Troubles sensoriels

2900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées puis des tests de douleur, immersion de la queue dans l'eau chaude, pression sur la queue, filaments de von Frey et plaque froide, pour mesurer l'effet de molécules ciblant les récepteurs RFamide sur la douleur. Les retombées thérapeutiques annoncées pour les patients sont renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de préciser le rôle de six récepteurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un "modèle entier" et décrit la souris comme un modèle "incontournable" en neurosciences.

Objectifs

La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que des récepteurs spécifiques sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré des lignées de souris modifiées génétiquement afin de présenter une déficience pour chacun de ces récepteurs spécifiques. L’étude de ces lignées nous permettra de mieux comprendre l’implication de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi nous pourrons envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 2900, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche pharmacologique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces 6 récepteurs ainsi que des ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones et pouvant s’y fixer), dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.

Procédures

Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x4 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure Test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection composé x 10 (10 secondes) / 15 tests TIT (30 secondes) / 15 tests TPT (30 secondes) PE3 : Injection composé x1 (10 secondes) / 10 tests TIT (30 secondes) / 10 tests TPT (30 secondes) PE4 : Injection composé x1 (10 secondes) / 16 tests TIT (30 secondes) / 16 tests TPT (30 secondes PE5 : Chirurgie (20 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey (20 minutes) / 15 tests de la plaque froide (5 minutes) PE6 : Chirurgie (5 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 10 tests du Von Frey (20 minutes) / 10 tests du plantar (15 minutes) PE7 : Groupe 1 : Injection x1 (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes) Groupe 2 : Injection (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.

Remplacement

L’étude du rôle des récepteurs à peptide RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur n’est réalisable que sur l’animal entier car il n’existe pas, à ce jour, de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. De plus, cette étude a pour but de compléter l’évaluation de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris. La combinaison des résultats obtenus par les approches génétiques et pharmacologiques permettra ainsi de conclure de manière plus convaincante quant à l’implication des différents récepteurs RF-amide dans la modulation de la douleur.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests effectués sont compatibles avec le bien-être de l'animal ce qui permet de réduire l’effectif. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle des récepteurs RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et d'un développement complet du système nociceptif.

912 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie réutilisée jusqu'à quatre fois et le reste tué par surdosage de barbituriques. On leur pose des inserts ophtalmiques dans le cul-de-sac conjonctival, retirés au huitième jour, pour évaluer le temps de résidence, la pharmacocinétique et la tolérance oculaire d'un dispositif à libération prolongée. Le porteur reconnaît que l'insert "peut induire une gêne oculaire" et admet n'avoir mené "aucune approche statistique" pour fixer un effectif calqué sur des études antérieures. Le bénéfice annoncé, remplacer des instillations quotidiennes par une application hebdomadaire, vise le confort des patients.

Objectifs

Le projet doit permettre d’évaluer les points suivants : 1) le temps de résidence (c’est-à-dire la vitesse de disparition) au niveau de la surface oculaire des inserts ophtalmiques en cours de développement, 2) le devenir du médicament contenu dans les inserts dans les tissus de l’oeil (avec le dosage dans les tissus oculaires et le sang des principes actifs testés ; 2 à 3 dans le cadre de ce projet), et 3) confirmer la bonne tolérance oculaire des inserts. Le but est ainsi d’élaborer des inserts restant un maximum de 7 jours au niveau du cul-de-sac conjonctival après avoir été déposés sur l’œil (un seul insert par œil) et qui délivre le principe actif durant cette période.

Bénéfices attendus

Les bénéfices pour le patient d’un insert ophtalmique délivrant un principe actif pendant 7 jours seront une amélioration de leur qualité de vie et de l’observance de leur traitement en remplaçant des instillations journalières par une application hebdomadaire de l’insert. Une meilleure observance des traitements par le patient le préviendra d’une évolution défavorable de la maladie pouvant entraîner la perte de la vue.

Procédures

Les animaux seront soumis aux procédures suivantes : - Contention et pose de l’insert dans le cul-de-sac conjonctival (une légère sédation ainsi qu’une anesthésie peuvent être envisagées si besoin), durée 2-3 minutes, 5-10 minutes si une sédation est nécessaire.- Retrait de l’insert (ou de ce qu’il en reste) au jour 8 (contention et légère sédation et anesthésie si nécessaire) durée 2-3 minutes, 5-10 minutes si une sédation est nécessaire- Manipulation et contention des lapins afin de faire les observations avec l’ophtalmoscope et la lampe à fente, durée 15 à 20 minutes. - Pour la partie “étude du devenir du médicament dans les tissus de l’oeil” , les animaux sont contentionnés puis sacrifiés par surdosage de barbituriques (durée 5-10 minutes).

