Troubles immunitaires

Une partie réutilisée dans d'autres protocoles, 163 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré : les 69 chez qui une polyarthrite rhumatoïde est induite seront tués pour des analyses après leur mort, les 94 autres, contrôles ou sans symptômes, seront réaffectés après avis vétérinaire. Le porteur décrit une maladie provoquée qui détruit les cartilages et bloque les articulations, avec douleur, gonflement, perte de mobilité et perte de poids. Chaque animal subit quinze anesthésies, quinze prélèvements sanguins, trois biopsies ganglionnaires et des séances d'imagerie pouvant durer jusqu'à trois heures. Le porteur indique que de nombreux tests sont réalisés in vitro avant de passer au primate non-humain, sans que la dynamique des cellules immunitaires à l'échelle du corps entier puisse selon lui s'étudier autrement.

Objectifs

En France, 5 millions de personnes sont touchées par des maladies auto-immunes (comme le diabète de type 1, ou la polyarthrite rhumatoïde). Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire. Ce dysfonctionnement peut se traduire par la production d’anticorps dirigés contre les propres cellules du malade ou par une atteinte et une inflammation des organes touchés. Certaines d’entre elles évoluent en maladies inflammatoires chroniques (comme la polyarthrite rhumatoïde). Le domaine de l'imagerie médicale avec la Tomographie à Emission de Positons (TEP), l’imagerie par résonance magnétique et l’imagerie optique est en plein essor. Cependant son application à la mesure et à la surveillance du suivi de l'état immunitaire des patients en est encore à ses débuts. Le développement d’outils, comme des immuno-traceurs, permettrait de visualiser directement in vivo certaines populations cellulaires spécifiques du système immunitaire et de pouvoir le suivre au cours du temps en conditions saines ou pathologiques. Ceci permettrait de caractériser la réponse immunitaire survenant lors de pathologies d’intérêt. Le développement de traceurs pour l’imagerie contribuera à une approche personnalisée de prise en charge de ces pathologies. Ainsi, le développement et l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques sera simplifié. Ce projet a ainsi pour but de développer des approches en imagerie pour mieux caractériser les processus inflammatoires dans un modèle de polyarthrite rhumatoïde et par la suite de pouvoir disposer d’outils permettant de tester l’efficacité thérapeutique de nouvelles immunothérapies. Cette maladie auto-immune se manifeste par une inflammation chronique des articulations conduisant à la destruction de certaines d’elles. Il serait donc pertinent de pouvoir visualiser, par imagerie immuno-TEP, les cellules impliquées dans l’inflammation. Cette application d’imagerie in vivo est la combinaison de modalité d’imagerie TEP avec l’injection de radiotraceurs à base d’anticorps ou dérivés d’anticorps ayant une grande spécificité pour leur cible. Localement, la microscopie optique permettra de visualiser les recrutements cellulaires au niveau des articulations inflammées. Ces données d’imagerie permettront de mieux comprendre et de prédire la réponse immune à l’inflammation et par conséquent d’élaborer des immunothérapies ciblées plus efficaces. Ce projet se déroulera par études successives afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués.

Bénéfices attendus

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune se manifestant notamment par un dérèglement des cellules immunitaires de la première ligne de défense de l’organisme déclenchant à elles seules une inflammation chronique qui conduit à la destruction de certaines articulations. Il est donc important de visualiser, par imagerie TEP, de manière préventive les cellules impliquées dans l’inflammation. Par conséquent, le bénéfice de ce projet est de disposer d’outils, comme des immuno-traceurs, permettant de cibler et visualiser les cellules du système immunitaire dans un contexte inflammatoire de manière minimalement invasive. De cette manière et dans le but ultime de mieux comprendre et prédire la réponse immune à l’inflammation et par la suite d’élaborer des immunothérapies ciblées plus efficaces. Actuellement, les traitements utilisés sont adaptés à chaque personne selon l’importance de la pathologie, l’efficacité et tolérance des personnes face aux médicaments. Il existe des traitements antirhumatismaux de fond qui agissent directement sur la maladie. Malheureusement, ces traitements sont insuffisants pour certains patients. De ce fait, les immunothérapies cherchent à moduler plus précisément la réponse immunitaire et inflammatoire pour éviter son dérèglement. Ainsi, cette thérapie contribue à rétablir l’équilibre dans l’organisme en tenant compte de ses mécanismes naturels.

