Troubles immunitaires

Rasées et greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome, 392 souris reçoivent au quatrième puis au dixième jour des anticorps qui lèvent le frein immunitaire, avant de subir au douzième jour l'ablation chirurgicale de la greffe et de la peau au-dessus. Une dépigmentation apparaît vers le trente-cinquième jour, et le suivi se poursuit par une anesthésie gazeuse hebdomadaire pendant seize semaines pour peser, mesurer et photographier, avec quatre prises de sang. 400 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées entre un et neuf mois pour les prélèvements. Le porteur décrit un arbre décisionnel dont les points limites comprennent la prostration, la taille maximale de la greffe, la nécrose et le saignement.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 35 jours, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 9 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

392 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 5min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 10min). Puis, 1 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée : 16 semaines x 3min). Entre 1 et 4 mois, en plus du suivi visuel, nous prélèverons 3 fois 100µl de sang pour analyser les cellules circulantes du système immunitaire ( 3x1min). Puis, à la fin de l'expérience (de 4 à 9 mois), nous pourrons encore prélever une 4ème fois 100µl de sang pour nos analyses.

Impact sur les animaux

La piqure d’injection des cellules en intradermique dans le flanc gauche sous anesthésie légère gazeuse peut entrainer une rougeur. 392 animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, uniquement au niveau du point d’injection des cellules. La résection par chirurgie, d’une durée de 5 à 8 minutes, entraine au réveil un état de stress lié à un léger manque de mobilité de la patte arrière à cause de la pose de 2 points de suture et des 4 à 5 agrafes le long des berges de la plaie. Durant les premières minutes après le réveil, une douleur est ressentie par les animaux qui présentent des signes (dos vouté, raideur de la patte postérieure gauche, marche avec les pattes postérieures écartées). Après 10min, les souris retrouvent leur mobilité et un comportement normal (grooming, activité exploratoire, interaction sociale). Les sites d’injections d'analgésique en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse légère peuvent présenter une rougeur. Les prises de sang effectuées à la joue nécessitent une contention stressante pour l’animal pendant 30s. La pression sur la joue pour arrêter le saignement ajoute du stress.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 400 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du vitiligo. D'après la publication de référence, nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 9 semaines car l'induction du vitiligo est maximal à cette période et les injections ne sont pas génées par le stade anagène du développement du système pileux.

Une injection qui déclenche une inflammation, un AVC provoqué chirurgicalement en une trentaine de minutes, des injections de microparticules d'oxyde de fer, quarante minutes d'imagerie par résonance magnétique, une heure d'imagerie par ultrasons après ouverture de la peau du crâne, la pose d'une fenêtre crânienne, puis une perfusion intracardiaque. 3 025 souris vont être utilisées dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour savoir comment les cellules inflammatoires gagnent le cerveau après un accident vasculaire cérébral. Le porteur annonce une pesée quotidienne et une notation de la grimace, les souris étant tuées au-delà de 15 % de perte de poids ou d'un score supérieur à sept pendant les quarante-huit heures critiques. Toutes sont mises à mort pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Les méninges ont été récemment (re)découvertes en tant que voie d’infiltration immunitaire, notamment dans les pathologies auto-immunes, et jouent également un rôle dans la régulation du débit sanguin cérébral, le drainage des antigènes vers le compartiment immunitaire, ainsi que la circulation des leucocytes du parenchyme vers la circulation sanguine. Cependant, le rôle des méninges dans l’AVC ischémique est peu connu. A partir de ces informations, nous suggérons qu’une meilleure compréhension des voies et des mécanismes par lesquels les cellules inflammatoires infiltrent le parenchyme à la suite d’un AVC ischémique nous conduira vers de nouvelles possibilités de traitement. Afin de répondre à cette problématique, le projet prévoit l’utilisation combinée de techniques d’imageries innovantes et performantes, de modèles expérimentaux adaptés et des manipulations aux niveaux tissulaires et cellulaires, et porterons notre attention vers les lieux de l’inflammation méningée.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet pourront grandement améliorer notre compréhension de la physiopathologie de l’AVC et présentent un grand potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux du projet seront répartis en plusieurs groupes et seront soumis à certaines interventions correspondant au protocole suivi par chaque groupe. L’ensemble des interventions prévues durant le projet sont les suivantes : - Une injection intrapéritonéale d'un produit induisant une inflammation (animal vigile contentionné, < 1 minute) - L’induction d’un AVC (acte chirurgical, environ 30 minutes) * - Des injections intraveineuses de microparticules d’oxyde de fer (< 1 minute) * - Des examens d’imagerie par résonance magnétique et par particules magnétiques (environ 40 minutes) * - Des examens d’imagerie par ultrasons, nécessitant l’ouverture de la peau de la tête (contient un acte chirurgical, environ 1 heure) * - Des examens d’imagerie en microscopie bi-photonique, nécessitant l’ouverture de la peau de la tête (contient un acte chirurgical, environ 40 minutes) * - Une pose de fenêtre crânienne (acte chirurgical, environ 30 minutes) * - Perfusion intracardiaque (acte chirurgical, environ 10 minutes) * Les interventions marquées d’un astérisque sont réalisées sur l’animal sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient : Pour l’ensemble des procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et par le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids, observation dans la cage en s’assurant du bien-être des animaux, échelle de grimace de la souris, prise alimentaire et boisson). Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra en un simple coup d’œil d’identifier et de surveiller particulièrement les animaux les plus « à risque ».

