Troubles sensoriels

2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris knockout subissent des modèles de douleur avec tests d'immersion et de pression de la queue, test de Von Frey, plaque froide et chirurgies, pour étudier le rôle de récepteurs dans la nociception. Le porteur indique que la douleur infligée interdit toute réutilisation, chaque animal étant tué à l'issue de sa procédure, les effets attendus incluant un abaissement du seuil douloureux et des inflammations aux points d'injection. Il décrit le modèle murin comme "incontournable" en neurosciences et le travail sur "l'animal entier" comme "indispensable".

Objectifs

La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que des récepteurs spécifiques sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré des lignées de souris modifiées génétiquement afin de présenter une déficience pour chacun de ces récepteurs spécifiques. L’étude de ces lignées nous permettra de mieux comprendre l’implication de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi nous pourrons envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 2900, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche pharmacologique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces 6 récepteurs ainsi que des ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones et pouvant s’y fixer), dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.

Procédures

Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x4 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure Test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection composé x 10 (10 secondes) / 15 tests TIT (30 secondes) / 15 tests TPT (30 secondes) PE3 : Injection composé x1 (10 secondes) / 10 tests TIT (30 secondes) / 10 tests TPT (30 secondes) PE4 : Injection composé x1 (10 secondes) / 16 tests TIT (30 secondes) / 16 tests TPT (30 secondes PE5 : Chirurgie (20 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey (20 minutes) / 15 tests de la plaque froide (5 minutes) PE6 : Chirurgie (5 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 10 tests du Von Frey (20 minutes) / 10 tests du plantar (15 minutes) PE7 : Groupe 1 : Injection x1 (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes) Groupe 2 : Injection (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.

Remplacement

L’étude du rôle des récepteurs à peptide RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur n’est réalisable que sur l’animal entier car il n’existe pas, à ce jour, de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. De plus, cette étude a pour but de compléter l’évaluation de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris. La combinaison des résultats obtenus par les approches génétiques et pharmacologiques permettra ainsi de conclure de manière plus convaincante quant à l’implication des différents récepteurs RF-amide dans la modulation de la douleur.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests effectués sont compatibles avec le bien-être de l'animal ce qui permet de réduire l’effectif. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle des récepteurs RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et d'un développement complet du système nociceptif.

5 100 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Une hypertension oculaire leur est provoquée par injection de solution saline dans le vitré ou par surcharge en eau, suivie d'examens ophtalmologiques, d'administrations de gouttes jusqu'à huit fois par jour et parfois de la pose chirurgicale d'un implant. L'objectif est de développer des traitements contre l'hyperpression oculaire du glaucome, les yeux étant prélevés à l'issue. Le porteur qualifie les atteintes de faibles et transitoires et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne reproduit l'œil dans sa globalité.

Objectifs

Le glaucome est une maladie grave et fréquente, le plus souvent indolore, qui touche principalement les personnes âgées de plus de quarante-cinq ans et peut entrainer une perte de la vision. Aujourd’hui dans le monde, soixante-dix millions d’individus sont atteints, dont un million en France. L’augmentation de la pression à l’intérieur de l’oeil est la principale cause de glaucome. La pression oculaire est due au liquide transparent contenu à l’intérieur de l’oeil: l’humeur aqueuse produite et évacuée par les structures à l’intérieur de l’oeil. Lorsque le système d’évacuation de l’humeur aqueuse est déficient, elle s’accumule, la pression augmente et endommage les cellules nerveuses de la rétine et le nerf optique responsables de la vision. L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, de modèles expérimentaux d'hyperpression oculaire chez le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux visant à diminuer cette hyperpression et à protéger les cellules rétiniennes permettant la vision.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre le glaucome est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Selon la procédure, l'induction de l'hypertension oculaire peut se faire soit directement au niveau de l'œil par une injection dans le vitré de solution saline, soit par l’ingestion d'un volume d'eau. La première technique dure moins d’une minute, la seconde est un peu plus longue, pour le bien-être de l’animal puisqu’elle dure au maximum deux-trois minutes afin de réduire les rares effets indésirables (stress, agitation, fausse route). Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (mesure de la PIO grâce un appareil dédié́, lampe à fente, imagerie). Ces examens sont réalisés en routine chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation ou en clinique vétérinaire. Ces examens sont extrêmement courts puisqu’ils ne durent que quelques minutes (quelques secondes pour les plus court à cinq minutes maximum pour les plus longs comme l’imagerie) et pourront être réalisés plusieurs fois par jour pour les mesures de la pression intraoculaire à quotidiennement pour les observations et le suivi des animaux. Les administrations, elles, pourront se faire plusieurs fois par jour et sur la durée de l’étude quand elles sont sous forme de gouttes ou d’injections. La fréquence de ces administrations dans la majorité des cas n’excèderont pas 6 à 8 administrations par jour pour le cas des gouttes ophtalmiques. Dans ce cas, l’animal est maintenu immobile moins d’une minute. Pour la pose d’implant, l’acte nécessite une anesthésie et éventuellement des points de sutures au niveau des conjonctives ou de la cornée. Cet acte chirurgical dure cinq minutes tout au plus et sera réalisé généralement une seule fois, puisque l’implant à vocation à délivrer son contenu sur une longue période.

