Troubles immunitaires

349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.

Objectifs

La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.

Bénéfices attendus

Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.

Procédures

prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure

Impact sur les animaux

Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure

Remplacement

Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)

Réduction

Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).

Raffinement

Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).

Choix des espèces

Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

2920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélèvement d'organes et une vingtaine réutilisées dans un autre projet. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections intradermiques dans les oreilles, un anticorps IgE puis l'antigène, provoquant une inflammation de l'oreille, suivies d'administrations de candidats médicaments et de prélèvements sanguins répétés. Le porteur décrit ce modèle d'anaphylaxie cutanée passive comme un outil de "screening" de molécules pour les maladies auto-immunes et indique n'avoir pas relevé de signe de douleur au-delà de l'inflammation locale. Il affirme qu'un modèle substitutif in vitro n'a pas abouti et revendique le recours à l'"organisme" complet de la souris.

Objectifs

L’objectif de cette demande d’autorisation est de mettre en place un modèle d’anaphylaxie passive cutanée (PCA : Passive Cutaneous Anaphylaxis) permettant d’étudier rapidement l’impact de candidats médicament sur la dégranulation des cellules mastocytes in vivo, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto immunes. Pour cela un anticorps au format IgE dirigé contre un antigène du non soi est injecté sous anesthésie générale dans le pavillon de l’oreille en intradermique pour sensibiliser la souris, puis quelques heures plus tard l’antigène (et un colorant physiologique et indolore pour la souris permettant de suivre la perméabilité vasculaire) est injecté provoquant dans les minutes qui suivent un gonflement de l’oreille et une coloration bleue de l’oreille (deux paramètres que nous suivrons) due à une activation des cellules mastocytes qui vont relarguer de nombreux granules comme l’histamine notamment. L’évaluation de candidats médicaments dans ce type de modèle vise à évaluer si le traitement par ces candidats permet de diminuer l’anaphylaxie (réaction allergique survenant rapidement après contact avec l’agent inducteur) observée au niveau cutané, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto-immunes. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études incluses dans ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur la dégranulation des mastocytes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique.

Procédures

Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : -chaque souris reçoit deux injections intradermiques (une dans chaque oreille) réalisées sous anesthésie générale (moins d'une minute) ; +/- 23h plus tard et selon la phase de la mise au point : administration du véhicule, composé de référence ou candidat médicament en per os, Intra veineuse, sous cutanée ou intra péritonéale sur souris vigile (moins de 30 secondes) ; suivi 1 heure plus tard d’une injection en intraveineuse en vigile (moins de 30 secondes) ; photographies de la coloration de l’oreille et mesures de l’épaisseur de l’oreille par pied à coulisse sur souris vigile (au maximum 4 mesures - moins d'une minute à chaque mesure) ; Durée totale des études de 48h heures maximum.Tout au long de l’étude chaque souris pourra se voir prélever un petit volume de sang par µsampling (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène - moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Inflammation locale de l’oreille de la souris durant de la durée de l’étude (1 heure à 24 heures) -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale intra-veineuse sous-cutanée ou per os

Devenir

Les souris incluses dans la première phase de mise au point de ce modèle ne nécessitant pas de prélèvements de tissus pourront être réutilisées dans le cadre d’un autre projet. A l’issue de chaque procédure, les animaux seront sinon euthanasiés pour collecte des organes et tissus et analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Dans le cadre plus spécifique de ce projet, les tentatives de mise en place d’un modèle substitutif à ce modèle in vivo n’ont pour l’instant pas abouti et nous ne disposons pas d’un modèle de dégranulation in vitro suffisamment fiable et permettant le même niveau de prédictibilité que celui mené dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle très communément réalisé. Un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour les procédures 2 et 3 à l'aide d'un t test. De plus pour les premières phases chaque animal sera son propre contrôle, une seule des deux oreilles recevant l’agent inducteur et la seconde étant le contrôle.

