Troubles sensoriels

Opérés sous anesthésie générale pour se faire implanter un dispositif médical dans l'œil, lors d'une chirurgie pouvant durer jusqu'à deux ou trois heures, 300 lapins et 150 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur indique que l'hématome ou l'œdème au niveau du site opératoire peut entraîner une diminution ou une perte importante de la vision. Ces implantations servent à constituer les dossiers d'autorisation de mise sur le marché de produits d'ophtalmologie, testés pour le compte de donneurs d'ordre. L'effectif est arbitré à partir de l'estimation du nombre d'études signées avec ces clients sur les cinq ans du projet.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en ophtalmologie (exemple : produit ou matériel utilisés pour les chirurgies de la cataracte ou du glaucome...).). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité et tolérance lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux de données de performance et de tolérance des produits de santé en ophtalmologie. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.

Procédures

Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer de quelques minutes à jusqu’à 2h à 3h). Cette intervention peut avoir lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - stress liés à la réalisation d’une anesthésie générale et d’une chirurgie (stress de la contention, , stress lors du réveil). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours. -hématome ou œdème au niveau du site opératoire pouvant entrainer une diminution ou une perte importante de la vision. - retrait de la nourriture chez le porc qui est de 12 à 24h, pour la mise à jeun per opératoire en vue de l’anesthésie.

Devenir

Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induits par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en ophtalmologie.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" des produits à tester différents. Les études de screening et les études pilotes peuvent être menées en amont pour permettre de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, ou pour déterminer le meilleur modèle pour le dispositif à tester, réduisant de réduisant le nombre d’animaux utilisés pour les études réglementaires à plus grande échelle, quidoivent répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir de l’estimation du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet.

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : -Le stress des animaux : avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : en phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et complétés par des scores de suivi de la douleur. La présence d’un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter la souffrance.

Choix des espèces

Le lapin et le porc sont des modèles reconnus dans la littérature scientifique en ophtalmologie, en raison des grandes similitudes anatomiques avec l’œil humain. Le choix de l’espèce se fera selon le type de dispositif et les contraintes normatives associées, afin de répondre à ce que demande la réglementation pour la mise sur le marché des dispositifs médicaux. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l’utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.

Toutes tuées à l'issue parce que les atteintes subies interdisent tout placement ou réutilisation, 492 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par une première chirurgie de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, une partie d'entre elles subissant une seconde intervention, chirurgicale ou pharmacologique, destinée à détruire par degrés leur appareil vestibulaire. Les souris ainsi rendues déséquilibrées suivent ensuite un programme de rééducation calqué sur celui proposé aux patients humains. Le porteur signale que ces souris peuvent aussi devenir sourdes, précise que ce point n'est pas quantifié parce qu'il sort du sujet, et affirme que la neurophysiologie intégrative ne peut être conduite que sur animal vivant et éveillé.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier à l'aide de modèles précliniques fiables et reproductibles, l'intérêt potentiel de la mise en place de protocoles locomoteurs et visuels. Les objectifs spécifiques seront i) de déterminer les fenêtres d'opportunités thérapeutiques en quantifiant l'intérêt d'une prise en charge précoce, ii) de déterminer en fonction de la sévérité des pathologies vestibulaires, les bénéfices thérapeutiques potentiels des différentes approches locomotrices et visuelles. Dans le cas de pathologies touchant l'équilibre, les patients ressentent des déséquilibres et des flous visuels liées à une mauvaise stabilisation du corps et du regard au cours des mouvements. Se mettent alors en place des substitutions sensorielles qui permettent progressivement le rétablissement de l’équilibre grâce aux informations visuelles et proprioceptives. La prise en charge des patients comprend la mise en place d'une rééducation vestibulaire consistant en des séances de sollicitations multi sensorielles, notamment à la marche ou visuelles. Ces protocoles n'ont cependant jamais fait l'objet de validations précliniques, ils sont extrêmement variables et dépendent largement de la pratique des professionels de santé.

Bénéfices attendus

Le projet constitue un projet de recherche fondamental dont les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des capacités plastiques du cerveau dans un contexte de dégradation ou perte totale des infomations sensorielles vestibulaires. En particulier le projet permettra de mieux identifier le potentiel thérapeutique associé à des protocoles de réhabilitations effectués en rééducation vestibulaire. Bien que conduit chez l’animal, les retombées sociétales du projet concernent donc la recherche translationnelle chez l’homme et notamment la question de la réhabilitation de patients souffrants de pertes vestibulaires.

Procédures

Tous les animaux (n=492) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Pour générer les modèles de vertiges, une partie des souris seront soumises à une seconde chirurgie afin de causer des pertes vestibulaires gradées par une approche chirurgicale ou pharmacologique. Ces animaux bénéficieront ensuite d'une réhabilitation comparable aux interventions thérapeutiques mises en place chez l'homme dans le cadre de réhabilitation vestibulaire.

Impact sur les animaux

Des chirurgies et interventions pharmacologiques potentiellement douloureuses nécessaires au projet sont réalisées ; afin de minimiser le stress et la douleur, des traitements analgésiques et antalgiques adaptés sont mis en place. Comme les patients, les souris déficientes vestibulaires peuvent présenter des déficits auditifs associés qui ne sont cependant pas l'objet de l'étude et ne sont donc pas quantifiés.

Devenir

L'ensemble des procédures subies ne permettent pas de placer ni réutiliser les animaux qui doivent donc être euthanasiés (n=492 maximum) en fin de protocole.