Impact sur les animaux

Le projet a pour but de trouver des traitements permettant une diminution de la pression intraoculaire. L’augmentation de la pression intraoculaire induite par les différents protocoles est faible et transitoire. Elle n’occasionnera aucune douleur pour l’animal tout au plus une gêne de courte durée (quelques minutes après l’injection intravitréenne). Les procédures décrites sont réalisées par un personnel formé et dans des conditions réduisant au maximum les risques de nuisances ou d’effets indésirables. Le stress occasionné lors de la prise des mesures sera de courte durée puisque que ces examens ne durent que quelques secondes et qu’une anesthésie locale est appliquée si nécessaire. Il en va de même pour le stress lié à l’induction. Dans le protocole décrivant la surcharge hydrique, l’animal sera maintenu plus fermement et une sensation de lourdeur au niveau de l’estomac est envisageable mais elle aussi sera de courte durée, l’excès hydrique étant rapidement éliminé par les urines. Les fausses routes sont exceptionnelles mais si malheureusement une telle situation devait arrivée l’animal serait mis à mort rapidement après l’apparition des signes. Les nuisances subies par les voies digestives supérieures seront minimisées par l’utilisation de tubulures souples non perforantes. Enfin les éventuelles nuisances induites par les administrations seront surtout liés à la contention de l’animal mais là aussi elles seront de courtes durées, de l’ordre de quelques secondes à moins de quelques minutes (inférieures à 5 minutes).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de biomarqueurs et de produits...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse,..) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction des données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre d'études estimées. Il tient également compte des variations du métabolisme et de la robustesse des résultats calculés à partir de tests statistiques. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les lapins seront placés préférentiellement par deux si les conditions expérimetales le permettent dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture rationnée et enrichissement. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de méthode alternative. De nombreuses études sur la pression intraoculaire sont réalisées chez le lapin en raison des similitudes avec l'oeil humain (taille de l'oeil, structures, mécanismes impliqués) permettant de recueillir des résultats extrapolables à l'humain et de tester des traitements ou des dispositifs médicaux directement transposables chez l'homme. Nous avons donc choisi cette espèce pour mener à bien le projet. Les lapins sont de jeunes adultes et ont minimum 8 semaines, âge minimum pour la maturation de l'oeil.

2670 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un pincement du nerf optique leur provoque une cécité d'un œil, suivi d'injections de biomolécules dans l'œil ou par voie intraveineuse, le porteur indiquant que le pincement et les injections oculaires causent une douleur. La mise à mort est justifiée par la récupération des rétines et des nerfs optiques, aucune souris ne pouvant selon le porteur être réutilisée, replacée ou adoptée. Il présente l'effet neuroprotecteur et régénérateur de ces molécules comme une piste pour éviter la cécité dans le glaucome, au conditionnel.

