Troubles immunitaires

4 332 souris vont être utilisées, chacune subissant selon la procédure jusqu'à douze prélèvements d'urine sous contention manuelle, cinq prises de sang, quatre injections, puis une injection létale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et durent dix à douze semaines par animal. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour vieillir plus vite, ce qui les fait mourir plus tôt, et le projet leur inflige une maladie auto-immune du rein pour observer comment l'âge en accélère l'installation. Le porteur écrit que le développement de cette glomérulonéphrite "n'est pas douloureux pour l'animal", tout en déclarant l'ensemble des procédures en gravité modérée.

Objectifs

L’altération progressive et irréversible du rein est une caractéristique du vieillissement chez l’homme conduisant à terme à l’insuffisance rénale chronique (IRC) puis à l’insuffisance rénale terminale nécessitant la mise en place de dialyse ou de greffe rénale Tandis que les fonctions immunitaires déclinent avec l’âge, le vieillissement est aussi caractérisé par une une augmentation du risque d’être atteint de maladies auto-immunes. Dans ces maladies, notre propre système immunitaire se retourne contre nous et produit des anticorps attaquant nos propre cellules. Parmi elles, la glomérulonéphrite extra-membraneuse (GEM) est une maladie auto-immune où des anticorps cible des cellules du rein. Bien que des avancées significatives aient été réalisées dans la compréhension de cette maladie, les facteurs favorisant son initiation restent peu compris, que ce soit du point de vue de l’induction de l’auto-immunité ou de la progression de la maladie. De plus, malgré un pic d’incidence de la GEM autour des 55-60 ans, l’influence du vieillissement sur la physiopathologie de la maladie n’a jamais été étudiée. Notre projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le vieillissement, au niveau rénal mais aussi immunologique, favorise l’induction et la progression de cette maladie rénale.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur l’induction et la progression de la GEM. Ceci permettra à terme de proposer de nouveaux outils diagnostiques ou pronostiques en identifiant des marqueurs de prédisposition à la GEM mais aussi d’ouvrir de nouvelles perspectives de voies thérapeutiques pour les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Au cours de la procédure 1, par animal sur tous les animaux du projet (12 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 12 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection lethale. Au cours de la procédure 2, par animal sur tous les animaux du projet (10 semaines) : - 1 injection sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 5 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 10 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection léthale.

Impact sur les animaux

Certaines des souris utilisées sont génétiquement modifiées pour avoir une accélération du vieillissement, ce qui entraine une mortalité à des âges plus précoces. Lors des expériences, les souris pourraient être sujettes à un stress et angoisse liées à leur manipulation voire des douleurs liées aux injections, prélèvements d’urine et de sang effectuées sur ces souris. Des complications éventuelles peuvent survenir suite à l’utilisation de seringue notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement. Le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse n'est pas douloureux pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d'effectuer une cinétique d'induction ou de progression de la maladie.

Remplacement

L’analyse des altérations au cours du vieillissement peut être étudiée in vitro sur modèles de cellules en 3D. La mise au point dans notre équipe de ce protocole in vitro, est à un stade précoce. De plus, bien que ces modèles cellulaires aient un potentiel important pour remplacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La GEM étant une pathologie où le système immunitaire produit des anticorps ciblant les cellules du rein, seul un modèle animal permettra de caractériser et surtout d'établir une cinétique permettant de mieux comprendre les mécanismes favorisant au cours du vieillissement l’induction et la progression de la maladie.

Réduction

Les souris disposant de deux reins, nous optimiserons l’utilisation de ces souris en effectuant différentes méthodes d’analyses sur chaque rein. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet en prenant en compte les effets attendus et le type de tests statistiques effectués.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures, tels que les traitements, que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur, de complications ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire une fois par semaine sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de suivi adaptée au modèle.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ce qui nous permettra d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser de nombreuses analyses nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, des études au sein de nombreuses équipes, dont la nôtre, montrent que les méthodes d’induction de la maladie utilisées reproduit l’ensemble des symptômes observés chez les patients GEM. Ceci permet d’établir ce modèle de souris comme un bon modèle de la maladie humaine. Enfin, les souris génétiquement modiiées pour avoir un vieillissement prématuré sont un modèle qui est déjà disponible et nous avons les expertises nécessaires pour diriger un modèle murin.