Remplacement

L’intégration des signaux sensoriels issus de l’oreille interne, de la proprioception, de la vision, et les signaux moteurs issus de la moelle implique de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions entre systèmes, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests couvrant la période de réhabilitation. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, il est susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères. Les animaux seront utilisés à l’âge où les réflexes sensorimoteurs étudiés sont matures, soit à partir de 6 semaines et jusqu’à 16 semaines (4 mois) pour les plus âgées.

Brûlés en quatre points du dos sous anesthésie générale, 8 mini-porcs subissent ensuite huit renouvellements de pansement et seize biopsies cutanées de 8 mm. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur neuf jours de manipulation, et tous tués à l'issue pour prélever la peau brûlée. L'objet est de tester un pansement régénératif censé éviter les autogreffes chez les grands brûlés, avant tout essai clinique. Le porteur décrit un programme hebdomadaire de jeux, des fruits et légumes quotidiens et un pansement gastrique préventif, dans le même document qui prévoit quatre brûlures profondes par animal.

Objectifs

Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical innovant à 2 composantes : une composante physique et une composante biologique. Celui-ci est destiné au traitement des brûlures chez l'homme. Les 2 composantes physique et biologique ont par ailleurs été testées séparément en laboratoire et sur des brûlures cutanées de mini-pigs. Les objectifs de ce projet sont de tester le pansement dans sa forme finale (composantes combinées) sur les brûlures du mini-pig, en évaluant plusieurs critères : - La tolérance du pansement. - Sa protection contre les contaminations bactériennes. - Le maintien de son intégrité au cours du temps. - La réduction de l’inflammation locale et systémique. - L’impact sur la vitesse et la qualité de cicatrisation. La pertinence de cette étude repose sur la forte ressemblance entre le mini-pig et l’homme à l’échelle de la peau, ce qui est rend les données générées robustes pour une translation vers des études cliniques.

Bénéfices attendus

Les brûlures constituent un problème de santé publique majeur, avec près de 11 millions de personnes dans le monde subissant annuellement des brûlures suffisamment graves pour nécessiter des soins médicaux. Ce problème touche particulièrement les enfants qui représentent près de 50 % des brûlés, et pour lesquels la stratégie thérapeutique la plus souvent choisie est d'effectuer une autogreffe de peau. Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical régénératif innovant, destiné au traitement des brûlures du second degré profond chez l’homme, dans le but d'éviter, lorsque c'est possible, les autogreffes, et de restaurer rapidement l'intégrité du tissu tout en minimisant les infections, la douleur et la cicatrice résiduelle. Son intérêt est aussi d'améliorer la vitesse et la qualité de cicatrisation par rapport aux pansements traditionnels.

Procédures

Les interventions réalisées comprennent 9 jours de manipulation au total (20 à 30 minutes par animal et par jour), sous anesthésie générale : -4 brûlures au total par animal, réalisés en une seule fois (10 minutes). -8 renouvellements de traitement et pansements des brûlures (15-20 minutes). -2 prises de sang (6mL) au total par animal (1 minute). -4 biopsies de peau rondes de 8mm au total par plaie et par animal (5-10 minutes).

Impact sur les animaux

-Douleur due aux brûlures et aux biopsies. -Stress et gêne dus à la présence de plusieurs pansements sur le dos de l’animal. -Stress dû à la manipulation fréquente et à l’hébergement individuel. -Risque d’effets secondaires liés à l’anesthésie fréquente (mais de courte durée) et/ou à l’administration fréquente d’analgésiques. -Risque d’infection des plaies.

Devenir

Le sort des 8 animaux inclus dans cette étude est la mise à mort à la fin du protocole, pour cause de prélèvement d'organes post-mortem, notamment la peau au niveau des différentes brûlures pour analyses des tissus cutanés.

Remplacement

Les études de tolérance et d’efficacité d’un dispositif médical doivent être réglementairement réalisées sur des modèles animaux avant tout essai clinique chez l’homme. Les tests cutanés qu’il est possible de faire en laboratoire ont été appliqués avant d’envisager le modèle animal mais ceux-ci génèrent peu de données ; la peau est en effet un tissu complexe et la cicatrisation un mécanisme auquel participent une multitude de cellules et de facteurs, qui ne peut être reproduit dans un laboratoire.

Réduction

Après une étude pilote, le nombre d’animaux inclus dans cette étude a été validé par une méthodologiste statisticienne et assure un nombre optimal d’individus pour générer des résultats robustes et exploitables.

Raffinement

Dans la conception de ce projet, l’ensemble des procédures ont été bien étudiées afin de générer des données robustes et exploitables tout en respectant les critères du bien-être animal et en limitant sa douleur et son stress. Les animaux disposent de nourriture adaptée, diversifiée et enrichie quotidiennement (fruits et/ou légumes), d’eau en accès libre et d’un programme hebdomadaire de jeux et activités. De plus une attention particulière sera apportée au confort digestif des animaux 1- par continuité de l’alimentation entre élevage et animalerie et 2-par apport d’un pansement gastrique avant alimentation une fois par jour aux porcs pour diminuer le risque d’ulcère gastrique. Pendant toutes les manipulations, les animaux seront installés sur un tapis chauffant, et les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, suivies d’un traitement approprié contre la douleur. Les animaux seront surveillés 3 à 6 fois par jour pour noter le moindre signe clinique apparent et lancer une prise en charge adaptée ; un suivi des points limites stricts et spécifiques au projet est donc réalisé tout au long de la procédure. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront séparés pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase à cause des risques d’arrachement des pansements avec des comportements de grignotage des pansements entre congénères. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif.

