d'imagerie n'y a jamais été réalisée. Nous considérons donc qu'il s'agit d'une étude pilote, et qu'il n'est pas possible de réaliser un calcul du nombre de sujets nécessaires.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel ou igloo, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge (points limites cités plus loin). La douleur sera évaluée par utilisation de la par l'utilisation de la mouse grimace scale. Les animaux seront pesés quotidiennement (points limites cités plus loin). Les animaux des groupes colites ou présentant des arthrites bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture ad libitum. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 20% ; le score moyen de la mouse grimace scale est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une déshydratation seront réhydratés. Les animaux présentant des signes de douleur ou d'inconfort (mouse grimace scale > 0.5, isolement, horripilation, respiration rapide) recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale, une anesthésie locale.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des TLS en conditions inflammatoires. Il faut également noter que la cible de notre traceur (PNAd) est un motif conservé entres espèces, autorisant une translation rapide des résultats obtenus de la souris à l'homme. Dans les modèles de colite, les souris utilisées seront des souris mâles âgées de 8 semaines, stade optimal pour l'induction du modèle. Le modèle de lupus utilisera des souris femelles de souche BALB/c ou C57BL6/J âgées de 8 semaines. En effet, les souris mâles ne présentent pas de phénotype lupique. Le modèle d'arthrite fera appel à des souris DBA/1 de 8 semaines, selon les données de la littérature. Le modèle de vieillissement fera appel à des souris Swiss âgées de 68 semaines, et de 8 semaines pour les contrôles.
Etude de la pharmacocinétique, pharmacodynamique et biodistribution d’immunothérapies bispécifiques innovantes chez le cynomolgus
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
36 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, huit d'entre eux étant tués pour le prélèvement d'organes et vingt-huit réutilisés dans d'autres procédures du projet ou d'autres études. Chacun subit jusqu'à huit prises de sang dans une même journée, vingt-cinq au total sur douze semaines, trois prélèvements de ganglions de trente minutes, et pour certains un prélèvement de moelle osseuse. Les anesthésies s'enchaînent sur vingt-quatre heures, dont une de deux heures et, pour une seconde procédure, une de huit heures, que le porteur reconnaît inconfortables. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'usage d'animaux non-humains "indispensable".
Objectifs
Les immunothérapies sont des traitements qui agissent sur le système immunitaire du patient pour lutter contre la pathologie. Dans le cadre du cancer, les immunothérapies ont pour objectifs de réactiver le système immunitaire affaibli par la tumeur. Dans le cadre des maladies auto-immunes ou maladie inflammatoire chronique, les immunothérapies ont pour but d’inhiber ou de réguler le système immunitaire. Malgré des avancées et plusieurs immunothérapies efficaces, les patients non-répondeurs/en rechutes sont nombreux. Il est donc essentiel de continuer de chercher d’autres combinaisons de thérapie pour améliorer les soins actuels dans le cancer ou maladies inflammatoires chroniques ou aigues.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration, valider l’intérêt thérapeutique et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. La biodistribution de la molécule thérapeutique d’intérêt dans les tissus permettra de renforcer ces données.
Procédures
Les animaux seront soumis à des anesthésies pour effectuer une injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt, à plusieurs prélèvements : - sanguins (au maximum 8 dans une même et seule journée, 25 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 12 semaines maximum) durée 15 min -de ganglions (3, avant et pendant le traitement,) durée 30 min. Des animaux pourront avoir un prélèvement de moelle osseuse (durée 30 min). Des anesthésies prolongées seront effectuées (maximum 2 heures pour une procédure et 8h pour une seconde) lors de l’injection intraveineuse et le prélèvement de ganglions.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h, et notamment une anesthésie prolongée de 2h, lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Une légère douleur peut être induite par le prélèvement de moelle osseuse, qui sera traitée par antalgique.