3 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans l'œil sous anesthésie, puis est placée jusqu'à quatre mois sous lumière intense, avec jusqu'à cinq électrorétinogrammes de trente à quarante-cinq minutes et dix-sept séances d'imagerie de la rétine. Le porteur affirme que les cultures de cellules isolées ne reproduisent pas la maladie dans un "organisme entier" et retient la souris comme espèce la plus appropriée. Il décrit par ailleurs des conditions d'hébergement inchangées pendant l'illumination, à ceci près que les cotons sont retirés des cages pour empêcher les souris de se cacher de la lumière.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l'âge est une maladie oculaire provoquée par une dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine, qui apparaît le plus souvent à partir de 65 ans. En France, environ 1,5 millions de personnes seraient atteintes de DMLA. Dans cette pathologie, un processus inflammatoire, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires, participe de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Notre projet vise à tester différentes molécules pouvant réduire ce processus inflammatoire et ainsi briser le cercle vicieux inflammation/dégénérescence. Nous étudierons l’effet de ces molécules sur des modèles murins adaptés.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’aider à la mise au point d’une thérapie pour rétablir à long terme l’immunosuppressivité sous rétinienne et empêcher l’accumulation de cellules inflammatoires pathogéniques, freinant ainsi significativement l’évolution de la DMLA.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules thérapeutiques par voie intraoculaire (1 fois par animal anesthésié, durée de l’intervention : moins de 5 minutes). Ils iront en stabulation sous une lumière intense (jusqu’à 4 mois). Des explorations fonctionnelles de la rétine seront réalisées sous anesthésie : par enregistrement d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, maximum 5 fois par animal) et de méthodes d’imagerie rétiniennes (durée 10 minutes pour les 2 examens, maximum 17 fois par animal).

Impact sur les animaux

Lors des anesthésies, il y a un risque de mauvaise réaction à l’anesthésiant (difficultés respiratoires, anxiété) et un risque d’hypothermie. Lors de l’injection dans l’œil, il y a un risque d’inflammation localisée (œil rouge) et de micro saignements. Lors de le procédure d’illumination, les animaux peuvent ressentir un stress lié à l’exposition à la lumière intense (animaux agités), et leurs fonctions visuelles peuvent baisser. Lors des explorations, les animaux peuvent également ressentir un stress lié à la contention lors de l’administration des collyres (animaux agités).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. Cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux, car nous avons besoin de prélever des organes entiers pour les analyser dans leur globalité.

Remplacement

Les études in vitro ou sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Nous prévoyons 3750 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 5 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables, selon nos expériences antérieures. Nous prévoyons d’injecter le traitement dans un œil et le contrôle dans le deuxième œil de chaque animal pour limiter la variabilité entre animal et réduire ainsi le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Une période d'acclimatation de 5 jours sera prévue avant tout début d'expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées standard avec enrichissement : 1 bâton en bois, coton. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Lors des expériences de d’illumination, les animaux sont placés dans une pièce différente, mais restent dans leurs cages de stabulation normale, selon les mêmes conditions, hormis la luminosité et les cotons qui sont retirés pour éviter que les animaux ne se cachent de lumière. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Les animaux bénéficieront si besoin d’une anesthésie générale et d’une anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant pour prévenir le risque d’hypothermie.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Nous utilisons des modèles génétiquement modifiés qui sont plus susceptibles à l’induction d’une inflammation pathogène, mimant la DMLA. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie étudiée.

Tous tués en fin de protocole pour prélever leur sang, leur liquide alvéolo-pulmonaire et leurs tissus pulmonaires, 1 680 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun inhale, vigile, des substances tussigènes pendant vingt à trente minutes pour déclencher des épisodes de toux, isolé dans une boîte en plexiglas. Le porteur décrit une bronchoconstriction, une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de mucus par le museau, et prévoit en plus des chirurgies de pose de cathéter de vingt à trente minutes et des ponctions veineuses répétées sous anesthésie. Il écrit limiter le nombre d'animaux "tout en prenant en compte les besoins de nos clients", et fixe le sexe et le poids des cobayes "selon la demande client".