Choix des espèces

Les nombreuses similitudes entre l’homme et le porc en termes d’anatomie et de physiologie cutanée en font un excellent modèle animal pour l’étude de l’efficacité du pansement sur la cicatrisation des brûlures cutanées. Les animaux sont adultes. La croissance d’un jeune animal pourrait affecter et probablement améliorer la cicatrisation, ce qui introduirait un biais dans l’analyse.

Le nerf sciatique droit de 75 rats est sectionné puis suturé sous anesthésie générale, opération de quarante minutes qui leur fait perdre la motricité et la sensibilité de la patte arrière. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et s'achèvent sans réveil, le nerf étant prélevé pour compter les fibres myélinisées et mesurer la gaine de myéline. Le porteur prévoit des difficultés de déplacement, une atrophie possible du membre, des douleurs après l'opération et des automutilations dont il ne peut estimer la durée, et fait courir les animaux vingt minutes par séance sur un tapis roulant pour les limiter. Il écrit par ailleurs que cette opération est "très bien tolérée" par les animaux.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse périphérique. La stratégie de réparation des nerfs périphériques considérée comme le gold-standard est la suture microchirurgicale directe sans tension, avec l’utilisation de greffe nerveuse d’interposition en cas de perte de substance nerveuse. Dans le cadre des lésions des nerfs périphériques dont la réparation par une suture directe sans tension est possible, différents types d’enveloppement nerveux ont été utilisés dans le but d’améliorer les résultats cliniques des réparations. Un enveloppement nerveux est l’utilisation d’un matériel (biologique ou de bio-ingénierie) sous la forme d’un tube placé autour des moignons nerveux, qu’ils soient suturés ou non. L’objectif principal de notre étude pré-clinique sur modèle murin est de comparer les effets de la protection de la suture nerveuse par une enveloppe graisseuse autologue sur la récupération fonctionnelle motrice et sensitive, par rapport à la protection par un manchonnage veineux. L’objectif secondaire est de comparer les caractéristiques histologiques de la cicatrisation nerveuse lors de la protection de la suture par une enveloppe graisseuse, par rapport à la protection par un manchonnage veineux.

Bénéfices attendus

Bien que la chirurgie réparatrice des nerfs périphériques soit aujourd’hui réalisée de manière quotidienne, les résultats ne sont pas excellents. Sur l’ensemble des procédures de chirurgie nerveuse réalisée, seuls 40 à 50% des patients présentent une récupération fonctionnelle satisfaisante. Une régénération nerveuse incomplète peut entrainer une mauvaise récupération motrice, par dénervation musculaire, ainsi qu’une mauvaise récupération sensitive et des douleurs chroniques. Les lésions traumatiques des nerfs périphériques ont des coûts socio-économiques importants, et les résultats concernant la douleur, la durée de récupération, l’impact psychologique et le retour à une fonction de base sont mauvais. Nous espérons que les différents tests réalisés sur la récupération fonctionnelle montreront une différence significative entre les groupes suture avec enveloppement par manchon ou par graisse autologue versus suture seule. Nous espérons également montrer au moins une absence de différence significative entre les groupes manchonnage veineux et manchonnage graisseux. Nous espérons évaluer histologiquement la présence ou non d’un micro-environnement favorable à la régénération nerveuse en cas d’enveloppement nerveux par graisse autologue. Une meilleure récupération fonctionnelle avec l’utilisation de graisse autologue dans cette étude pré-clinique, en comparaison au gold standard de la réparation nerveuse (suture directe microchirurgicale sans tension) permettrait d’appuyer la réalisation d’étude clinique, en particulier dans le cadre des lésions nerveuses périphériques traumatiques. L’utilisation de graisse autologue entourant une suture nerveuse directe serait une amélioration technique simple et peu couteuse du gold-standard. En effet, la disponibilité de graisse autologue est constante sur le site opératoire d’une chirurgie nerveuse périphérique. De plus, une récupération fonctionnelle meilleure ou équivalente avec l’enveloppement de graisse autologue en comparaison au manchonnage veineux dans cette étude permettrait également d’appuyer la réalisation d’études cliniques.

Procédures

Il y a 4 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique. Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale, sous ventilation et durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond à l’entrainement physique sur animal vigile (tapis roulant horizontal) qui permettra une meilleure récupération du positionnement de la patte lésée ; chaque test durera 20 minutes et cela dès J+1 semaine de l’intervention jusqu’à la fin du protocole. – La troisième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (3,6 et 9 semaines post-opératoire), chaque test durera environ 20 minutes. -La quatrième intervention est le prélèvement du nerf sciatique, réalisé sous anesthésie générale afin de procéder, par la suite, à l’analyse histologique. Cette dernière étape est sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux. Le prélèvement de la veine jugulaire externe, malgré son rôle majoritaire de drainage veineux cervico-facial chez le rat, n’est pas décrit comme à risque de nuisance chez le rat. Son prélèvement nécessite une incision supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

La réparation des nerfs périphériques comporte des mécanismes physiopathologiques hautement intégrés qui ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifères ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (chirurgie de la main par exemple).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à l’outil BiostaTGV avec un test bilatéral et une analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8) qui montre que l’effectif théorique de 15 rats par groupe permettra de mettre en évidence des différences significatives. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. Avant chaque procédure, nous réaliserons du "Handling" afin de diminuer le stress de l'animal. L’entrainement physique doux (tapis roulant horizontal) permettra aux animaux de limiter toute automutilation rencontrée lors de nos précédents protocoles. Cette nouvelle technique de raffinement permettra aux animaux d’avoir un membre plus fonctionnel. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrière.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chez l'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature et à celles de notre laboratoire. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

