Troubles immunitaires

Issues d'un élevage de lignées transgéniques dont une partie sera tuée en fin de période reproductive sans qu'aucun prélèvement ne soit réalisé, 4 930 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles développent une maladie neurodégénérative et des troubles cognitifs, avec un risque d'agressivité et de blessures entre congénères que le porteur signale. Chacune subit une biopsie avant sept jours de vie sur animal vigile, puis des injections répétées pendant sept mois, jusqu'à douze prises de sang et une batterie de tests cognitifs de cinq à vingt minutes. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" et présente comme une mesure de remplacement le fait de n'avoir retenu que trois candidats vaccins sur huit après criblage in vitro.

Objectifs

L'implication de l'immunité dans les troubles neurodégénératifs est un domaine qui émerge fortement et qui est désormais considéré comme une voie très prometteuse pour le développement d'immunothérapies innovantes modifiant la progression de ces pathologies, en particulier dans la maladie d'Alzheimer (MA) et les autres Tauopathies. Il est clairement établi que l’inflammation locale au niveau du système nerveux central est une caractéristique associée à la neurodégénérescence, notamment dans la MA et d'autres tauopathies, et joue un rôle complexe dans la physiopathologie de la maladie. Outre cette inflammation locale, des preuves de plus en plus nombreuses mettent aujourd'hui en évidence un rôle des acteurs périphériques du système immunitaire dans la pathophysiologie de la MA et des tauopathies. Des résultats préliminaires suggèrent fortement une réactivité de ces cellules contre les protéines Tau pathogènes. Le projet a ainsi pour objectif de développer des stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire réactif contre les protéines pathogènes, afin d’en contrôler son activité et limiter les mécanismes qui contribuent à l’émergence des processus neurodégénératifs. L’induction d’une tolérance immunitaire spécifique est alors recherchée pour agir de façon ciblée et ne pas perturber le fonctionnement normal du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives et plus spécifiquement la Maladie d’Alzheimer (MA) ont un impact considérable sur le secteur de la santé et le secteur médico-social, en raison du coût important de la prise en charge et de la prévalence élevée de cette maladie, qui touche environ 7 millions de personnes en Europe. Avec le vieillissement de la population, le nombre de personnes concernées par cette forme de démence va largement augmenter. La prise en charge de ces patients constitue aujourd’hui un coût de plus de 20 milliards d'euros par an pour la France. Aucune thérapie actuelle ne parvient à enrayer significativement cette pathologie, qui conduit à une destruction irréversible des neurones. Nous pensons qu’il y a un réel intérêt à développer cette nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche se différencie des autres stratégies d’immunothérapie actuellement testées en clinique, qui visent à induire l’élimination active des dépôts protéiques. A noter toutefois, qu’un précédent essai a été suspendu en raison de cas de méningo-encéphalites chez certains patients. Notre approche cherche au contraire à induire une tolérance face à ces dépôts et limiter ainsi l’inflammation associée à la réactivité contre ces protéines pathogènes. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.

Procédures

Les animaux modèles utilisés développent une maladie neurodégénérative avec l’émergence de déficits cognitifs au cours du temps, s’apparentant aux symptômes de la Maladie d’Alzheimer. Pour constituer les cohortes d’étude, les animaux devront être identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie effectuée de manière précoce sur animal vigile (geste d’environ 1 minute). Les traitements seront administrés par injection répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) ou sous-cutanée dès l’âge jeune adulte (3 mois) pour une période de 7 mois à raison d’une injection quotidienne pendant 5j et/ou toutes les 2 semaines, tous les mois ou tous les 3 mois, selon le protocole. Ces injections sont effectuées sur animal vigile par simple contention et ne dure que quelques secondes par animal (moins de 30 secondes). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile toutes les 4 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement), à l’exception de la phase initiale où 2 prélèvements seront réalisés à 2 semaines d’intervalle. Les animaux seront prélevés entre 1 et 12 fois sur la durée du traitement (période de 12 mois). Les animaux seront finalement soumis à des tests cognitifs pour évaluer l’effet thérapeutique des thérapies proposées et évaluer leur impact sur les fonctions cognitives. Ces tests comportementaux durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 5 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de thérapie prévue, afin de réaliser des prélèvements pour des analyses complémentaires.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec l’émergence de déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge, source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). La biopsie effectuée chez les souriceaux vigiles de moins de 7 jours permettant l’identification génétique des animaux peut être génératrice de stress, d’inconfort et d’une douleur de courte durée. Les traitements mis en œuvre impliquent des injections au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) ou de la base de la queue (sous-cutané) de manière répétée au cours du temps. Ces injections pourront induire un stress en raison de la contention nécessaire à la bonne réalisation de l’administration et une douleur de courte durée liée à l’introduction de l’aiguille (piqûre). De même, plusieurs prélèvements de sang seront nécessaires et potentiellement générateurs de stress et de douleur. Un risque de saignement prolongé existe mais reste peu probable. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, l’anesthésie précédent l’euthanasie des animaux pour les prélèvements implique une injection intrapéritonéale pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