Objectifs

La toux est un réflexe primordial pour la protection des voies respiratoires et pulmonaires contre la production de substances internes (sécrétions) ou externes (inhalées). La toux chronique (durée dépassant les 8 semaines) affecte environs 10% des adultes de la population mondiale et représente un des symptômes les plus courant pour lequel les individus consultent les centres de soins primaires. La toux représente également la manifestation clinique dont les patients atteints de pathologies respiratoires se plaignent le plus. De nombreux facteurs de risques sont associés à la toux dont l’âges et le genre, les pathologies pulmonaires et extra-pulmonaires (e.g. infections respiratoires, asthme, reflux gastroœsophagiens…), les facteurs environnementaux (e.g. polluants), les produits chimiques irritants ou les allergènes. Le plus souvent, les patients souffrant de toux chroniques présentent également une hypersensibilisation des voies nerveuses impliquées dans le réflexe de toux amplifiant la fréquence et le nombres d’épisodes de toux. Malgré l’existence de nombreux traitements permettant de lutter contre ces épisodes de toux, l’efficacité de ces derniers peut être limitée et présentent un effet interindividuel très variable. De plus, chez 40% des patients, les mécanismes physiopathologiques à l’origines de la toux chronique ne sont pas toujours bien identifiés diminuant ainsi l’efficacité de la prise en charge du patient avec un traitement adapté. Le projet a donc pour objectif de tester l’efficacité de candidats médicaments sur un modèle de toux in vivo chez le cobaye vigile. De plus, il est essentiel de pouvoir connaitre la dose efficace d’un candidat médicament en déterminant sa concentration permettant d’assurer son effet thérapeutique optimal tout en minimisant le risque d’effets indésirables. Pour cela, il pourra être établi une analyse du devenir du candidat médicament dans l'organisme après son administration, et testé en parallèle de l’étude de son efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des arguments scientifiques sur l’efficacité de nouveaux candidats médicaments chez le cobaye soumis à l’inhalation d’agent irritants des voies respiratoires. Les effets de ces molécules pourront être évalués sur une analyse solide de la réponse comportementale des épisodes de toux mais pourront également être confortés par une analyse approfondie de la réponse moléculaire et/ou immunohistochimique. En parallèle, l’établissement du profil pharmacocinétique des candidats médicaments pourra permettre de déterminer leur dose thérapeutique optimale pour, à terme, proposer une posologie adaptée de la molécule d’intérêt.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'inhalation de substances tussigènes afin d'induire des épisodes de toux. La durée de cette étape est d'environ 20 à 30 min et s'effectue sur animaux vigiles. Ces derniers seront également traités avec des candidats médicaments ou des analgésiques par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale de manière aigue ou répétée (pour les analgésiques si besoin). Ces types d'administrations prennent 1 minute pour être effectuées. Les cobayes pourront également être traités avec les candidats médicaments par voie intraveineuse directement dans la veine jugulaire lorsqu'une seule administration sera nécessaire. Cette procédure se déroule sous anesthésie gazeuse et dure environs 10 min. Les administrations intraveineuses peuvent également être effectuées à travers un cathéter veineux sur animaux vigiles pour réaliser des traitements répétés et l'acte prend 1 minute. Il sera cependant nécessaire de réaliser une chirurgie unique sous anesthésie gazeuse pour implanter le cathérer dont la durée de l'intervention est de 20 à 30 min. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux veineux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée pour une durée de 10 min par prélèvement.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. De plus, pour l’analyse de la toux, l’animal doit être placé et isolé dans une boite en plexiglass pendant plusieurs minutes ce qui peut engendrer de l’anxiété. L’induction des épisodes de toux via l’inhalation de substances tussigènes est une source d’inconfort pour le cobaye car ce sont des agents irritants pour les voies respiratoires et peuvent également causer une bronchoconstriction entrainant une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de muscus par le museau. Pour les administrations de composés par voie sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Une ou plusieurs administration par voie orale des composés pourront être réalisées, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille pouvant être source de douleur. Certaines modalités d’administration, telles que les injections intraveineuses directement dans les vaisseaux veineux nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux tout comme lors des chirurgies d’implantation de cathéters. Cette dernière modalité peut entrainer un risque d’infection et être l’origine de douleur et de perte de poids en post-opératoire. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée, générant potentiellement du stress et de l’inconfort.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir collecter le sang, le liquide alvéo-pulmonaire, les tissus pulmonaires et les voies aériennes pour quantifier les effets du candidat médicament sur l’aspect moléculaire et/ou immunohistochimique. De même, certains animaux seront mis à mort pour les analyses de pharmacocinétique permettant de quantifier la biodistribution par organes du candidat médicament étudié.