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales prévues pour la réalisation du projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants, car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La physiopathologie du modèle, globalement établie, nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra de mieux comprendre la physiopathologie de l’accident vasculaire cérébral et de ce fait améliorer la récupération des patients.

Réduction

Notre projet ne permettant pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale, nous nous sommes assuré d’utiliser le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur chaque modèle. Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues). L’ensemble des échantillons prélevés lors des procédures pourra être partagé et utilisé, permettant une réduction du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés durant tout le projet. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun comportement de maladie. Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (échelle de grimace de la souris) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle malgré les soins apportés. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra en un simple coup d’œil d’identifier et de surveiller particulièrement les animaux les plus « à risque ». Durant les chirurgies prévues dans la procédure, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie (injection sous cutanée minimum 20 minutes avant le début de la chirurgie). Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l’endroit à inciser. Les yeux des souris seront couverts par du gel ophtalmique afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris sont placées dans des enceintes de réveil chauffées, avant d’être remises dans leur cage respective, où elles disposeront de croquettes humides ou de diet gel auxquels elles auront été habituées sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature, et les techniques employées sont bien maîtrisées. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont similaires chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. L’ensemble des procédures comprend des animaux âgés de 8 à 15 semaines correspondant à un stade jeune adulte, ainsi que des animaux âgés de 16 mois, correspondant à un stade adulte âgé. Cela permettra de fournir un modèle pertinent et de reproduire la variabilité liée à l’âge dans l’inflammation et la récupération post-ischémique.

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mini-pompe osmotique diffusant des anticorps de patients leur est implantée sous la peau du dos au cours d'une chirurgie d'une heure trente, sans anti-inflammatoire possible puisque les maladies étudiées sont neuroinflammatoires. Suivent trois tests comportementaux étalés sur 37 jours, dont sept jours d'apprentissage à retrouver une plateforme cachée dans une piscine remplie d'un liquide opaque et un conditionnement contextuel en chambre, les mâles étant hébergés seuls, ce qui supprime selon le porteur le blottissement et le toilettage entre congénères. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ni in silico ne permet d'étudier l'effet de ces anticorps sur la mémoire et que seuls des animaux vivants le permettent.