Raffinement

L’administration de l’antigène par voie systémique va entrainer une inflammation locale du pavillon de l’oreille ayant reçu l’anticorps au forma IgE de cet antigène. Dans le cadre de cette DAP les doses utilisées du couple Anticorps/Antigène sont basées sur une analyse bibliographique et pour lesquels il n’a pas été relevé de souffrance ou de signes de douleur (si ce n’est l’inflammation locale de l’oreille qui est le paramètre étudié dans ce modèle) Des prélèvements de sang répétés en cinétique sont réalisés à différents temps afin de mesurer les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « multisampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude Les administrations intradermiques dans chaque oreille sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs l’utilisation de candidat médicament comme les anticorps nécessitent souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8-9semaines, soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules, elles subissent des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces, et un tiers reçoit dans l'eau un produit qui enflamme l'intestin pendant sept jours, provoquant selon le porteur une douleur intestinale croissante et des diarrhées avant la mise à mort. Le projet étudie la rupture de l'équilibre entre l'hôte et son microbiote induite par un régime pauvre en fibres. Le porteur affirme l'impossibilité de modéliser cette dynamique in vitro ou in silico.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies non transmissibles (maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. Ces maladies sont associées à des signaux déclencheurs provenant de notre environnement (microorganismes de l’intestin, alimentation) et se caractérisent par une inflammation locale de l’intestin. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Ces maladies de longue durée résultent de l’association combinée de plusieurs facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux dont la nutrition et l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de cet organe. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des altérations de la composition du microbiote intestinal chez des patients atteints de maladies non transmissibles. Cette altération de la symbiose hôte-microbiote est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du système immunitaire de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies non transmissibles, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par la diminution du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal et de son hôte. Notre projet consiste à évaluer la mise en place et le maintien à long terme d’une rupture de symbiose hôte-microbiote induite par un régime pauvre en fibres et à déterminer les conséquences de ce changement de régime alimentaire sur la symbiose lors d’un stress inflammatoire aigu. L’objectif final de nos travaux est de caractériser la rupture de symbiose et d’en évaluer les conséquences sur la santé dans un modèle animal afin d’identifier des leviers, à la fois côté hôte et côté microbiote, qui permettraient de retarder, prévenir et/ou traiter sa survenue, son installation et sa persistance chez l’individu.

Bénéfices attendus

Les maladies non-transmissibles, qui sont en constante augmentation, sont une préoccupation majeure de santé publique. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. De nombreux travaux témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal due à un régime alimentaire appauvri en fibres. Notre projet amènera à une meilleure compréhension des mécanismes de la rupture de la symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire appauvri en fibre s ; compréhension qui permettra d’identifier de nouvelles solutions de dépistage et de traitement.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en cage indivuduelle tout au long de l'expérimentation. Les deux tiers des animaux recevront un régime appauvri en fibres pendant une durée de 4 semaines. Tous les animaux recevront une solution par gavage au minimum 2 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de contention sera de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux auront au minimum 1 et au maximum 3 prises de sang. Le temps de collecte, contention comprise, sera de 30 secondes à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans la procédure. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. Un tiers des animaux recevra dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin pendant sept jours consécutifs en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime inflammatoire, ce qui pourra entrainer une perte de poids. Les prises de sang engendrent une douleur modérée de courte durée et un stress léger dû à la contention. De même, les gavages seront réalisés par un expérimentateur confirmé à l’aide d’une sonde gastrique et engendreront un stress léger dû à la contention de quelques minutes mais ne causeront pas de douleur. L’absorption du produit inflammatoire entraine une douleur intestinale croissante pendant les 7 jours de traitement occasionnant des diarrhées avant la mise à mort des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire/modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 120 animaux pour le groupe contrôle et 240 animaux pour les groupes expérimentaux sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement composé d'un abri en propylène rouge et d’un Mouse Swing et d'un abri en propylène rouge afin de répondre au mieux à leurs besoins comportementaux naturels et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les cages seront transparentes afin que les animaux gardent un contact visuel avec leurs congénères et n’auront pas de couvercles filtrants afin de maintenir le contact sonore et olfactif. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris qui sont largement utilisées pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes pauvres en fibres en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc une référence pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