L’ensemble de ce projet vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes et jamais testées dans le cadre des maladies neurodégénératives. Il est donc indispensable d’avoir recours à un modèle expérimental in vivo chez la souris pour appréhender l’efficacité thérapeutique des traitements envisagés. Ces études ne peuvent être en aucun cas remplacer par des modèles in silico ou in vitro. Toutefois, ce modèle animal sera utilisé uniquement pour des vaccins ou des stratégies thérapeutiques ayant été validés in vitro et ayant démontré des effets. Ainsi, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous pré-sélectionnerons et utiliserons un nombre limité de candidats vaccins. Sur les 8 candidats envisagés, seuls les 3 « meilleurs », sélectionnés sur la base des tests in vitro, seront retenus pour les études in vivo. Cette stratégie s’inscrit dans un principe de remplacement, en limitant les tests in vivo autant que faire se peut et de les remplacer si possible par des approches alternatives.

Réduction

Le projet impliquera un total de 4930 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux dont notamment des pathologies neurodégénératives. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre de ce projet, les souris seront utilisées soit à l’âge de 2 à 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie, soit à l’âge de 10 mois, stade où les troubles cognitifs sont observés.

Une injection intrapéritonéale d'une substance qui favorise les tumeurs, puis un irritant intestinal dans l'eau de boisson pendant trois cycles de cinq jours, et des mesures de tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. 2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Le projet cherche à établir qu'en modulant le fer des globules blancs on renforce la réponse contre les tumeurs, preuve de concept présentée comme une piste thérapeutique. Le porteur annonce des points limites entraînant une mise à mort anticipée sans en préciser aucun, et dépose ce protocole en double, deux demandes de 2 016 souris publiées le même jour.

Objectifs

A ce jour, plusieurs moyens thérapeutiques existent pour lutter contre le cancer. Parmi eux, on retrouve des traitements dont le but est de stimuler notre système immunitaire afin de contrôler les cellules cancéreuses. Cette technique constitue un grand espoir pour l’amélioration de la survie des patients. Ces traitements sont essentiellement centrés sur les globules blancs, qui sont les principaux acteurs de la réponse anti-tumorale, capables d’éliminer les masses tumorales déjà formées. La fonction des les globules blancs est influencée par la composition de leur environnement, et nous proposons que le fer puisse être un de ses éléments. En effet, il est établi que le fer est un élément essentiel pour les cellules métaboliquement actives comme les globules blancs, car il est nécessaire pour un nombre important de réactions cellulaires. Notre hypothèse de travail est basée sur des données de la littérature selon lesquelles un milieu dépourvu de fer diminue la prolifération des globules blancs et la production de molécules anti-tumorales. La concentration sanguine du fer étant contrôlée par une hormone sécrétée majoritairement par le foie et qui favorise sa rétention dans les cellules, nous avons développé des modèles murins génétiquement modifiés afin d’induire une sur-expression ou une délétion de cette hormone spécifiquement dans les globules blancs. Grâce à ce projet, nous voulons apporter la preuve de concept qu’une modulation des niveaux de fer intracellulaire des globules blancs, médiée par l’hormone du fer, impacte leur prolifération et activation, et in fine leur réponse anti-tumorale. Ainsi, de nouveaux traitements centrés autour du fer pourraient voir le jour et garantir une meilleure qualité de vie aux patients, avec des traitements de faible toxicité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une hormone contrôlant les taux de fer de cellules immunitaires. Cela permettra de proposer des traitements modulateurs du fer qui pourront avoir un effet anti-tumoral ou d' améliorer l’efficacité des traitements déjà existants.

Procédures

Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et être responsable de diarrhées et de risque de saignement et donc une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux. Le tatouage et biopsies de queue engendreront un stress et une douleur légère. Le transport entre les 2 animaleries peut également engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.

