Troubles sensoriels

Les rats utilisés portent une mutation qui affaiblit leur système immunitaire pour éviter le rejet du greffon, ce qui leur vaut une perte de poils, des poils qui s'accumulent sous les paupières et une sensibilité accrue aux infections. 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur rétine est lésée au laser ou par injection d'un composé chimique, puis un fragment de rétine cultivé à partir de cellules souches humaines est greffé sous la rétine au cours d'une opération de quinze à vingt minutes, suivie d'imageries hebdomadaires et d'électrorétinogrammes sous anesthésie générale. Tous sont tués à la fin pour analyser la rétine et le devenir des cellules greffées, et tout signe d'infection de l'œil entraîne une mise à mort anticipée.

Objectifs

Les maladies choroïdiennes héréditaires et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), sont des pathologies qui entraînent une perte de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité. Elles affectent des millions de personnes dans le monde, et dans la plupart des cas aucun traitement disponible. Ce projet a pour objectif de démontrer que l'on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations seront réalisées dans un modèle de rats porteur d'une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Afin de mimer les pathologies humaines, la rétine des animaux sera lésée avec le laser ou avec l’injection d’un composé chimique. Le potentiel thérapeutique des greffons sera évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière).

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les dystrophies rétiniennes (prévalence de 1 sur 3000) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (8 pourcent de la population française) ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.

Procédures

Pour cette étude une lignée de rats immunodéprimés sera transplantée avec des cellules humaines. Afin de mimer la pathologie humaine, deux techniques seront testées : lésion de la rétine avec le laser (moins d'une minute) ou injections d’un composé chimique (injections d’une durée de quelques secondes) : 1 injection pour les animaux concernés. Chirurgie: Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. La procédure chirurgicale consiste en une transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet de 3 types d’examen : 1/Un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique); cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes. Cet examen sera réalisé une fois par semaine pendant 2 mois pour mettre en place le modèle par injection de composé chimique (maximum 8 fois) ou 1 fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux greffés et gardés le plus longtemps). 2/ Un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu. Cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale. L’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). 3/ Un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois). Analgésies et antidote anesthésie (injections d’une durée de quelques secondes): maximum 11 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 3 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'œil.

Impact sur les animaux

Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s’accumuler dans l’œil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statuts immunodéficient. Un léger stress et une brève douleur localisée au moment de l’introduction de l’aiguille peuvent être induits par les injections des différents médicaments en intrapéritonéale ou sous cutané. L’anesthésie peut entrainer un risque cardio-respiratoire et d’hypothermie. La photocoagulation au laser et les greffes sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Une douleur et/ou un risque infectieux peuvent survenir pendant ou après les greffes. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme).

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologies) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration aux tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d’évaluer que des paramètres isolés de culture et non pas des interactions avec une rétine. Il n’est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d’un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptes aux petits effectifs. Au final, 180 animaux seront utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés avec enrichissement de nourriture et boisson à volonté. Les animaux utilisés dans ce projet ont une perte de poils dans la 3-4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'œil sous les paupières nécessiter un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Pour les expérimentations qui le nécessitent, les rats bénéficieront d’une anesthésie générale. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré-opératoire et post-opératoire par l’injection d’analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil entrainera l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats immunodéficients : Ces rats possèdent une modification génétique qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Les différentes analyses seront réalisées chez le rat adulte sur une durée maximum de 3 mois après greffe, le stade le plus tardif prévu per l’étude. Le choix de l'âge adulte est lié au fait que les greffes sont plus aisées à réaliser dans l'oeil adulte (plus grand) de même que les traitements lasers. De plus , la DMLA est une maladie qui touche les adultes.

Jusqu'à vingt-six mesures d'audition sous anesthésie générale, de deux heures chacune, et treize injections à travers le tympan sur cent quatre-vingts jours : 560 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste des candidats médicaments contre la perte d'audition liée à l'âge chez des lignées qui développent une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer, pour vérifier si traiter l'oreille ralentit le déclin cognitif. Chez ces souris, le porteur décrit des agressions plus fréquentes entre congénères, une baisse des interactions sociales et une masse corporelle réduite dès cinq à six mois. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever le cerveau et l'oreille interne, et parce que leur modification génétique interdit, selon lui, tout replacement ou réutilisation.