Remplacement

L’objectif principal du projet étant de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur les caractéristiques comportementales de la toux (i.e., fréquence et/ou intensité des épisodes de toux), il n’est pas possible de substituer les cobayes par des modèles in vitro. Par ailleurs, si des méthodes d’extrapolation in vitro-in vivo sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (nombre de voies d’administrations et de doses à tester et nécessité de collecter les organes en fin de protocole). Selon l’objectif des projets, chaque animal pourra être son propre contrôle au cours des inductions des épisode de toux. Un même animal inclus dans un des groupes d’efficacité subira les tests d’induction de la toux, les prélèvements sanguins et la collectes des organes permettant de faire un suivi longitudinal. Le nombre d'animaux choisi par groupe doit permettre de mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre le groupe contrôle négatif et le(s) groupe(s) traité(s) avec un composé de référence. Par ailleurs, suite à la phase de pré-sélection des animaux répondeurs ou non-répondeurs aux agents tussigènes, les animaux non-répondeurs pourront être utilisés dans les groupes d’analyse de pharmacocinétique du même projet. Pour ces analyses pharmacocinétiques, chaque animal pourra être son propre contrôle en fonction du volumes de sang nécessaire (

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures, les nouveaux environnements ainsi qu’aux expérimentateurs. Avant de rentrer dans la salle d’hébergement, il est demandé aux expérimentateurs de toquer 2 fois à la porte pour diminuer le stress lié à la surprise. Pour l'induction de la toux par inhalation d’agents tussigènes : - les inductions sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. - les animaux sont habitués à être placés dans la boite de plexiglass. - l’induction de la toux se fait sur animaux vigiles évitant l’expositions à des agents anesthésiques et aux méthodes d’administrations de ces agents qui peuvent être source de stress. - pour limiter la bronchoconstriction, un bronchodilatateur est administré à la fin après la nébulisation facilitant la ventilation. Les actes pouvant générer de la douleur telles que les implantations de cathéter et les administration/prélèvements dans la veine jugulaire nécessitant une incision cutanée seront réalisés sous anesthésie chimique ou gazeuse et analgésie pré-opératoire et/ou locale et/ou post-opératoire selon le score sur la grille d’observation. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins et les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent) pour compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (min 2x/jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale la plus appropriée pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments antitussifs et la physiologie du réflexe de toux est le cobaye. Cette espèce exprime une réaction comportementale proche de celle de l’Homme en présence de 3 agent tussigènes communément utilisés pour induire des épisodes de toux chez l’Homme. En effet, les cobayes sont capables de tousser contrairement aux rats et aux souris ne permettant pas, chez ces espèces, de modéliser la toux d’un point de vue comportemental. De plus, les mécanismes nerveux sous-tendant le réflexe de la toux impliquent les fibres sensorielles composant le nerf vague, dont la neurophysiologie et l’aspect histologique sont très similaires à ceux de l’Hommes. Suite à l’activation de ces fibres, l’intégration des influx nerveux au niveau supraspinal se fait dans le bulbe rachidien dans le noyau du tractus solitaire tout comme chez l’Homme. Selon la demande client, les animaux utilisés dans le cadre de ces études seront des cobayes : -Femelles : > 200g correspondant à un âge > 4-8 semaines -Mâles : > 350g correspondant à un âge > 9-10 semaines Ces âges correspondent, en fonction du genre, à l’atteinte de la maturité sexuelle indiquant un ralentissement du développement, limitant ainsi la variabilité des résultats.

