Troubles immunitaires

924 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des vecteurs viraux codant des molécules immunothérapeutiques puis des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour analyse de leurs organes, afin de comparer des candidats contre l'immunosuppression qui suit un sepsis. Le porteur indique n'attendre aucune toxicité des produits testés. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative capable d'apporter le même niveau d'information.

Objectifs

Nous nous interessons au développement de molécules agissant sur le système immunitaire exprimées par des vecteurs viraux notamment pour traiter l’immunosuppression post-sepsis. De nombreuses molécules existent sous forme de protéines recombinantes dont certaines d’entre elles sont déjà en développement clinique dans le traitement de l’immunosuppression post-sepsis. L’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur viral pourrait permettre une expression prolongée, une distribution différente dans l’organisme, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme soluble et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat basé sur un vecteur viral codant pour une molecule agissant sur l’immunité adaptative, administré par voie intraveineuse. Dans le but d’optimiser ce 1er candidat, nous voulons évaluer dans une étude préclinique exploratoire, la possibilité de co-exprimer dans ce vecteur, une molécule agissant sur l’immunité innée avec la molécule agissant sur l’immunité adaptative déjà validée, chez la souris naïve puis dans un modèle murin de souris spécifique de l’immunosuppression induite par le sepsis. Agir à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative pourrait permettre une meilleure restauration du système immunitaire et ainsi diminuer le temps d’hospitalisation, le taux d’infection secondaire et in fine le taux de mortalité post-première infection et/ou seconde infection. Plusieurs candidats ont été développés : un pour chacune des molécules seules et un pour les deux ensembles. L’objectif final est de démonter l’intérêt de co-exprimer deux molécules agissant sur les deux pans du système immunitaire pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis, dans un même vecteur. Cependant, le modèle murin de sepsis utilisé étant classé sévère, il est primordial de vérifier l’efficacité des produits dans des souris naïves au préalable. En effet, si le(s) produit(s) n’avai(en)t pas l’effet escompté sur le système immunitaire, ou que l’ajout de la seconde cytokine s’avérait délétère pour l’activité déjà connue du produit, il ne serait alors pas testé dans le modèle sepsis.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression induite notamment par le sepsis en restaurant le système immunitaire des patients et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est de permettre l’avancement des connaissances scientifiques sur les différents produits d’immunothérapie injectés par voie intraveineuse chez la souris naïve. Les objectifs à long terme sont de tester ces produits d’immunothérapie dans un ou plusieurs modèles de souris immunodéprimées à la suite d’une infection (sepsis). Si un/plusieurs de ces produits permettent de restaurer l’immunosuppression induite chez la souris, ils pourraient faire l’objet d’un développement clinique afin d’espérer obtenir une autorisation de mise sur le marché afin de soigner l’immunosuppression chez l’homme dans l’indication du sepsis.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Injection d’un tampon par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 14% des animaux -Injection d’un produit d’immunothérapie, parmi les 4 produits à visée thérapeutique à tester, par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 86% des animaux -Prélèvement de sang sous anesthésie locale (30secondes/souris) pour 100% des animaux

Impact sur les animaux

Aucune toxicité des produits testés n’est attendue. Les animaux subiront en plus de l’injection des produits d’immunothérapie des prélèvements sanguins après anesthésie locale.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort puis le sang et/ou organes sont prélevés nous permettant d’évaluer l’efficacité de notre produit d’immunothérapie. Aucune souris restante à la fin des deux procédures.

Remplacement

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la durée et le taux d’expression de plusieurs produits d’immunothérapie chez l’animal et de mesurer les activités immunologiques sur différents types cellulaire provenant de différents organes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs.

Réduction

Tout au long du projet, nous essayerons de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le sang de 3 souris/groupe/temps sera prélevé pour la réalisation de la pharmacocinétique (nombre d’animaux suffisant, basé sur les résultats des procédures précédemment réalisées dans le cadre du projet global), pour limiter le nombre d’animaux. Six souris/groupe sont prévues pour couvrir l’éventuelle variabilité des tests immunologiques (variabilité plus importante pour ces tests immunologiques déjà observée au préalable) et permettre l’analyse statistique. Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, le nombre d’animaux proposé ici pour chacun des types de tests est le minimum requis pour obtenir un résultat fiable. Dans ce projet, pour chaque procédure nous prélèverons post mortern la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.