Impact sur les animaux

Les inserts développés utilisent des excipients déjà largement utilisés pour la formulation de collyres ou dispositifs médicaux appliqués sur la surface oculaire des patients. Il n’est pas attendu que les constituants des inserts induisent une réaction toxique au niveau de la surface de l’œil. Les inserts, petits solides de 10 mg de forme allongée, peuvent cependant induire une gêne oculaire lors de leur pose. Une fois ces derniers hydratés par les larmes ils forment un gel translucide dont la gêne oculaire doit être fortement réduite. Cette gêne oculaire sera également évaluée et caractérisée pendant le déroulé des études et du projet, principalement lors de la phase 1 du projet.

Devenir

Pour la phase 1 du projet (suivi du temps de résidence et de la tolérance des inserts), un lapin peut être réutilisé jusqu’à 4 fois, après des périodes de repos d’une semaine minimum, et conformément à l’avis du vétérinaire (seuls les animaux sains, ne présentant aucune lésion oculaire, pourront être réutilisés). Pour la phase 2 du projet (étude du deveir du médicament dans les tissus de l'oeil), les animaux sont mis à mort par surdosage d’anesthésique aux temps prévus des prélèvements.

Remplacement

La vitesse de disparition des implants de la surface oculaire ne peut être modélisée avec précision par des méthodes in vitro ou in silico. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour l’évaluation du temps de résidence au niveau de la surface oculaire. Cependant, des expérimentations in vitro, permettant de définir la vitesse de dégradation des inserts sont réalisés avant de tester les inserts chez l’animal. Seuls les inserts ayant les meilleurs profils en terme de vitesse de dégradation seront par la suite testés chez l’animal, ce qui permettra aussi de limiter le nombre d’animaux à utiliser (voir point suivant, réduction).

Réduction

Des expérimentations in vitro, permettant d'établir des vitesses de dégradation des inserts dans des conditions données sont réalisées avant de tester les inserts chez l’animal. Seuls les inserts ayant les meilleurs profils en terme de vitesse de dégradation seront par la suite testés chez l’animal, ce qui permettra aussi de limiter le nombre d’animaux à utiliser. De plus, les lapins ne seront pas systématiquement mis à mort à la fin d’un cycle d’évaluation de la phase 1 du projet. En effet, après un temps de repos d’une semaine environ, les lapins pourront être utilisés pour tester un nouvel insert dans l’œil n’ayant pas servi lors de la première évaluation. Plusieurs cycles sont ainsi possibles pendant 6 mois (lapins de 2-3 mois au début des premiers tests, et lapins de 9-10 mois lors du dernier test). Il n'est pas attendu de différence de réaction oculaire entre des jeunes lapins de 3 mois et des lapins plus vieux de 10 mois, ce qui permet de réutiliser les lapins. L’évaluation pharmacocinétique quant à elle utilise par définition beaucoup d’animaux. Cependant dans le but de réduire leur nombre, il est prévu de n’utiliser que 3 lapins par temps de prélèvement. Pour cela aussi les deux yeux seront dosés avec la référence ou les inserts à évaluer. Aucune approche statistique spécifique n'a été réalisée pour déterminer le nombre d'animax à utiliser. Cependant ce nombre a été déterminer en s'appuyant sur les nombres utilisés dans des études du même ordre.

Raffinement

Les lapins seront placés dans des cages individuelles avec enrichissement du milieu afin que ces derniers soient dans un environnement qui leur soit le plus adapté possible. Ils seront suivis quotidiennement pendant les périodes d’évaluation, ainsi que pendant les phases « de repos » afin de s’assurer de leur bien-être et de pouvoir apporter rapidement des soins le cas échéant. Les lapins disposeront également de bâtons de bois à ronger, de papier kraft ciselé et des jouets en caoutchouc.

Choix des espèces

Pour les études ophtalmiques, le lapin, avec son œil relativement grand représente le modèle animal le plus adapté pour ce type d’étude. Des lapins adultes, âgés de 2-3 mois et pesant environ 2-2,5 kg seront commandés pour ces études.

1621 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des rétinopathies leur sont induites par une exposition des mères et des portées à 75 % d'oxygène, par impacts laser sur l'œil ou par ultrasons, suivis d'injections intraoculaires répétées de composés à tester. Le porteur reconnaît une détresse respiratoire des mères, euthanasiées dès le retour à l'air normal, les souriceaux étant confiés à une mère adoptante. Il affirme que la néovascularisation de la rétine ne peut être modélisée in vitro et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

Les pathologies ophtalmiques tel que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (RD) sont les premières causes de handicap visuel chez les personnes adultes. Ces pathologies, sont caractérisées dans leur forme tardive par l’apparition de néovaisseaux pathologiques, de fuites vasculaires et d’une inflammation chronique qui peuvent mener à une cécité définitive. Actuellement la prise en charge des patients est composée d’injections intraoculaire répétées d’anti-VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Cependant, certains patients restent ou deviennent résistants à ce traitement. Dans ce contexte, nous proposons de tester l’effet de molécules inhibitrices de l’inflammation et/ou de la vascularisation dans divers modèle murin mimant la DMLA et la RD.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en évidence l’effet anti-angiogénique de certaines molécules dans les différents modèles de rétinopathie et de dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) chez la souris, ce qui pourrait par la suite bénéficier aux patients atteints de rétinopathie diabétique proliférante ou de DMLA humide.

Procédures

Dans le cas de la rétinopathie induite par l’oxygénation : Les femelles et leurs portées seront vigiles et seront soumises à une concentration d’oxygène de 75 pour cent pendant 5 jours. Les souriceaux vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1 min/souris). Dans le cas de la sonication : Les souris seront anesthésiées pendant 5 mins et vont être soumises à une injection intrapénienne et à des ondes ultrasons au niveau de l’œil pendant 60 secondes. Par la suite, des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont être réalisées 1 fois par jour pendant 7 jours sur souris anesthésiées afin d’évaluer l’évolution des fuites vasculaire causé par la sonication. Enfin, deux injections intraoculaires de composé thérapeutique (1min/souris) seront réalisées sur souris anesthésiées. Dans le cas de la néovascularisation choroïdienne induite par le laser : Les souris seront anesthésiées et vont recevoir 4 impacts laser par œil, la durée de ce traitement est d’environ 1 min par souris. Des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont ensuite être réalisés 1 fois par jour pendant 7 jours chez ces souris anesthésiées afin d’évaluer la croissance vasculaire liée aux impacts laser. Les souris vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1min/souris). Après la réalisation des actes décrits, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Le modèle de rétinopathie induit par l’oxygène (OIR) peut induire chez les femelles un stress physique et une douleur causer par une détresse respiratoire. Ceci peut donc engendrer chez les souriceaux une malnutrition ainsi qu’un stress thermique. La sonication, le laser ainsi que les injections intra oculaires peuvent engendrer un stress thermique ainsi qu’une détresse respiratoire dû à l’anesthésie mais également une légère douleur au niveau de l’œil causé par une neuro-inflammation.

Devenir

A l’issu des expérimentations les souris vont être euthanasiées, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

La néovascularisation caractéristique de la rétinopathie diabétique et de la dégénérescence maculaire liée à l'age (DMLA) ainsi que les fuites vasculaires sont le résultat d’une interaction complexe entre les vaisseaux de la rétine de la choroïde et de leur environnement. Ceci ne peut pas être modélisée complètement in vitro

Réduction

Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire (1621) pour avoir une puissance statistique suffisante afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences. Les variabilités interanimal et inter-expériences ont pu être déterminées au cours d’expérimentations précédentes avec des protocoles identiques autorisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par 5 ou par portée dans des cages ventilées. Pour les femelles et leurs portées, les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Pour les mâles, les cages comportent plusieurs cotons et un bâton à ronger. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou par le personnel de l’animalerie. Les animaux auront une période de 5 jours d’acclimatation avant l’expérimentation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. L’âge des animaux est suivi par rapport à leurs dates de naissance (fournies par le fournisseur) qui sont indiquées sur les étiquettes de leurs cages. Les animaux sont numérotés par des bagues à l’oreille. Si nécessaire et en cas d’agressivité les mâles seront séparés et isolés (seul par cage). Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasirons les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante à la sortie du caisson. Lors des procédures expérimentales les souris seront sous anesthésie général, sous anesthésie local pour les injections intraoculaires et sur un tapis chauffant pour prévenir tous risquent d’hypothermie. Toute atteinte oculaire inattendue (inflammation, gonflement) entrainera l’euthanasie de l’animal).

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé dans les maladies oculaires. En effet, le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR), de néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) et de sonication sont 3 modèles qui ont été établie chez la souris. La souris est un petit animal facile à manipuler et qui comporte beaucoup de similitude physiologique avec l’homme. Dans le cas de l’OIR les animaux seront utilisés dès 7 jours de vie. La mise en place des vaisseaux rétiniens se fait lors des 3 premières semaines de vie de la souris, l’hyperoxygénation entre le 7ème et le 12ème jour de vie de la souris nous permet d’induire une rétinopathie. Dans le cas du CNV et de la sonication les souris seront utilisées à partir de la 8 semaines de vie, en effet c’est l’âge ou le système visuel et inflammatoire de la souris est établi.

2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Les souriceaux sont soumis à des variations d'oxygène pour reproduire la rétinopathie du prématuré, certains recevant une injection dans l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que les mères supportent mal le retour à un air normal et développent une détresse respiratoire, ce qui conduit à les tuer dès la sortie du caisson et à confier les petits à des mères adoptantes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité de reproduire la maladie sur des cellules isolées.

Objectifs

La rétinopathie du prématuré (ROP) est un trouble oculaire potentiellement cécitant qui affecte les prématurés. Elle survient lorsque les vaisseaux sanguins de la rétine, la couche de tissu nerveux à l'arrière de l'œil responsable de la vision, se développent anormalement. Chez les prématurés, les vaisseaux sanguins de la rétine ne sont pas complètement formés à la naissance et, par conséquent, ils peuvent être perturbés par des facteurs tels que l'oxygénothérapie et d'autres traitements médicaux. Dans certains cas, des vaisseaux sanguins anormaux peuvent se développer dans la rétine, provoquant des cicatrices et pouvant entraîner un décollement de la rétine et la cécité. La ROP est une maladie grave qui peut entraîner des problèmes de vision à vie ou la cécité si elle n'est pas traitée. Cependant, une détection et un traitement précoces peuvent aider à prévenir la perte de vision dans la plupart des cas. Notre objectif est de révéler et comprendre le mécanisme de l'hypoxie intermittente chronique (CIH) et son influence sur la rétinopathie induite sur des souriceaux par l'oxygène (OIR) (modèle animal normalement utilisé pour la rétinopathie du prématuré), comprenant l'angiogenèse rétinienne, la néovascularisation rétinienne et l'inflammation rétinienne. L'hyperoxie fait référence à un état d'augmentation des niveaux d'oxygène ou à une concentration d'oxygène supérieure à la normale. L'hypoxie se caractérise par des niveaux d'oxygène réduits ou une concentration d'oxygène inférieure à la normale. La concentration normale d’oxygène dans l’air ambiant (normoxie) est de 20.9%. La rétinopathie est toute lésion de la rétine des yeux pouvant entraîner une déficience visuelle. La rétinopathie fait souvent référence à une maladie vasculaire rétinienne ou à des lésions de la rétine causées par un flux sanguin anormal. L'angiogenèse est le processus physiologique de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. La néovascularisation fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, en particulier à une croissance anormale ou excessive des vaisseaux.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de l’hypoxie intermittente et son interaction dans un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, ainsi que de connaître les expressions géniques qui entrent en jeu. Cela permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme pour réguler l’inflammation dans l’œil et soigner la rétinopathie du prématuré.

Procédures

Dans ce projet il n’y a pas de chirurgie. Les animaux seront soumis à des variations de concentrations d’oxygène (hyperoxie pendant 5 jours et hypoxie intermittente pendant 4 ou 10 jours). Pour le protocole d’hyperoxie, la concentration en oxygène est maintenue à 75% (la montée se fait en 15-20 minutes). Lors du protocole d’hypoxie, la concentration en oxygène passe de 20,9 % à 7 % en 45 secondes. Elle se maintient à 7 % pendant 30 secondes puis revient à 20,9 % en 15 secondes. Ensuite, la concentration en oxygène se maintient à 20,9 % pendant 45 secondes. C'est un cycle d'hypoxie intermittente, répété 10 heures par jour de 10h00 à 20h00. Certains recevront des injections intravitréennes (qui dure entre 2 et 3 minutes) sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une stabulation dans un environnement non adapté (hyperoxie ou hypoxie). Le modèle d’hyperoxie peut induire chez les femelles une difficulté de réadaptation en normoxie qui se traduit par une détresse respiratoire. En revanche l’hyperoxie n’a pas d’impact sur les souriceaux. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire. Dans de rare cas, cela peut induire une inflammation.

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem sur les souriceaux, cela implique donc leur euthanasie. Les mères ne peuvent pas entrer dans une nouvelle procédure après leur passage dans le caisson d’hypoxie/hyperoxie et seront donc également euthanasiées.

Remplacement

Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’oeil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Pour cette étude nous utiliserons un total de 2400 souris. Nous devons induire plusieurs expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables selon nos précédentes expériences (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 6 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par portée dans des cages ventilées. Les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Lors des expériences de d’hyperoxie et d’hypoxie, les animaux sont stabulés dans des cages ayant les mêmes dimensions qu’en stabulation normale, avec les mêmes enrichissements. Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasions les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante swiss à la sortie du caisson. En effet, les souris Swiss sont connues pour être de bonnes mères adoptantes. Certains souriceaux subiront une injection intravitréenne sous anesthésie générale et anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant pour prévenir le risque d’hypothermie.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la rétinopathie, l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développé le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène et l’hypoxie intermittente. Pour le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, les animaux seront utilisés dès 8 jours de vie. En effet, chez la souris la vascularisation rétinienne se développe à la naissance jusqu’à 21 jours. Les variations d’oxygénation déclenchent une néovascularisation que pendant la vasculogenèse rétinienne qui a lieu les 3 premières semaines de vie de la souris. L’hyperoxygénation entre 8 et 13 jours de vie entraine une perte des vaisseaux (phase de vaso-oblitération). Au retour en normoxie à 13 jours l’hypoxie relative mène à une angiogenèse compensation et pathologique ce qui correspond à la phase de néovascularisation.

3 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Selon les groupes, elles subissent des injections répétées et des modèles de douleur, constriction chirurgicale d'un nerf, incision de la patte, immersion et pression de la queue, filaments de von Frey et plaque froide, tests qui mesurent leur seuil de douleur. L'objet est d'évaluer des molécules ciblant les récepteurs RFamide contre la douleur chronique et l'hypersensibilité aux opiacés, de nouvelles stratégies thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que la nociception ne se mesure que sur l'"animal entier" et qualifie la souris de modèle "incontournable" en neurosciences.

Objectifs

La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment identifié des composés capables de bloquer sélectivement ces récepteurs à neuropeptides RFamide impliqués dans l’hypersensibilité. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur chez la souris nous permettra de mieux comprendre le rôle de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi il nous sera possible d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 3020, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche génétique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces récepteurs à neuropeptides RFamide et de leurs ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception, c’est-à-dire de la perception de stimulus douloureux et dans le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.

Procédures

Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x5 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection é x20 (10 secondes) / 15 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 15 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE3 : Injection x5 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE4 : Groupe 1 : Injection x6 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection x9 (10 secondes) / 14 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 14 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE5 : Groupe 1 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes Groupe 2 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes)/ 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes PE6 : Chirurgie incisionnelle (5 minutes) / Injection (10 secondes) x7 / 10 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 10 tests du plantar d’une durée de 15 minutes PE7 : Groupe 1 : Injection ITH sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection ICV sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes PE8 : Injection composé (10 secondes) x1 / Injection anesthésie générale x1 (10 secondes) / injection analgésie locale x1 (10 secondes) / Ouverture thoracique (30 secondes) / Prélèvement de sang (30 secondes) / Perfusion / Prélèvement du cerveau PE9 : Injection composé (10 secondes) x1 / Prélèvement sanguin sur animal vigile (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait de l'administration de substances pharmacologique et des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.

Remplacement

Les molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour les différents récepteurs RFamide disponibles au laboratoire dans les mêmes modèles de douleur.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands des récepteurs RFamide sur l’hyperalgésie induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. L’ensemble de nos expérimentations animales est réalisé sur des souris dont le fond génétique permet de visualiser au mieux le développement de l’hyperalgésie. Par ailleurs, c'est également ce fond génétique que nous avons utilisé pour générer des souris génétiquement modifiées pour les différents récepteurs RFamide, ce qui nous permettra de comparer les conséquences du blocage pharmacologique et génétique de ces différents récepteurs. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et à un développement complet du système nociceptif.