Procédures

- Anesthésie générale (15 anesthésies, durée 30min) pour les prélèvements et observations cliniques (température, poids…) - Prélèvement de sang pendant 6 semaines (15 prélèvements). Un prélèvement de sang prend environ 2 minutes par animal. - Biopsie ganglionnaire : 3 biopsies lors de l’études espacées d’au moins deux semaines - Imagerie TEP sur corps entier (4 séquences). Les séquences d’imagerie effectuées sur animaux anesthésiés pourront durée jusqu’à 3h. - Imagerie Bi-photon sur les articulations distales (2 séquences). Les séquences d’imagerie pourront durer jusqu’à 2h

Impact sur les animaux

La polyarthrite rhumatoïde est une affection inflammatoire chronique qui touche principalement les articulations distales de la main et du pied. Sa progression mène à une destruction des cartilages articulaires et une ankylose (diminution voire impossibilité de mouvement) des articulations. Cela se traduit cliniquement par de la douleur, un gonflement articulaire, une perte de mobilité, une perte de poids, qui peuvent être source de stress chez l’animal. D’un point de vue biologique, la polyarthrite rhumatoïde peut entraîner une anémie, une neutropénie, une éosinophilie ou encore une thrombopénie. Ainsi que les anesthésies nécessaires aux prélèvements de suivi de la pathologie et aux examens d’imagerie peuvent provoquer une légère perte de poids et un stress transitoire chez les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant développés une arthrite rhumatoïde seront euthanasiés en fin d’étude pour des analyses post-mortem. Ces analyses permettront d’identifier les cellules immunitaires présentes dans les articulations inflammées et de pouvoir les corréler aux résultats d’imageries in vivo réalisés précédemment. Les animaux contrôles ou ne présentant pas de symptômes seront réutilisés dans d’autres protocoles après évaluation favorable par le vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles stratégies d’imagerie, transposables directement chez l’homme, permettant de détecter spécifiquement des cellules immunitaires spécifiques dans le contexte du modèle de pathologies auto-immunes. Ainsi, les radiotraceurs mis en œuvre et testés permettront d’évaluer la distribution et dynamique de certains acteurs de la réponse immunitaire à l’échelle de l’organisme entier et à l’échelle cellulaire au niveau des sites d’inflammation dans un modèle de maladie inflammatoire chronique, la polyarthrite rhumatoïde. L’impact de molécules thérapeutiques sur cette réponse avant leur utilisation chez l’homme sera aussi évalué. Ces analyses nécessitent un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorale et cellulaire) ainsi que le changement induit par un traitement. A ce jour, la distribution et la dynamique des cellules immunitaires au niveau du corps entier ne peuvent pas être étudiés in vitro. Néanmoins, un grand nombre de tests (toxicité, criblage…) seront réalisés in vitro avant de le tester sur le modèle primate non humain.