Raffinement

Mise en place du raffinement dans nos procédure : Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie générale gazeuse après application d’un anesthésique local. Les prélèvements sanguins se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Les points limites ont été définis de manière suffisamment prédictive et précoce pour éviter toute souffrance de l'animal de la naissance à la mort. Tout au long des procédures nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue après injection de nos candidats (2h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de nos produits sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du paracétamol sera donné dans l’eau de boisson (0.6mL/mL). Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal. En cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au sérum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si une infection bactérienne et/ou une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle animal pour étudier la réponse immunitaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité d’un des candidats dans ce modèle murin, il nous semble pertinent de valider les autres candidats dans le même modèle, puisqu’une comparaison entre ces différents produits sera réalisée ici. Ces produits d’immunothérapies sont développés pour être utilisés chez l’homme et ils devraient cibler des patients adultes. Pour réaliser les tests préliminaires chez la souris naïves, nous utiliserons des souris avec un système immunitaire fonctionnel. Nous utiliserons donc des animaux d’au moins sept semaines pour ces études précliniques.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à sept par animal, et du LPS qui provoque un état de type septique avec fièvre, diarrhée et tremblements, ces derniers servant de point limite, ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le porteur affirme que l'étude de la protéine visée ne s'envisage que dans un "organisme complet" et non sur un modèle cellulaire. Les débouchés annoncés pour l'aplasie fébrile de l'enfant restent formulés comme des perspectives.

Objectifs

Le traitement des cancers de l’enfant utilise la chimiothérapie, qui peut transitoirement entrainer un déficit d’immunité appelé aplasie. Durant cette période, les enfants présentent souvent des épisodes de fièvre, pouvant être sévères et entraîner la mort. Devant ce risque, des mesures importantes sont mises en place avec hospitalisation en urgence et utilisation d’antibiotiques. Les infections en cours d’aplasie fébrile restent une réelle complication avec risque de décès chez ces enfants malades. Onze à 24 % vont présenter une bactériémie (présence d’une bactérie dans la circulation sanguine), facteur de risque de décès en contexte d’aplasie fébrile. En effet, la mortalité au cours des aplasies fébriles chez l’enfant est estimée entre 0,2 et 3 %, pouvant s’élever jusqu’à 10% chez les patients avec une bactériémie. Les infections à Pseudomonas aeruginosa gardent une place majeure tant par leur fréquence que par leur sévérité. A ce jour, il n’existe pas de marqueur biologique pouvant prévenir la gravité d’une aplasie fébrile. Il existe des molécules de danger, libérées dans le corps en période d’infection, et qui sont néfastes pour l’organisme (inflammation majorée, formation de caillots sanguins). Des études publiées montrent que neutraliser ces molécules de danger peut avoir un effet protecteur, améliorant le pronostic au cours d’une infection sévère. Des travaux préliminaires réalisés chez l’adulte présentant une infection sévère et généralisée, suggèrent que la protéine X, naturellement produite par l’organisme, est capable d’inhiber les effets délétères de certaines molécules de danger. Notre projet repose sur l’hypothèse que, chez l’enfant présentant une aplasie fébrile, le taux sanguin de X peut prédire la sévérité de l’infection. Notre étude s’articule en 2 axes : (1) une étude clinique portant sur l’intérêt du dosage de X dans une population pédiatrique suivie en oncologie et (2) une étude chez la souris mesurant la synthèse et l’élimination de X au cours de l’infection et évaluant son potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les débouchés cliniques sont multiples : (i) évaluation de nouveaux marqueurs permettant de prédire la gravité d’un épisode d’aplasie fébrile, (ii) orientation vers le type de pathogène (bactérien, fongique, viral), (iii) proposition d’escalade ou de désescalade de la prise en charge anti-infectieuse, notamment dans le contexte des tumeurs solides pédiatriques et enfin (iiii) un potentiel impact thérapeutique.

Procédures

Dans les quatre procédures de l’étude, les animaux seront traités par des injections intrapéritonéales. Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Dans les quatre procédures de l’étude, des prises de sang seront réalisées. Sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes), la prise de sang rétro orbitaire permet la récolte de 50 à 100µL de sang en moins de 2 minutes, sans traumatisme et sans douleur. Lorsqu’un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement (avec réveil). Procédure 1 : pour chaque animal • 1 injection intra péritonéale • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 2 : pour chaque animal • 2 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie • • Procédure 3 : • 3 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 4 : • 7 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’administration de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux des procédures 1, 3 et 4. Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre de sous-cutanées qu’un un animal pourra recevoir. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

Ce projet étudie le sepsis, c’est-à-dire une inflammation systémique déclenchée par le LPS (lipopolysaccharide = endotoxine), mimant ainsi une infection bactérienne, chez le sujet soumis à une chimiothérapie aplasiante. Une inflammation systémique donne classiquement de la fièvre. Les souris pourront présenter, suivant la dose reçue (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une fatigue et une douleur potentielle. Une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une diarrhée transitoire, une modification de comportement par l’absence de mobilité pourront être observées. A une dose plus importante de LPS, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés. Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. 1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle concerne tous les animaux du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle permet, sous anesthésie gazeuse, une récolte de sang rapide, sans traumatisme et sans douleur. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’injection de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Devenir