206 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une biopsie de l'extrémité de la queue vers six à huit jours de vie pour le génotypage, puis un tatouage à l'encre. Le porteur crée deux lignées portant des mutations de facteurs de réparation de l'ADN, prévoit une létalité embryonnaire, et annonce des résultats susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques pour les patients dont le génome est instable. Si un phénotype dommageable apparaît avant le sevrage, les souris sont tuées immédiatement pour que leur système hématopoïétique soit analysé.

Objectifs

Des mutations dans des génes impliqués dans la stabilité du génome peuvent causer des défauts hématopoïétiques. Afin de déterminer quelles sont les conséquences de ces mutations in vivo, 2 modèles de souris portant ces mutations seront produits. Ces modèles permettront de déterminer les conséquences fonctionnelles de ces mutations en se focalisant sur le système hématopoïétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de ces mutations et plus largement sur le rôle des facteurs analysés dans la stabilité du génome. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients présentant une instabilité du génome.

Procédures

Biopsie de la queue réalisée vers 6-8 jours de vie en vue du génotypage (une biopsie par animal). Une biopsie correspond à un prélèvement de l'extrémité de la queue par animal qui dure quelques secondes. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation.

Impact sur les animaux

Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défauthématopoïétique. Stress associé à la biopsie nécessaire pour le génotypage ainsi que le tatouage (marquage à l'encre). De plus, une létalité embryonnaire pourrait être observée.

Devenir

A la fin de chaque procédure les souris seront mis à mort selon la méthode règlementaire utilisée en fonction de l’âge des souris

Remplacement

Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement des cellules du sang qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. En effet, le développement des cellules sanguines des mammifères et leurs rôles sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN sera en grande partie réalisée dans des lignées cellulaires des différentes lignées de souris ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.

Réduction

En se basant sur des tests statistiques, nous réduiront au maximum le nombre de souris utilisées pour obtenir les résultats escomptés. Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des lignées cellulaires obtenues de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris seront observées de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés, morceaux de bois). Le maintien des souris dans une zone sans pathogène devrait les préserver d'infections opportunistes et ainsi éviter un caractère dommageable. La mise à mort de la souris sera réalisée selon la méthode réglementaire en fonction de l'âge en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites observés lors du scoring hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement des cellules sanguines, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les souris et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (au stade embryonnaire (E13) ainsi qu'après la naissance) sera déterminé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système hématopïétique sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel). Si un phénotype dommageable est observé avant cette période, les souris seront immédiatement mise à mort et leur système hémaopoïétique sera analysé.

Rendus immunodéficients par construction, puis greffés de cellules souches et d'un fragment de thymus humains, 120 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La greffe de thymus est placée sous la peau ou sous la capsule rénale, suivie d'injections d'anticorps dans le ventre aux jours 0, 7 et 14, puis de prélèvements de sang derrière l'œil aux semaines 12, 18 et 24. Le porteur mentionne parmi les atteintes possibles la séparation de la mère, le risque qu'elle rejette ses petits, et une réaction du greffon contre l'hôte, sans en décrire les manifestations. Tous sont tués à l'issue pour prélever sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus.

Objectifs

A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Afin de pouvoir répondre à ce type de problèmatique, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire en mimant de manière plus spécifique la physiologie humaine. Et cela tous en permettant d'extrapoler les effets qu'ils pourront avoir avec d'avantage de sécurité. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Ce projet expose donc la procédure visant à améliorer l'humanisation de rats immunodéficients qui recevront une greffe de cellules souches et une greffe de thymus.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation dans les rats humanisés par une greffe de cellules souches et une greffe de thymus. Ces animaux pourront montrer un système immunitaire semblable au système immunitaire humain.

