Troubles immunitaires

11 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunodéprimées puis infectées par instillation pulmonaire de Mycobacterium abscessus, et reçoivent des composés par voie orale ou injectable une à deux fois par jour pendant cinq semaines, pour tester de nouveaux antibiotiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une respiration difficile, un écoulement des yeux et du museau et de l'apathie, avec mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la dynamique de l'infection, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à l'animal entier.

Objectifs

Les mycobactéries non tuberculeuses ou mycobactéries atypiques sont des bactéries opportunistes dont le réservoir réside dans l’environnement (sol et eaux). Ce sont des bactéries non pathogènes intrinsèquement pour l’homme, elles sont dites opportunistes car elles vont devenir infectieuses sur un terrain affaibli. Elles vont être responsables d’infections pulmonaires chez des sujets fragilisés, atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive ou immunodéprimés. Ces sujets vont alors développer une infection pulmonaire progressive entrainant une insuffisance respiratoire sévère voire la mort si elle n'est pas traitée. Avec une moindre incidence, ces bactéries peuvent être responsables d’infections cutanées, toujours sur des sujets affaiblis. Ces maladies pulmonaires dues aux mycobactéries non tuberculeuses sont en augmentation dans le monde et dans plusieurs pays, dont les États-Unis et le Canada, le taux d'incidence de ces maladies est supérieur à celui de la tuberculose. Les approches thérapeutiques sont limitées et les infections sont difficiles à traiter en raison de la résistance aux antibiotiques conférée par une paroi cellulaire imperméable, des pompes à efflux ou des enzymes de résistance. Parmi les mycobactéries non tuberculeuses, le groupe Mycobacterium abscessus complex est l’un des plus cliniquement pertinents. La prévalence de groupe a augmenté au cours des deux dernières décennies. Afin d’éviter l’émergence de mutants résistants, les traitements sont des cocktails d’antibiotiques sur de longues périodes, plusieurs mois voire plusieurs années. Le développement de nouvelles thérapeutiques s'impose donc de toute urgence. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés dans des modèles d’infection pulmonaire chez la souris induite par des bactéries appartenant au groupe Mycobacterium abscessus complex. Ces composés auront par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur ces mêmes bactéries.

Bénéfices attendus

Après avoir montré leur efficacité in vitro sur un panel de Mycobacterium abscessus complex, et démontré de bonnes caractéristiques pharmacocinétiques, les molécules d’intérêt seront testées in vivo dans un ou des modèles d’infection pulmonaire chez la souris. Comme chez l’homme, les mycobactéries non tuberculeuses ne sont pas intrinsèquement pathogènes chez la souris saine. Afin d’obtenir un niveau d’infection permettant d’observer une efficacité, nous devons diminuer voir supprimer leurs défenses immunitaires. Nous utiliserons 2 types de modèles : Un premier, court (maximum 2 semaines) utilisant des souris immunodéprimées, nous permettra de savoir rapidement si le composé testé est efficace pour diminuer significativement la charge bactérienne pulmonaire. Un second, plus long (4 à 5 semaines) utilisant des souris immunocompétentes à l’immunité affaiblie nous permettra de savoir si malgré la présence d’une réaction immunitaire même diminuée le composé reste efficace. Pour chaque modèle, une première procédure, nous permettra d’établir les conditions optimales d’infection. Les nouvelles molécules seront tout d’abord évaluées sur le modèle utilisant des souris immunodéprimées, puis les meilleures d’entre-elles seront évaluées sur le modèle utilisant des souris immunocompétentes.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 5 semaines. 2/ Injection en intra-péritoneale, d’un immuno-suppresseur, 2 fois pendant l’étude. 3/ Injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire, une fois par jour pendant un maximum de 6 semaines. 4/ Instillation en intranasale ou en orotrachéale d’une souche infectieuse 5/ Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse, une fois pendant l’étude