Nous souhaitons doser la molécule X ainsi que diverses molécules pro-inflammatoires dans le sang des animaux mais aussi dans des organes comme la rate, le foie, les poumons et les reins qui sont très touchés par l’orage cytokinique déclenché par le sepsis. Les animaux seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le métabolisme de la protéine X est mal connu à ce jour. Sa synthèse est probablement mixte, avec une production (i) par les cellules sanguines), mais également (ii) par d’autres tissus, dont les endothéliums vasculaires (=vaisseaux sanguins). L’étude de cette protéine ne peut donc s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. Un modèle murin parait être le plus adapté à l’étude de cette protéine.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 (Berndston et al. J ANIM SCI 1991). La cinétique des réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, celles-ci seront répétées au minimum deux fois pour renforcer l'approche statistique (Cf. chronogramme associé au dossier).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, selon l’annexe III de la directive 2010/63/CE, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général selon les critères de Lloyd et al. (Lab animal management and welfare, 1994). Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. De plus, la littérature scientifique décrit de nombreux modèles murins de sepsis. Nous disposons au laboratoire, d’une lignée de souris de fond génétique C57BL/6 chez laquelle le gène de la protéine X, étudiée dans ce projet, est rendu non fonctionnel. Cette technique couramment utilisée en recherche pré-clinique permet de démontrer l’importance d’une protéine dans un modèle donné. Notre étude porte sur l’aplasie fébrile pédiatrique. Nous utiliserons donc des animaux de 4 à 5 semaines, sevrés mais n’ayant pas atteint la maturité sexuelle.

6 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des souris dites humanisées vendues à des laboratoires. Elles reçoivent une irradiation puis une greffe de cellules humaines par voie intraveineuse, avec des prélèvements sanguins de contrôle, et une partie développe une réaction du greffon contre l'hôte se traduisant par une perte de poids. Le porteur indique que les souris ayant pris la greffe sont expédiées vivantes aux chercheurs, tandis que les échecs et les animaux en fin de protocole sont euthanasiés. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles reproduisent la réponse immunitaire "dans son ensemble" et ne peuvent être remplacés, tablant sur un taux de succès de 80 %.

Objectifs

L’étude des pathologies humaines et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques sont souvent limités par l’absence de modèle animal approprié. La souris est le modèle le plus fréquemment utilisé pour la compréhension du fonctionnement du système immunitaire ainsi que l’étude des maladies infectieuses et des cancers dans l’espèce humaine. Cependant, les résultats expérimentaux obtenus chez la souris ne sont pas toujours transposables à l’homme car les systèmes immunitaires des 2 espèces présentent des différences marquées. Dans certaines conditions expérimentales, la greffe de cellules humaines permet de générer des souris dites humanisées récapitulant une partie du système immunitaire humain. L’objectif de ce projet est de proposer à la communauté scientifique la production de souris humanisées qui serviront de modèles pour la recherche scientifique et médicale. Le type cellulaire greffé (cellules souches ou cellules périphériques du sang) déterminera la spécificité du modèle.

Bénéfices attendus

Le système immunitaire est impliqué dans beaucoup de maladies humaines : cancer, maladies métaboliques, infections virales, phénomènes allergiques. Cependant, il existe des différences importantes entre les systèmes immunitaires humain et murin. Une façon de dépasser ces différences est d’utiliser des modèles murins greffés avec des cellules ou des tissus humains — c'est-à-dire des rongeurs « humanisés » au niveau de leur système immunitaire. Les modèles rongeurs « humanisés » présentent un système immunitaire humain compétent et constituent par conséquent des modèles pertinents pour la recherche dans les domaines de l'immuno-oncologie, la biologie tumorale, les maladies infectieuses, les rejets de greffe et les études de transplantation tissulaire. Quelques-uns des domaines clés dans lesquels les souris humanisées ont considérablement contribué à la compréhension scientifique de la maladie humaine sont décrits ci-après. Les premières études sur des souris humanisées ont permis d'identifier les voies inflammatoires impliquées dans le développement du cancer du sein. Les modèles humanisés ultérieurs ont également permis d'étudier les interactions complexes entre les cellules immunitaires au sein de tumeurs humaines. Il est ainsi possible d’étudier le potentiel thérapeutique de médicaments, seuls ou en combinaison, pour réduire la progression tumorale. Ce type d’approche est aussi à la base du développement des immunothérapies qui rencontrent un succès spectaculaire dans certaines pathologies et pour certains patients. Les modèles murins humanisés sont également de bons modèles d’infection par les virus (ex : HIV, Hépatites, Zika), les bactéries (ex : Salmonelles, Streptocoques…) et les parasites (ex : Leishmania). Notre plateforme d’humanisation de rongeurs proposera à la communauté scientifique des modèles humanisés « prêts à l’emploi ». La préparation des modèles rongeurs humanisés est longue (jusqu’à 15 semaines), délicate et coûteuse. Sur notre plateforme, le process d’humanisation de l’animal sera hautement standardisé et réalisé par des équipes spécialisées afin d’autoriser une reproductibilité maximale des données scientifiques et de réduire le nombre d’animaux requis.