Procédures

Les différentes interventions sur les animaux sont : l'injection de cellules souches, la greffe de thymus soit en sous-cutanée soit sous la capsule rénale (durée entre 10-20 min). Les injections d'anticorps LoCD2b en intra-péritonéale à J0, J7 et J14. Ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil). Toutes ces procédures expérimentales sont maitrisées.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendues sont : le stress dû à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales (placement biopsie thymique en sous cutanée ou sous la capsule rénale, l'injection en ip, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux, GVHD...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude grâce à une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux afin de pouvoir documenter l'effet des différents traitements étudiés sur le système immunitaire.

Remplacement

Il n'est à l'heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et d'étudier l'effet sur celui-ci d'anticorps et/ou médicament. Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Le rat ayant un système immunitaire humain constituera donc un modèle scientifiquement robuste et fiable pour reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entres les groupes.

Raffinement

Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter le stress du à l'expérimentation. Les rats seront hébergées en cages ventilées par groupe de 2 à 5 individus dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). La nourriture et l'eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Par ailleurs, nous maitrisons les gestes expérimentaux. L'état de santé des animaux seront surveillés par une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.

Choix des espèces

Le choix du rat repose sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris. Les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés.

2 052 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie d'ischémie-reperfusion du rein gauche de quarante-cinq minutes à une heure, l'ablation complète du rein droit la veille de sa mise à mort, jusqu'à sept semaines d'administration quotidienne des composés testés, des micro-prélèvements de sang et des échographies. Le porteur décrit les suites possibles de l'opération, hémorragie lors de la pose du clamp, douleurs, atteinte partielle de la fonction rénale, sang dans les urines, perte de poids. Les molécules ainsi évaluées viennent de la recherche de ses clients et ont déjà montré leur efficacité sur des cellules rénales humaines en culture, un résultat que le projet propose de confirmer sur deux mille souris opérées.

Objectifs

La greffe de rein est un traitement de choix de certaines maladies rénales chroniques (MRCs) arrivées à un stade ultime. Toutefois, il s’accompagne d’un phénomène incontournable : le syndrome d’ischémie-reperfusion (IR) rénal. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un manque d’apport temporaire en nutriments et en oxygène. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit quant à elle par une reprise de la circulation sanguine. Cette reperfusion est brutale ce qui génère énormément d’inflammation au niveau du greffon. À court terme, les conséquences délétères du syndrome d'IR se traduisent principalement par une reprise différée de la fonction rénale survenant post-transplantation, elle correspond à une insuffisance rénale aiguë (IRA). À plus long terme, l’IRA peut évoluer soit vers (1) une MRC dans laquelle on peut observer l’apparition progressive de lésions microvasculaires et d’une fibrose rénale, soit vers (2) une insuffisance rénale terminale qui mène au retour du patient sur liste d’attente pour une nouvelle greffe de rein exacerbant ainsi le besoin continu d’organes. Malgré les progrès réalisés dans la prise en charge de ces patients, l’IRA d'origine ischémique demeure une complication fréquente et grave, associée à un risque accru de morbidité et de mortalité. Actuellement, les traitements les plus courants reposent sur l’administration d’immunosuppresseurs et l’utilisation d’une fluidothérapie. En revanche, ils n’ont que pour but principal une prévention du rejet de la greffe et un maintien de la volémie du patient, respectivement. D’autres stratégies sont en cours de développement et impliquent entre autres des molécules additives aux solutions de conservation, des modalités de perfusion du greffon ou encore des molécules administrées directement chez le receveur. Ces approches n’étant pas validées, il apparaît comme étant primordial de renforcer les recherches dans cette indication. L’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés issus de la Recherche de nos clients dans un modèle d’IR rénale chez la souris afin de prévenir et de traiter le syndrome d’IR chez l’Homme. Ces composés ayant par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur des cellules rénales humaines de patients.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels consistent en l’administration d’immunosuppresseurs et l’utilisation d’une fluidothérapie, mais ne présentent pas d’activité majeure sur l’IR générée au cours de la transplantation rénale, ni même sur la transition d’une IRA vers une MRC qui en découle. De plus, les immunosuppresseurs sont associés à de nombreux effets secondaires. L’identification d’un ou plusieurs candidat(s) médicament(s) agissant plus spécifiquement au niveau du greffon permettra d’augmenter l’efficacité du traitement tout en diminuant les effets secondaires et participera activement à réduire le nombre de patients en attente d’une nouvelle de greffe de rein.