Devenir
Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de 28 des animaux dans ce projet après accord du vétérinaire et du SBEA pour une nouvelle procédure. Effectivement, un même animal pourra être réutilisé dans une autre procédure de cette même étude, mais également dans un protocole d'une autre étude. Les 8 animaux (ré-)utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule seront mis à mort pour permettre le prélèvement de différents organes, ces animaux auront pû précédemment étre utilisés dans une procédure expérimentale légère ou modérée.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires, sur des lignées cellulaires, sur des cellules et biopsies humaine (ex vivo) ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Des analyses computationnelles de banques de données humaines et animales ont également permis de confirmer la cohérence des traitements étudiés. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.
Réduction
Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum,. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, un nombre minimal d’animaux est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude Pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule. Dès que cela est possible, les animaux seront réutilisés entre les différentes procédures expérimentales de la même molécule ou d’une autre molécule, cela permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé dans ce projet. Lors de l’étude, les animaux seront leur propre contrôle. Si une dose testée répond à toutes les attentes, les autres doses ne seront pas étudiées. Une étude bibliographique approfondie de l’art antérieur sera effectuée pour espère trouver cette dose. Si une molécule n’a pas un profil satisfaisant pour passer en essai clinique chez l’homme, l’étude complémentaire au niveau tissulaire ne sera pas effectuée.
Raffinement
Toutes les procédures sont réalisées chez le macaque sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique Les animaux sont hébergés avant et après protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.
Choix des espèces
Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes dont le système immunitaire est alors mature.
Mécanismes physiopathologiques de la surdité dans les maladies de l’inflammasome.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Surexposées au bruit pendant quelques heures ou injectées trois jours de suite dans l'abdomen pour déclencher une inflammation de l'oreille, 4 660 souris sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes tuées à l'issue. Leur audition est mesurée environ toutes les deux semaines, chaque séance durant une heure, et une partie subit une chirurgie de deux heures sans réveil. L'équipe cherche à identifier les mécanismes de la perte auditive chez les patients porteurs de mutations d'un gène de l'inflammasome, symptôme qu'elle décrit comme le plus invalidant de la maladie. Le porteur affirme pourtant que ces mêmes atteintes auditives sont "largement compensées" chez la souris et n'entraînent pas de phénotype dommageable, et que les chirurgies terminales ne sont "pas susceptibles d'entraîner une douleur".
Objectifs
Les patients atteints de syndrome auto-inflammatoire rare appelé syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) présentent une inflammation chronique, une fièvre intermittente et des douleurs articulaires, ainsi que des caractéristiques très spécifiques comme une éruption type urticaire (> 95 % des patients) et des caractéristiques neuroinflammatoires telles qu'une perte auditive neurosensorielle (60 %). Les traitements actuels ciblant certaines molécules stabilisent la maladie ; cependant, dans la plupart des cas, ils ne font pas régresser la perte auditive, qui reste le symptôme le plus invalidant. Les mécanismes qui sous-tendent le phénotype de perte auditive chez les patients restent inconnus, ce qui empêche le développement de tests audiologiques et de traitements appropriés. Nous avons récemment découvert que certaines mutations pour un gène entraînaient une forme atypique de maladie avec perte auditive mais où la plupart des autres symptômes sont atténués. Notre projet a pour but i) d'identifier et de caractériser de manière approfondie chez la souris les événements responsables de la perte auditive progressive chez les individus porteurs de mutations de ce gène aux niveaux moléculaire, cellulaire et tissulaire, et ii) de décrire, aux niveaux moléculaire et cellulaire, le nouveau mécanisme physiopathologique qui sous-tend la perte auditive chez les patients porteurs de mutations. Le projet bénéficiera de modèles animaux spécifiques pour les formes classiques et atypiques de cette maladie.
