Troubles sensoriels

75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur sectionne le nerf sciatique droit sous anesthésie, avant de le réparer par colle biologique ou manchonnage veineux, puis ils subissent des tests fonctionnels à 15, 30 et 90 jours et une évaluation électrophysiologique finale sans réveil. Le porteur indique que la section du nerf provoque une perte des fonctions motrices et sensitives du membre, des douleurs postopératoires et un risque d'automutilation. Il affirme que ce mécanisme nerveux intégré ne peut pas être reproduit de façon satisfaisante in vitro ou in silico et écarte les modèles sur invertébrés.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse. Actuellement, la technique de suture associée au manchonnage veineux est considérée comme la technique de référence en termes de réparation nerveuse. La technique de suture associée à l’enveloppement par colle biologique se veut plus simple, puisque moins de points de suture sont à réaliser (seulement deux versus quatre pour la technique de référence). De nombreuses colles biologiques sont utilisées neanmoins, meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prévenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Le névrome correspond à une prolifération anarchique des neurones qui interfère avec la récupération fonctionnelle et peut engendrer des douleurs. Cette étude pré-clinique a pour objectif de déterminer si la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux pour prévenir l’apparition de névrome, tout en permettant une bonne repousse nerveuse sur le nerf sciatique droit chez le rat. Il s’agira d’évaluer de façon clinique, électrophysiologique, et histologique la repousse axonale selon les deux groupes : suture/manchonnage veineux et suture/enveloppement par colle biologique.

Bénéfices attendus

Les lesions nerveuses representent une part importante de la traumatologie de la main, environ un million de cas par an dans le monde. Il est decrit de nombreuses techniques pour les reparer. Il existe des risques non negligeables de complications malgre la reparation realisee, et plus particulierement de nevrome. Les nevromes correspondent a une proliferation de tissu nerveux avec une repousse axonale desorganisee, engendrant des douleurs pas exces de nociception, pouvant s’associer a des dysesthesies. Ces nevromes, lorsqu’ils sont constitues, necessitent un second geste chirurgical pour en faire l’exerese, avec risque de perte de sensibilite definitive en aval. Il est admis que l’ajout d’un manchon veineux autour de la suture nerveuse permet l’absence de nevrome dans les suites post-operatoire. Une etude pre-clinique sur le manchon veineux sur le nerf sciatique de chien, ainsi qu’une etude clinique sur le manchonnage veineux sur les nerfs collateraux des doigts, etaient toutes deux en faveur de l’absence de nevrome dans les suites operatoires. A ce jour, certains chirurgiens pratiquent la technique : suture + colle biologique. Cette technique se veut plus simple, avec moins de points de suture et d’apprentissage plus rapide. De nombreuses colles biologiques sont utilisees, neanmoins meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique,. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prevenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Ainsi, nous espérons que notre étude permettra de prouver que la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux dans la prévention des névromes. Si l'étude tend vers une preuve d'efficacité, nous souhaiterions réaliser dans les suites une étude clinique chez l'Homme, afin de développer davantage cette technique et obtenir si cela est possible une autorisation de mise sur le marché (AMM) dans cette indication.

Procédures

Il y a 3 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique droit (J0). Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale sous ventilation durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (J15, J30 et J90), chaque test durera environ 20 minutes. - La troisième intervention est l’évaluation électrophysiologique du nerf sciatique droit avec abord chirurgical, réalisée sous anesthésie générale sous ventilation et qui ne devra pas excéder 15 minutes ; suivi du prélèvement du nerf sciatique afin de réaliser l’analyse histologique sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux lorsque les animaux ne seront pas lésés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

mécanisme physiopathologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammofères (i.e. invertébrés) ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (e.g. chirurgie de la main).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Les protocoles ont été déterminés de manière à réaliser une étude longitudinale afin que chaque animal réalise un maximum d’analyses, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Les statistiques ont été réalisées via un logiciel. Le calcul du nombre de sujets nécessaires a été réalisé en comparant deux proportions binomiales, selon une proportion théorique de 0,30 (soit 30% de névrome observé chez l’homme), et une proportion observée supposée de 0,50, avec un test unilatéral. On considère un risque de première espèce alpha de 5% et une puissance de 90%. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrières.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chezl'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