Objectifs

Le glaucome est une des principales causes de déficit visuel. Les neurones présents dans la rétine (RGC, Cellules Ganglionnaires Rétiniennes) transmettent les informations captées par les photorécepteurs sous forme de signal électrique par via leur fibre nerveuse (axone) qui parcourt le nerf optique (NO) jusqu’au cerveau. Dans le glaucome, ces axones et les RGC dégénèrent, provoquant une cécité irréversible. Un modèle robuste de cette pathologie est obtenu chez la souris par un pincement maitrisé du NO provoquant la dégénérescence des axones qui le composent. Nous souhaitons tester dans ce modèle les propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices de biomolécules « NV » Sur des cultures de neurones, les NV favorisent la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones et leur repousse après lésion. Ces résultats suggèrent que les NV pourraient être utilisés pour protéger les RGC de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) dans le glaucome et favoriser la repousse de leurs axones dans le NO (effet neurorégénérateur). Nos études ont montré que l’injection intraoculaire de vecteurs AAV2 (virus adéno-associé 2) codant pour le peptide NV de première génération (AAV2-NV1) favorise la survie des RGC et la repousse de leur axone, efficacité renforcée en présence de CNTF (ciliary-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance neuroprotecteur et neurorégénérateur (effet synergique d’AAV2-NV1 et AAV2-CNTF). De plus, ces travaux ont permis de montrer l’absence de toxicité ou d’effets secondaires lors de l’injection intraoculaire d’AAV2-NV1. Nous avons développé de nouvelles générations de NV, modifiées pour augmenter leur affinité pour leur cible et donc leur efficacité, et conjuguées à des CPM (Cell Penetrating Molecules) tels que les VHH (molécules dérivées de chaines lourdes d’immunoglobulines de lama capables de franchir les membranes cellulaires) ou des peptides étiquettes (ciblage préférentiel des neurones en fixant le récepteur de l’acétylcholine) afin d’augmenter leur stabilité et leur adressage aux neurones. Nous souhaitons tester ces nouvelles générations de NV dans le modèle souris de glaucome afin d’identifier la molécule ayant l’efficacité maximale avec une toxicité minimale pour ensuite développer ce candidat comme médicament pour le glaucome en l’amenant à l’essai clinique.

Bénéfices attendus

Les biomolécules NV développées dans notre laboratoire possèdent des propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices susceptibles d’apporter une réponse à de nombreuses pathologies dégénératives. Dans le glaucome, l’augmentation de la pression intraoculaire cause une dégénérescence des axones dans le nerf optique, une mort des cellules ganglionnaires rétiniennes et à terme la cécité. Dans le cadre de ce projet, l’administration de ces molécules a pour but d’induire la régénération des fibres axonales dans le nerf optique après lésion, ce qui aura pour bénéfice de reconnecter l’œil au cerveau et donc d’éviter la cécité causée par cette lésion. Leur effet neuroprotecteur devrait quant à lui permettre la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, dont les axones forment le nerf optique.

Procédures

Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur de nos biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes) et est réalisé sous anesthésie profonde et analgésie. L’injection intravitréenne de nos biomolécules NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes). L’injection intraveineuse de NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes).

Impact sur les animaux

Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur des biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Il est attendu que le pincement du nerf optique et l’injection des biomolécules NV dans l’œil causent une douleur chez la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, toutes les procédures requièrent la récupération de tissus (rétines, nerfs optiques) destinés à être analysés en vue de démontrer l’effet thérapeutique de notre molécule NV.

Remplacement

Les biomolécules NV utilisées dans ce projet sont préalablement validées in vitro pour leur efficacité et leur absence de toxicité sur des cultures de cellules neuronales, des cellules épithéliales rétiniennes et des explants de rétines. Les cellules neuronales et épithéliales rétiniennes ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux (lignées cellulaires). Les explants de rétine, réalisés à partir de rétines de souris, permettent de tester plusieurs constructions et concentrations de NV avec un nombre réduit de souris, ce qui permet par la suite de ne tester in vivo que les molécules NV efficaces in vitro. Les explants de rétine constituent un modèle in vitro très proche du modèle in vivo (même espèce, même tissu) et facilite l’extrapolation.

Réduction

Le nombre d’animaux requis pour établir l’efficacité des biomolécules dans ce modèle a été calculé par un test de puissance statistique à partir de nos résultats antérieurs. La mise à mort des animaux pour la récupération des yeux et des nerfs optiques étant nécessaire au projet, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable. Les deux yeux des souris seront valorisés quand cela sera possible afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les techniques de chirurgie de l’œil nécessaires à la réalisation du projet ont été acquises auprès d’un laboratoire de référence. La maîtrise des bons gestes chirurgicaux limitera les risques d’altération de la lentille lors des injections intraoculaires et augmentera la probabilité de créer des lésions du nerf optique bien calibrées et donc exploitables. Les animaux recevront des antalgiques avant et après lésion ainsi qu’une anesthésie locale juste avant le pincement du nerf optique. Les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Après le réveil des animaux, les animaux sont remis dans leur cage et gardés pour une durée variable dépendante de la procédure (entre 1 heure et 44 jours pour la procédure la plus longue).