194 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être transférées vivantes vers le laboratoire d'un collaborateur pour la suite de l'étude. Ces souris porteuses d'une mutation liée au syndrome de Hermansky-Pudlak subissent deux prélèvements sanguins à six et huit semaines, pour analyser leurs plaquettes et leur système immunitaire. Le porteur indique un risque de saignement prolongé chez ces animaux dont la mutation affecte la coagulation. Il affirme que la lignée cellulaire in vitro ne suffit pas et que le modèle souris reste "indispensable" à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’étude des maladies rares d’origine génétique permet aujourd’hui de décrire les gènes, des protéines et des mécanismes biologiques fondamentaux pour la compréhension du vivant et celle de maladie plus fréquente. Nous avons identifié chez des patients atteints du syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP) qui est une maladie multisystémique caractérisé par un albinisme oculo-cutané et un terrain hémorragique. Une mutation d'un gène qui pourrait être à l’origine du déficit immunitaire global ainsi que d’anomalies sanguines principalement thrombopénie (déficit des plaquettes) avec des dysfonctionnements de la fonction plaquettaire. Notre projet et l’étude de la modification de ce gène impliqué dans la pathologie complexe observée chez les patients, grâce au modèle de souris portant la mutation de notre gène d'intêret. Plus précisément, nous souhaiterions étudier les paramètres hématologiques et particulièrement les plaquettes et leur physiologie. Pour cela des prélèvements de sang seront réalisés chez des souris contrôles et mutantes, afin d’être analysés. Au total 194 souris seront nécessaires pour valider notre question biologique et obtenir des résultats statistiquement valides.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet et l'étude de systeme immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare le syndrome de Hermansky-Pudlak , nous souhaiterons comprendre les mecanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur la thrombopenie (deficite plaquettaire)

Procédures

Les souris seront soumises à 2 prelevements sanguins (vigiles) à l'age de 6 et 8 semaines. Nous avons également un groupe de 7 mois.

Impact sur les animaux

Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction plaquettaire et de la thrombopénie, un risque de saignement prolongé au moment de la prise de sang pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes.

Devenir

Tous les animaux seront transferés dans le laboratoire de notre collaborateur pour completer l'étude immunologique.

Remplacement

Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal (souris) reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en gardant s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Etant donné le manque de donnée concernant cette nouvelle lignée, l’analyse de puissance sera revue en fonction des données générées. En effet, en fonction du phénotype observé, on pourrait être amené à réduire le nombre d'animaux tout en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Un maximum de 194 souris sera nécessaire. Comme on s'attend à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, nous utiliserons pour chaque série l'un des 2 sexes (selon la production), ce qui éviterait de dédoubler les effectifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation et son euthanasie. Les animaux seront observés toutes les semaines avec une grille de suivi du bien-être, en plus du suivi quotidien habituel. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local afin d’atteindre l’hémostase.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intêret à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; de plus, le modèle de souris est très étudié et largement utlisé pour analyser la fonction plaquettaire. Les animaux seront étudiées à l'âge de 6 et 8 semaines à fin d'étudier les 2 stades avant l'age adulte et à l'age adulte. Nous avons également un groupe de souirs de 7 mois afin comparer l'effet de l’âge dans ce groupe.

2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à dix injections, avec adjuvant de Freund, et douze prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever la rate, les ganglions et la moelle osseuse. L'objectif est commercial, produire des anticorps humains à partir de souris génétiquement modifiées pour remplacer les produits d'origine humaine dans des kits de diagnostic. Le porteur affirme qu'une réponse immunitaire in vivo est "nécessaire" et présente une "offre sur mesure" à ses clients.

Objectifs

Le but est de générer des anticorps humains à l’aide de souris génétiquement modifiées et de les mettre à disposition pour la clinique humaine. A ce jour, les kits cliniques détectent un anticorps spécifique d’une cible donnée (bactérie, virus, allergène…). Ils nécessitent un sérum humain et des anticorps de référence pour contrôler la qualité des kits. Pour des raisons légales et éthiques, la production d’anticorps à partir de produits d’origine humaine a pour but d’être supprimé. La limite est aussi l’absence de standardisation car le taux d’anticorps varie d’un patient à l’autre. De plus, les besoins croissants en produits d’origine humaine sont aujourd’hui difficilement pourvus. Pour certaines pathologies, il est parfois difficile d’obtenir un sérum humain ayant la spécificité souhaitée. La production d’anticorps humains permettrait : - une absence de contamination d’agents pathogènes - une production robuste et respectueuse des contraintes règlementaires - une évolution dans la production d'anticorps au vu de la suppression des produits d’origine humaine - une standardisation garantissant de reproductibilité des tests - une offre « sur mesure ». Afin d’obtenir des anticorps ayant la plus forte affinité pour l’antigène, une réponse immunitaire in-vivo est requise. Après une première réponse immunitaire in-vivo chez l’animal, nous prélèverons les organes d’intérêt et effectuerons ensuite la production d'anticorps entièrement in vitro. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour reproduire une réaction immunitaire humaine et obtenir des anticorps très proches de ceux des patients. 3 lignées seront utilisées pour cibler entre autres les pathologies suivantes : otite, sinusite, bronchite, pneumonie, infections pulmonaires chroniques, allergies, diarrhée chronique, maladies auto-immunes, maladies gastro-intestinales, rhinite, asthme et infections parasitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise au point de la production de larges lots d’anticorps humains à partir de souris. Chez la souris nous pourrons moduler la réponse immunitaire pour permettre la génération d’anticorps spécifiques au traitement de maladies infectieuses et utiles dans le cadre d’auto-immunité, d’inflammations chroniques, de cancers, d’allergies, voire de troubles hématologiques.