4 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines rendues aveugles par un modèle de rétinite pigmentaire, elles reçoivent une injection intraoculaire d'un vecteur viral, subissent des examens répétés de l'œil sous anesthésie et une biopsie de la queue pour génotypage, avant prélèvement des yeux. Le porteur indique que l'injection peut provoquer de petites hémorragies oculaires et que l'anesthésie comporte un faible risque de défaillance cardio-respiratoire. Il affirme qu'il "n'existe pas de méthodes substitutives in vitro" et retient la souris pour la ressemblance de sa rétine avec celle de l'humain.

Objectifs

La rétinite pigmentaire (RP), forme la plus commune des dégénérescences rétiniennes congénitales, se développe en deux étapes successives. Au début de la maladie, les patients perdent uniquement leur capacité à voir en condition scotopique. Cette incapacité liée à la dégénérescence des photorécepteurs à bâtonnet, représente un handicap mineur puisque dans un environnement normal et bien éclairé, ces patients conservent leur vision, leur permettant une vie quasi normale. Cependant, la maladie progresse par la perte de fonction et la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Cette perte secondaire des cônes qui entraîne une perte de la vision centrale et une quasi-cécité chez les patients atteints de RP. Trouver des stratégies pour redonner la vision à des personnes l’ayant perdu est un enjeu crucial afin de permettre aux personnes touchées de rester autonome. Notre stratégie consistera à exprimer des protéines photosensibles dans des cellules de rétines aveugles de manière à les rendre sensibles à la lumière. Afin de trouver la stratégie thérapeutique la plus efficace possible, il nous faut comprendre comment les différents neurones qui forment le réseau rétinien travaillent ensemble pour traiter l’information visuelle. Dans la première partie, nous tenterons de comprendre le rôle des différents types cellulaires dans le traitement de l’information visuelle. Dans un second temps, nous tenterons de redonner la vision à un modèle de s souris aveugles ( modèle murin de la rétinite pigmentaire). Grâce aux progrès de la recherche en génétique, il est possible d’utiliser un vecteur viral pour introduire l’expression d’un gène d’intérêt dans une cellule cible. L’œil présente des caractéristiques favorables pour le transfert de gènes par des virus adéno-associés (AAV). Le virus adéno-associé est un virus non pathogène et non immunogène et permet un transfert de gène efficace dans les cellules in vivo Les animaux seront injectés par voie intraoculaire à l’âge adulte (8 semaines).

Bénéfices attendus

Ce projet conduira : - à l'identification de cibles thérapeutiques prometteuses pour les maladies dégénératives de la rétine, - les résultats de cette étude permettront d'approfondir les connaissances sur le rôle général des types cellulaires dans le codage de l’information dans la rétine. - cette étude pourra permettre le développement d’une nouvelle classe de thérapies géniques pour proposer des traitements aux personnes souffrant des maladies héréditaires de la rétine.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection intraoculaire de la thérapeutique à évaluer effectuée sous anesthésie générale et locale (5 à 10 min). Par la suite, les animaux seront amenés à effectuer un examen de l’œil répétés, une fois par quinzaine (6 fois maximum par animal) sous anesthésie gazeuse (2 min). Enfin, les animaux seront euthanasiés selon deux méthodes réglementaires en fonction des prélèvements et analyses à réaliser.

Impact sur les animaux

L'injection intra-oculaire peut provoquer des lésions temporaires comme de petites hémorragies oculaires ; Ces dernières se résorbent rapidement, en général dans les 24 heures qui suivent l’injection. Au cours des anesthésies, un faible risque de défaillance cardio-respiratoire est à prévoir. Pour la caractérisation génétique de l'animal, nous devrons faire une biopsie de la queue. Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les yeux des animaux et effectuer les analyses histologiques nécessaires à notre étude.