Procédures

En fonction des modèles développés, les animaux pourront recevoir dans un premier temps un traitement de radiothérapie afin d’être à même de recevoir la greffe. Les cellules humaines leur seront ensuite injectées par voie intraveineuse en guise de greffe. Une fois la greffe suffisamment développée dans l’organisme des souris, un ou des prélèvements sanguins pourront être réalisés pour s’assurer que le niveau de greffe est suffisant ou pour analyser d’autres paramètres biologiques d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les étapes de radiothérapie, d’injection de cellules et de prélèvement sanguin seront des sources potentielles de douleur et/ou de stress pour l’animal. La radiothérapie endommage le système immunitaire et peut endommager certains organes. L’injection veineuse des cellules humaines nécessite l’utilisation d’une boîte de contention afin de maintenir l’animal immobile pendant quelques minutes. Le prélèvement sanguin nécessitera également une contention de l’animal. Cette contention sera réalisée de façon manuelle ou à l’aide d’une boîte de contention en fonction de la voie d’abord. Par ailleurs, chez les modèles de souris humanisés générés via injection de cellules humaines la maladie du greffon contre l'hôte(GvHD) survient (ce qui n’est pas le cas chez les modèles générés via injection de cellules souches). La GvHD se traduit généralement par un eperte de poids ainsi qu’une activité réduite de l’animal.

Devenir

Les souris ayant été humanisées via injection de cellules du sang ou ayant développé un système immunitaire humain après injection de cellules souches : sont expédiées au scientifique -les souris n’ayant pas réussi à reconstituer un système immunitaire humain ainsi que celles ayant répondu favorablement à la greffe cellulaire mais en fin de protocole seront euthanasiées.

Remplacement

Les modèles constitués par les souris humanisées permettent d’étudier les réponses immunitaires de l’organisme dans son ensemble. Il n’est donc pas possible de les substituer par d’autres méthodes non animales.

Réduction

Nous anticipons un taux de succès de 80% (% de souris développant un niveau suffisant de cellules humaines dans le sang), ce qui représente 4800 animaux validés disponibles pour la recherche pour les 5 ans du projet. Nous travaillerons tout le long du projet à augmenter ce taux de succès au fur et à mesure de l’expérience acquise pour atteindre une réduction maximale d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux utilisés étant immunodéficients, ils seront hébergés dans un environnement indemne de tout germe susceptible de les rendre malades. Ils seront également toujours manipulés sous hotte, de manière à éviter tout risque de contamination. Tout le long de la procédure, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter une éventuelle dégradation de leur état de bien-être. Le cas échéant, de l’aliment humidifié leur sera mis à disposition sur le sol de la cage et une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi vétérinaire. Des soins adaptés seront apportés selon les préconisations de ce dernier (ex : réhydratation, soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, soins intensifs, …). En cas d’atteinte de point limite, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Concernant l’injection des cellules en intraveineux : les animaux seront placés au préalable dans une armoire chauffante à 38°C (maximum 30 minutes) pour obtenir une vasodilatation et faciliter l’injection. La même approche pourra être suivie pour les prélèvements sanguins. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire (pour injection ou prélèvement), un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Une réhydratation systématique sera réalisée après prélèvement sanguin, au moins équivalent au volume prélevé.

Choix des espèces

Nos modèles humanisés seront développés chez la souris. Seuls des animaux immunodéficients se prêtent à la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel. Les seuls modèles animaux immunodéficients disponibles à l’heure actuelle correspondent à des modèles souris et rats. D’autre part, la souris est, à l’heure actuelle, l’espèce la plus utilisée en recherche biomédicale. De nombreuses données expérimentales ont déjà été collectées à l’aide des modèles humanisées murins. Ces choix sont dictés par les données scientifiques internes et externes (publications scientifiques) à notre entreprise quant à l’efficacité de la prise de greffe et les applications spécifiques de ces modèles.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.

Procédures

• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).

Devenir

les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.

Choix des espèces

Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.