Deux plaies de pleine épaisseur dans le dos, sous anesthésie, pour caler la taille des lésions et la durée d'observation d'un projet ultérieur de pansement : 87 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est tondue et ses griffes arrière coupées avant l'intervention, puis ses pansements sont changés tous les trois jours, chaque fois sous anesthésie. Aucun pansement fonctionnalisé n'est testé ici, cette étape sert à préparer celle qui le fera. Le porteur affirme que les modèles de peau in vitro comportent "trop de lacunes" et qualifie le modèle animal d'"incontournable", puis annonce que les 87 souris seront gardées en vie et proposées à l'adoption.

Objectifs

Le projet présenté ici est une étude pilote qui a vocation à mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée. Il est le pré-requis d’une étude sur le développement d’un pansement pour la libération locale et prolongée d’agents pro-cicatrisants type vitamine E en utilisant des pansements fonctionnalisés avec des polymères thermo-répondants. En effet, la cicatrisation des plaies est un processus complexe visant à maintenir la fonction de barrière de la peau. Faute de cicatrisation suffisante, les plaies chroniques entraînent des infections persistantes et l'incapacité des cellules cutanées à se réparer, entraînant une gêne et une détresse importantes chez le patient. Dans notre projet l’idée est qu’après élimination des débris et tissus inertes, le pansement appliqué peut être exploité comme une plateforme pour délivrer des molécules bioactives afin de prévenir l'infection bactérienne et de favoriser la cicatrisation. Le projet a pour objectif de développer des revêtements de polyarginine thermorépondants pour la fonctionnalisation de pansement. Les revêtements développés posséderont trois propriétés : (i) bactéricide à la fois par contact grâce à la polyarginine, (ii) antioxydante et (iii) favorisant la cicatrisation par la libération d'un agent cicatrisant naturel.

Bénéfices attendus

Le projet présenté ici est un projet pilote pour le développement d’un dispositif médical favorisant la cicatrisation de plaies chroniques. L’étude pilote en elle-même doit permettre de mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée sur lésion de pleine épaisseur. Il permettra de déterminer avec précision la taille des lésions à réaliser ainsi que le temps d’observation. Ainsi nous pourrons raffiner au mieux nos expériences pour la validation de l’effet des recouvrements de surface en cours d’élaboration en assurant plus de reproductibilité.

Procédures

Tonte et coupe des ongles des pattes arrières sur animaux anesthésiés d'une durée de 10 minutes Réalisation de plaies cutanées et mise en place des pansements sous anesthésie d'une durée de 30 minutes Changement des pansements et observation des plaies sous anesthésie d'une durée de 10 minutes tous les trois jours.

Impact sur les animaux

Au cours de l’expérimentation deux plaies cutanées seront réalisées sur le dos de l’animal. La nuisance générée sera de deux ordres. Le premier est la douleur associée à la procédure chirurgicale. La seconde nuisance est l’application de pansement sur les plaies.

Devenir

Animaux gardés en vie et proposés à l'adoption.

Remplacement

Il existe des modèles de peau in vitro. Ces derniers sont plus ou moins complexes. Le plus simple est un modèle en deux couches, une couche épithéliale constituée à partir de kératinocytes et une couche mimant le tissu conjonctif sous jacent sous la forme d’une matrice (biologique ou synthétique) ensemencée avec des fibroblastes. Dans les modèles plus complexes, des cellules immunitaires sont ajoutées dans le succédané de tissu conjonctif. Certains modèles testent également l’incorporation de cellules endothéliales. Ces modèles sont intéressants mais ne permettent pas de recréer les différentes phases de la lésion cutanée et de sa cicatrisation : création d’un caillot sanguin, formation d’un tissu de granulation à partir du tissu conjonctif, ré-épithélialisation. Il manque également les éléments propres à la réaction immunitaire locale qui peut être pertubée par un matériau ou encore un élément essentiel qu’est le mouvement de la plaie. En effet les plaies cutanées par essence sont soumises à des contraintes mécaniques. Ceci doit être pris en compte dans l’évaluation de nos stratégies. En effet pour un pansement l’application de ce dernier sur la plaie est un facteur qui va modifier potentiellement la libération locale du principe actif. Les modèles in vitro comportent donc trop de lacunes qui ne leur permettent pas de représenter fidèlement la situation clinique à traiter et qui nous oblige donc a utiliser un modèle animal.Le modèle animale est également incontournable car les éléments qui seront testés après établissement de ce modèle sont de nouvelles molécules qui nécessiteront avant leur emplois chez l'homme un validation de leur sécurité et de leur efficacité.

Réduction

Il s'agit ici d'une étude pilote, nous allons donc réaliser une étude descriptive. Nous utilisons une approche incrémentale analysant un paramètre du modèle l'un après l'autre. Pour chaque paramètre, il y aura également une approche progressive permettant de limiter le nombre d'animaux lorsque la variable testée a atteint l'objectif. On travaillera donc avec des petits lots d'animaux (4 à 6).