Impact sur les animaux

Les nuisances principales et effets indésirables sont ceux d’une infection pulmonaire : Respiration difficile et/ou bruyante, yeux et museau qui coulent, apathie. Les animaux recevront également les différents traitements par gavage oral ou par injection en sous cutané, en intrapéritonéal ou en intraveineux, traitements susceptibles de créer de l’inconfort voir de la toxicité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement, ni sur une durée de quelques semaines, la dynamique bactérienne dans un organisme, la complexité cellulaire impliquée et la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour évaluer l’efficacité de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons des modèles bien établis dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe est compris entre 6 à 10. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière avec administration d’analgésique dans l’eau de boisson dès l’infection. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. Pour éviter tout risque de surinfection, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. Les animaux à phénotype dommageable seront hébergés en portoir ventilé. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature dans les modèles d’infection pulmonaire et qui permet de recourir à des animaux génétiquement modifiés ou mutants, immunodéprimés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte afin d’avoir une maturité pulmonaire.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette prestation menée pour des laboratoires partenaires utilise des souris porteuses d'une mutation reproduisant une maladie liée aux immunoglobulines G4, avec injections de composés et prélèvements de sang et d'urine sur des animaux dès l'âge de deux semaines maintenus avec leur mère. Le porteur indique n'administrer aucun analgésique, au motif qu'il fausserait la réponse immunitaire observée. Il affirme que le modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier" et qu'aucune méthode alternative ne le permet.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de leurs composés thérapeutiques sur les maladies associées aux immunoglobulines G4 (IgG4-RD). Ces maladies sont des troubles fibro-inflammatoires chroniques graves à médiation immune qui se traduisent souvent par des niveaux élevés de protéines dans le sang (IgG4), dans les urines et par le développement de masses semblables à des tumeurs touchant plusieurs organes chez l’homme. Ses différentes manifestations cliniques rendent son diagnostic difficile. Les traitements conventionnels visent à atténuer l'inflammation par l'utilisation anti-inflammatoires mais le taux de rechute (40%) et les conséquences de leur prise sur le long terme sont importants. Le présent projet propose d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les IgG4-RD afin d’augmenter les chances de rémission. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin très bien caractérisé nommé LATY136F qui développe spontanément un syndrome lymphoprolifératif ayant des caractéristiques immunopathologiques semblables aux IgG4-RD chez l’homme. Ce modèle nous permet d’envisager l’étude de composés à visée thérapeutique afin d’évaluer leur efficacité sur la mise en place et l’évolution des IgG4-RD. Pour cela, nous évaluerons les différentes populations cellulaires du système immunitaire de ces souris après injection de composés thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer en phase pré-clinique l’efficacité des composés thérapeutiques ciblant les maladies chroniques graves associées aux IgG4. La prévalence exacte de ces maladies n’est pas connue en partie à cause de son diagnostic difficile à établir et à les dissocier des maladies chroniques connues. Actuellement, les traitements reposent sur l’utilisation d’agents anti-inflammatoires et 40% des patients sont en rechutes. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques est nécessaire afin d’augmenter les chances de rémission des patients. Ce projet permettra d’évaluer à la fois l’effet des composés thérapeutiques sur l’initiation et le développement des IgG4-RD.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’injection intra-péritonéale (i.p) ou sous-cutanée (s.c) de composés thérapeutiques visant à diminuer ou empêcher le développement spontané du syndrome lymphoprolifératif chez les souris LatY136F, modèle qui reflète les maladies associées aux IgG4 chez l’homme. Chaque individu sera manipulé pour : - les collectes de sang et d’urine à J0 et en fin d'expérimentation (=10 semaines) pour déterminer l'évolution des protéines dans le sang et les urines et d'en conclure sur l’efficacité du traitement. Cette intervention est rapide et dure environ 2 minutes par souris pour la récolte du sang et de l'urine. - les pesées hebdomadaire (30 secondes par souris) - les injections des composés thérapeutiques par voie i.p ou s.c en fonction du type de molécule et de la demande des partenaires. La durée d’injection par voie i.p est de 30 secondes par souris. La durée d’injection par voie s.c est de 3 min et 30 secondes temps comprenant la phase d’endormissement de 3 min à l’isoflurane et 30 secondes pour l’injection. -les anesthésies générales gazeuses à l’isoflurane dans le cas d’injection des composés thérapeutiques en s.c d'une durée de 3 minutes. L’expérimentation se terminera lorsque les souris auront 12 semaines. Le jour de l’arrêt expérimental, les souris seront mises à mort pour le prélèvement des organes lymphoïdes et non lymphoïdes en vue de l’immunophénotypage et des études histologiques.