Objectifs

Des pertes d’audition même modérées ou légères peuvent augmenter à long terme un déclin cognitif et accélérer l’évolution négative des maladies neurodégénératives. Ceci est particulièrement vrai pour les cas de démences. A ce jour on estime que 4 millions des 50 millions de cas de démences dans le monde peuvent être en relation avec une perte d’audition liée à l’âge non traitée. Les différents mécanismes qui vont entrer en interaction entre les pertes d’audition liés à l’âge et le déclin cognitif vont être les suivants : - des dysfonctionnements du métabolisme énergétique des cellules nerveuses et de certaines voies de signalisation. - la privation sensorielle prolongée qui va avoir un impact sur diverses région cérébrales et accélérer le déclin cognitif. - une occupation des ressources cognitives plus importante pour traiter l’information auditive afin de compenser la dégradation de l’audition. Ce qui va réduire la ressource disponible pour les autres fonctions cognitives supérieures. - des modifications dans la relation structure/fonction de certaines zones du cerveau. Ainsi l’activité de certaines zones du cerveau sera modifiée du fait de la perte d’audition. Or certaines des zones qui seront modifiées sont des zones qui sont importante dans le traitement de la mémoire. Donc ces modifications pourront dégrader le traitement de la mémoire car les neurones disponibles dans ces zones seront affectés au traitement de l’information auditive. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons évaluer l’efficacité de candidats médicament des pertes d’audition dans le contexte d’une maladie neurodégénérative qui est la maladie d’Alzheimer. Nous souhaitons donc traiter les animaux contre les pertes d’audition liées à l’âge suivre l’audition des animaux sur une période de 6 mois et enfin évaluer le stade de développement de la maladie ainsi que l’efficacité du traitement sur les pertes d’audition. Ce travail sera réalisé sur plusieurs lignées génétiquement modifiées. Les différentes lignées ont été choisies car celle-ci ont déjà fait l’objet de travaux de recherche dans l’audition.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer si un traitement des pertes d’audition liées à l’âge peut permettre d’améliorer le stade de développement d’une pathologie neurodégénérative. En validant cette stratégie thérapeutique sur des modèles animaux nous pourrons poursuivre le développement de ce projet chez l’homme. L’objectif étant de ralentir le développement de cette pathologie afin d’améliorer la durée de vie en bonne santé des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Anesthésie injectable pour réaliser les mesures d’audition chaque semaine depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 80 animaux inclus dans cette procédure. -Mesure d’audition sous anesthésie générale au maximum 26 fois sur une période de 180 jours. -Chaque mesure d’audition dure environ 2h. -Euthanasie des 80 animaux en fin de procédure. -Anesthésie injectable pour réaliser les mesures d’auditions chaque semaine depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 480 animaux inclus dans cette procédure. -Mesure d’audition sous anesthésie générale au maximum 26 fois sur une période de 180 jours. Chaque mesure d’audition dure au maximum 2h. -Traitement transtympanique sous anesthésie générale gazeuse chaque 15 jours depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 480 animaux inclus dans cette procédure. Cela représente un maximum de 13 injections sur une période de 180 jours. Chaque injection dure au maximum 45min. -Euthanasie des 480 animaux en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour ce projet : Les animaux qui vont développer la pathologie de démence vont être atteint des symptômes suivants : Des pertes d’audition liées à l’âge. Des comportements d’agression plus fréquent envers leurs congénères chez les deux sexes et une diminution des interaction sociales. Une masse corporelle réduite par rapport aux animaux contrôle à partir de 5 à 6 mois d’âge.

Devenir

A la fin de chacune des procédure les animaux sont euthanasiés. Tout d’abord afin de collecter les tissus du cerveau et de l’oreille interne afin de réaliser des analyses pour évaluer l’efficacité du traitement et pour évaluer le stade de développement de la maladie d’Alzheimer. De plus cette euthanasie est justifiée car les animaux sont génétiquement modifiés donc ils ne peuvent pas faire l’objet d’un replacement ou d’une réutilisation dans un autre projet.

Remplacement

Le recourt à l’animal de laboratoire est nécessaire dans ce projet car nous souhaitons évaluer le bénéfice d’un traitement de l’audition dans le développement d’une maladie neurodégénérative. Ceci ne peut pas être réalisé sur des culture de cellules ou d’explant puisque nous étudions la synergie entre deux pathologies. Toutefois les candidats médicaments que nous allons tester ont été préalablement sélectionné par rapport à leurs effets positifs dans des modèles vitro, ex-vivo voir même in vivo.