Réduction

Pour mettre en place ce modèle d’arthrite rhumatoïde chez le macaque Cynomolgus et de permettre de tester des molécules thérapeutiques, nous nous baserons, dans la mesure du possible, sur les modèles déjà décrit dans la littérature afin de maximiser nos chances de réussites. Nous commencerons sur des groupes de 3 animaux. Le nombre d’animaux pourra être réduit, dans la procédure 1, si les premiers schémas d’induction de polyarthrite rhumatoïde sont satisfaisants. Concernant les tests statistiques, le nombre d’animaux retenu par groupe a été limité au minimum permettant une comparaison des résultats obtenus par l’utilisation de tests statistiques non paramétriques pour comparer les groupes entre eux.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera effectué sur des animaux anesthésiés. Nous serons cependant très vigilants lorsque nous mettrons en place le modèle et ferons des analyses d’indicateurs réguliers en utilisant des grilles de score (la fréquence des observations augmentera pendant la phase aigüe). De plus, nous possédons, par exemple, un système d’alerte automatique via notre base de données en cas de perte de poids supérieure à 10% en 15 jours, des numérations formules sanguines anormales ou bien atteinte de critère d’arrêt spécifique au projet. Lors de la mise en place du modèle, un vétérinaire examinera lui-même les animaux régulièrement (en fonction de l’apparition des symptômes) afin d’anticiper une détérioration trop importante de la santé de l’animal et, au besoin, pouvoir procéder à une euthanasie en cas d’atteinte des points limites. Les animaux seront surveillés quotidiennement et plusieurs grilles de score permettant d’évaluer l’état clinique d’avancement de la pathologie, le comportement et la douleur de l’animal seront mises en place. De plus, une analgésie sera instaurée en fonction de l’état clinique de l’animal, ou même en amont pour prévenir un phénomène douloureux. Enfin, ce projet ne nécessite pas de mise en hébergement en individuel, ainsi les liens sociaux seront conservés dans les groupes.

Choix des espèces

Le macaque Cynomolgus est retenu pour ce projet pour plusieurs raisons : - La réponse immunitaire similaire à celle de l’homme, et évaluation de la réponse immune possible dans les tissus. - Les réponses aux vaccins et aux traitements dans cette espèce sont semblables à celles observées chez l’homme - Ils ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles de polyarthrite rhumatoïde Les animaux utilisés seront au stade de développement adulte (à partir de 3 ans) car ils ont un système immunitaire mature. Le système immunitaire évolue en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Les candidats radiotraceurs ou candidats traitements étudiés pourront faire l’objet d’essais cliniques chez l’adulte, il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal au système immunitaire « mature ».

1 528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sur l'oreille, sous anesthésie, des applications répétées d'imiquimod pour induire une maladie proche du lupus, ainsi que des traitements par diverses voies, des prélèvements sanguins et des recueils d'urine par isolement de quatre heures, sur une durée pouvant atteindre dix semaines, pour tester des candidats médicaments. Le porteur décrit un modèle encore à mettre en place et sans expérience préalable sur les nuisances. Il affirme que l'efficacité d'un candidat médicament ne peut être démontrée que chez l'animal, dans un organisme complet.

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune caractérisée par la production d’auto-anticorps qui conduisent à de nombreuses affections des organes notamment des reins, des articulations, de la peau et du système nerveux. Le lupus néphrétique, une lésion rénale associée au lupus, affecte 30 à 70% des patients lupiques et a un impact négatif sur le pronostic des patients. Ce lupus néphrétique est divisé d’un point de vue médical en 6 classes. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle induit par l’imiquimod (substance médicamenteuse dont les propriétés sont de modifier la réponse immunitaire) appliqué en local chez la souris qui récapitule la classe II du lupus néphrétique. Cette induction topique entraine une activation de cellules clés du système immunitaire nous permettant ainsi de mieux comprendre l’interaction entre les différents mécanismes d’action et de pouvoir étudier l’impact de nos candidats médicaments sur ces différents mécanismes d’action. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études conduites dans le cadre ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur les maladies auto-immunes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique et de pouvoir étudier l’impact de nos candidats sur les différents mécanismes d’action impliqués dans cette pathologie

Procédures

Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : - Application de la crème sous anesthésie : temps d’absorption 10 min (? à consolider après réalisation de la procédure 1), 3 fois par semaine, 10 semaines max -traitement iintra veineux, intra péritonéal, sous cutanée ou per os, per os : moins d’une minute, fréquence suivant le protocole de l’étude, 10 semaines max - Prélèvement de sang par microsampling : (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène) (moins de 30 secondes) avec une fréquence dans la limite des recommandations de la structure de Bien-Etre Animal -Urine : jusqu’à 4 heures sur sable hydrophobe (mais un suivi sera établi pour réduire ce temps au maximum), tous les 15 jours (hébergement individuel durant 4 heures max), 10 semaines max -Pesée de la souris : moins de 30 secondes