Procédures

Les animaux subiront au maximum 10 injections intrapéritonéales (ou intramusculaire ou intra-veineuse dans de rares cas), durée moins de 30 secondes. 12 prélèvements sanguins maximum seront aussi effectués, chacun durant environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

La répétition des injections intrapéritonéales (ou intramusculaire ou intra-veineuse dans de rares cas) pourrait engendrer un léger inconfort chez les souris. De plus, un adjuvant de Freund sera utilisé lors des injéctions d'antigène.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure afin de collecter des cellules de la rate, des ganglions ou de la moelle osseuse pour créer les banques d'anticorps.

Remplacement

Une réponse immunitaire in-vivo est nécessaire afin d’obtenir des anticorps spécifiques. Des anticorps de synthèse seraient à l’inverse moins spécifiques. C’est pourquoi l’utilisation de la souris est nécessaire. Les souris génétiquement modifiées permettent de reproduire une réaction immunitaire équivalente à ce qui est observé chez l'Homme et donc d’avoir des anticorps très proches de ceux retrouvés chez des patients.

Réduction

Nous utiliserons 10 souris par projet, en immunisant 2 lots successifs de 5 souris, afin de garantir la production des livrables dans le cadre de projets de prestation de service. Ce nombre théorique pourra être réduit si au moins une souris parmi le premier lot de 5 développe la réaction immunitaire souhaitée. Nous prélèverons les organes d'intérêt et pour ensuite réaliser la production de l'anticorps in vitro. Ainsi, les animaux seront utilisés seulement pour la phase de développement initiale. Une fois les anticorps créés, l’utilisation d’animaux ne sera plus requise. Nous évaluerons la production d’anticorps chez toutes les souris en fin de protocole. La méthode ne vise pas le calcul d’une valeur précise d’anticorps et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur la présence ou non d’anticorps chez les animaux.

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les antigènes seront injectés sur des animaux vigiles afin de réduire au minimum le nombre de manipulations sur les animaux. De plus, les tests préalablement faits avec ces antigènes ne mettent pas en évidence de dommage quelconque subi par les animaux.

Choix des espèces

La génétique ainsi que le système immunitaire des souris sont bien caractérisés. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux comme la souris permettra d’induire une réponse immunitaire caractéristique et facilement identifiable. Nous utiliserons des souris adultes entre 2 et 12 mois. Durant cette période, le système immunitaire est bien développé et fonctionnel et son efficacité de production d’anticorps n’est pas impactée par l’âge des animaux. De plus, cette large fenêtre d’utilisation nous permettra d’éviter la surproduction d’animaux pour le maintien des lignées.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intramusculaire puis jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant dix jours, et un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie avant leur mise à mort. Le porteur indique un inconfort et un stress liés aux injections répétées, sans attendre d'autre effet des molécules testées. Il affirme que le modèle murin est le seul modèle préclinique adapté pour étudier la réponse immunitaire après une greffe de poumon.

Objectifs

BOB1 est un facteur exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients transplantés le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associé au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de « calmer » les lymphocytes activés qui devraient moins agresser le greffon.. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique (qui se met en place après une greffe). Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune allogénique, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique in vivo chez la souris au préalable. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une greffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 1 minute, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intra-péritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro, et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables, et à l'aide de tests statistiques. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.