Réduction

Afin de limiter les effectifs un calcul d’effectif est réalisé en amont. Ce calcul d’effectif a été en considérant le seuil d’audition comme variable principale. Ce calcul a été fait pour rechercher l’effectif nécessaire par groupe pour une amélioration de 20 décibels ou plus (en fonction de la fréquence) du seuil d’audition par rapport aux groupes contrôles.

Raffinement

Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que : les modalités d’administration et de prélèvement, d’hébergement et d’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15minutes les animaux sont placés sur des tapis chauffants. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes. Des protocoles d’analgésie adaptés sont mis en place lorsque nécessaire par exemple pour les exsanguinations sous anesthésie générale avec laparotomie. Pour la réalisation des injections transtympaniques nous utilisons des endoscopes de très petite taille avec des aiguilles de très petite taille de diamètre afin de limiter la taille de la perforation du tympan. De plus lors de ces administrations répétées nous allons pouvoir vérifier l’apparition d’une inflammation de l’oreille externe ou le développement d’une otite de l’oreille moyenne. Mise en place de points limites précoces et adaptés. comme par exemple :l’absence prolongée de toilettage, tremblements, perte de poids …

Choix des espèces

Les lignées génétiquement altérées qui développent la pathologie neurodégénérative qui concernent ce projet n’existent que chez la souris. Les animaux seront tous des jeunes adultes ceci afin de démarrer les procédures avant le développement de la pathologie neurodégénérative. En fin d’expérimentation les animaux auront 8 mois d’âge afin d’arriver au stade précoce ou médian de développement de la maladie d’Alzheimer chez ces souches de souris.

Jusqu'à cinq séances de trente minutes d'enregistrement des démangeaisons, puis cinq autres séances de trente minutes de stimulation au toucher léger : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après un rasage sous anesthésie, elles reçoivent des injections locales d'une substance qui déclenche des démangeaisons chez l'humain, et le porteur décrit des démangeaisons spontanées d'intensité faible à modérée réparties sur les vingt à trente minutes qui suivent chaque injection. Le projet cherche à identifier quels nerfs de la peau cette substance active, avec l'espoir de traiter un jour les démangeaisons de l'eczéma ou du psoriasis. La substance n'est jamais nommée, désignée d'un bout à l'autre du résumé comme "la substance étudiée".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'identifier les nerfs de la peau activés par une substance induisant des démangeaisons chez l’homme. Pour cela, il étudiera si la substance étudiée est capable d'augmenter les démangeaisons induites par des substances de référence, qui induisent des démangeaisons en activant des nerfs bien identifiés. Inversement, il étudiera si ces substances augmentent les démangeaisons induites par la substance étudiée.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement spécifique des démangeaisons induites chez l’homme par la substance étudiée. Mieux connaître leurs mécanismes permettra à terme de développer des traitements spécifiques pour les soulager. Identifier les nerfs affectés est une première étape d'étude des mécanismes impliqués. Les bénéfices de ce projet en termes d’avancées scientifiques et thérapeutiques pourraient aussi s’étendre aux démangeaisons présentes dans d’autres maladies (eczéma, psoriasis).

Procédures

1) Rasage de la future zone d’injection, réalisé 1 fois sous anesthésie, éventuellement renouvelé 1 fois, durée maximale de 5 minutes. 2) Injection locale des substances de référence (1 ou 2 fois), de la substance étudiée (1 fois) et/ou d’une substance-contrôle (1 fois), durée maximale de 30 secondes.

Impact sur les animaux

1) Stress de faible intensité lors de l’anesthésie générale (durée < 5 min, réalisée 1 fois). 2) Stress et inconfort lors des manipulations et de l’injection (durée < 5 min, réalisées 2 fois ou 4 fois). 3) Stress lors de l’enregistrement des démangeaisons spontanées dans un espace dédié (durée 30 min ; réalisé 3 ou 5 fois). 4) Stress lors des mesures des démangeaisons induites par le toucher léger dans un espace dédié (durée 30 min, réalisées 3 ou 5 fois). 5) Démangeaisons spontanées localisées, d’intensité faible à modérée, intermittentes, d’une durée < 2 secondes chacune, réparties pendant 20-30 minutes suivant l’injection (réalisée 2 ou 4 fois). 6) Démangeaisons localisées induites par à un toucher léger, d’intensité très faible, d’une durée < 1-2 secondes uniquement en réponse au toucher léger appliqué. Épreuve réalisée 3 ou 5 fois, durée 30 min.