Remplacement

Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et mises au point in vivo en se basant sur des données publiées de la littérature. Le recours aux modèles de tumeurs chez la souris nous permettra de caractériser les cellules immunitaires qui s'infiltrent et s'activent dans la tumeur . Ces paramètres ne peuvent pas être observés in vitro et le recours à l'animal est donc nécessaire dans le cadre de cette étude. Les souris sont âgées de 8 semaines au minimum car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les injections sous-cutanée et les imageries seront faites sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet. Lors du transfert, les souris seront mises dans des boites de transport avec de l'enrichissement et de la nourriture.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certains mécanismes dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

Toutes mises à mort pour prélèvement d'organes, 2 016 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales ou une injection intrapéritonéale d'une substance qui favorise les tumeurs, suivie de trois cycles de cinq jours d'ingestion d'un irritant intestinal dans l'eau de boisson. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées et des risques de saignement liés à cet irritant, et mesure les tumeurs au pied à coulisse trois fois par semaine. Il conclut que le recours à l'animal est "nécessaire" parce que l'infiltration des cellules immunitaires dans la tumeur ne s'observe pas in vitro, et attend de ce travail des "traitements modulateurs du fer".

Objectifs

A ce jour, plusieurs moyens thérapeutiques existent pour lutter contre le cancer. Parmi eux, on retrouve des traitements dont le but est de stimuler notre système immunitaire afin de contrôler les cellules cancéreuses. Cette technique constitue un grand espoir pour l’amélioration de la survie des patients. Ces traitements sont essentiellement centrés sur les globules blancs, qui sont les principaux acteurs de la réponse anti-tumorale, capables d’éliminer les masses tumorales déjà formées. La fonction des les globules blancs est influencée par la composition de leur environnement, et nous proposons que le fer puisse être un de ses éléments. En effet, il est établi que le fer est un élément essentiel pour les cellules métaboliquement actives comme les globules blancs, car il est nécessaire pour un nombre important de réactions cellulaires. Notre hypothèse de travail est basée sur des données de la littérature selon lesquelles un milieu dépourvu de fer diminue la prolifération des globules blancs et la production de molécules anti-tumorales. La concentration sanguine du fer étant contrôlée par une hormone sécrétée majoritairement par le foie et qui favorise sa rétention dans les cellules, nous avons développé des modèles murins génétiquement modifiés afin d’induire une sur-expression ou une délétion de cette hormone spécifiquement dans les globules blancs. Grâce à ce projet, nous voulons apporter la preuve de concept qu’une modulation des niveaux de fer intracellulaire des globules blancs, médiée par l’hormone du fer, impacte leur prolifération et activation, et in fine leur réponse anti-tumorale. Ainsi, de nouveaux traitements centrés autour du fer pourraient voir le jour et garantir une meilleure qualité de vie aux patients, avec des traitements de faible toxicité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une hormone contrôlant les taux de fer de cellules immunitaires. Cela permettra de proposer des traitements modulateurs du fer qui pourront avoir un effet anti-tumoral ou d' améliorer l’efficacité des traitements déjà existants.

Procédures

Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et être responsable de diarrhées et de risque de saignement et donc une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux. Le tatouage et biopsies de queue engendreront un stress et une douleur légère. Le transport entre les 2 animaleries peut également engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.

Remplacement

Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et mises au point in vivo en se basant sur des données publiées de la littérature. Le recours aux modèles de tumeurs chez la souris nous permettra de caractériser les cellules immunitaires qui s'infiltrent et s'activent dans la tumeur . Ces paramètres ne peuvent pas être observés in vitro et le recours à l'animal est donc nécessaire dans le cadre de cette étude. Les souris sont âgées de 8 semaines au minimum car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les injections sous-cutanée et les imageries seront faites sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet. Lors du transfert, les souris seront mises dans des boites de transport avec de l'enrichissement et de la nourriture.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certains mécanismes dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

Trois injections intrapéritonéales espacées de deux jours, puis la mise à mort pour prélever les lymphocytes T : les souris donneuses fournissent les cellules injectées par voie intraveineuse aux souris receveuses, qui reçoivent à leur tour quatre injections avant d'être tuées. 400 souris vont être utilisées, 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger, pour comprendre le rôle d'une protéine dans le syndrome néphrotique idiopathique, première maladie rénale de l'enfant. Le porteur écrit que les animaux ne subissent que des injections et que celles-ci n'induisent aucune souffrance au-delà de la douleur de la piqûre. Il affirme que la seule stratégie pour comprendre le rôle de cette protéine consiste à éteindre son expression in vivo.