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle souris pour sa taille et son anatomie, particulièrement adaptées à la chirurgie ophtalmique. De plus, certains de nos tests seront réalisés avec des souris génétiquement modifiées existantes. Souris adultes âgées de 8 semaines. Les expériences sont réalisées à un stade où les rétines sont matures et dans lesquelles les neurones ont une capacité régénératrice minime afin de reproduire des conditions semblables à celles de la pathologie chez l’homme.

200 chiens, cochons, moutons et bovins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements de sang répétés puis une ou deux chirurgies sous anesthésie, parfois précédées de la création d'une lésion par anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux, pour évaluer des dispositifs de robotique chirurgicale. Le porteur indique une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours. Il affirme que l'expérimentation sur l'organisme entier est incontournable et relève d'une obligation réglementaire avant l'usage de ces dispositifs chez les patients.

Objectifs

La chirurgie assistée par ordinateur (CAO) regroupe un ensemble d'outils informatiques destinés à aider le chirurgien dans la préparation et la réalisation d’une opération, particulièrement en chirurgie des tissus mous (chirurgie viscérale, urologique ou cardiaque) et en chirurgie orthopédique avec implantation de dispositif ou non. Elle a pour objectif de faciliter la réalisation des gestes diagnostiques ou thérapeutiques par le chirurgien, afin qu’ils soient les plus précis, les plus efficaces et les moins invasifs possible. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Ce projet de recherche a pour objectif la validation de robots ou d'éléments robotiques innovants, l’apprentissage des personnels de santé, le développement de nouvelles stratégies pouvant réduire le traumatisme tissulaire, améliorer le diagnostic et pallier une dysfonction. Ces dispositifs innovants doivent être étudiés sur des modèles animaux vivants pertinents, dans le but de valider leur faisabilité, leur innocuité et leur efficacité. Ces nouvelles techniques moins invasives et ces approches originales permettront de mettre à profit pour les patients et les équipes soignantes les avancées de la robotique dans un environnement chirurgical et interventionnel. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs/méthodes et techniques en robotique chirurgicale par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase de recherche et de développement. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés du projet sont : - Une amélioration de la sécurité et/ou de l'efficacité des machines, dispositifs et techniques évalués. - Pour les aspects thérapeutiques, une réduction du tremblement et de la fatigue du chirurgien, une amélioration de la précision et de la technicité du geste chirurgical par un traitement informatisé de l’image, une vidéo 3D nette pendant toute la durée de l’intervention et une fiabilité du système plus importante, entrainant une plus grande précision du positionnement des prothèses et des implants et permettant par exemple d’éviter les ré opérations parfois multiples des patients. La réduction de l'invasivité du geste chirurgical et des temps opératoires (permettant par exemple la réduction du traumatisme tissulaire et du risque infectieux secondaires, corollaires de ces interventions) sont d'autres bénéfices attendus du projet. - Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients, une amélioration des capacités diagnostiques de la pathologie visée peut également être obtenue. - Les avantages peuvent aussi être éducationnels, avec des applications dans la formation des chirurgiens à des techniques opératoires complexes, la planification précise d’interventions chirurgicales délicates et la téléassistance en opérations extérieurs (OPEX) dans le cadre de la chirurgie et la médecine militaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en robotique d'assistance chirurgicale avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif robotique d'assistance chirurgicale associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif robotique, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs et techniques testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Cela impose l’expérimentation de ces dispositifs sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille, d’où la nécessité de tester sur les espèces citées ci-dessus. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les ovins sont par exemple, le modèle le plus pertinent pour la durabilité des stratégies opératoires et dispositifs testés dans ce projet. Leur intérêt principal réside dans le fait qu’ils ne sont pas en croissance et sont particulièrement robustes. Les porcins sont par exemple, un modèle très pertinent pour la durabilité de l’ancrage des dispositifs (feuillets valvulaires épais par exemple lorsque le dispositif est implanté dans le cœur). Les porcs sont également le modèle plus proche de l’homme pour ce qui est chirurgie viscérale et seront privilégiés, de ce fait, pour la robotique utilisée en chirurgie viscérale. Les bovins sont par exemple, un modèle très pertinent pour leur grande taille et le débit élevé des dispositifs cardiovasculaire potentiellement testés dans ce projet (robotique chirurgicale utilisée pour la chirurgie cardiovasculaire). Les canins ne seront utilisés que plus rarement, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’homme. Par exemple les canins sont le seul modèle à présenter un auricule gauche avec ostium comme chez l’homme, un comportement du tissu de conduction cardiaque proche de l’homme, etc. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