Devenir

En fin de procédure, il est prévu la mise à mort de tous les animaux (480) car leur exposition à la substance étudiée interdit leur réutilisation, replacement ou adoption et/ou ils sont destinés à des prélèvements post-mortem de tissus à des fins d'analyses.

Remplacement

Depuis plus de 10 ans, nous étudions les effets de la substance sur des modèles cellulaires. Nous avons montré l’implication de plusieurs mécanismes qui, cependant, peuvent aussi être à l’origine d’autres sensations que les démangeaisons, que nos modèles cellulaires ne permettent pas de distinguer. Nous continuerons à utiliser ces modèles cellulaires pour cette étude mais nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale pour étudier les mécanismes des démangeaisons induites. Un 2ème aspect est l’implication de multiples types cellulaires dans les démangeaisons. Ces cellules ne peuvent pas être rassemblées dans un modèle cellulaire. Nous ne pouvons pas nous passer de l’expérimentation animale pour prendre en compte l’ensemble de ces types cellulaires.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu en vue de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs ou l’analyse statistique des résultats. Étant donnée la variabilité́ des démangeaisons induites par la substance, nous prévoyons 20 animaux/groupe pour garantir des résultats robustes. Cependant, nous réaliserons toujours une 1ère série d’expériences sur 12 souris (minimum pour que des résultats se dessinent) suivie de son analyse, et ne complèterons que si nécessaire d’après ces 1ers résultats. Le nombre d’animaux prévu est un maximum qui sera réduit autant que possible en pratique.

Raffinement

Les responsables du projet mettront en œuvre des mesures pour assurer et maintenir le bien-être de chacun des animaux : enrichissement des cages (matériel de nidification et igloo), habituation des animaux aux manipulations et aux tests, renforcement positif (coupelle de gel appétant en récompense pendant l'habituation), points limites et stratégie d’analgésie. Des points limites prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée comme modèle d’étude des démangeaisons. Le développement des nerfs impliqués dans les démangeaisons évolue chez la jeune souris jusqu’à l’âge de 3-4 semaines. Leur état de développement est stable à partir de l’âge de 5 semaines. Les souris âgées ne sont pas appropriées du fait de modifications physiologiques dues à l’âge. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 8 à 16 semaines.

Jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical : 740 souris et 740 rats rendus diabétiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au bout d'un mois de diabète, les rats malades ne pèsent plus que 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, boivent et urinent davantage, perdent leur tonus et se voûtent. Presque tous sont tués à l'issue pour les analyses histologiques, 80 animaux écartés avant l'étude pour un défaut de l'œil pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur retient le rat et la souris pour la rapidité d'apparition des signes de rétinopathie, et annonce un modèle destiné à tester des traitements, dont la mise au point occupera la première des cinq années du projet.

Objectifs

L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de rétinopathie chez le rat et la souris diabétique afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des petits vaisseaux sanguins de la rétine. Ces vaisseaux deviennent poreux, ils perdent leur étanchéité ce qui conduit à des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un œdème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète a également des conséquences sur la cornée et le cristallin, structures dont la transparence est nécessaire pour la vision. Le projet s'étale sur 5 ans, après une période de mise en place des modèles dans notre établissement pendant la première année, nous estimons que pourront se dérouler des études de test d'efficacité de traitement. Ces études comporteront au maximum 5 groupes de 10 animaux, pour comparer l'efficacité de plusieurs concentrations d'une molécule ou plusieurs molécules entre elles par rapport à un traitement placebo. Nous estimons pouvoir réaliser 2 études par an, pendant 4 ans.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et préserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection d’un produit qui agit sur le pancréas. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injections. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques, leur glycémie augmente. L’hyperglycémie altère les vaisseaux sanguins et les nerfs avec une répercussion sur différents organes, ce qui peut entrainer notamment des troubles cardiovasculaires, au niveau des reins, et au niveau de l’œil. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris qui serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète. Les examens qui seront pratiqués pour la réalisation du projet ou les administrations de produit par instillations (gouttes oculaires), ou par injections seront rapides (quelques minutes) et ne devraient pas porter atteinte au bien-être de l'animal, elles impliquent le maintien de l'animal manuellement afin de l'immobiliser, cette manipulation est transitoire et sans impact sur sa locomotion future. Certains examens ou administration de produits, notamment au niveau de l'œil, nécessitent l’immobilisation complète pendant plusieurs minutes de l'animal, seront pratiqués sous anesthésie légère. L’animal est replacé rapidement dans son environnement habituel, sans conséquences majeures sur son état, si ce n’est la gêne transitoire due à l’injection de produits. Des prélèvements pourront être réalisés sur animal vigile et la durée de l'action ne dépassera pas les 5 min, le volume sera adapté au minimum pour ne pas nuire à l’animal. Le stress dû au maintien de l'animal, à la piqûre de l'aiguille, une rougeur peut apparaitre au site de prélèvement, ne doit pas impacter le mode vie de l'animal une fois l'action finie.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.