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées en groupe. Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie locale sur le site de l’incision. L’analgésie post-opératoire sera réalisée pour assurer le bien-être des souris avec une surveillance journalière. La chirurgie sera privilégiée le matin. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, coton, tunnel…) afin de permettre la fabrication de nids. L'évaluation du bien-être des animaux se fera au cours d'évaluations journalières à partir d'un tableau de référence (en annexe).

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris car c’est un modèle de cicatrisation décrit dans la littérature qui permettra de diminuer le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. La cicatrisation chez le rongeur est légèrement différente du processus chez l’humain (Chez l’homme, il y a d’abord la ré-épithelialisation puis la granulation avant la contraction alors que chez les rongeurs le processus débute par la contraction, mais la stabilisation de la plaie permet d’éviter le phenomène de contraction. Les souris seront âgées de 10 semaines, il s’agira donc de jeunes adultes. A cet âge la capacité des animaux à supporter des chirurgies est optimale et le système immunitaire est pleinement mature.

Rasées sur le dos puis exposées à un allergène, par patch répété six fois ou par solution appliquée cinq jours d'affilée sur trois cycles, 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur décrit une peau qui desquame, rougit, s'épaissit et sèche, des souris qui se grattent, se lèchent et peinent à se toiletter, avec une perte de poids de 5 à 10 % la première semaine. 180 d'entre elles reçoivent en plus un traitement par gavage, et 150 une injection dans le péritoine. Il écrit néanmoins que les applications cutanées "n'engendreront pas de nuisances particulières" puisque les animaux sont anesthésiés au moment de la pose.

Objectifs

Augmenter le portefeuille des approches thérapeutiques est crucial pour répondre aux besoins cliniques et proposer des traitements personnalisés aux patients allergiques tels que les patients atteints de dermatite atopique. La dermatite atopique est l’affection cutanée inflammatoire chronique la plus courante avec une prévalence en forte croissance. Elle se caractérise par un prurit, de l’inflammation et un eczéma et une hypersensibilité à des substances environnementales inoffensives. L'étiologie de la dermatite atopique n’est pas complètement comprise, mais de nombreux facteurs (génétiques, environnementaux, immunitaires ou structurels) contribuent au développement des lésions cutanées. La dermatite atopique est caractérisée par l'infiltration de cellules immunitaires, notamment des lymphocytes T qui par leur présence contribuent à la rupture de la barrière épidermique et à l'épaississement de la peau. Il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu qui induisent le recrutement de ces lymphocytes T au niveau de la peau pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients. Pour ce faire, nous utilisons des modèles expérimentaux de dermatite atopique chez la souris qui miment des situations physiopathologiques des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet propose de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de la maladie de dermatite atopique, notamment liés aux lymphocytes T. La dermatite atopique est traitée par des médicaments anti-inflammatoires topiques et systémiques sans réel effet curatif sur la maladie de type modérée à sévère. Il apparait donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux médicaments plus spécifiques et plus efficaces. Ainsi, ce projet permettra d’identifier et de caractériser de nouvelles pistes utilisables pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’enjeu socio-économique des pathologies allergiques et notamment la dermatite atopique nécessite le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ce type de pathologies. Nous anticipons que la réalisation de ce projet pourrait donc avoir des répercussions en santé humaine sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de dermatite atopique.

Procédures

Pour les souris où la dermatite atopique est induite sur le dos des souris (1080 souris), les animaux seront rasés et l’application de patch (pour 660 souris sur les 1080) ou une solution (pour 420 souris sur les 1080) contenant l’allergène inducteur de la dermatite sera déposé sous anesthésie générale volatile (durée intervention : 5min/animal). L’application de patch sera répétée 6 fois au total (pour 450 sur 660 souris recevant des patchs). Pour les 420 souris recevant une solution d’allergène sur le dos et les 420 souris recevant une solution d’allergène sur les oreilles, il y aura au total 3 cycles de 5 jours consécutifs d’application sous anesthésie volatile (durée intervention : 5min/animal). Pour les modèles de dermatite atopique induite après transfert adoptif de cellules (150 souris), il y aura une seule injection au niveau du péritoine (durée intervention :

Impact sur les animaux

Les protocoles de développements d’inflammations cutanées de dermatite atopique pourraient conduire à une perte de poids de 5 à 10% transitoires des animaux sur la première semaine ainsi qu’une baisse légère d’activité des animaux. Le développement de l’inflammation cutanée attendue au cours du protocole seront responsables de desquamation, de rougeurs, de sécheresse et d’épaississement de la peau. Les souris peuvent également présenter des phénomènes de grattements/léchages sur les zones traitées et être gênées pour leur toilettage. Les applications cutanées n’engendreront pas de nuisances particulières car les animaux seront anesthésiés et surveillés jusqu’à leur réveil.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans les procédures expérimentales seront euthanasiés en fin d'étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

L'étude des mécanismes physiologiques reliés à l'immunité nécessite des modèles in vivo capables d’intégrer différents processus cellulaires telles que l’activation des cellules immunitaires suite à des stimulation de l’environnement, la migration cellulaire et l'infiltration dans différents tissus, notamment la peau. Il n'existe pas actuellement de méthodes alternatives à cette étude in vivo pour l'obtention de résultats scientifiques exploitables, pertinents pour la pathologie humaine. Le remplacement par substitution n’est actuellement pas envisageable, aucun modèle cellulaire in vitro ne permet de mener les études proposées, puisque ces mécanismes impliquent des micro- et macro-environnements cellulaires, incluant de nombreux types cellulaires ainsi que le système vasculaire de la peau. Cependant, ce projet est basé sur une étude de preuve de concept réalisée in vitro qui justifie cette étude in vivo. D’autre part, ce projet utilise des modèles d’invalidation de gène chez la souris. C’est pourquoi ce projet de recherche ne peut se faire qu’en utilisant la souris comme modèle d’étude afin de comprendre les mécanismes d’activation des cellules immunitaires en condition d’inflammation cutanée. Les résultats de ces travaux devraient contribuer à optimiser les traitements chez les patients.