Bénéfices attendus
En caractérisant les atteintes auditives dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les patients porteurs des mutations du gène étudiées. -Ce gène étant impliqué dans un complexe impliqué dans l’immunité innée, notre travail ouvrira la porte à l’identification d’autres protéines du complexe comme potentiellement impliquées dans la surdité -Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes et avec un travail similaire qui est en cours chez les patients porteurs de mutations dans ce gène, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à une mutation de ce gène. Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients porteurs de mutations de ce gène. L’existence de médicaments capables d’inhiber le complexe dont fait partie cette molécule rend cette perspective très concrète.
Procédures
Les interventions seront : - Une inflammation de l’oreille sera induite sur les modèles animaux de deux façons possibles : i) soit par une surexposition sonore de quelques heures soit ii) par l’injection d’une faible dose d’une substance dans l’abdomen sur trois jours par doses croissantes pour mimer une petite infection. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de l’activation de l’inflammation dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu approximativement toutes les deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par l’inflammation de l‘oreille. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie terminale de 2h pour faire des mesures fonctionnelles dans l’oreille.
Impact sur les animaux
La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système sensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies, celles-ci sont terminales et donc ne sont pas susceptibles d’entraîner une douleur. -En ce qui concerne l’induction de la réaction inflammatoire, celle-ci sera limitée à l’oreille et pourrait causer une douleur légère et/ou un inconfort léger. - Les doses typiquement utilisées sont 4-5 fois inférieures à celles utilisées pour induire une réaction inflammatoire forte qui peut entraîner des pertes de poids importantes les deux premiers jours après injection puis une reprise de poids les jours suivants. Aux doses plus faibles, on s’attend à pas d’effet ou un effet mineur. De plus, une douleur légère au point d’injection de et une réduction de l’activité et de la mobilité peut survenir pendant quelques jours.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.
Réduction
La détermination du nombre d’animaux a été réalisée en tenant compte à la fois des contraintes techniques (coût, hébergement, temps, etc.) et de l’expertise développée dans l’équipe sur des expériences similaires. Pour les procédures qui en nécessitent, une analyse de puissance détaillée a été effectuée. Dans toutes les procédures, des cages standard de 5 animaux seront utilisées.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des enregistrement de données sous anesthésie, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratation sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel hydrique.
Choix des espèces
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades différents. Nous étudierons les conséquences de l’inflammation principalement à des âges adultes mais nous serons amenés à considérer de temps en temps des expériences de suivi chez la jeune souris afin de s’assurer (en cas de doute) qu’il n’y a par exemple pas d’inflammation spontanée avant son induction. L’étude utilisera des animaux âgés de 0 jour (naissance) à l’âge adulte (15 mois maximum).
Identification des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les différences liées au sexe dans l’immunité
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Ovaires ou testicules retirés sous anesthésie, implant hormonal glissé sous la peau, injections jusqu'à trois fois par semaine, deux séances d'irradiation : 4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 2 620 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 1 480 d'un niveau modéré. Elles portent des modèles de sclérose en plaques avec paralysie de la queue et des pattes, d'asthme et de lupus avec inflammation de la peau et des reins, l'objet étant de comprendre pourquoi les maladies auto-immunes touchent davantage les femmes. Le porteur écrit que les animaux "récupèrent parfaitement" des castrations et annonce des douleurs abdominales modérées, sur un projet où plus de la moitié des souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Les objectifs de notre projet seront d'identifier ll'origine des différences liées au sexe dans l'immunité et les maladies associées. Les études porteront sur des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, une pathologie respiratoire (asthme) et les réponses immunitaires lors d’une infection virale. Dans chacune de ces conditions, des différences de susceptibilité entre sexes ont été démontrées. Nous étudierons notamment le rôle des hormones sexuelles (œstrogènes et androgènes) ainsi que celui des gènes portés sur les chromosomes sexuels.
Bénéfices attendus
Les maladies auto-immunes, mais aussi les allergies, sont plus fréquentes chez les femmes comparées aux hommes. Ce projet permettra de comprendre comment les hormones sexuelles et les gènes portés sur les chromosomes sexuels, influencent ces maladies. Une meilleure connaissance de ces maladies permettra ainsi d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques les exploitant.
Procédures
Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris mâle ou femelle - Implant sous la peau réalisée sous anesthésie générale ( 30 sec), dure moins de 5 min - - des injections (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine - - des prélèvements de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure - deux irradiations de moins de 4 minutes chacune
Impact sur les animaux
Une partie des animaux sera opéré pour retirer les ovaires ou les testicules. Les animaux récupèrent parfaitement de ces opérations. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. Certaines de nos modèles de souris développent spontanément une inflammation au niveau de la peau et des reins. Certains de nos modèles de souris miment une sclérose en plaques et ses caractéristiques telles qu'une paralysie de la queue et des pattes. Pour les animaux irradiés, nous surveillerons particulièrement les lésions cutanées (croûtes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. En effet, les animaux que nous utilisons vont subir des protocoles pour mimer les maladies humaines : sclérose en plaques et asthme par exemples. Pour étudier ces maladies, nous avons besoin non seulement d'évaluer l'état physique des animaux mais aussi d'analyser leur réponse immunitaire dans les organes malades (rein, peau, cerveau, poumon) et les organes de l'immunité (rate, ganglions) que nous prélèverons donc après leur mise à mort.
Remplacement
Les maladies que nous étudiont (ex: sclérose en plaques, asthme) ne peuvent pas être étudiées dans des modèles cellulaires in vitro et nécessitent l'utilisation d'animaux. En effet, ils impliquent plusieurs organes, par exemple dans la sclérose en plaques, à la fois le cerveau et la moelle épinière sont malades. De plus, nous étudions les réponses immunitaires de ces maladies. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (à des temps précis) et dans différentes parties du corps (organe malades, rate). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées in vitro.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles murins les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Notre expérience de ces modèles, que nous maitrisons au laboratoire depuis plusieurs années, nous a permis de conclure que le nombre minimal d’animaux est de 5 par groupe. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal.
Raffinement
Le change de la litière des souris est réalisé tous les 15 jours. Les cages seront systématiquement enrichies (coton, igloo, tunnel) pour leur permettre de faire un nid et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids. L'angoisse des animaux sera réduite par une période d'acclimatation à l'hébergement mais également par une habituation à la manipulation. Un protocole est mis en place avec la structure du bien-être animal (SBEA) de notre centre pour prévenir toute douleur, souffrance ou angoisse de l'animal. De plus, les procédures et le suivi de l'animal seront réalisés par des personnes compétentes, formées à l'expérimentation animale et maitrisant parfaitement les procédures ici décrites. Les animaux sont surveillés tous les jours par les zootechniciens du service, en accord avec la réglementation. A cela s'ajoutent des points limites qui ont été mis en place et qui seront appliqués pour éviter toute souffrance aux animaux. Les opérations chirurgicales des animaux seront réalisées selon des protocoles que nous maîtrisons et sous anesthésie générale. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Après la chirurgie (qui dure moins de 5 min), les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie. En post-opératoire, les animaux seront analgésiés pendant 24 heures. Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Dans le modèle de sclérose en plaques, une modification de l’hébergement sera réalisée pour éviter l’inconfort des animaux qui commencent à être paralysés.
Choix des espèces
Les acteurs de la réponse immunitaire chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. De plus, nous utilisons des modèles de pathologie dont les signes cliniques sont très proches entre l'espèce humaine et la souris : lupus, sclérose en plaque, asthme... Les groupes expérimentaux seront analysés à l’âge de 8 semaines à 4-5 mois maximum. Les animaux sont de jeunes adultes mâles et femelles utilisés entre 8 et 16 semaines. Quand nécessaire, les souris subissent une castration (retrait ovaires ou testicules) à 4 semaines de vie avant maturité sexuelle, sinon les animaux sont utilisés entre 8 et 16 semaines, une fois la maturité de leur système immunitaire atteinte.