Troubles immunitaires

1 200 souris et 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections de vaccin sous anesthésie, espacées de quinze jours sur soixante jours, et subit cinq prélèvements de sang, avec une fièvre, une perte d'appétit et un gonflement au point d'injection attendus pendant un à deux jours. Il s'agit de tester de nouveaux adjuvants censés déclencher une réponse cellulaire cytotoxique que les adjuvants autorisés chez l'humain n'obtiennent pas. Le porteur écrit vouloir démontrer que ses modèles cellulaires pourraient à terme remplacer les animaux, et tire de cette comparaison même la "nécessité de l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques".

Objectifs

Les vaccins protéiques sont une classe de vaccins qui utilisent des protéines spécifiques de pathogènes pour stimuler une réponse immunitaire protectrice chez l'organisme. A cette composante protéique est ajouté un adjuvant afin d’obtenir une réponse immunitaire capable de protéger contre le pathogène ciblé. A ce jour, les adjuvants acceptés chez l’homme induisent de bonne réponses anticorps, mais la réponse cellulaire cytotoxique est très faible. Ces vaccins protéiques sont donc à ce jour peu efficaces pour protéger des infections virales. Nous avons développé de nouveaux adjuvants dans le but d’augmenter fortement cette réponse cellulaire cytotoxique. Nous avons développé de plus des stratégies pour limiter les effets secondaires tel que fièvre, inflammation locale… Nous nous proposons maintenant de tester ces candidats adjuvants chez le rongeur sur un modèle de vaccination très classique nous permettant d’évaluer la réponse immunitaire ainsi que vérifier l’absence d’effets secondaires importants.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but premier de trouver de nouveaux adjuvants pour des vaccins protéiques capable d’induire une bonne réponse immunitaire humorale et cellulaire importante sans générer d’effets secondaires importants. Il est important de noter qu’à ce jour il n’y a pas d’adjuvants réellement efficaces pour les vaccins protéiques qui permettent d’obtenir une bonne protection contre les pathogènes viraux. Ce projet pourrait permettre de mettre au point des vaccins contre des maladies virales pour lesquelles il n’existe aucun vaccin efficace à ce jour.

Procédures

Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins (temps injection 1 min max) espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal (temps prèlèvement 1 min maximum) et sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.

Remplacement

Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et la réactogenicité de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires ainsi que nos modèles de diffusion /relarguage in vitro pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 8 groupes de 6 souris. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminer une ou 2 formulations vaccinales optimisées qui seront ensuite testées chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de garder suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Une réaction locale au niveau du site d’injection ou de la fièvre peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Une grille de « scoring » permettra de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. A l’aide de cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude est le modèle immunologique de référence chez la souris. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à trente injections intradermiques d'acide hypochloreux. Le produit épaissit et durcit la peau du flanc, provoque des croûtes et une inflammation chronique, avec des léchages et des grattages excessifs, une perte de poids et une altération du pelage. Six injections intraveineuses et sept prises de sang par animal s'y ajoutent, pour tester des anticorps censés traiter la sclérodermie. Les anticorps ne seront testés que si la première partie du projet parvient d'abord à installer la maladie chez la souris, ce qui range les bénéfices annoncés derrière une condition quand les lésions cutanées, elles, sont programmées.

Objectifs

La sclérose dermique, maladie auto-immune, plus connue sous le nom de sclérodermie, est une maladie rare où la peau devient anormalement dure et épaisse. Cette maladie est due à une surproduction de collagène, une protéine qui rend normalement la peau souple, mais qui, en excès, la rend rigide et moins fonctionnelle. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en place ce modèle sur des souris (première partie du projet) pour ensuite tester nos différents anticorps candidats ciblant une protéine membranaire pour traiter cette maladie (deuxième partie du projet).

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif de la sclérose dermique. Les approches thérapeutiques visent à ralentir la progression de la maladie, à soulager les symptômes et à améliorer la qualité de vie. Le traitement est adapté selon la forme de la maladie et les organes atteints. C’est pourquoi le développement de nouveaux traitements est à ce jour nécessaire.