Impact sur les animaux

Selon les données de la littérature et sans expérience sur ce modèle, les nuisances estimées sont les suivantes : -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée ou per os pouvant induire stress et douleur ponctuels -Inflammation de l’oreille pouvant induire éventuellement rougeur, gonflement douleur transitoire (durée d’une heure après l’application de la crème) -Prélèvements de sang pouvant induire stress et douleur ponctuels

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus et les analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Pour ce projet spécifiquement, le modèle présenté permettrait d’évaluer plusieurs cibles cellulaires impactés dans les maladies auto immunes dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour l’évaluation des candidats médicaments

Raffinement

L’application de la crème sur le pavillon de l’oreille de la souris sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse pour éviter que l’animal n’enlève la crème et que celle-ci ne soit absorbée par l’animal par une voie d’administration non désirée (par lechage par exemple). Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « microsampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu en respectant les recommandations de la SBEA, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Les recueils d’urine pour examens biologiques seront réalisés sur litière de sable hydrophobe en remplacement des cages à métabolisme, maintenant ainsi les animaux dans de meilleures conditions de stabulation. Le volume de recueils sera régulièrement contrôlé pour ainsi arrêter la diurèse si le volume nécessaire est obtenu et sans dépasser une durée maximale de 4h pour limiter le stress des animaux dû à la séparation des congénères durant le recueil. Projet dédié à identifier de nouveaux mécanismes afin de rechercher des candidats traitements les modulants : l’objectif n’est pas d’atteindre l’installation complète de la pathologie de lupus néphrétique mais d’identifier les modulations des biomarqueurs et autres données relevantes et permettant les réponses scientifiques. Les études n’iront donc pas au-delà de 10 semaines et pourront même potentiellement être plus réduites Une coupe des griffes de pattes arrières pourra être réalisée, à l’occasion d’une anesthésie pour application de la crème, afin d’éviter des complications supplémentaires dues au grattage si des premiers signes de prurit apparaissent. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs, l’évaluation de candidats médicaments comme les anticorps nécessite souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats. Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris immunodéficientes reçoivent une greffe de peau humaine sous anesthésie, une irradiation, une injection de lymphocytes T régulateurs et des prélèvements sanguins répétés sur trois mois. Le projet valide une thérapie cellulaire censée remplacer les immunosuppresseurs pour éviter le rejet de greffe. Le porteur qualifie ces expériences d'"indispensables" pour obtenir l'autorisation de l'agence du médicament et convaincre les financeurs de l'essai clinique.

Objectifs

Les immunosuppresseurs induisent des effets secondaires graves chez les patients transplantés avec un organe solide ou atteints de maladie auto-immune tels que des cancers et infections fréquentes et graves et ne sont pas efficaces chez les patients greffés avec des cellules souches après chimiothérapie. La thérapie cellulaire a pour but de remplacer les traitements immunosuppresseurs pour éviter leurs effets secondaires et être plus efficaces, par une injection unique de cellules régulatrices. Les essais cliniques de phase I/IIa avec ces cellules ont montré des résultats encourageants. Il existe plusieurs types de cellules que nous pourrions associer et dont l'efficacité thérapeutiquepeut être optimisée. Nous avons précisé ces associations et optimisations in vitro et nous devons évaluer la dose thérapeutique et l'absence d'effet secondaire dans les modèles pré-cliniques de souris avant de pouvoir les administrer chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Cette thérapie vise à empêcher le rejet d'organe et soigner les patients greffés avec des cellules souches après chimiothérapie, sans immunosuppresseurs pharmacologiques et sans effets secondaires. Ces expériences précliniques sont indispensables pour évaluer la sécurité d'emploi et l'efficacité de cette thérapie cellulaire pour obtenir l'approbation de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé de leur application chez l'Homme, et pour convaincre les agences nationales de financer l'essai clinique.