Objectifs

Les maladies de la neuromyélite optique (NMOSD) et de la MOGAD sont des maladies neurologiques auto-immunes très invalidantes qui détruisent certaines cellules du cerveau. Ce n’est que récemment que des études cliniques ont mis en évidence des atteintes en dehors du nerf optique et de la moelle épinière, notamment des atteintes de l’hippocampe dans le cerveau qui est une région responsable de la mémoire, et des troubles de la mémoire. Ces troubles sont encore peu étudiés dans ces deux maladies alors que cela représente un réel handicap chez les patients. Une étude préliminaire utilisant des anticorps de patients ayant la NMOSD (appelés NMO-IgG) a démontré que les NMO-IgG impactaient l‘activité des neurones de l’hippocampe suggérant un mécanisme concernant l’origine des troubles de mémoire chez ces patients. Les effets de substances pharmacologiques suggèrent qu’il est possible de combattre les effets délétères des anticorps de ces maladies sur la mémoire. L’objectif est de tester l’impact sur la mémoire spatiale des auto-anticorps NMO-IgG et MOG-IgG (anticorps de patients ayant la MOGAD) chez la souris. Il s’agira dans un premier temps d’évaluer si les souris développent des troubles de la mémoire liés à la présence de ces anticorps par la réalisation d’expériences testant la mémoire spatiale, une mémoire dépendante de l’hippocampe. Si tel est le cas, des substances pharmacologiques seront utilisées dans un second temps afin de déterminer si elles bloquent les troubles de la mémoire. Ce projet permettra d’une part de déterminer si les anticorps de ces maladies induisent des troubles de la mémoire, et d’autre part d’offrir de nouvelles solutions thérapeutiques ciblées de ces atteintes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra pour la 1ère fois d’identifier l’impact des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG sur la mémoire. Cette étude permettra de caractériser les troubles de la mémoire, si ce sont des troubles de l’apprentissage ou des troubles de la consolidation de la mémoire, dans la NMOSD et la MOGAD. Ce projet permettra également d’analyser l’impact des anticorps sur différents types cellulaires dans l’hippocampe. Il permettra ainsi d’établir un lien entre auto-immunité, astrocyte et myéline étant des types de cellules présentes dans l’hippocampe et impliquées dans la mémoire. Enfin grâce à l’utilisation de produits pharmacologiques visant à rétablir les troubles de la mémoire, ce projet est une approche pré-clinique qui permettra d’offrir des pistes thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez les patients ayant la NMOSD et la MOGAD.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale avec implantation d'une mini-pompe osmotique, l'intervention durant 1h30 au maximum. L'intervention chirurgicale est suivie par une phase de récupération d'environ 5 jours. Par la suite, ils passeront 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 37 jours. Le premier test qui durera 30 minutes permet d’évaluer l’état de stress de la souris. Pour le second test, la souris qui est posée dans une piscine avec un liquide opaque et thermostaté doit pendant 7 jours apprendre à se rappeler de l’emplacement d’une plateforme cachée. Un jour et un mois après apprentissage, les capacités de rappel de l’emplacement de la plateforme seront testées. Le dernier test consiste à placer la souris pendant 6 minutes dans une chambre de conditionnement où elle pourra associer un évènement au contexte dans lequel elle est (la chambre). Un jour et un mois après, la souris est replacée dans le même contexte (la chambre) pour tester les performances de sa mémoire associative. Ces deux derniers tests permettent d’évaluer l’apprentissage et la consolidation de la mémoire spatiale.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire des effets secondaires indésirables : perte de poids, douleur, stress pendant quelques jours. Les souris seront implantées avec une mini-pompe pouvant représenter une gêne et de l’inconfort pour les souris. La réalisation d‘injections peut engendrer du stress. Cela peut mener à des infections chez la souris tout comme la présence de points de suture. Les tests comportementaux peuvent également induire de l’inconfort (nouvel environnement), un certain degré de stress et de la fatigue (tests répétés). L’hébergement spécifique des mâles induit chez les souris des interactions sociales minimisées et une absence de contact physique positif qui empêche le blottissement, le toilettage et le réchauffement des souris entre elles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et d'analyser les altérations morphologiques et cellulaires.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle cellulaire ou in silico ne peut permettre d’étudier les conséquences cognitives des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG. L’étude préliminaire ex vivo, bien qu’elle permette l’étude de mécanismes relatifs aux processus de mémoire, n’est pas suffisante pour démontrer un potentiel effet des anticorps sur des troubles de mémoire. L’étude physiopathologique de ces deux maladies, et donc l’effet d’anticorps sur la mémoire via des tests comportementaux, ne peut être effectuée que grâce à l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été établi à 15. Les prédictions statistiques se basent sur les résultats de plusieurs études comportementales menées chez la souris où le nombre d’individu requis pour observer des différences dans des tâches de mémoire où le comportement est subtil est de 15 avec une puissance statistique fiable, mais aussi sur l’évaluation d’un article. Dans cet article utilisant la même méthodologie que ce projet (diffusion d’anticorps humain de patients via une mini-pompe osmotique chez des souris de même souche), les résultats montrent qu’il faut au moins 15 souris par groupe pour atteindre une bonne puissance statistique. Deux études pilotes seront réalisées en amont des deux études comportementales pour permettre de valider la méthodologie. Il est important de noter que la deuxième étude pilote et l’étude comportementale sur la consolidation ne seront réalisées que si des différences statistiquement significatives sont obtenues lors de l'étude comportementale sur l’apprentissage. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, les souris ayant subi les tâches comportementales serviront également aux analyses du cerveau afin de corréler sur un même animal les performances de mémoire et les atteintes morphologiques.