Procédures

Pesées : 8 pesées x 30 sec = 4 min Injections intradermales : 30 injections x 30 sec = 15 min Injection intraveineuses : 6 injections x 1 min = 6 min Prélèvements de sang : 7 prélèvements x 1 min = 7 min

Impact sur les animaux

Douleur et inconfort localisés : L’injection intradermique peut provoquer une légère douleur au point d’injection, avec un risque d’inflammation locale, d’œdème, de rougeur et de sensibilité accrue de la zone traitée. Développement de lésions cutanées : Les souris développent un épaississement local de la peau, une induration, ou des croûtes, pouvant gêner la mobilité ou entraîner des comportements de léchage ou de grattage excessifs. Inflammation et stress : L’administration répétée de d'acide hypocloreux induit une inflammation chronique locale, source d’inconfort, de stress pour l’animal. Altération de l’état général : Si la réaction inflammatoire est importante ou si les lésions sont étendues, on peut observer une baisse d’activité, une perte de poids ou une altération du pelage, signes d’une souffrance plus globale.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, les organes et sites d’injections sont prélevés pour analyse

Remplacement

Il existe à ce jour des méthodes in vitro permettant de reproduire au mieux de manière limité l’induction de la sclérose dermique comme par exemple l’utilisation de cultures de cellules humaines ou de tissus reconstruits, tels que la peau artificielle ou des organoïdes cutanés. Ces modèles permettent d’étudier les mécanismes de la fibrose, de tester des molécules et d’observer les effets sur des tissus humains. Cependant il est toujours impossible de reproduire l’effet biologique et physiologique de l’organisme tout entier. Ainsi, les constructions testées dans ce modèle ont d’abord été validées par test in vitro, notamment pour tester leur efficacité sur la cible mais aussi leur tolérance

Réduction

Nous utiliserons donc un nombre minimal d’animaux par groupe : induction de la maladie chez 12 souris pour une inclusion dans les procédures de 10 souris par groupe minimum à la fin de l’expérience (le taux de réussite de l’induction de la sclérose dermique est de 80-90% selon la littérature). Ce nombre nous permettra d’arriver à des résultats statistiquement significatifs. Lors de la première partie du projet, nous développerons le modèle avant de tester dans une seconde partie nos candidats. Par conséquent, si le modèle n’est pas validé en première partie, les anticorps ne seront pas testés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 4 avec enrichissement du milieu (tunnel et fristotis en carton), et surveillés quotidiennement. Les injections intradermiques sur le flanc (induction) ainsi que les injections intraveineuses (traitement) sont réalisées par un expérimentateur entraîné, et réalisées sous anesthésie (lidcoaine au point d'injection). Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient les plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 présentent une réponse inflammatoire marquée, ce qui les rend particulièrement adaptées à l’étude des maladies auto-immunes et inflammatoires comme la sclérodermie. Elles permettent de reproduire de façon fiable les mécanismes de fibrose et de vasculopathie observés chez l’humain. Elles sont sensibles au développement de la fibrose cutanée, notamment lors de l’administration de substances comme l'acide hypochloreux. Ce profil permet de modéliser efficacement les différentes phases de la maladie et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements Nous utiliserons des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début du protocole (20-25g). Cet âge permet d’assurer une bonne santé générale, une réponse immunitaire stable et une croissance terminée, ce qui est crucial pour la reproductibilité et l’interprétation des résultats. En fin d’expérience les animaux seront âgés de 12-17semaines (30-40g).

Les souris utilisées portent une altération ciblée des cellules souches du poil, censée désorganiser le follicule, rompre la barrière de la peau et déclencher une inflammation cutanée. 1 113 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont épilées sous anesthésie, reçoivent pendant trois jours l'application cutanée d'un inducteur de recombinaison génétique, puis des injections dans l'abdomen, des prises de sang et un régime hypercalorique pendant cinq semaines que le porteur présente comme sans complications métaboliques notables. Toutes sont tuées pour suivre l'évolution de la réponse immunitaire sur l'ensemble de l'expérience, dont l'objet est de reproduire les premières étapes de l'hidradénite suppurée.

Objectifs

L’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire chronique de la peau, qui touche environ 1 % de la population. Elle se manifeste par des nodules douloureux, des abcès profonds, des fistules et des cicatrices, principalement localisés dans les zones de pli (aisselles, aine, régions anogénitales). La maladie évolue souvent vers une inflammation chronique, accompagnée de lésions malodorantes, de cicatrices rétractiles et de fibrose de la peau. Le diagnostic est souvent tardif, avec un délai moyen de plus de 7 ans entre les premiers symptômes et la prise en charge. L’hidradénite suppurée a un impact majeur sur la qualité de vie des patients, comparable à celui d’autres maladies chroniques sévères. Elle est associée à un risque accru de dépression, d’anxiété, de douleurs chroniques, de surpoids et de difficultés professionnelles. De façon préoccupante, les taux de suicide sont significativement plus élevés chez les personnes atteintes d'hidradénite suppurée que dans d’autres maladies de peau comme le psoriasis. L’hidradénite suppurée reste à ce jour une maladie difficile à traiter, et constitue un besoin médical non satisfait en l’absence d’options thérapeutiques réellement efficaces. Le développement de traitements ciblés est freiné par deux obstacles majeurs : d’une part, la méconnaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués, accentuée par l’hétérogénéité des formes cliniques de la maladie ; d’autre part, l’absence de modèle animal fiable permettant de reproduire les caractéristiques clés de la maladie humaine et de tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le développement de ce nouveau modèle murin a pour objectif principal de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’hidradénite suppurée, notamment le lien entre dysfonction des cellules souches folliculaires, altération de la barrière épithéliale et inflammation cutanée. À court terme, ce modèle permettra de valider des hypothèses mécanistiques et d’identifier de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans l’initiation et la chronicisation de la maladie. À moyen terme, il servira à tester des candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires, anticorps monoclonaux) dans un système physiologiquement pertinent. À plus long terme, l’ambition est de contribuer au développement de traitements ciblés pour les patients atteints d’hidradénite suppurée, une maladie encore sans solution curative.