Objectifs

Le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) est la forme la plus fréquente des maladies rénales de l’enfant et de l’adulte jeune. Ce syndrome est caractérisé par la survenue brutale d’oedèmes généralisés liés à une fuite urinaire massive de protéines (protéinurie) entraînant une perte importante de protéines du sang, en particulier de l’albumine. Les oedèmes sont souvent associés à une hyperlipidémie et une hypercoagulabilité sanguine. Bien que la majorité des patients réponde favorablement au traitement de première intention par les corticoïdes, le taux de rechute avoisine les 80%, et un traitement à long-terme, qui associe les corticoïdes à d’autres immunosuppresseurs, est souvent nécessaire pour maintenir la rémission, ce qui est délétère pour les patients compte-tenu des effets secondaires néfastes de ces traitements. La cause exacte du SNI reste inconnue. Les études génétiques récentes n’ont pas permis d’identifier des anomalies structurales de gènes. Actuellement, l’hypothèse la plus étayée par les différentes études clinico-biologiques concernant ce syndrome, notamment la réponse aux traitements immunomodulateurs et/ou immunosuppresseurs, est celle d’une pathologie du système immunitaire dont certaines cellules, encore non identifiées, pourraient sécréter un facteur soluble plasmatique contribuant à l’induction du défaut de perméabilité des glomérules rénaux à l’origine de la protéinurie. Dans de précédentes études, il a pu être démontrer in vivo, sur des modèles murins, que la surexpression de Cmip précèdait l'apparition de la protéinurie selon des mécanismes qui restent à élucider. Il a été identifié, chez les patients atteints de SNI, cette même protéine CMIP, dont l’expression est particulièrement augmentée au cours des poussées de la maladie, dans les lymphocytes T et les podocytes du glomérule rénal. Actuellement, la fonction de cette protéine reste inconnue, d'où l'objet de ce projet. Comprendre la fonction de CMIP dans le système immunitaire permettra d' identifier les mécanismes par lesquels, la surexpression de CMIP dans les lymphocytes T, induirait le développement d'un SNI. Les résultats attendus constitueraient une avancée majeure dans la compréhension de cette pathologie et pourrait permettre d’identifier une nouvelle cible thérapeutique potentielle. (A noter que la nomenclature internationale désigne C-Maf inducing Protein humaine par CMIP et celle de souris par Cmip)

Bénéfices attendus

Lors de la phase de poussée du SNI, l'expression de CMIP est détectée dans le système immunitaire (lymphocytes) et dans le rein (podocytes). Il a pu être démontré, par l'utilisation de souris transgéniques, que l'expression de Cmip dans les lymphocytes engendrait des perturbations du système immunitaire. Ces phénomènes précèdent l'apparition de la protéinurie. Les mécanismes impliqués dans ces perturbations ne sont pas connus et leur élucidation pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. L'élucidation de la fonction de CMIP permettrait une grande avancée dans la compréhension des dysfonctions immunitaires induites par la surexpression de cette protéine.

Procédures

Au cours de l’expérimentation, Les souris donneuses recevront une injection intrapéritonéale (qui dure 10 secondes par souris) tous les deux jours pour un total de 3 injections, puis elles sont sacrifiées et les lymphocytes T prélevés pour être injectés en IV (qui dure 30 secondes par souris) sous AG dans les souris receveuses qui recevront une injection IP tous les deux jours pour un total de quatre avant le sacrifice

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble des procédures, les animaux ne subissent que des injections. Ces injections, hormis la douleur de la piqure n'induiront aucune autre souffrance et n'auront pas d'autre incidence sur leur condition de vie.

Devenir

Les animaux sont systématiquement euthanasiés en fin de procédure afin de prélever les organes dans le but de préparer des cellules d'intérêts.

Remplacement

Le gène CMIP est de découverte récente et son implication dans les maladies humaines reste inconnue. Il est peu exprimé voire indétectable chez le sujet sain. En revanche, il est fortement exprimé dans certaines pathologies dysimmunitaires humaines en particulier le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) où il est surexprimé dans les lymphocyte T CD4 qui sont impliqués dans la maladie. Pour l’instant, sa fonction est inconnue. La seule stratégie pour comprendre comment il agit pour entraîner des désordres immunitaire à l'origine du SNI, est de l’invalider in vivo (éteindre l’expression du gène) et analyser les conséquences sur la fonction du lymphocyte T par rapport aux souris contrôles (qui expriment normalement le gène). La compréhension de la fonction de CMIP dans le lymphocyte T est primordiale si on veut élucider les mécanismes immunopathologiques du SNI