Remplacement

Nous étudions dans ce projet l’efficacité de l’expression de protéines sensibles à la lumière (optogénétiques) dans les cellules cibles de la rétine. L’induction ne peut être effectuée qu'in vivo puisque le circuit de la rétine doit être intact avant l’expression de la protéine optogénétique. Il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro. De plus de nombreuses barrières biologiques qui constituent de véritables obstacles pour les vecteurs de transfert de gène n’existent pas dans les modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est basé l’expérience du laboratoire dans des expérimentations similaires. Il sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Des outils statistiques adaptés seront utilisés pour l’analyse de nos résultats. Au total, 4000 animaux sont nécessaires à cette étude sur une période de 5 ans.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Ils bénéficieront d’une anesthésie générale fixe ou gazeuse selon le type d’expérimentation. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire - les souris seront placées sur un tapis chauffant lors des injections intraoculaires pour éviter une hypothermie pouvant être induite par l’anesthésie . - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation - Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Nous avons sélectionné le modèle murin car la structure de sa rétine de la souris est semblable à celle de l’Homme. Nous utilisons dans cette étude : - Un modèle murin de rétinite pigmentaire - Des modèles murins transgéniques permettant une expression spécifiques de protéines dans des types cellulaires. -Les injections sont effectuées à l’âge de 8 semaines, âge auquel le circuit de la rétine des souris est mature.

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit trois incisions dans la peau du dos sous anesthésie, refermées par fil et par colle, puis est suivi une vingtaine de jours avant d'être tué pour prélever la ligne de suture. Le projet compare des colles de suture développées par le laboratoire, en vue d'un marquage CE et d'une étude clinique. Le porteur retient le lapin car les rongeurs arrachent les corps étrangers de leur peau, alors qu'un lapin peut porter un gilet de protection.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes formules de suture nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) pour la suture d’incision chirurgicale. 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel :un prélèvement histologique sera réalisé à J21 à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatrisation de la plaie. Par ailleurs, les tests précliniques sont indispensables à l’évaluation d’un dispositif médical avant le passage aux tests cliniques chez l’Homme. La formule sélectionnée pourra alors passer à l’étape suivante du marquage CE : l’étude clinique.

Bénéfices attendus

La suture de plaie traumatique ou d’incisions chirurgicales est réalisée soit par colles chirurgicales, soit par un fil de suture, soit une agrafe. La suture par fil/agrafe créé des lésions du derme et implique la présence d’un corps étranger dans la suture, engendrant un risque d’apparition d’une infection cutanée post-opératoire. Ils ont également comme inconvénient de ne pas stabiliser parfaitement la plaie lorsque des tensions sont exercées dessus. Le bord à bord des berges cutanées est maintenu uniquement au niveau du point de suture ; ceci a pour conséquence de rouvrir la plaie, gênant la cicatrisation et laissant une cicatrice fibreuse voire des cicatrices hypertrophiques ou chéloïde. Des rapports montrent que l’incidence de la formation d’une cicatrice hypertrophique après une chirurgie se trouve entre 33% et 91%. D’après l’enquête nationale de prévalence des infections nosocomiales en France, la prévalence des patients infectés était de 4,97% en 2006 (au niveau du site opératoire dans 14% des cas). Ainsi, l’utilisation d’une colle chirurgicale ayant une force d’adhésion équivalente à une suture permettrait de résoudre les limites détaillées ci-dessus (bord à bord parfait, pas de corps étranger, pas de lésion, une parfaite stabilisation des berges de la plaie…). Les seuls produits actuellement utilisées pour cette application sont les colles de cyanoacrylate (Leukosan). Elles ont pour avantage d’avoir un temps de prise rapide et une haute résistance au déchirement. Cependant leurs faibles propriétés adhésives à la peau font qu’elles ne sont indiquées que pour les sutures de petites plaies avec un taux de déhiscence de 20%. Elles ne peuvent ainsi pas être utilisées en alternative d’une suture par fil ou agrafe. L’étude des propriétés adhésives des colles chirurgicales actuellement commercialisées montre que la faible adhérence de ces colles est due au fait qu’elles se fixent sur la surface desquamante des tissus biologiques. Or, il s’avère que l’adhésion à un tissu biologique repose sur un ancrage à son extrême surface. Les produits testés dans cette étude reposent sur ce principe. Cet ancrage à la superficie du tissu permet d’atteindre des performances techniques inégalées (équivalente à une suture par fil et dix fois supérieures aux colles chirurgicales).