Procédures

Des animaux seront greffés avec de la peau sous anesthésie générale gazeuse durant environ 30 minutes et analgésie générale et locale chimique. Des animaux seront irradiés une fois pendant 3 minutes. Les animaux seront injectés une fois avec des cellules sous anesthésie gazeuse de quelques minutes. Du sang sera prélevé toutes les 2 semaines sous anesthésie générale gazeuse de quelques minutes et analgésie locale chimique. Les souris seront manipulées quotidiennement quelques minutes pour suivre leur poids et le rejet de greffe. Les souris seront euthanasiées après anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

L'administration unique des cellules nécessite une immobilisation de la souris de quelques minutes et peut induire une perte de poids. Les souris seront manipulées quotidiennement pour suivre leur poids et le rejet de greffe. Les souris seront anesthésiées par inhalation gazeuse pendant environ 30 minutes pendant la greffe de peau, ce qui peut diminuer la température corporelle. La chirurgie de greffe peut causer des douleurs. Un pansement sera maintenu sur la greffe pendant 12 à 14 jours après chirurgie et l’animal sera anesthésié le temps de refaire un bandage si besoin et lors du retrait du bandage. Du sang sera prélevé au sinus toutes les 2 semaines pouvant causer une douleur. Les souris immunoincompétentes seront par groupe de 5 maximum par cage ventilée pour éviter les infections opportunistes.

Devenir

Les souris injectées avec des cellules ne pourront pas être utilisées à nouveau. Les injecter avec les cellules d'un second donneur induirait une reconnaissance des cellules entre elles et serait ininterprétable.

Remplacement

Les études fonctionnelles in vitro sont limitées par l’absence du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire et ne peuvent remplacer les études in vivo. La preuve de concept a été faite dans ces modèles de souris, et ces thérapies doivent être évaluées dans les mêmes modèles. Ces modèles de souris avaient été choisis en remplacement de modèles primates non humains, et sont plus pertinents (test direct de cellules humaines et non de cellules de primates non humains).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est réduit à 10, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus.

Raffinement

Pour le modèle de greffe, les souris seront sous anesthésie générale gazeuse et analgésie chimique durant la chirurgie de la greffe de peau. Les animaux seront ensuite placés sur tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil, le greffon sera recouvert de tulle gras et d’une compresse stérile maintenue par un pansement puis d’un bandage pendant 12 à 14 jours. L’animal sera anesthésié quelques minutes de façon gazeuse le temps de refaire un bandage si besoin ou pour son retrait. Pour les prélèvements de sang, les souris seront anesthésiées quelques minutes sous forme gazeuse, analgésiées localement, et prélevées d' un faible volume de sang avec 2 semaines de récupération entre 2 ponctions. Les souris seront par groupe de 5 maximum par cage ventilée sur un portoir à l'animalerie. Tous les animaux seront suivis pour leur poids, leur comportement, leur intégrité, le développement de la GVH et/ou du rejet de greffe et seront euthanasiés après anesthésie gazeuse à l’atteinte des points limites définis selon une grille de score ou 100 jours après l’injection des cellules.

Choix des espèces

Nous avons choisi les souris immunoincompétentes qui permettent l'acceptation de cellules immunes et/ou d'un greffon de peau humain. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient détruites par le système immunitaire d'une souris. Ces souris présentent aussi des facilités de reproduction, d'hébergement et de manipulation. Les souris doivent avoir atteint un poids adulte pour le suivi de perte de poids résultant de l'injection des cellules, les expériences sont standardisées telles que les cellules sont injectées chez des souris agées de 8 à 12 semaines.

40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.

Bénéfices attendus

Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.

Procédures

Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.

Devenir

Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.

Réduction

Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.