805 rats, rates gestantes et leur descendance, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les rates exposées à un cocktail de pesticides et à des champs électromagnétiques de type 5G subissent échographies sous anesthésie et prélèvements de lait sous ocytocine, et leurs ratons passent des tests nommés de redressement, d'agrippement, de réflexe et d'open field avant d'être tués pour analyses cérébrales. Le porteur affirme retenir des doses proches des valeurs "sans effet" et n'attendre aucun impact majeur, tout en prévoyant des animaux surnuméraires. Il indique qu'aucune approche in vitro ou informatique ne modélise ces co-expositions et conclut que l'étude "sur rat vivant" est la seule possible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en évidence les éventuels effets d’un cocktail de pesticides, d’une exposition aux champs électromagnétiques de nouvelle génération type 5G (CEM) ou de la co-exposition cocktail de pesticides + CEM sur le neurodéveloppement d’animaux. Ce projet sera réalisé sur 805 rats Sprague Dawley (Procédure 1 : 2 rates adultes gestantes et 12 fœtus, Procédure 2 : 15 rates adultes gestantes et 90 ratons, Procédure 3 : 98 rates adultes gestantes et 588 ratons).

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des réponses aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales concernant les possibles effets neurobiologiques des expositions durant le développement aux champs électromagnétiques et à un cocktail de pesticides avec le minimum de rats possibles pour conclure et répondre à l’objectif du projet.

Procédures

Aucune intervention ne sera réalisée sur animaux vigiles. Les rates gestantes des procédures 1, 2 et 3 seront soumises à une échographie sous anesthésie au jour de gestation (G)14. La durée maximale sera de 1h. Les rates des procédures 1 et 2 seront soumises à des injections d’ocytocine (hormone de lactation pour permettre le prélèvement de lait maternel sous anesthésie au 16ème-19ème jour gestationnel). De même, les rates de la procédures 3 seront soumises à des injections d’ocytocine pour réaliser des prélèvements de lait maternel à jour post natal (PND) 15 et 21. Des tests néonataux seront réalisés à PND3 et PND10 chez 1raton/sexe/portée: un test déterminera la capacité du raton à se redresser en partant d'une position où il est sur le dos (durée maximum d'environ 60 secondes), un autre test estimera la capacité d'un raton à s'agripper à une barre (environ 60 secondes) et un dernier test déterminera l'intégrité des réflexes de placement en mesurant la durée de pivotement de l'animal à 180° sur un plan incliné (durée maximum d'environ 60 secondes). Le test de l’open field sera réalisé à PND16 et PND20 chez 1 raton/sexe/portée. Il permettra d'évaluer le comportement anxieux et la locomotion motivée par l'exploration en positionnant l'animal au centre d'une enceinte standard (durée maximum 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les doses d’exposition aux pesticides et/ou CEM seront proches des valeurs dites « sans effet toxique observé » ou « sans effet » et ne devraient pas avoir d’impact majeur sur l’animal (malformations fœtales par exemple). Seuls la réalisation des tests comportementaux, les manipulations quotidiennes et les prélèvements (le lait avec les injections pour le prélever, le sang) ou observations spécifiques (échographie), semblent pouvoir causer des effets délétères comme du stress chez les rats. L’hébergement individuel des rates en période périnatale pourrait également être une nuisance causant du stress chez les animaux.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à des temps définis dans le but de réaliser des prélèvements biologiques post mortem pour effectuer des analyses biochimiques et de biomarqueurs cérébraux, ainsi que des dosages dans différents organes cibles.

Remplacement

Les approches informatiques et de cultures cellulaires existantes, ne permettent pas actuellement, de modéliser au mieux l’impact de l’exposition précoce au CEM et à un cocktail de pesticides et surtout à leur co-exposition sur le neurodéveloppement et ce qui en résulte sur les fonctions sensorielles et motrices. En effet, les êtres vivants sont complexes et différents systèmes peuvent intervenir pour limiter les effets d’une exposition ou à contrario être impactés par cette exposition et leur dysfonctionnement entrainant des répercussions sur d’autres organes, cellules, fonction. Pour avoir des réponses prenant en compte tous ces paramètres, la seule approche possible est l’étude sur rat vivant.