Réduction

Dans les différentes expérimentations et pour réduire la variabilité expérimentale, la détermination sexuelle étant importante, les souris des 2 sexes seront utilisés, mais indépendamment. Nous privilégierons des lots de souris issues de mêmes portées avec le fond génétique le plus proche possible en vu de diminuer également la variabilité expérimentale. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux. D’autre part, nous optimiserons l’utilisation de chaque animal et maximiserons le nombre de données à partir d’un seul animal. Nous mettrons également en banque des données utilisables a posteriori par d’autres utilisateurs notamment des blocs de tissus, des analyses de large base de données. Les niveaux de significativités permettant la comparaison entre les échantillons seront déterminés par un modèle statistique. Nous utiliserons pour chaque procédure le nombre minimal d’individus permettant la réalisation de ce test statistique, tout en assurant la fiabilité des résultats (reproductibilité et significativité). Nous mettons en place une stratégie longitudinale de mesures répétées de l’épaississement de l’oreille permettant d’appliquer un modèle statistique au cours du temps plus puissant.

Raffinement

Les points limites ont été anticipés mais toute souris ayant atteint un point limite sera euthanasiée. Tout traitement anti-inflammatoire n’est pas compatible avec les études menées (perturbation de la réponse immunitaire et inflammatoire) cependant un traitement visant à réduire ou supprimer la douleur (par exemple, par traitement avec des analgésiques) sera proposé. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d'amélioration des procédures. Le design expérimental a été établi en vue de limiter au maximum toute gêne ou souffrance de l’animal, comme le nombre d’application cutanée. D’autre part, les conditions d’hébergement permettent l’utilisation de méthodes d’enrichissement adaptées et les animaux seront suivis visuellement quotidiennement en particulier au niveau des zones cutanées traitées et des oreilles.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle adapté à la complexité de la physiologie humaine, elle a de grandes similitudes génétiques avec l’homme en particulier concernant le système immunitaire et la peau. La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines comme la dermatite atopique. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. La souris est aussi le modèle de choix pour réaliser l’invalidation de gènes spécifiques afin d’en étudier la fonction. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux comme les anticorps qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Enfin, il est important de mentionner que les modèles expérimentaux proposés miment des situations physiologiques et pathologiques de l’Homme. L’ensemble de ces critères font que la souris est le modèle le mieux adapté à notre activité d’expérimentation animale. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées pour réaliser les différents traitements proposés dans ces procédures expérimentales correspondant au stade optimal de développement pour étudier les réponses immunitaires en particulier dans la dermatite atopique à l’âge adulte.

Implantés d'un faisceau d'électrodes dans la cochlée au cours d'une chirurgie de 45 minutes, 24 rats Wistar sont ensuite reliés cinq heures par jour, cinq jours sur sept pendant un mois, à un émulateur d'implant cochléaire. Ils reçoivent par ailleurs de la rapamycine par voie orale ou de la chloroquine en intrapéritonéal, avec perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation et dysfonction hépatique parmi les effets attendus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués au bout d'un mois pour l'étude des tissus de l'oreille interne, l'objet étant de comprendre la fibrose qui dégrade le fonctionnement des implants chez l'être humain. L'isolement quotidien pendant les phases de stimulation figure parmi les nuisances déclarées, et une cage à rails coulissants est présentée comme permettant à l'animal de se mouvoir "sans contraintes".

Objectifs

L'implant cochléaire est un dispositif médical permettant en cas de surdité de stimuler électriquement les fibres nerveuses du nerf auditif. Les sons sont convertis en impulsions électriques avec un processeur de son, puis transmis à la partie implantée qui délivre le courant dans la cochlée. Chez le rongeur, un implant cochléaire ne pouvant pas être implanté en raison de sa taille, il peut être émulé par un dispositif externe. Dans des études préliminaires, nous avons démontré que le produit TIPH-1 permet de réduire la fibrose après implantation cochléaire et stimulation électrique de la cochlée avec un émulateur d'implant cochléaire. Le mécanisme d'action de TIPH-1 dans la réduction de la fibrose semble être lié à une modulation de l'autophagie. Afin de confirmer cette hypothèse nous allons moduler l'autophagie in vivo par l'administration de rapamycine et de chloroquine sur un modèle d'implantation cochléaire murin (rat) développé dans le laboratoire. Le volume de la fibrose cochléaire sera évaluée 1 mois après l'implantation.

Bénéfices attendus

A l'issue de ce projet, la connaissance des mécanismes responsables de la fibrose après implantation cochléaire permettra de développer des stratégies thérapeutiques pour limiter ce phénomène chez l'Homme et pour lequel il n'existe aucun traitement efficace à l'heure actuelle. Cette fibrose dégrade le fonctionnement de l'implant cochléaire et limite leur utilisation à des personnes présentant une surdité déjà avancée, car la fibrose contribue à la perte de l'audition naturelle chez la personne implantée.