Impact sur les animaux

Les tests d’efficacité de composés thérapeutiques sur les maladies liées aux-IgG4 n’entraineront pas d’effet indésirable chez les animaux dans la mesure où les doses injectées sont préalablement testées pour leur toxicité chez nos laboratoires partenaires. Toutefois, lors de l’expérimentation les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques pouvant engendrer du stress notamment lors des contentions, des collectes de sang et d’urine, des pesées hebdomadaires et des injections de composés thérapeutiques pendant 10 semaines. Les injections n’entraineront pas de douleur. Tous les actes techniques seront réalisés par du personnel expérimenté et expert afin de limiter les contraintes subies par l’animal. Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des organes dans le but d’analyser la réponse immunitaire suite aux traitements

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules, doses ou durées de traitement sont à tester. Dans la mesure du possible, les expériences sont multiplexées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Ce protocole demande également l’utilisation d’animaux jeunes de 2 semaines nés au sein de notre animalerie. Les animaux seront maintenus avec leur mère pour la première injection et sevrés ensuite vers 21 jours. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. Toutefois, nous veillerons au bien être animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des animaux à des âges différents dans la mesure où le développement de la pathologie observé est progressif. Afin de vérifier l’effet des composés thérapeutiques, nous traiterons des souris âgées de 2 semaines avant l’apparition des premiers symptômes pour vérifier si le traitement empêche ou retarde la maladie ; puis sur des souris âgées de plus de 3 semaines lorsque la pathologie est mise en place pour vérifier l’effet du traitement sur les symptômes.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie inflammatoire humaine, elles reçoivent des composés jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines, avec cinq à neuf prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital et des prélèvements urinaires. Le porteur indique que le phénotype dommageable, avec gonflement des ganglions et lésions tissulaires, s'installe vers vingt semaines, et que les composés testés peuvent induire un inconfort. Il affirme que le recours à un modèle animal est "indispensable" pour juger de l'efficacité d'un composé après une phase in vitro.

Objectifs

Chez l’homme, la maladie à IgG4 est une maladie fibro-inflammatoire systémique à médiation immunitaire. Elle se présente sous forme de dysfonctionnement d’organe ou de lésions avec infiltration lympho-plasmacytique dans un ou plusieurs organes (principalement entre autres dans les reins et les poumons) avec des symptômes relatifs à l’organe atteint. Elle peut entraîner une défaillance d’un ou plusieurs organes voire la mort si elle n’est pas traitée. Un taux élévé d’immunoglobulines caractérise également cette pathologie. L’objectif du projet est la découverte de médicament présentant des avantages thérapeutiques par rapport à l’offre médicamenteuse actuelle, capables de contrer l’augmentation des immunoglobulines permettant ainsi de diminuer la gravité des signes cliniques. Par extension, certaines maladies auto-immunes (i.e. Lupus érythémateux disséminé) pourraient également bénéficier de ces thérapies. Pour ce faire, le projet utilisera des souris homozygotes pour la mutation LATY136Fqui récapitule bon nombre des caractéristiques de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Il n’y a actuellement pas de traitement spécifique de la maladie associée aux IgG4 mais les corticoïdes voire des immunosuppresseurs, permettent la régression des infiltrats inflammatoires et donc des symptômes de la maladie. L’objectif du projet est la découverte d’autres options thérapeutiques capables de contrer l’augmentation des immunoglobulines permettant ainsi de diminuer la gravité des signes cliniques. Par extension certaines maladies auto-immunes (i.e. SLE) pourraient également bénéficier de ces thérapies.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 12 semaines sous un volume de 5 à 10mL/kg en fonction de la voie d’administration 2/ en fonction de la durée de l’étude, 5 à 9 prélèvements sanguins à la veine sub-mandibulaire ou au sinus rétro-orbital (sous anesthésie à l’isoflurane et après application locale d’analgésique) 3/ lors des études longues, au maximum 9 prélèvements urinaires (dont un au moment du sacrifice) seront obtenus par mixtion spontanée (espacés d’une semaine) 3/ Au maximum 8 prélèvements urinaires pour les études longues