Procédures

Les souris seront épilées sous anesthésie (durée de l’intervention : environ 5 minutes) afin d’assurer une application homogène des traitements topiques. L’application cutanée d’un inducteur de recombinaison génétique ou de son solvant (type solvant organique hydrophobe) sera réalisée pendant 3 jours consécutifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés à intervalles réguliers au cours de l’expérimentation. Chaque prélèvement durera moins de 20 secondes, afin de minimiser le stress animal. L’administration des substances expérimentales sera effectuée par voie intrapéritonéale, avec des injections réalisées en moins de 20 secondes, de manière à limiter l’inconfort des animaux. La bactérie utilisée dans ce protocole ne provoque pas d’infections cutanées chez la souris, garantissant une exposition sans risque infectieux significatif. Enfin, l’introduction d’un régime alimentaire hypercalorique sur une période de 5 semaines ne génère pas de complications métaboliques notables dans notre modèle, assurant le maintien du bien-être animal tout au long de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

L’administration d’un inducteur de recombinaison génétique pourrait entraîner des effets secondaires transitoires tels qu’une légère perte de poids, une réduction de l’activité locomotrice ou des modifications du métabolisme hépatique. Notre modèle cible spécifiquement les cellules souches du follicule pileux, considérées comme l’un des éléments déclencheurs de la maladie. Leur altération pourrait entraîner une désorganisation de la structure folliculaire, une rupture de la barrière épithéliale et une inflammation cutanée localisée

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.

Remplacement

Plusieurs modèles in vitro ont été évalués, comme les cultures cellulaires ou les systèmes de type organoïdes. Toutefois, l’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire complexe, impliquant des interactions entre les cellules de la peau, le microbiote cutané et le système immunitaire. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire fidèlement cette complexité. Les systèmes actuels permettent d'étudier certains mécanismes isolés, mais ils ne permettent ni d’observer l’infiltration de cellules immunitaires, ni de modéliser les interactions dynamiques entre les différents compartiments cellulaires de la peau. C’est pourquoi nous avons recours à un modèle animal spécifique, permettant de mieux comprendre les premières étapes de la maladie. Ce modèle permettra également de tester des stratégies thérapeutiques dans un environnement physiologique pertinent. En parallèle, nous poursuivons le développement de modèles alternatifs non animaux, dans l’objectif de réduire au maximum le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la fiabilité scientifique de nos résultats. Des calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs tout en évitant une surutilisation. Nous utilisons aussi des approches multimodales sur un même animal, ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. Des modèles in vitro, en amont, nous permettent également d’affiner nos hypothèses expérimentales et d’orienter nos analyses in vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis

Raffinement

Les animaux sont suivis quotidiennement par un personnel formé afin de détecter précocement tout signe de souffrance : lésions cutanées, altération du pelage, changements de comportement ou de posture, perte de poids, ou automutilation. Ils sont hébergés en cages collectives enrichies, avec litière douce, matériaux de nidification (neslets), abris (dômes ou tubes en carton) et accès à l’alimentation et à l’eau ad libitum. L’environnement est contrôlé (température, humidité, cycle lumière/obscurité) pour garantir des conditions de vie optimales tout au long de l’expérimentation. Nous collaborons avec les vétérinaires référents afin d'assurer un raffinement constant des procédures, notamment par l’adaptation des soins ou l’euthanasie anticipée dès l’apparition de signes cliniques dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi pour l’étude des maladies humaines. Ce modèle présente plusieurs avantages : 1. De nombreuses souches sont disponibles et bien caractérisées sur le plan génétique, ce qui permet de cibler précisément certaines populations cellulaires impliquées dans la maladie étudiée. 2. La petite taille de l’animal, sa facilité d’élevage, et la courte durée de sa gestation permettent de conduire des études dans des délais raisonnables. 3. Il existe aujourd’hui des outils permettant d’activer ou de désactiver certains gènes de façon localisée ou temporaire, ce qui est essentiel pour étudier les mécanismes biologiques complexes de la maladie.

63 souris privées de système immunitaire fonctionnel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées, puis reçoivent sans anesthésie une injection intraveineuse de cellules sanguines humaines, avant jusqu'à quatre anesthésies générales de quinze à trente minutes pour le suivi par imagerie. Le porteur attend une maladie du greffon contre l'hôte atteignant la peau, le tube digestif et le foie, une perte de poids progressive sur quatre à six semaines, une leucémie envahissant la rate, le foie et les ganglions, et des inflammations de la muqueuse buccale après l'irradiation. Il affirme qu'aucune simulation informatique ne reproduit ces interactions, que le modèle murin est "le seul modèle validé" et qu'une étude préclinique chez la souris est "indispensable" au dépôt du dossier auprès de l'agence du médicament.

Objectifs

La greffe de cellules sanguines issues d'un donneur volontaire sain est considérée comme le seul traitement permettant d’obtenir la guérison de certains cancers du sang chez l'Homme. La greffe permet que le système immunitaire du donneur reconnaisse comme étrangères les cellules cancéreuses du receveur et les tue : c’est ce qu’on appelle l’effet anti- tumoral (ou anti-leucémique) du greffon. Toutefois, les cellules du système immunitaire du donneur sont incapables de faire la différence entre une cellule cancéreuse et une cellule saine du receveur. L’attaque des cellules saines du receveur par le système immunitaire du donneur s’appelle la maladie du greffon contre l’hôte. Une stratégie prometteuse qui permettrait de moduler la maladie du greffon contre l’hôte sans altérer l’effet l’effet anti- tumoral du greffon est la thérapie cellulaire, notamment avec les cellules myéloïdes régulatrices (MDSCs). Notre objectif est de développer un médicament de thérapie innovante pour moduler les conflits hôtes/greffon dans le contexte de la transplantation de cellules sanguines à partir d’un donneur volontaire sain. Nous avons développé une méthode pour obtenir rapidement des "MDSCs" obtenues à partir d’un échantillon de greffon de donneur sain, conduisant au dépot d'un brevet. Précedemment, nous avons identifié la dose injectée minimale pour obtenir une diminution de l'incidence et de la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte dans un modèle pré-clinique murin. L'objectif de ce projet est triple 1/Reproductibilité de l'efficacité des MDSCs injectées au moment de la transplantation, en injectant des MDSCs issues de 3 lots différents de production. 2/L'évaluation de la dispertion des cellules dans les organes cibles et l'infiltration/différenciation des cellules injectées dans ces organes. 3/ L'absence d'effet néfaste de la thérapie notamment de l'absence de favorisation de cellules leucémiques. Il s’agit d’un projet multisite dans deux EU différents.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus à moyen terme de ce projet sont de déposer un dossier technique complet (dossier non clinique) auprès de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) afin de proposer un jour notre thérapie cellulaire chez l’Homme. Le projet va permettre de 1/ de confirmer chez l'animal l'efficacité du produit de thérapie cellulaire. 2/Etudier la répartition tissulaire des cellules après l'injection. 3/ Vérifier l'absence d'aggravation de la leucémie (leucémie, principale indication actuelle en clinique pour la greffe de cellules sanguines humaines à partir d'un donneur sain). A plus long terme, si ce produit de thérapie cellulaire est efficace et peu toxique dans la greffe de cellules sanguines, il pourrait s'étendre à d'autres applications comme la transplantation d'organes solides pour moduler les conflits hôte/greffon.

Procédures

-Une irradiation faible dose, de chaque animal pour 63 souris réalisée une seule fois (durée d'environ 2 minutes sur une journée).: -Une injection intraveineuse sur animal conscient (non anesthésié) de cellules sanguines humaines, une seule fois en début d’expérience pour 63 souris (dure environ 5 secondes sur une journée). -Une anesthésie générale répétée (X4 maximum) pour 63 souris (anesthésie générale de 15 à 30 minutes maximum sur une journée). L'anesthésie générale est prévue soit 4 fois dans 1 semaine pour suivre par imagerie la dispertion et répartition tissulaire des cellules une fois par semaine (maximum 4 semaines) pour le suivi de la leucémie.

Impact sur les animaux

-la douleur légère induite par la piqure d’aiguille à l’injection des cellules (J0) -stress modéré lors de la procédure d'irradiation à faible dose, -Potentielles mais rares lésions d'inflammation de la muqueuse de la bouche après irradiation (pendant 3-5 jours) -Stress lié aux injections et aux anesthésies générales -Potentiels signes de maladie du greffon contre l’hôte (atteinte de la peau, du tube digestif et/ou du foie), avec une sévérité habituellement modérée. Les souris vont alors très progressivement (sur 4 à 6 semaines) perdre du poids et montrer des signes de fatigue et d’altération de l’état général. -Développement leucémique lent infiltrant la rate, le foie et les ganglions. Cette infiltration leucémique des organes est contrôlé par l'imagerie hebdomadaire basée sur la bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) qui permet d'arrêter l'expérimentation à un volume tumoral cible sans laisser se développer les symptômes terminaux de la leucémie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour confirmer les données cliniques et de bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) par des données microscopiques. Tâche1: prélèvement des organes cibles de la maladie du greffon contre l'hôte (peau, tube digestif, foie) pour analyse au microscope de la sévérité de la maladie développée. Tâche 2: prélèvement des organes cibles dans lesquels patrouillent les MDSCs pour observer par microscopie la localisation exacte et le devenir des MDSCs. Tâche 3: prélèvement des organes envahis par la leucémie pour explorer d'éventuels contacts cellulaires entre les cellules leucémiques et les MDSCs.

Remplacement

Nous avons optimisé in vitro nos connaisances sur le mécanisme d'action des MDSCs. Toutefois, pour proposer les MDSCs comme médicament de thérapie innovante chez l'Homme, une étude pré-clinique robuste dans un modèle murin est indispensable. En effet, dans les cancers liquides, aucune simulation informatique ("modèle in silico" )ne permet aujourd'hui de reproduire en laboratoire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules en thérapie. A ce jour, le seul modèle validé est le modèle murin.

Réduction

Nos études antérieures ont révélé un effet important de nos traitements, aboutissant à des différences significatives entre des groupes même avec un faible nombre d'animaux (n=3). Ainsi pour chaque tâche expérimentale, des groupes de taille minimale de trois animaux seront constitués.Des analyses statistiques seront réalisées pour interpréter les résultats. Afin de prendre en compte une viariabilité liée au donneur (variation d'efficacité d'un produit cellulaire en fonction du donneur humain d'origine), chaque tâche sera repétée trois fois avec des cellules issues de trois donneurs différents.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un secteur spécifique pour les animaux avec une déficience profonde de leur système immunitaire, en animalerie exempte d'organisme pathogène spécifique. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Les expérimentations d'imagerie seront atourées d'une anesthésie. Les points limites sont clairement identifiés : des signes généraux sur l'évaluation clinique de l'état général de la souris et le développement de signes cliniques de conflits hôte/greffon) et des signes spécifiques de chaque expérimentation ( suivi de la croissance tumorale), conduisant à un arbre décisionnel pour l'arrêt anticipé de la souffrance.

Choix des espèces

La modèle animal murin utilisé est un modèle mondialement reconnu pour étudier la greffe de cellules sanguines humaines. Ces souris n'ont pas de système immunitaire fonctionnel capable de rejeter des cellules sanguines de l'Homme (ce qui permet une étude à long terme des cellules sanguines humaines injectées). En revanche elles ont des cellules présentatrices d'antigènes qui peuvent activer les cellules sanguines humaines acceptées. Ainsi, ce modèle reproduit la maladie du greffon contre l'hôte couramment observé chez les patients greffés. On observe une réactivité des cellules sanguines humaines contre les organes cibles de la souris ( la peau, le tube digestif et le foie), ce qui mime ce qui est observé chez l'Homme. D'autre part, la greffe de cellules sanguines d'un donneur sain vers un patient est en général indiquée pour véhiculer un effet du greffon contre la leucémie. Or l'adjonction de lignées leucémiques humaines dans ce modèle de souris reproduit le contexte leucémique d'un patient. Notre projet vise à étudier l'administration d'un nouveau médicament (produit à partir de cellules du greffon du donneur) dans ce contexte de greffe de cellules sanguines. Nous devons étudier l'impact de ce nouveau médicament sur l'incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte et l'absence d'effet qui pourrait favoriser la leucémie. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe de cellules humaines est meilleure dans cette période de vie

Les souris de ce projet sont immunodéficientes et humanisées, la rate qu'on leur retire étant remplacée par des fragments de rate humaine, y compris de rate fœtale. 1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins répartis sur 112 jours et une échographie de quarante-cinq minutes tous les quatorze jours, leur immunodéficience les exposant par ailleurs aux infections. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que ces animaux sont modifiés et greffés de tissu humain, et prévoit de proposer les rates murines retirées à des équipes d'immunologistes du campus comme source de cellules.

Objectifs

Le premier objectif du projet est d’explorer expérimentalement le rôle de filtration de la rate et les différents mécanismes physiques et biologiques à l’origine de la rétention des globules rouges dans la rate, en particulier dans le cadre de maladies héréditaires (drépanocytose, sphérocytose héréditaire, ...) ou acquises (Paludisme,...). Dans ces maladies, la déformabilité des globules rouges est altérée, entraînant une rétention dans la rate à l’origine d’anémie et de complications pouvant être graves. Les mécanismes d’anémie et de congestion de la rate sont complexes et requièrent un modèle expérimental. Les modèles murins conventionnels ne sont pas totalement pertinents pour analyser cette fonction physiologique et les mécanismes physiopathologiques. Des souris greffées par des fragments de rate humaine permettraient en revanche d’aborder ces questions. La filtration des globules rouges est un phénomène dynamique, tridimensionnel et multicellulaire, impossible à répliquer entièrement in vitro dans l’état actuel de la technique. L’étude aura également pour objectif d’étudier la prise de greffe et le développement de fragments de rate fœtale. Cela permettra d’analyser la fonction filtrante et immunologique de ces rates immatures en considérant que leur développement reflète – ou non – en partie la poursuite de leur développement physiologique. En deuxième objectif, nous souhaitons explorer la faisabilité de l’auto-greffe splénique humaine afin de restaurer une fonction déficiente, sur le modèle de la préservation de la fertilité par cryopréservation-réimplantation différée des ovaires en médecine humaine. Chez les patients atteints de drépanocytose, une splénectomie est parfois nécessaire du fait de complications graves. La cryopréservation d’une partie du tissu splénique permettrait sa réimplantation et la restauration d’une fonction splénique normale chez les patients guéris ultérieurement de leur drépanocytose. Démontrer dans le modèle murin la prise de greffe avec des fragments de rate humaine serait une indication forte du succès possible de notre démarche. La probabilité de succès est élevée du fait du phénomène de splénose (repousse de petits fragments spléniques), observé tant chez l’être humain que chez la souris.

Bénéfices attendus

La rate joue un rôle crucial dans le système immunitaire et aide à maintenir une circulation fluide des globules rouges en éliminant ceux qui pourraient obstruer les petits vaisseaux. En cas de certaines maladies des globules rouges, la rate peut devenir hyperactive, entraînant une anémie et d'autres complications. Les mécanismes exacts de ces processus ne sont pas encore bien compris. Un processus spécifique appelé "pitting" permet à la rate d'éjecter des corps rigides ou des parasites morts des globules rouges sans les endommager. Ce processus est difficile à étudier en laboratoire, car il nécessite l'utilisation de rates humaines, qui sont rares et limitées. Pour mieux comprendre ces mécanismes, l’étude propose de greffer des fragments de rate humaines sur des souris afin d'observer directement la filtration des globules rouges et d'évaluer les effets de médicaments sur la déformabilité des globules rouges. Ce modèle pourrait également être utilisé pour des interventions thérapeutiques ou prophylactiques. L’utilisation de rates fœtale permettrait également d’étudier la maturation de ces dernières dans notre modèle. La perte de fonction splénique peut entraîner des complications graves. Après une rupture de rate traumatique, la rate peut se régénérer spontanément, ce qui suggère qu'une réimplantation contrôlée de tissu de la rate pourrait améliorer le pronostic à long terme des patients. Cette étude préclinique est une étape nécessaire avant de solliciter l'agence de la biomédecine pour la mise en œuvre d'une démarche ambitieuse de préservation de la fonction de la rate chez l'être humain, ce qui pourrait avoir de grands bénéfices pour certains patients.

Procédures

Les animaux dans ce projet expérimental seront soumis : Procédure 1 : - 2 à 6 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toutes les 8-12h - 1 à 3 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toute les 8-12h - 1 chirurgie (45 min) sur animaux anesthésiés et analgésiés - 8 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (30 sec) répétés tous les 14 jours sur une période totale de 112 jours - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux endormis jusqu’à 112 jours (45min) Procédure 2 : - Pour l’ablation de la rate et la greffe, les interventions seront les mêmes que pour la procédure 1 - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux anesthésiés jusqu’à un temps déterminé en procédure 1 (45 min) sur animaux anesthésiés - 2 injections (30 sec) espacées de 3 jours si besoin - 1 injection sur animaux endormis (2min) - 5 prélèvements sanguins (30sec) de faible volume répété à 1 min, 30 min, 2h, 24h et 48h - Imagerie sur animaux anesthésiés durant un temps défini ne dépassant pas 4 heures

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficiente ce qui augmente leurs sensibilités aux infections. Les injections et prélèvements de sang peuvent causer une douleur légère et temporaire à chaque site d'injection. La piqure d’aiguille pour l’injection elle-même provoque une douleur légère de courte durée. La chirurgie (exérèse de la rate, greffe) quant à elle, entraîne une douleur et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis à mort car étant des organismes génétiquement modifiés et/ou greffés et/ou injectés avec du tissu humain ils ne peuvent pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La démarche n'est pas directement applicable chez l'être humain et nécessite une étape préclinique. Les seules données antérieures disponibles sur cette démarche de greffe de rate humaine ont été obtenues chez la souris. Les modèles in vitro et ex vivo préalablement développés présentent des limites dans leur puissance d’exploration (visualisation directe de la filtration des globules rouges, évaluation de l’impact des médicaments in vivo), ne pouvant être franchies que par l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de souris impliquées est réduit au maximum pour confirmer la faisabilité de la démarche et évaluer les médicaments avant leur utilisation chez l'être humain. Nous souhaitons nous assurer d'une probabilité de prise de greffe fonctionnelle supérieure à 70%. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la prise de greffe lors de nos procédures permet un suivi transversal permettant de réduire le nombre d’animaux. Les rates murines enlevées lors de la splénectomie préparatoire seront proposées à des équipes d’immunologistes du campus comme source de cellules. Le nombre d’animaux a été défini avec un biostatisticien et à l’aide d’un outil statistique où nous considérons deux groupes et 3 répétitions. Chaque répétition sera divisée en 4 jours d'expériences, avec 2 animaux par groupe et par jour. Par conséquent, nous considérons un effet aléatoire jour qui inclut à la fois les effets de la répétition et du jour. Un effet lot/jour pourrait représenter 10,00 % de la variabilité totale, ce qui nous amène à multiplier le nombre total d'individus par un facteur adapté par rapport à une situation où aucun effet de lot n'est attendu. Résolution statistique de l'expérience : Nous avons décidé d'utiliser 8 individus par groupe et par répétition, ce qui porte le nombre total d'individus à 48. En tenant compte d'un effet lot/jour de 10,00 %, ces nombres devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des effets importants à très importants.

Raffinement

Le choix du modèle animal participe au raffinement en sélectionnant une espèce et une souche adaptées aux objectifs scientifiques tout en minimisant l’inconfort. Leur immunodéficience impose un hébergement en conditions sanitaires strictes où tout ce qui sera en contact avec les animaux sera stérile pour limiter les risques infectieux. Les interventions chirurgicales et injections seront faites sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée afin de limiter la douleur, le stress et d’optimiser la récupération. Des plaques chauffantes préviendront l’hypothermie, une réhydratation post-opératoire sera assurée, et un gel appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. Les greffons stériles seront traités afin de garantir une asepsie maximale et prévenir toute infection ou réponse inflammatoire. La greffe sera effectuée là où la rate se régénère naturellement. Cette technique est privilégiée car elle est robuste et évite une nouvelle incision. L’échographie permet un suivi transversal des animaux et déceler des signes précoces de nécrose des greffons. Les animaux seront observés quotidiennement, avec des critères d’évaluation précis basés sur les recommandations de la SBEA. Des points limites spécifiques et précoces, tels qu’une perte de poids, des signes de détresse, des signes inflammatoires ou d’infections sont identifiés et pourrons permettre de traiter l’animal avec l’avis du vétérinaire et le cas échéant, la mise à mort sera réalisée.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer des mesures fiables et indépendantes de fonctionnement anormal de la rate. Nous utilisons plusieurs techniques. Les marqueurs actuels, peu adaptés aux contraintes hospitalières, nécessitent une validation plus robuste comme prédicteurs de gravité. Le produit final visé est un test biologique de routine quantifiant la fonction splénique. Pour atteindre cet objectif, un modèle expérimental animal est indispensable. Après avoir testé diverses hypothèses physiopathologiques et agents pharmacologiques in vitro, nous devons désormais confirmer nos résultats in vivo pour proposer de nouvelles solutions thérapeutiques. Un modèle murin est essentiel, car les systèmes moins évolués ne reflètent pas suffisamment le contexte humain. L’humanisation du modèle murin par greffe d’organes humains a déjà permis des avancées significatives dans la compréhension de plusieurs phénomènes physiopathologiques. De jeunes adultes de 8 semaines seront utilisés afin d’être suffisamment âgés pour permettre une chirurgie aisée et suffisamment jeunes pour permettre un suivi prolongé (3 mois). De plus, cet âge correspond à l’âge des souris dans l’article publié sur lequel nous nous basons pour ce projet.

66 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un lymphome humain leur est greffé, suivi sept jours plus tard de lymphocytes T génétiquement modifiés, puis de six à huit séances d'imagerie sous anesthésie et de prélèvements sanguins étalés jusqu'au cinquante-deuxième jour. Le modèle tumoral paralyse les membres postérieurs, une douleur que le RNT classe comme modérée tout en indiquant qu'elle peut durer jusqu'à quatorze heures. Des tests en éprouvette ont déjà montré que la molécule déclenche le gène suicide et tue les cellules, ce dont le porteur conclut que la validation chez la souris est "indispensable".

Objectifs

Les lymphocytes T (LT) font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces LT pour le traitement des cancers est en plein développement. Ces thérapies par ces cellules, appelées CAR-T (Chimeric Antigenic Receptor-T), ont révolutionné le traitement des maladies du sang. Le principe consiste à prélever des cellules LT d’un patient, de les modifier génétiquement et de les lui réinjecter dans le but qu'elles reconnaissent et éliminent spécifiquement les cellules cancéreuses. Cependant, des préoccupations en matière de sécurité, tel que le risque d'effets secondaires, nécessitent des mécanismes d'élimination contrôlée des cellules CAR-T. Les gènes dit « suicides » offrent une solution prometteuse à cet effet. En effet, pour contrôler ces cellules CAR-T en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de ces gènes suicides qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvés. Les cellules CAR-T activées par ces médicaments meurent. Les objectifs de ce projet sont doubles. Dans un modèle de lymphome humain greffé chez la souris nous souhaitons : (1) Valider et définir la quantité de cellules CAR-T nécessaires pour éliminer le lymphome greffé chez la souris et (2) Evaluer l'impact du gène suicide sur l'efficacité antitumorale des cellules CAR-T et leur élimination.

Bénéfices attendus

Le bénéfice est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des cellules CAR-T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de cellules CAR-T et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies anti-tumorales.

Procédures

Dans notre étude, 66 souris analgésiés et anesthésiées seront transplantées avec un lymphome humain (1 fois, 30 secondes), 7 jours après la greffe, 58 souris recevront des lymphocytes T génétiquement modifiés (1 fois, 30 secondes) et 14 jours après la greffe 28 souris seront injectées par le médicament induisant l’activation du gène suicide ou une solution de contrôle (1 fois, 30 secondes). 30 souris vigiles auront deux prélèvements de sang (2 minutes maximum), un réalisé à 14 jours et l’autre 28 jours après la greffe. 28 souris vigiles auront à J17 après la greffe un prélèvement de sang d’une durée de 2 minutes maximum, 14 souris vigiles auront ensuite 3 autres prélèvements de sang (2 minutes) à J28, J42 et J52 après la greffe. Toutes les souris seront anesthésiées pour les 6-8 imageries durant 5 minutes et auront au préalable une injection d’un produit pour réaliser les imageries.

Impact sur les animaux

Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées. Du stress sera également généré lors des anesthésies gazeuses d'une durée de 3 à 5 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des cellules tumorales, des lymphocytes et du médicament ainsi que les prélèvements de sang pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 secondes à 2 minutes). Le modèle tumoral induit des paralysies des membres postérieurs de la souris entraînant une douleur d'intensité modérée d'une durée de quelques minutes à 14 heures maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus et d'organes pour des analyses tissulaires.

Remplacement

Des tests in vitro réalisés sur les cellules CAR-T ont montré que la molécule utilisée dans ce projet induit le déclenchement du gène suicide et l'activation du signal de mort dans les cellules par apoptose. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.

Réduction

Il s'agit d'une étude comportant un effectif de 66 animaux au total. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les groupes comporteront 2-6 animaux maximum tout en permettant une analyse statistique fiable des prélèvements par une méthode permettant de caractériser et compter des cellules.

Raffinement

Tout au long du déroulement des procédures, une observation quotidienne de l'état clinique des souris sera réalisée et le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins. Les injections de cellules sont réalisées sous anesthésie et sous analgésie, afin de réduire à son strict minimum le stress et l'inconfort de l’animal. Des points limites prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Afin de pouvoir greffer des cellules cancéreuses et les lymphocytes humains, une souris imunodéficiente doit être utilisée afin d'éviter le rejet des cellules humaines injectées. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-25 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.