Procédures

Les animaux auront tous une intervention chirurgicale de mise en place d'implant cochléaire sous anesthésie générale (durée 45 minutes) suivie d'une prise en charge de la douleur et du risque d'infection. Les animaux implantés recevront pour la moitié d'entre eux un traitement oral par rapamycine, et pour l'autre moitié des injections intrapéritonéales de chloroquine. Suite à la chirurgie les animaux auront une stimulation électrique de l'audition par implant cochléaire 5 heures par jour, 5 jours sur 7 pendant 1 mois dans une cage adaptée pour ne pas les gêner dans leurs déplacements et autres activités.

Impact sur les animaux

Les procédures suivantes vont être réalisées: /implantation cochléaire: nuisances attendues : stress, douleurs au site opératoire, vertiges, infection du site opératoire /stimulation électrique avec l'implant cochléaire : nuisances attendues: isolement pendant la phase de stimulation (5h/j, 5 jours/7) /administration orale de rapamycine : nuisances attendues : perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation, réduction de l'activité motrice, sensibilité accrue aux infections / administration intrapéritonéale de choloroquine : douleur passagère au point d'injection, perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation, réduction de l'activité motrice, sensibilité accrue aux infections, dysfonction hépatique.

Devenir

A l'issue de la période d'un mois de stimulation électrique, les animaux seront euthanasiés pour réaliser une étude des tissus de l'oreille interne.

Remplacement

Il n'est pas possible à ce jour d'étudier in vitro le développement de la fibrose cochléaire après implantation et stimulation électrique. Il n'existe pas de modèle de remplacement pour mener à bien cette étude. Il n'existe pas de méthode d'imagerie non invasive permettant d'évaluer précisément la fibrose cochléaire. Néanmoins, les études in vivo feront suite à la validation in vitro des cibles mécanistiques et tous les efforts ont été portés sur les points concernant la réduction et le raffinement pour limiter l'usage d'animaux vivants.

Réduction

Afin de limiter au maximum le recours aux animaux vivants, nous avons procédé à l'utilisation du logiciel G power pour calculer le nombre nécessaire et suffisant d’animaux sur la base des résultats obtenus dans des expérimentations antérieures. Sur la base d'un test ANOVA , il est nécessaire d'analyser 10 animaux dans chaque groupe pour obtenir des résultats avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%. Sachant qu'il n'y aura que 2 groupes experimentaux il faudra donc analyser les os temporaux de 20 animaux. Dans notre expérience, la stimulation électrique prolongée 1 mois peut entraîner un descellement du connecteur de stimulation et rendre la stimulation électrique impossible. Nous avons estimé à 20% de nombre de rats supplémentaires à opérer pour anticiper ce problème. Cela porte le nombre total d'animaux à 24 au maximum. Les 4 animaux supplémentaires ne seront utilisés qu'en cas de problème technique en cours d'expérimentation.

Raffinement

Afin de pouvoir réduire le recours aux animaux vivants, les techniques utilisées dans ce projet ont été adaptées. La technique d'implantation cochléaire est utilisée en routine chez le rat dans le laboratoire. Les nuisances liées à l’implantation cochléaire seront limitées par la réalisation du geste sous anesthésie générale, suivie d’un traitement antalgique poursuivi après le geste et une antibioprophylaxie. En période post-opératoire immédiate, les animaux seront surveillés en cage individuelle jusqu'à reprise des activités normale. Les nuisances liées à la stimulation électrique sont davantage liées à la connexion de l’animal à l’émulateur qu’à la stimulation électrique elle-même. Le niveau de stimulation électrique est adapté à partir d'enregistrements électrophysiologiques réalisés à travers l'implant de sorte à ce que l'intensité des sons perçus par l'animal via l'implant soit identique à celle des sons perçus naturellement. La stimulation électrique par implant cochléaire nécessite de connecter un plot électrique à un système de câbles. Afin que ce système n'entrave pas les déplacements et l'activité des animaux, une cage spécifique a été développée pour permettre à l'animal de se mouvoir, s'alimenter et se reposer sans contraintes. Les câbles électriques sont attachés sur un système de rails coulissants au couvercle de la cage qui se déplacent avec l'animal sans tension. En dehors des périodes de stimulation électrique, les animaux seront stabulés par groupes de 2 à 3 animaux dans des cages avec enrichissement, et avec nourriture et boisson ad libitum. Les nuisances possibles liées à la chloroquine et à la rapamycine seront limitées grâce à l’antibioprophylaxie donnée pendant la chirurgie, la surveillance quotidienne des animaux avec pesée, et si besoin réhydratation et alimentation adaptée par gavage.

Choix des espèces

Le rat de souche Wistar offre le compromis le plus intéressant entre la faisabilité d’une implantation chirurgicale d’un faiseau d'électrodes dans la cochlée, et la possibilité d’utiliser les outils classiques de biologie moléculaire et cellulaire. D'autres modèles murins tels que la souris ne permettent pas de positionner le plot de connexion de manière suffisament stable pour pouvoir conserver l'animal pendant la durée de l'experience. La souche Wistar est préférée aux autres souches car 1/ les travaux antérieurs ont été effectués sur cette souche, et la comparaison ne serait pas possible en choissisant une autre souche, 2/ la plupart des kits de biologie moléculaire ont été conçus sur des séquences génomiques de cette souche. Ce modèle offre en outre la transférabilité de nos données in vitro, acquises sur macrophages de rat, vers in modèle in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Des jeunes adultes (environ 250 grammes) seront utilisés. La résistance à l’anesthésie et la taille des animaux rend plus facile l’implantation des animaux, et limitera donc des pertes inutiles.