Impact sur les animaux

Les signes physiologiques des homozygotes apparaissent à partir de 4 semaines d’âge (adénomégalie, lésions tissulaires) et s’amplifient au cours du temps jusqu'à atteindre un phenotype dommageable aux alentour de 20 semaines. Les composés administrés peuvent induire un inconfort. La dose pourra alors être diminuée pour l'ensemble du groupe traité. L'arrêt temporaire ou définitif du traitement pour ce groupe peut être envisagé tout en continuant l'étude pour les autres groupes. Si ces mesures ne fonctionnent pas, une mise à mort anticipée sera envisagée (avis vétérinaire). Des prélèvements sanguins seront effectués : 5 à 9 en fonction de la durée de l’étude. Au maximum, 8 prélèvements urinaires par mixion spontanée seront effectués lors des études longues (espacés d’une semaine).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

Après une phase de test d’évaluation d’efficacité in vitro permettant la sélection des meilleurs candidats, l’utilisation de modèles animaux mimant les pathologies humaines est indispensable pour juger de l’efficacité d’un nouveau composé

Réduction

Le modèle utilisé étant bien décrit dans la littérature, la mise au point sera ainsi limitée. Nous travaillerons sur des groupes homogènes au moment de leur inclusion dans l’étude, afin de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé et générer des résultats reproductibles. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (par exemple, maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Il sera toutefois adapté en cas de signes d’atteintes pulmonaires (élimination des sources de poussières), ou rénale (avec une litiére absorbante). La bonne connaissance de ce modèle décrit dans la littérature permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique selon des critères d’interruption prédéfinis. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est la souris, notamment une souche portant la mutation LATY136F, caractérisée et décrite dans la littérature par plusieurs équipes. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux entre 4 et 16 semaines d’âge suivant l’objectif de l’étude : effet des molécules sur les taux d’IgG1 et IgE ou caractérisation de l’impact de la diminution du taux d’immunoglobulines sur les atteintes tissulaires et fonctionnelles à long terme.

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps, par voie intraveineuse sous anesthésie ou trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un mois, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaux hebdomadaires sous anesthésie jusqu'à cent jours, pour mesurer la durée d'action d'une immunothérapie anti-CD45RC avant un essai clinique. Le porteur indique que la biosécurité de l'anticorps a déjà été démontrée et qu'aucun effet indésirable n'a été observé, et précise que tous les rats sont euthanasiés pour analyser le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'ensemble des systèmes biologiques humains et conclut que le rat reste le "meilleur modèle".

Objectifs

L'immunothérapie ciblée constitue un espoir majeur dans le traitement de nombreuses pathologies dont les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes ou encore le rejet de greffe. Contrairement aux médicament immunosuppresseurs couramment utilisés, la thérapie par injection d'anticorps permet d'induire des effets immunomodulateurs spécifiques en agissant uniquement sur les populations cellulaires d'intérêt. Depuis plusieurs années, notre équipe de recherche a démontré l'efficacité de l'immunothérapie par injection d'anticorps dans le contrôle de l'inflammation dans des modèles de transplantation, de maladie du greffon contre l'hôte et de maladie auto-immune. Une nouvelle société pharmaceutique développe actuellement plusieurs versions de cet anticorps. Les résultats obtenus suite à la collaboration entre cette société et notre laboratoire de recherche permettent aujourd'hui d'envisager un essai clinique de phase I courant 2024. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la pharmacodynamique (la durée de l'effet thérapeutique) de l'anticorps in vivo chez le rat en prévision de cet essai clinique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est de définir à la fois la durée de l'effet d'une injection d'anticorps, et la durée de l'effet d'un cycle de traitment par injection répétées d'anticorps. Ces résultats ont pour objectif final d'orienter le protocole de traitement pour l'essai clinique chez l'Homme.

Procédures

Les animaux auront soit une seule injection d'anticorps en intraveineuse (sous anesthésie) soit un mois de traitement avec 3 injections intrapéritonéales par semaine. Dans les deux cas, un petit volume de sang sera prélevé en rétro-orbital sous anesthésie toutes les semaines à partir de la dernière injection et jusqu'à réapparition des cellules (maximum 100 jours après la dernière injection d'anticorps) pour controler l'efficacité à long terme du traitement.

Impact sur les animaux

La biosécurité de l'anticorps, selon la dose et les protocoles utilisés dans cette étude, a déjà été démontré. Aucune nuisance ou effet indésirable n'a été observé. Les injections intraveineuses ou intrapéritonéales ainsi que les prélèvements sanguins peuvent engendrer une douleur légère de courte durée.

Devenir

L'euthanasie au terme de la procédure ou à l'atteinte du point limite est nécessaire pour permettre l'analyse en parallèle des cellules présentes dans le sang et dans les tissus tels que la rate, les ganglions et la moelle osseuse.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsqu'aucun modèle expérimental in vitro ne permet de le remplacer. Aujourd'hui il n'existe pas de modèle in vitro qui permette de reproduire l'ensemble des systèmes biologiques présents chez l'homme. Ainsi, l'injection d'anticorps chez le rat (anticorps démontré comme étant un bon susbtitut de l'anticorps humain) est le meilleur modèle pour étudier la durée de l'effet du traitement en prévision d'un essai clinique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire chez l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les symptômes seront évalués selon une grille critériée deux fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batônnet de bois,...).

Choix des espèces

Nous avons déjà démontré l'intérêt des modèles de rats pour étudier les pathologies humaines et notamment pour étudier l'implication de certaines cellules dans leur développement. Ainsi, en plus d'avoir mis en évidence la pertinence de l'utilisation des modèles de rats, nous avons prouver que l'injection de notre anticorps n'induit pas d'effets indésirables ou nuisibles chez le rat adulte.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras, elles reçoivent des injections répétées induisant fibrose puis cancer du foie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer le rôle de deux protéines dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur résume les retombées en une phrase, la validation des "effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs". Il affirme qu'"il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé" et conserve les organes pour tirer un maximum de données de chaque souris.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs ont été déjà identifiés (diabète, inflammation, modification du microbiote intestinal). Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à 2 acteurs clefs impliqués dans le développement de ces maladies. Ces acteurs peuvent agir de pair favorisant le développement de ces maladies chroniques du foie. Pour une meilleure compréhension de leurs rôles, nous évaluerons sur des animaux, l’impact potentiellement bénéfique de leur absence sur le développement et la progression de ces maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ces études précliniques valideront les effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs dans les maladies chroniques du foie .

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la cicatrisation hépatique. Pour la procédure 2 : les souris recevront une injection 2 fois par semaine pendant 6 semaines à partir de 7-8 semaines d’âge. Pour la procédure 3 : une unique injection sera réalisée sur les souris mâles âgés de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont les contentions, les prises de poids régulières ainsi que les injections en fonction des procédures. Les effets indésirables attendus pourraient être principalement une faible inflammation locale au site d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, certains aspects du projet seront réalisés sur des cellules. Cependant, il est nécessaire de réaliser des études précliniques car les études sur cellules ne permettent pas de reproduire la maladie humaine. Ainsi, il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé pour ces études.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes et exploitables. Les expériences seront reproduites pour confirmer la significativité statistique. Les organes obtenus à partir des souris seront conservés et stockés pour des analyses ultérieures afin d'enregistrer autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (grille d’observation) nous permettront d'identifier précocément tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée et pertinente pour étudier ces maladies. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La maladie développée par la souris récapitule les symptômes et les caractéristiques de la maladie chez homme. Pour la procédure 1, la mise sous régime riche en graisse débutera lorsque les souris auront 8-10 semaines d’âge. En effet, un tel régime induit une prise de poids importante et peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Cette procédure permet d’analyser la progression des maladies chroniques du foie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline. Pour la procédure 2, le traitement chimique induisant la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge. Cette procedure permettra d’étudier les mécanismes moléculaires associés à la fibrose hépatique. Pour la procédure 3, l’injection du réactif induisant le cancer hépatique sera effectuée à environ 2 semaines d’âge (âge approprié pour cette procédure) et la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge (animaux relativement jeunes). Cette procédure permettra d’étudier les stades le plus avancés de la maladie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline.

7 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie pour d'autres protocoles. Ils reçoivent deux à quatre injections d'un candidat médicament sous anesthésie et des prélèvements de sang, pour produire des anticorps servant de contrôle positif à un test réglementaire. Le projet répond à la demande d'un partenaire industriel développant trois candidats médicaments. Le porteur affirme qu'aucun remplacement n'est possible, les anticorps humains équivalents n'étant pas disponibles.

Objectifs

Notre partenaire, développe des candidats médicaments , dont l’objectif thérapeutique est soit dans le traitement de cancer soit dans des indications en auto-immunité. Trois candidats médicaments (CM) sont actuellement en développement et sont prévus d’être introduits en clinique dans les 2 ans. Dans le cadre du développement de tests permettant la détection et la mesure des anticorps dirigés contre les candidats médicaments (anti-CM-1, anti-CM-2 et anti-CM-3), produits chez le primate et chez l’homme, tests utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme, notre partenaire désire générer des anticorps polyclonaux de primate qui seront utilisés comme contrôle positif dans ce test. Ces anticorps peuvent être obtenus par vaccination non invasive de primates, suivie d’une prise de sang limitée au volume éthiquement acceptable, à partir duquel seront purifiés les anticorps.

Bénéfices attendus

Les anticorps produits chez le primate dans ce protocole seront purifiés et serviront de contrôle positif dans le tests d'anticorps anti-candidat médicament, utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme.

Procédures

Phase 1 Injection du candidat médicament (30 min) à J0 et à J21 sur animaux sous anesthésie légère, et prélèvement de sang en petit volume (30 min) à J0, et à J31, sur animaux sous anesthésie légère. Phase 2 Injection du candidat médicament (30 min) à J0, J21, J42 et à J63 sur animaux sous anesthésie légère, et prélèvement de sang en petit volume (30 min) à J0, J21, J42, J63 et à J71, sur animaux sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Les animaux reçoivent deux à quatre injections intradermiques ou sous-cutanées lors de l’immunisation selon les groupes, à 3 semaines d'intervalle, ce qui peut induire une légère inflammation cutanée, et donc une légère douleur (type vaccin). Nous n'attendons pas d'effet indésirable suite aux prélèvements sanguins espacés au minimum de 3 semaines (petits volumes).

Devenir

Les animaux issus de cette procédure peu invasive, de sévérité modérée, seront gardés en vie, et pourront intégrer un autre protocole de classe légère ou modérée en fonction de la compatibilité des objectifs scientifiques et uniquement après avis du vétérinaire référent.

Remplacement

Il n'existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. L'alternative non animale serait d’utiliser des anticorps humains anti-candidat médicament (anti-CM) comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité. Cependant, ces molécules ne sont pas disponibles. Il est nécessaire d’obtenir des anticorps anti-CM comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité, qui puissent être reconnus par des anticorps secondaires anti-humains. Or des anticorps de ce type ne peuvent pas être obtenus in vitro, car ils ne seraient pas reconnus par les anticorps secondaires anti-humains. Bien que l’utilisation de tels anticorps anti-CM déjà disponibles ait été envisagée, elle ne permettait pas la détection d’anticorps anti-CM humains. Cela aurait invalidé le test, qui présente un caractère réglementaire. Ainsi l'immunisation d’animaux dont les anticorps peuvent être reconnues par des anticorps humaines doit être utilisée à cette étape du développement.

Réduction

Le nombre maximum de 2 animaux par groupe est suffisant pour la production et la purification d’une quantité suffisante d’anticorps polyclonaux. Cependant si l'immunisation d'une seul animal satisfait à la quantité et à la qualité des anticorps produits, le second animal ne sera pas utilisé. Aucun test statistique n’est nécessaire. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés et dans la mesure du possible, les primates inclus dans cette procédure expérimentale, pourront être réutilisés d’un protocole précédent après avis favorable du vétérinaire.

Raffinement

De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie et un traitement analgésique leur sera donné de façon adaptée en cas de réactions secondaires suite à l’immunisation. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des immunisations, passant de 3 à 6 fois par jours, et consiste en des examens cliniques de l’animal vigile, permettant une prise en charge individuelle et adaptée. Les animaux seront hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités seront hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de l’espace.

Choix des espèces

Les PNH, particulièrement les babouins, représentent l’espèce animale de choix pour la génération d’anticorps de référence pouvant servir de contrôles positifs pour doser les anticorps anti-anticorps thérapeutique générés à la fois chez le singe (macaque) et chez l’homme. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 15Kg) dont le système immunitaire est mature.

2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à sept actes en un peu plus d'un mois, dont des injections, deux anesthésies rapprochées, une hyperthermie localisée et un prélèvement de sang intracardiaque terminal, pour tester des nanoassemblages contre l'hépatite auto-immune. Le porteur obtient ce total en triplant un effectif de 896 animaux, soit trois répétitions indépendantes. Le bénéfice annoncé, un traitement ciblé épargnant l'immunité globale, reste une perspective, ces produits n'ayant jamais été administrés à des animaux.

Objectifs

Les maladies auto-immunes comme le diabète de type I, la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque résultent d’un dérèglement du système immunitaire. Parmi ces maladies, l’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie rare avec une prévalence en Europe de 16 à 18 cas pour 100 000 habitants. Ce dérèglement hépatique provoqué par une attaque du foie par des lymphocytes T peut entraîner des défaillances hépatiques et/ou des cirrhoses. Le traitement actuel, non-spécifique (à base d’immunosuppresseurs combinant des corticostéroïdes et de l’azathioprine) présente de nombreux effets secondaires et entraîne une rémission complète en 18 mois pour seulement 75% des patients. De plus, 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après arrêt du traitement. Des nouveaux traitements sont donc nécessaires. Nous souhaitons tester une nouvelle approche de thérapie sous la forme de nanoassemblages (NA) complexes combinant plusieurs stratégies. Une première étape de caractérisation, de validation, et de test de toxicité dans des cellules en culture a été réalisée pour plusieurs formulations, à l’issue de laquelle, 4 différentes formulations ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une poursuite d’étude dans un modèle animal. Nous disposons de 2 modèles murins complémentaires d’une atteinte autoimmune hépatique. Les objectifs du projet sont de tester l’innocuité des 4 formulations sélectionnées sur des souris sauvages, puis de tester l’effet thérapeutique de ces NA sur les modèles murins d’hépatite. Ces travaux permettront in fine de combler l’absence actuelle d’approche thérapeutique ciblée pour le traitement de l’hépatite autoimmune.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir l’efficacité d’une nouvelle approche pour le traitement de l’hépatite autoimmune. Le traitement actuel de cette maladie n’a pas évolué depuis plus de 30 ans et consiste en une immunosuppression non spécifique prise au long cours, qui présente des effets indésirables certains. L’approche testée dans ce projet permet d’envisager un traitement ciblé, permettant de ne pas altérer l’immunité globale du patient.

Procédures

Au maximum, les animaux subiront 7 actes, sur une période de 34 à 37 jours. Des animaux recevront une injection (durée 1 minute, animal anesthésié), suivie 10 jours après d’une injection (durée 30 secondes, animal vigile), puis deux injections seront réalisées à une semaine d’intervalle (durée 1 minute chacune, animal anesthésié). Des souris subiront deux anesthésies à des temps rapprochés, la première pour une injection (durée 1 minute) et la seconde, 6 heures après, pour une phase d’hyperthermie modérée localisée (durée 30 minutes), Enfin, un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Des animaux subiront deux anesthésies gazeuses rapprochées (6 heures d’intervalle), ce qui pourrait engendrer un stress. De plus la seconde anesthésie, d’une durée de 30 minutes pourrait entrainer une dépression cardiovasculaire transitoire, ainsi qu’une diminution de la température corporelle de l’animal. Les modèles d’hépatite utilisés provoquent tous deux une hépatite modérée qui n’entraine pas d’effets indésirables notoires. Pour ce qui est des traitements testés, on ne peut pas savoir à l’avance puisqu’ils n’ont jamais été utilisés chez l’animal. Toutefois en se basant sur la bibliographie utilisant des produits comparables, aucun effet indésirable n’a été rapporté. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après les traitements.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer le foie, les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses d’histologie, de microscopie, de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les étapes de mise au point ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser en vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 2688 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 112 lots de 8 animaux = 896 ; 3 répétitions indépendantes : 2688 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. S’il s’avère qu’un traitement présente une toxicité, l’étude de ce traitement ne sera pas poursuivie dans les procédures suivantes. Dans un but de réduction, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les concentrations sont les mêmes pour plusieurs produits et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les manipulations invasives seront précédées d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. A notre connaissance, il n’existe pas de modèle pertinent autres pour notre étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 8 à 10 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de la pathologie et dans la réponse au traitement.

6 000 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois avec adjuvant, et des prélèvements de sang pouvant aller jusqu'à quatre par jour, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et des médicaments. Hébergés seuls alors que l'espèce est sociale, ils sont tués en fin de protocole, un prélèvement de sang final important rendant leur maintien en vie impossible selon le porteur. Celui-ci reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques).

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 2 mL répartis sur 4 à 8 sites maximum pour la voie sous-cutanée, 0.5 mL sur 4 sites maximum pour la voie intra-musculaire, 5 mL/kg pour la voie intraveineuse, 2mL sur 40 sites maximum pour la voie intra dermique. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique mais seront au maximum espacés d’un à deux jours sur une durée totale d’un mois. En cas de durée supérieure à un mois, la structure en charge du bien-être animal sera contactée pour évaluer le bénéfice / risque. Concernant les prélèvements, les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de 5 minutes. Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à une anesthésie générale par injection d’un anesthésique par voie intraveineuse ou à une anesthésie locale répétée par application d’une pommade anesthésiante. Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Il est en effet impossible de : réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre protocole d’immunisation, réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre projet effectué par l’établissement utilisateur. Lors du prélèvement final de la procédure, un volume significatif de sang est récupéré et cela rend incompatible la réutilisation de l’animal.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

Également, à travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin, anneau en plastique, mousqueton…) Un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Durant cette pesée, un examen approfondi de l’état clinique des lapins est effectué par le technicien (e.g. : vérification des points d’injection, maux de patte éventuels, dentition…). Également, durant ce processus, des caresses aux animaux sont prodiguées. Des points limites intermédiaires associés à des actions spécifiques et des points limites terminaux sont en place. Par exemple, en cas de perte de poids ≥ 20% sur une semaine, une nourriture appétante est proposée à l’animal. Également, en cas d’apparition de certains signes cliniques (exemples : masses sans douleur pour l’animal, abcès sans lésion, fécalome) des protocoles de soins validés par un vétérinaire sont prodigués aux animaux. Certains gestes douloureux (injections intra-dermique) sont réalisés sous anesthésie générale et les injections répétées sont effectuées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Choix des espèces

Le lapin est l'animal le plus utilisé pour la production d’anticorps étant l’espèce animale la plus adaptée pour cela, de par la production de volumes suffisants d'antisérum qualitatif et à titre élevé. Cela permet donc d’utiliser moins d’animaux pour l’objectif scientifique requis. Age minimum des lapins : 10 semaines. A cet âge, les lapins ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.