Procédures

Procédure chirurgicale d’incision et suture cutanée sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min. 1 injection d’anethésique 4 injections d’anti-inflammatoire 3 incisions cutanées Suture par fil Suture par collage

Impact sur les animaux

Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation

Devenir

Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 21 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés le long de la ligne de suture pour évaluer la qualité de la cicatrisation.

Remplacement

Les plaies traumatiques et les incisions chirurgicales sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Par ailleurs, nous souhaitons évaluer la qualité de la cicatrisation in vivo. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. Par ailleurs dans le développement d’un nouveau dispositif médical, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité des matériaux avant le passage chez l’Homme.

Réduction

Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de suture utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture. 3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement sur l’étude. Nous avons prévu d’utiliser le t test pour évaluer statistiquement les différences de temps de cicatrisation.

Raffinement

La peau du dos de l’animal va être incisée à 3 endroits lors de la chirurgie. L’animal sera placé sous anesthésie générale pour la chirurgie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis environ 21j le temps de la cicatrisation puis seront mis à mort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie, jusqu’à son réveil. Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux bois à ronger dans leur environnement de vie.

Choix des espèces

Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de suture de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans que l’animal ne sollicite sa suture. Par ailleurs, chez un lapin adulte de 2.5kg, la surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des incisions prévues dans cette étude. Enfin, un animal mature dispose de structures anatomiques cutanée et système immunitaire adaptés aux besoins de l’étude.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous anesthésie un tatouage puis des injections intradermiques de mélanocytes humains, avant un suivi photographique de la pigmentation puis leur mise à mort à deux et quatre semaines pour prélever la peau. Cette étude pilote vise seulement à fixer le nombre de cellules à injecter en vue de futurs essais sur un modèle de vitiligo, maladie décrite comme "bénigne" mais lourde psychologiquement. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable" car aucun modèle in vitro ne suivrait la fonctionnalité des mélanocytes dans le temps.

Objectifs

Les objectifs de ce projet constituant une étude pilote, sont d’évaluer in vivo chez la souris l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps suite à l’injection intradermique de différentes quantités de cellules responsables de la pigmentation cutanée appelées mélanocytes. Il s’agit d’un nouveau produit de thérapie innovante en cours de développement qui utilise des mélanocytes obtenus par différenciation de cellules souches humaines. Ce nouveau produit permettrait de repigmenter des zones cutanées dans le cadre d’une maladie appelée vitiligo au cours de laquelle des taches blanches, parfois des poils blancs, apparaissent sur la peau. Pour effectuer l’évaluation de ce nouveau produit de thérapie innovante, une suspension de mélanocytes à différentes concentrations, sera injectée en différents points dans une zone préalablement délimitée par tatouage sur des souris immunodéficientes, c’est à dire dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Un suivi de la pigmentation cutanée sera effectué de façon hebdomadaire à l’aide d'une caméra. Des prélèvements des sites d’injection des mélanocytes seront effectués à 2 temps différents mais relativement précoces après injection des mélanocytes humains afin de réaliser des analyses qui permettront de caractériser la présence et la fonctionnalité des mélanocytes. Cela permettra notamment de définir le nombre de mélanocytes à injecter dans le cadre d’études d’efficacité futures sur un modèle de vitiligo.

Bénéfices attendus

Le vitiligo est une maladie auto-immune, liée à un dysfonctionnement du système immunitaire, au cours de laquelle des taches blanches (parfois des poils blancs) apparaissent sur la peau. Elle concerne 0,5 à 1,0 % de la population mondiale selon des données de 2017. Ces dépigmentations peuvent survenir à n’importe quel moment de la vie, n’importe quel âge, et quelle que soit la couleur de la peau. Bien qu’il soit considéré comme une maladie bénigne, le vitiligo n’est pas anodin : il a des répercussions psychologiques importantes qui peuvent altérer la qualité de vie des personnes qui en souffrent (dépression, angoisse, isolement…). Des traitements existent, à base de crèmes, en association ou non avec un traitement par la lumière (photothérapie), traitements par voie orale ou sous-cutanée, mais la repigmentation est un phénomène long, 6 à 24 mois de traitement sont nécessaires pour obtenir des résultats satisfaisants, avec des effets secondaires plus ou moins importants, et une récidive dans 40 à 50% des cas. La greffe de mélanocytes provenant du patient lui-même est une solution mais elle nécessite de prélever de la peau dans une zone pigmentée, engendrant la création de cicatrices pouvant elles-mêmes être peu ou pas pigmentées. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter et de repigmenter plus rapidement les zones atteintes de dépigmentation, d’en évaluer la fonctionnalité et la stabilité au cours du temps par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge et la qualité de vie de personnes atteintes de vitiligo.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront tout d’abord soumises à un tatouage de 4 points effectués sur le dos en arrière des omoplates, sous anesthésie générale, réalisés en 10 minutes environ. Une semaine plus tard, les 24 souris seront soumises chacune à 4 injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, à l’intérieur de la région délimitée par les 4 points de tatouage. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Pour chaque souris, les sites d’injection seront observés et photographiés chaque semaine afin de suivre l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps. Ces observations et photographies seront effectuées sous anesthésie générale, en 5 à 10 minutes environ.

Impact sur les animaux

La douleur induite lors de la réalisation des points de tatouage puis des injections intradermiques des mélanocytes sera très limitée du fait de leur exécution sous anesthésie générale en un temps relativement court (moins de 10 minutes). Le suivi de l’évolution de la pigmentation cutanée effectué de façon hebdomadaire au cours de l’étude, nécessitant la mise sous anesthésie générale afin de positionner correctement la caméra au niveau de la région délimitée par les 4 points de tatouage, n’engendrera pas de douleur et sera réalisé en un temps très court (5 à 10 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Les 24 souris seront euthanasiées pour moitié 2 semaines après injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, et pour l’autre moitié au bout de 4 semaines, avec 3 souris de chacun des 4 groupes expérimentaux par temps de prélèvement, par injection d’une surdose d’euthanasique sous anesthésie générale profonde. Un prélèvement sera effectué au large des sites d’injections pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité des cellules injectées au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de mélanocytes injectés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané et réaction immunitaire). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet constituant une étude pilote mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. La réalisation de 4 sites d’injection intradermique par souris permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires mais de fournir suffisamment d’échantillons par temps de mesure pour la réalisation des analyses envisagées. Une analyse statistique sera réalisée à partir des résultats des analyses effectuées.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des points de tatouage, des injections intradermiques et des prises de photos hebdomadaires avec la caméra, effectuées sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection des sites d’injection ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 2 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm équipées d’un couvercle filtrant dans une animalerie dédiée au souris immunodéficientes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des bâtonnets d’ouate étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière. De la nourriture irradiée et de l’eau filtrée seront mises à disposition pour chaque cage.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation d’injections intradermiques. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes, très peu pigmentées, permettra d’éviter le rejet des mélanocytes humains injectés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines), l’injection intradermique de mélanocytes humains étant considérée comme une greffe cutanée.

170 rats et 6 macaques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les uns et les autres reçoivent une injection de vecteurs de thérapie génique sous la rétine des deux yeux, puis subissent des séries d'imageries et de tests rétiniens sous anesthésie, répétés jusqu'à quinze fois chez les macaques, ainsi que des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de tester l'efficacité d'un traitement de la maladie de Stargardt chez les rats et sa toxicité chez les macaques, que le porteur juge indétectable chez les rongeurs. Il présente la rétine comme non reconstituable in vitro et retient le macaque pour son œil proche de celui de l'humain.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Injection intramusculaire d'un traitement immunosuppresseur: Geste réalisé sur animaux vigiles (sous contention dans leur cage), pour les macaques une fois avant l'injection du vecteur, puis une fois par semaine pendant les 5 semaines suivant l'injection du vecteur. (v) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 10 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide après les chirurgies car les animaux seront sous anesthésie gazeuse.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Ce nombre basé sur celui de nos précédentes études, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 2 animaux par groupe, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voire de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.

14 rats et 7 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent une plaie cutanée au bistouri sur le dos et une injection intradermique, les souris une injection de médicament anticancéreux destinée à provoquer une nécrose de la peau, pour tester un nouvel appareil de mesure de l'élasticité des tissus comparé à deux dispositifs du commerce. Le porteur annonce des douleurs localisées, une perte de poids modérée et un stress lors des manipulations. Il présente l'outil comme plus simple et moins coûteux et renvoie au conditionnel son application clinique chez l'humain.

Objectifs

La caractérisation des propriétés mécaniques des tissus mous, à l’instar de l’élasticité cutanée, présente un intérêt majeur pour de nombreuses spécialités médicales et chirurgicales. Sur une peau cicatricielle (séquelles de brûlures, cicatrices post-opératoires ou post-traumatiques, cicatrices chéloïdes, greffes de peau, etc.) sa mesure répétée au cours du suivi objective l’efficacité d’un traitement et conforte l’examen clinique. Les technologies actuelles sont cependant imprécises, coûteuses et complexes à manipuler et il n’y a pas de protocole fiable utilisé en pratique clinique pour effectuer cette mesure. L’objectif du projet est de valider un nouveau dispositif de mesure de l’élasticité des tissus mous, indolore et non invasif. Une étude mécanique préalable a été réalisée sur des échantillons inertes mimant des tissus biologiques (Agar Agar de différentes concentrations). Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur tous les échantillons, et de meilleures performances qu'avec les technologiques utilisées actuellement. L'objectif de ce nouveau protocole est de valider ce dispositif sur des tissus biologiques in vivo (modèles murins : la souris et le rat) en le comparant au Cutomètre® et au Myoton®, deux outils permettant la mesure de l’élasticité cutanée et des tissus mous. L’ensemble de ces expérimentations animales permettra d’assurer la cohérence en vue d’un futur essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus après analyses statistiques seront en premier lieu de confirmer l’applicabilité de notre dispositif à l’étude de l’élasticité des tissus mous in vivo sur un modèle murin, ainsi que la simplicité de cette mesure. Nous souhaitons démontrer la précision et la fiabilité de cet outil par comparaison au Cutomètre® et au Myoton®, pour un coût et une complexité de mise en oeuvre moindres. Ces résultats positifs permettront à court terme de développer une étude chez l’homme en pratique clinique usuelle. Notre outil pourrait permettre d’évaluer instantanément et in vivo l’élasticité d’un tissu mou biologique. Il pourra aisément s’intégrer au diagnostic et au suivi thérapeutique de l’ensemble des pathologies nécessitant une évaluation objective de ces propriétés mécaniques, et permettre un gain majeur en qualité de vie pour les patients cibles. Il s’agit d’un dispositif très simple puisqu’il se compose d’une masse équipée d’un ou plusieurs capteurs de force, et est ainsi peu coûteux en comparaison aux technologies déjà présentes sur le marché. A terme, son utilisation pourra s’étendre à d’autres domaines tels que la médecine régénérative, la cosmétologie ou la chirurgie carcinologique, par exemple via la délimitation en temps réel des marges tumorales lorsque celles-ci sont incertaines à l’inspection et à la palpation.

Procédures

Dans le premier protocole, il est effectué sur le dos des rats une perte de substance cutanée rectangulaire (plaie mécanique au bistouri). Elle est réalisée sous sédation chimique, après rasage à la crème dépilatoire et désinfection cutanée. Elle est ensuite recouverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation. Il est également réalisé une injection intradermique ventrale d'un produit volumateur. Dans le second protocole, il est effectué sur le dos des souris une injection intradermique d'un médicament anticancéreux afin d'induire une zone de nécrose cutanée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus et prévisibles, et cibles des stratégies de raffinement sont : - Douleurs localisées au niveau des zones étudiées (perte de substance cervico-thoracique droite et point d'injection ventral droit chez le rat, zone de nécrose dorsale droite chez la souris) - Perte de poids modérée - Stress majoré lors des manipulations initiales et lors des mesures régulières en cours d'étude.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'étude : 14 rats et 7 souris, au terme des 2 mois de l'étude.

Remplacement

Les alternatives non animales pour notre étude ont été exploitées lors de la phase initiale du projet, lors de l'étude mécanique préliminaire in vitro réalisée sur des échantillons d'Agar Agar de différentes concentrations mimant des tissus biologiques. Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur toutes les concentrations en Agar et de meilleures performances qu'avec les méthodes élastométriques. L'objectif est désormais de valider notre outil sur le modèle animal, afin de le valider in vivo au cours d'un processus de cicatrisation complet. Ces résultats, s'ils sont positifs, permettront à terme de développer une étude chez l'homme en pratique clinique usuelle.

Réduction

Le nombre d'animaux requis pour notre étude a été calculé afin d'obtenir des analyses statistiques significatives en ce qui concerne la précision de nos mesures. Il est cohérent avec les protocoles suivis dans les études animales comparables. La durée totale d'étude de 2 mois a été retenue pour permettre un recul suffisant après cicatrisation, et ne pas prolonger inutilement le protocole. Elle est cohérente avec les délais des études comparables compris entre 1 mois 1/2 et 3 mois.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation des animaux avec des conditions de lumière et de température standardisées sera respectée en début d'étude, afin de limiter le stress animal. Une sédation sera réalisée avant chaque geste invasif, adaptée à la douleur. Concernant la perte de substance réalisée pour le protocole n°1, elle sera couverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation à la phase initiale. Passé le délai de 14 jours, et puisque les mesures seront alors plus espacées, un pansement hydrocolloïde transparent sera appliqué entre chaque mesure. En cas de douleur postopératoire, un antalgique sera administré à l'animal selon les bonnes pratiques usuelles. La réaction locale aux points d'injection sera étudiée à chaque temps et des photographies seront réalisées. Le choix d'une perte de substance dorsale a été fait pour éviter le risque de grattage de la lésion par le rongeur. Les cages comporteront des tiges de coton pour nidifier et des maisonnettes en carton.

Choix des espèces

Les modèles murins (souris et rats) sont très adaptés au suivi cicatriciel et permettent des manipulations aisées. Il s'agit des modèles principalement utilisés dans les études comparables de la littérature. Les rats et les souris seront à l'âge adulte. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des animaux plus jeunes, et leur surface corporelle ainsi que leurs capacités de cicatrisation seront optimales à ce stade de développement.

570 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral modifié est injecté directement sous la rétine des deux yeux sous anesthésie, suivi d'imageries et d'électrorétinogrammes répétés, puis les yeux, le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. L'objectif est de tester si une modification chimique de l'enveloppe du vecteur le dirige mieux vers la rétine. Le porteur affirme que la rétine ne peut être reconstituée "parfaitement in vitro" et retient le rat pour la taille de son œil, plus commode à injecter.

Objectifs

Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les outils les plus performants pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. L’AAV de serotype 2 (AAV2) est capable d’infecter une large gamme de cellules in vivo chez le mammifère comme les cellules musculaires, les hépatocytes ou les neurones ce qui explique en partie sa popularité. Ce sérotype a d’ailleurs été utilisé en clinique pour le transfert de gène dans le foie notamment dans le premier essai clinique sur hémophilie B. Ces propos optimistes sont néanmoins pondérés par des limites : •Le tropisme très large des AAV qui peut être à l’origine d’une expression du transgène dans d’autres tissus que celui ou ceux où l’expression du transgène est souhaitée. •Il reste nécessaire d’injecter des doses importantes qui peuvent entrainer une immuno-toxicité au détriment de l’effet thérapeutique Ces principaux inconvénients sont à l’origine de ce projet de recherche car nous pensons qu’une modification chimique ciblée, pourrait changer l’adressage des vecteurs vers l’organe d’intérêt, ici la rétine. Ce projet consiste à modifier chimiquement la capside (l’enveloppe) des vecteurs dérivés du Virus Adéno-Associé de type 2 et 8 (AAV2 et AAV8). Il repose sur le couplage à la surface des vecteurs de molécules chimiques ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine ce qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées. Des premiers tests seront effectués sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo. Il est également impossible de vérifier la bio-distribution et l’index thérapeutique de ces particules modifiées sur des cellules en culture. L'utilisation du rat est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres in vivo.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de déterminer l’infectiosité des AAV (virus adéno-associé) modifiés en les injectant chez des rats sains par voie sous-rétinienne. Il repose sur le couplage de molécules chimiques à la surface de la capside d’AAV ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrée et donc le risque de réaction immunitaire.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne, des vecteurs chimiquement modifiés dans les 2 yeux ou en intra-veineuse : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et de quelques minutes pour l’intra-veineuse. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, le jour de l’injection et le jour de l’euthanasie. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats. Durée du geste, 5min environ.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne ou intra-veineuse. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront sous anesthésie.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie…) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. L’œil du rat étant 5 fois plus gros que l’œil de souris, l’injection sous-rétinienne est plus facile à réaliser chez le rat, avec une distribution du produit plus homogène entre les individus. La taille de l’œil de rat permet également d’avoir suffisamment de matériel pour réaliser les analyses post-mortem.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses post-mortem et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec une solution saline, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes : marquages immunohistochimiques), des analyses de biologie moléculaire et biochimiques. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression de la GFP, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre le vecteur et une analyse statistique sur les amplitudes en ERG (électrorétinogramme).

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés et une régulation de leur température, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats. L’enrichissement sera renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le rat est un bon modèle pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large permettant une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats non albinos, ayant une acuité visuelle moins impactée par l’âge ce qui nous semble cohérent pour l’analyse de l’impact de vecteur sur l’intégrité et la structure de la rétine. Les rats seront utilisés à l’âge d’un mois pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.

1 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès deux jours de vie l'injection chirurgicale d'un vecteur de thérapie génique dans l'oreille, puis des injections répétées de corticoïdes, deux mesures auditives sous anesthésie avec pose d'électrodes sous la peau et des prises de sang, pour tester si un anti-inflammatoire améliore une thérapie génique de la surdité. Le porteur indique que la chirurgie, les injections et la pose d'électrodes provoquent des douleurs légères à modérées. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'expérimentation animale", faute de pouvoir mettre en culture ou simuler le système auditif dans son ensemble.

Objectifs

Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est pas compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. On estime que plus de la moitié des cas de surdité congénitale sont attribués à des causes génétiques et les mutations d’un gène sont les causes les plus fréquentes. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies génétiques. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais également tardifs et progressifs. Nous avons obtenu des résultats prometteurs de preuve de concept d’efficacité thérapeutique pour le traitement des surdités causées par le gène en utilisant des vecteurs viraux codant pour le gène (thérapie de remplacement). Le présent projet consiste à évaluer la possibilité d’améliorer l’efficacité de nos stratégies de thérapie génique.

Bénéfices attendus

La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétique donc potentiellement traitable par thérapie génique. Cependant de nombreuses études ont montré que l’injection d’un produit de thérapie génique dans l’organisme est susceptible d’entrainer une réponse inflammatoire et immunitaire. De plus cette réponse inflammatoire et immunitaire pourrait être potentialisée par le traumatisme chirurgical ce qui limiterait d’autant plus l’efficacité de la thérapie. Les bénéfices attendus de l’administration de produit anti inflammatoire de type corticoïdes seront l’augmentation de l’efficacité thérapeutique de vecteur à savoir une récupération de l’audition plus forte et plus durable (via une augmentation de la transduction et/ou la persistance du transgène). Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.

Procédures

L’injections du vecteur de thérapie génique se fera sous anesthésie gazeuse. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes. Les animaux seront soumis à des tests auditifs au nombre de 2 avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque test. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure de la réponse auditive. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à 1 mois. Un échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes pour chaque prélèvement) à chaque temps d’analyse (15 jours, 1 mois et 2 mois après la naissance).

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables potentiellement attendus sur les animaux sont les douleurs légères à modérées consécutives aux actes de chirurgie, d’injections intrapéritonéales répétées, de pose d’électrodes sous cutanées au niveau de la face et du dos lors des tests auditifs et de prises de sang répétées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous prélevons des tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble. Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Ils seront donc mis à mort. Nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies des animaux. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux qui subiront la chirurgie. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant pour la maman. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par la structure du bien-être animal.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance le système auditif est immature, 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, 30 jours après la naissance et au-delà,le système auditif est mature. L’administration du vecteur de thérapie génique se fera 2 jours après la naissance .