Réduction

Le nombre de souris par lot a été déterminé dans une étude pilote sur des souris contrôle non traitées. Ces souris ont été euthanasiées, les organes prélevés et les lymphocyte T préparés. Le phénotypage des lymphocytes T a été effectué par cytométrie. Nous avons utilisé le test de Mann-Whitney pour comparer les différentes sous-populations de lymphocytes T avec leur phénotype spécifique, ainsi que le taux de cellules nécessaires pour une analyse transcriptomique. Nous avons ainsi estimé le nombre de souris à traiter pour pouvoir finaliser toutes les études, qui doivent être réalisées (immunoselection, immunofluorescence, préparation de protéines et d’ARN) à partir des cellules extraites de ces souris. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été réduit au maximum tout en garantissant la qualité et la significativité des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par lot de même sexe sans dépasser le nombre de 5 animaux par cage ni d’animaux seul dans une cage. Ils ont à disposition de l’eau et des aliments à volonté et l’enrichissement est constitué par l’apport de papier compressé, d’un refuge en cellulose et de Sizzel-dri (enrichissement foisonnant à base de papier Kraft). Les souris sont surveillées visuellement 2 à 3 fois par jour au cours des procédures. Les points limites à l’expérimentation sont décidés en cas de souffrance ou de détresse, insensibilité aux stimuli, prostration, troubles respiratoires, hypothermie. Dans ces conditions, et en accord avec le code de l’expérimentation, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

CMIP est une protéine clé dans l'apparition de la protéinurie aussi bien chez l'homme que chez la souris. Nous avons choisi la souris car elle est reconnue comme modèle dans l’étude du SNI. Au cours d'études précédentes, nous avons généré des lignées de souris transgéniques qui sur-expriment Cmip dans les lymphocytes et les podocytes mais également des lignéesinvalidées pour le gène CMIP que nous utilisons dans ce projet Nous utiliserons des souris adultes entre 8 et 10 semaines car le système immunitaire est mature chez la souris à ces âges.

Attrapées et immobilisées à la main pour recevoir jusqu'à cinq injections dans le ventre en quinze jours, certaines souris subissent en plus un prélèvement de sang sous anesthésie générale dont la cicatrisation prend vingt-quatre heures. 1 380 souris, dont une lignée génétiquement modifiée qui développe une pathologie lupique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 900. Le porteur écrit que ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus, et qualifie lui-même de "dommageable" le génotype qu'il utilise. Toutes sont tuées en fin de procédure pour analyse des organes, ceux des souris témoins servant en plus à des cultures cellulaires.

Objectifs

Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles et les éosinophiles) dans le contrôle des facteurs immunitaires responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs médiateurs (des molécules qu'elles libèrent) dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de l'élimination de ces cellules ou de leur injection dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les éosinophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.

Procédures

Un génotype (gène absent dans une lignée de souris) dit dommageable (souris LynKO) est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie lupique légère mais cependant quantifiable. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : 1- des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») qui induiront une douleur brève de piqûre. Ces injections sont aussi efficaces que des intraveineuses pour disperser le composé injecté dans tous le corps mais moins contraignantes pour les souris. 2- des contentions (souris attrapées et immobilisées dans une main) : cet acte induit un stress bref pour les souris, mais sont indispensables pour réaliser les injections. 3- certaines souris seront soumises à un prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Ce geste peut induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures). Ce prélèvement permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant le traitement et à la fin de la procédure. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois au maximum sur une période de 15 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables induits sur les animaux seront un stress bref et des douleurs brèves. La contention des animaux induira un stress bref passager chez les animaux. Les injections induiront une légère douleur de piqûre brève. Les prélèvements sanguins (une seule fois) peuvent induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés en fin de procédure afin d'en analyser les organes d'intérêts.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des approches in vivo (dans l’organisme vivant) verront leurs organes utilisés pour des cultures cellulaires et des expériences in vitro et les organes des souris malades traitées ou non serviront de contrôles positifs ou négatifs pour des expériences ultérieures. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement. Le nombre d’individus à analyser par groupe d’animaux sera gardé au minimum autant que faire se peut.

Raffinement

Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'ils soient contaminés par des agents infectieux, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et avec un contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de l’humidité. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, ne sont jamais isolés et sont toujours hébergés avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher). Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans le présent projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. La contention des animaux reste nécessaire aux injections par voie intrapéritonéale (dans le ventre) prévues ce qui engendrera un stress bref chez les animaux. Ces pratiques seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut. Les souris seront observées quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.

Choix des espèces

Les études d’une approche thérapeutique innovante sur un modèle de pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 8 semaines (stade adulte). Tous les animaux seront utilisés avant 41 semaines d’âge pour éviter tout risque de souffrance des individus.