Raffinement

Les animaux seront habitués à leur utilisateur et seront hébergés par petit groupe dans les cages ce qui permettra de réduire leur niveau de stress. Les cages seront enrichies par l’introduction de morceaux de carton, batônnets en bois à ronger, de la litière ainsi qu’une roue et un igloo. Les souris auront un accès permanent à l’eau et à la nourriture. Lors de la chirurgie, du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux. Une infiltration d’anesthésique sera faite en amont sur la zone d’incision. La cicatrisation sera facilitée en appliquant une crème cicatrisante sur la cicatrice. Un antiseptique sera appliqué sur la peau au niveau du champ opératoire et en post-opératoire sur la cicatrice pour éviter les infections. La mini-pompe osmotique sera placée sous la peau au niveau du dos et sur le côté pour ne pas gêner l’animal dans ses déplacements. L’emploi d’une mini-pompe osmotique a été privilégiée pour éviter des injections intracérébrales répétées aux souris. Le ciment dentaire utilisé pour fixer la canule sur le crâne sera limé si nécessaire pour éviter toute aspérité qui pourrait blesser la face interne de la peau de l’animal. Les maladies étudiées étant neuroinflammatoires, l’emploi de traitements anti-inflammatoires n’est pas envisageable. 8h après la chirurgie le temps que la première dose d’anti-douleur ait fait effet, les souris recevront une seconde injection en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’un suivi journalier post chirurgie jusqu’à la fin de la procédure à l’aide d’une grille d’évaluation basée sur un système de scorage permettant l’évaluation de la douleur, du comportement, de la cicatrisation, du poids et leur prise alimentaire et de leur agressivité à la manipulation. Un score trop élevé sur l’ensemble des catégories ou l’atteinte d’un point limite dans une des catégories conduira à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car elle possède une organisation anatomique et un réseau limbique similaire à l’homme avec un hippocampe très développé. Depuis 50 ans, la souris est considéré comme un des meilleurs modèles expérimentaux pour l’étude de la mémoire. Depuis 15 ans la plupart des études dans ce domaine sont effectuées sur ce modèle. Une étude pilote a montré que les anticorps des patients NMOSD et MOGAD reconnaissent leur cible chez la souris. Enfin, les souris présentent l’intérêt de permettre l’utilisation facile de souris de modèles transgéniques. Les souris seront utilisées à un stade jeune adulte, soit à 8 semaines. A cet âge les souris ont atteint leur taille définitive facilitant l’implantation des mini-pompes osmotiques. De plus, l’étude sur laquelle les hypothèses statistiques se basent utilise des souris âgées de 8 semaines.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.