Remplacement

Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif pour ce type de projet, nous aurons recours à des animaux. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. L’œil est un organe complexe soumis à de nombreuses interactions. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les souris permettent d’étudier les effets systémiques de la maladie sur les structures de l’œil. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Les souris et les rats permettent de suivre l’évolution de la maladie au cours du temps.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec de l’enrichissement adapté à l'espèce. En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, une couche plus épaisse de litière sera déposée dans la cage et elle sera changée plus fréquemment, un biberon supplémentaire sera ajouté ; Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

L’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Dans la littérature, les rats et les souris ont une sensibilité durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Jusqu'à huit anesthésies par animal, une injection d'aiguilles dans le derme suivie d'une décharge électrique, et sept injections dans le péritoine : 433 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les sites d'injection. Les nuisances attendues sont les douleurs des injections, celles liées à l'électroporation et le stress des anesthésies répétées. Le modèle retenu est une souris à peau saine, le projet visant à comparer dix candidats à base d'ARN messager destinés à traiter chez l'humain des ulcères et des brûlures. Le porteur annonce des groupes de trois animaux pour la première partie et de cinq pour la seconde, sans rapporter ces effectifs au total de 433 déclaré.

Objectifs

Cette étude a pour objectif dans un premier temps, de développer un modèle murin (non pathologique) d’administration par électroporation (micro choc éléctrique permettant au candidat de de rentrer plus facilement dans les cellules cibles) de nos candidats médicaments pour le traitement des problèmes de peau, comme par exemple des ulcères, brulures, lésions de peau etc. puis dans un deuxième temps, les comparer par dose réponse afin de sélectionner les meilleurs candidats. Au final, l’ensemble de ces données de caractérisation serviront de base à la conception d’essai clinique chez l’homme. Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne 10 produits d’intérêt identifiés suite à nos travaux précédents.

Bénéfices attendus

Les problèmes de peau, pour certaines qui sont des pathologiques chroniques, handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La régénération des tissus de la peau est un processus très long et qui parfois ne permets pas totalement de retrouver l’état d’origine de la peau. Les patients attendent donc aujourd’hui des traitements efficaces et rapides. L’injection d’ARNm (=copie de l'ADN) pourrait permettre de régénérer la peau plus rapidement et plus longuement avec seulement une injection.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesies de 10-15 min. 1 injection intradermale (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intradermale, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intradermale puis maximum 7 intrapéritonéales) - Les douleurs et stress liés aux électroporations - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, dans ce projet, les sites d'injections seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion et du système immunitaire (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés).

Réduction

Nous utiliserons donc nombre minimal d’animaux par groupe (11 groupes de 3 animaux dans la première partie et 8 groupes de 5 animaux / constructions) permettant d’arriver à des résultats statistiquement significatifs. Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergées en groupe de 3 ou 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. L’injection intradermique sur le flanc est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient le plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Bien qu’il existe actuellement des modèles de peaux humaines reconstruites ou encore des modèles ex vivo permettant de tester la toxicité ou la pénétration de certains produits ou vecteurs, ceux-ci ne prennent pas en compte la totalité des conditions physiologiques de l’Homme. Ainsi, après vérification in vitro de la non toxicité (sur peau reconstruite) des vecteurs d’intérêts, nous souhaitons tester leur efficacité en condition « le plus proche de l’Homme » en reproduisant au mieux la complexité (avec des interactions cellulaires, une vascularisation et une réponse immunitaire similaires) de la peau humaine. De plus, la réponse immunitaire et l’inflammation, est un facteur clé dans l’évaluation de l’efficacité des peptides (élimination plus ou moins rapide par l’organisme) Souris swiss femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (20g) et 8-9 semaines maximum en fin d’expérimentation (35-40g). La peau de ces animaux est parfaitement stable et n'évolue plus à cet age.