Procédures

1/ Chirurgie ischémie-reperfusion du rein gauche sous anesthésie gazeuse (environ 45 minutes-1 heure), une fois dans l’étude 2/ Chirurgie néphrectomie sous anesthésie gazeuse (ablation complète du rein droit, environ 20 minutes), une fois dans l’étude et la veille de la mise à mort de l’animal 3/ Injection sous-cutanée d’un analgésique sur animal vigile, deux fois le jour de la chirurgie (quatre fois au cours d’une étude) 4/ Administration des composés à tester ou de leur solvant soit par gavage oral, soit par injection en sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineux, une à deux fois/jour pour la voie orale ou sous-cutanée, une fois/jour pour la voie intrapéritonéale, trois fois/semaine à raison d’une fois/jour pour la voie intraveineuse pendant un maximum de 7 semaines 5/ Micro-prélèvements de sang réalisés en quelques secondes sur souris vigiles, une session d’1 à 3 ponction(s) sur 24 heures, une semaine minimum de récupération (trois sessions maximum) 6/ Échographies effectuées sous anesthésie gazeuse au maximum deux fois dans une étude (environ 20 minutes/examen) 7/ Anesthésie gazeuse pour les prélèvements sanguin et urinaire puis la mise à mort, une fois dans l’étude

Impact sur les animaux

Les effets indésirables associés à la chirurgie sont : - pendant la chirurgie : stress lié à l’anesthésie, risque d’hémorragie lié à la pose et/ou retrait du clamp sur les vaisseaux et également lors de la néphrectomie - post-chirurgie : douleurs, atteinte partielle de la fonction rénale, mobilité réduite, perte de poids dans les 24 à 48hrs post-chirurgie, sang dans les urines (non systématique) Les différents traitements administrés soit par gavage oral, soit par injection en sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse sont susceptibles de créer de l’inconfort voire de la toxicité. Les différents prélèvements de sang réalisés au cours de l’étude peuvent également générer de l’inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale, des analyses sur les reins étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement l’ensemble des caractéristiques associées au syndrome d’ischémie-reperfusion, l’insuffisance rénale aiguë et sa transition vers une maladie rénale chronique qui en découlent, ni même la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend ainsi nécessaire le recours à des expériences in vivo pour comprendre ce phénomène pathologique et évaluer de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter le nombre d’animaux lors de la phase de mise au point. Le nombre de souris par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. L’imagerie par ultrasons (échographe), méthode non invasive, sera employée pour un suivi longitudinal des lésions microvasculaires et, par conséquent participera à diminuer le nombre d’animaux par groupe. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés au préalable sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant toute manipulation. Hébergement : Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (enrichissement : igloo, sizzle pad, aspen). Chirurgie (ischémie-reperfusion et néphrectomie) : Afin de palier l'inconfort lié aux gestes chirurgicaux, un programme d'anesthésie sera effectué. Un anti-douleur sera administrée en sous cutanée 30 minutes avant et 4 heures après la chirurgie suivi d’un apport dans l’eau de boisson pendant 48 heures. Un antiseptique puis un anesthésique local seront appliqués sur la peau au niveau de la zone d’incision. Pour éviter l’assèchement des yeux, une goutte de gel ophtalmique sera déposée sur chaque œil au début et en fin de procédure. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Une sonde rectale sera placée afin de mesurer la température corporelle, le tapis régulera alors sa température pour maintenir le corps à 37°C. En fin de procédure, les animaux seront replacés dans leur cage sur tapis chauffant jusqu’à leur réveil. Afin de faciliter la prise de nourriture, quelques croquettes humidifiées seront placées dans la cage. Un enrichissement adapté (igloo en carton) sera utilisé afin d’éviter tout accroc avec la cicatrice. La litière sera également remplacée par une litière plus douce et plus absorbante en fibre de cellulose pour éviter toute irritation de la cicatrice. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou à la mise à mort anticipée de l’animal. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse profonde.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature pour notre modèle de transition IRA-MRC. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.