Réduction

Pour minimiser le nombre d’animaux à inclure dans l’étude, plusieurs paramètres seront étudiés sur chaque animal. Des animaux supplémentaires seront ajoutés au protocole afin de s’assurer d’obtenir un nombre de ratons suffisant pour réaliser l’étude. Ces animaux supplémentaires ne seront commandés et utilisés qu’en cas de nécessité. Les ratons surnuméraires de chaque groupe pourront être utilisés pour la mise au point de protocoles d’analyses tissulaires post-mortem ce qui évitera de commander des animaux de nécropsie spécifiquement à cet effet. Ainsi, deux rates gestantes permettront de mettre au point les protocoles d’échographie et de prélèvement de lait et 15 rates gestantes permettront de doser les pesticides dans différents organes. En effet, 4 animaux minimum par groupe sont nécessaires pour le dosage en toxicologie. Les effets des pesticides pouvant entraîner, selon la dose utilisée mais aussi selon la sensibilité des individus à la substance, des effets secondaires non prévisibles, demandant d’exclure l’animal de l’étude, un cinquième individu est ajouté aux différents groupes (3 groupes au total). Enfin, 98 rates permettront d’étudier les effets de l’exposition aux pesticides et aux CEM sur leur descendance. Pour obtenir le nombre minimal requis de ratons (36/groupe), un minimum de 6 mères par condition (8 conditions) est requis. Une rate supplémentaire par groupe pourra être utilisée en cas de taille insuffisante de la portée et pour mettre au point certains protocoles. Le nombre d’animaux contrôles est plus important que le nombre d’animaux exposés car la configuration d’hébergement ne permet de réaliser les expérimentations qu’entre un groupe exposé et un groupe contrôle et non de façon concomitante, situation qui avait été envisagée pour diminuer le nombre d’animaux contrôle et donc le nombre d’animaux supplémentaires. Les pesticides étudiés étant volatils, il n’est pas possible de mettre les groupes exposés aux pesticides avec les contrôles dans une chambre et d’avoir les groupes exposés aux CEM dans l’autre chambre. De plus, le laboratoire possède deux chambres d’exposition hébergeant au maximum 7 cages. Les données seront réalisées à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Chaque animal sera observé quotidiennement selon différents critères préétablis afin de déterminer un score à partir d’une grille. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques, etc. Selon le score obtenu, une action sera mise en place pour soulager l’animal d’une quelconque souffrance. De plus, les animaux seront pesés tous les 2 jours. En période périnatale, une attention particulière sera portée au bien-être des mères et de leur portée et à la nidification. Ainsi, les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être (cylindre en carton, lanière en papier kraft, coton pour la nidification, bâtons de bois à ronger). Pendant la période périnatale, les rates seront hébergées individuellement puis avec leur portée. La prise alimentaire sera mesurée par une balance reliée à la mangeoire. Un test de détection de pesticides sera réalisé au jour 15 de gestation par prélèvement des fèces dans la cage, sans risque de douleur pour l’animal. Sauf contre-indication (âge et poids), une anesthésie gazeuse sera pratiquée en association avec un traitement analgésique avant la mise à mort des animaux. Le suivi des malformations fœtales sera réalisé de façon non-invasive par échographie. Pour limiter la contrainte appliquée aux animaux, ces derniers seront exposés au cocktail de pesticides via l'alimentation et non par gavage.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est un modèle de référence pour les études de toxicologie. En effet, le modèle rat est un bon indicateur pour prédire les éventuels effets toxicologiques chez l’Homme avec des systèmes biologiques et physiologiques largement décrit dans la littérature. Dans la procédure 1, les rates (âge dépendant du fournisseur, environ 15 semaines) arriveront gestantes (G3) au laboratoire pour réaliser des tests pour optimiser le prélevement de lait. Ils commenceront à G16 afin de s’assurer que le stade de gestation est suffisamment avancé pour optimiser le prélèvement (activation de la boucle d’éjection du lait). Une échographie sera réalisée à G14 pour mettre au point cette technique. Dans la procédure 2, des rates gestantes (G3) seront exposées au cocktail de pesticides ou non (groupe contrôle) quotidiennement par alimentation afin d'évaluer l'imprégnation des organes à ce cocktail ainsi que les fœtus. Dans la procédure 3, des ratesgestantes (G3) seront exposées aux différents agents chimiques et/ou physiques de G7 jusqu’au sevrage de leur descendance (PND21) pour évaluer les effets d'une exposition in utero. Le comportement des ratons sera observé à PND3, PND7, PND16, PND18 et PND20 (1raton/sexe/portée) et mis à mort à différents temps PND3, PND7, PND21 (1raton/sexe/portée) pour observer l’évolution du neurodéveloppement.