1 225 rats vont être utilisés dans ce projet, chacun recevant un fil de suture serré autour d'un globe oculaire pour faire monter la pression, puis une anesthésie par semaine pendant un mois et jusqu'à huit instillations de gouttes par jour. Tous sont tués à l'issue pour l'analyse des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit les examens ophtalmiques comme "totalement indolores et non invasifs" parce qu'ils se pratiquent aussi en cabinet chez l'humain, et reconnaît ailleurs que la pose du fil peut causer une douleur légère à modérée pendant les premières heures. Les bénéfices annoncés, identifier des cibles thérapeutiques et fournir des données précliniques avant les essais humains, restent au futur, la mise en place du modèle étant l'objet immédiat du projet.

Objectifs

Le glaucome est une maladie oculaire chronique caractérisée par des lésions progressives du nerf optique, souvent associées à une élévation de la pression intra-oculaire (PIO). Cette pression élevée résulte généralement d’un déséquilibre entre la production et le drainage de l’humeur aqueuse, un liquide clair à l’intérieur de l’œil. Le glaucome peut entraîner une perte de vision irréversible si elle n’est pas traitée. Il existe plusieurs types de glaucome, mais le plus courant est le glaucome à angle ouvert, où le système de drainage de l’œil est partiellement obstrué. Les symptômes peuvent inclure une vision floue, des douleurs oculaires et une perte progressive du champ visuel. Le glaucome touche environ 1 à 2 % de la population mondiale de plus de 40 ans, avec une prévalence qui augmente avec l’âge. En France, environ 800 000 personnes sont traitées pour le glaucome, mais on estime que 400 000 à 500 000 personnes supplémentaires pourraient être atteintes sans le savoir. Malgré les traitements disponibles, certains patients peuvent ne pas répondre adéquatement aux thérapies conventionnelles, ce qui peut conduire à une progression de la maladie. Les traitements actuels visent principalement à réduire la PIO, mais ils ne sont pas toujours efficaces pour tous les patients. La recherche sur le glaucome est donc cruciale pour développer de nouvelles méthodes de diagnostic et de traitement. Comprendre les mécanismes sous-jacents de l’élévation de la PIO et des lésions du nerf optique peut conduire à des thérapies plus efficaces et à une meilleure prévention de la cécité liée au glaucome.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place d'un modèle expérimental chez l'animal sont multiples et visent principalement à améliorer la compréhension de cette maladie ainsi qu'à développer de nouveaux traitements. Ce projet pourra nous aider à : 1. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l'efficacité de nouveaux traitements potentiels ou de médicaments existants pour ralentir ou inverser la progression de la maladie. 2. Observer comment les traitements sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans un organisme vivant, ce qui est crucial pour le développement de médicaments. 3. Fournir des données précliniques sur la sécurité et l'efficacité des traitements avant de passer aux essais sur l'homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’intervention : 1. L’établissement du modèle est réalisé avec la mise en place d’un fils de suture autour du globe oculaire. 1 seule fois par animal, le jour de l’induction. Cette étape ne devrait pas durer plus de 5 à 10 minutes sans compter l’anesthésie et le réveil de l’animal. Un seul œil est concerné. 2. Les anesthésies qui ne devraient pas durer plus d’une vingtaine de minutes, le temps du réveil. Ces anesthésies seront réalisées 1 fois pour l’induction et lors d’examens pour maintenir l’animal immobile soit 1 fois par semaine et durant 1 mois. 3. Les examens ophtalmiques (lampe à fente, tomographie, électrorétinogramme) qui sont réalisées soit quotidiennement la première semaine pour la tonométrie et la lampe à fente soit 1 fois par semaine. Ces examens ne durent pas plus de 5 minutes par animal. Les animaux seront anesthésiés afin de faciliter l’évaluation et maintenir l’animal immobile. Tous ces examens sont pratiqués chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation et également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ils sont totalement indolores et non invasifs. 4. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures durent moins d’une minute. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

La mise en place d’un fil de suture autour du globe oculaire est un acte chirurgical sans difficulté́ technique pouvant entrainer pour l’animal un léger inconfort notamment à cause de la pression exercée et des frottements. Les pesées hebdomadaires, les contentions quotidiennes et répétées nécessaires pour les observations, le suivi ou les administrations des produits peuvent induire chez l’animal un stress non négligeable bien que ces actes qui ne durent tout au plus que quelques dizaines de secondes soient réalisés par un personnel sensibilisé et formé au bien-être. Il en va de même pour les piqures réalisées notamment pour l’anesthésie des animaux. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un inconfort et un stress supplémentaire est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de lampes ou d'armoires chauffantes. L’administration des produits pourraient entrainer l’apparition de signes d’irritation comme des rougeurs et un inconfort. Bien que les travaux publiés ne montrent pas de changement de comportement, d'effet secondaires ou de manifestations de douleur, on ne peut pas exclure que l'affection recherchée, soit l’élévation modérée de la pression intraoculaire, entraine une douleur légère à modérée durant les premières heures qui suivent la mise en place des fils de sutures.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Les animaux, hébergés par deux au minimum, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, tunnel) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de minimiser au maximum le stress des animaux, le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des animaux tout comme le suivi sanitaire quotidien. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum tout comme l'administation si nécessaire d'un analgésique. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement

Choix des espèces

Ce modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis 2015 et est bien caractérisé chez le rongeur. Ce modèle, chez la souris et le rat est relativement facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité, une bonne fiabilité et relativement peu de nuisances ou d'effets indésirables. De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée.