Troubles sensoriels

250 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection de gel dans l'œil pour provoquer une hypertension intraoculaire maintenue pendant vingt et un jours, puis des traitements et des prélèvements de liquide intraoculaire, pour tester de nouveaux composés contre le glaucome. Le porteur indique que l'augmentation de pression "ne devrait pas générer de douleur excessive" et prévoit des points limites en cas de douleur non tolérée. Il retient l'œil du lapin comme "modèle de référence" pour sa taille proche de l'œil humain, et met à mort les animaux faute de pouvoir les réutiliser.

Objectifs

L'objectif du projet est d'évaluer chez le lapin sur une durée de 7 à 21 jours les effets de nouveaux composés sur une hypertension intraoculaire chronique induite par une injection d'un gel dans l'oeil.

Bénéfices attendus

La cause principale du glaucome (diminution irréversible du champ visuel, 2ème cause de cécité) est une augmentation de la pression intraoculaire à l’origine de la destruction des cellules du nerf optique. Les traitements existants (β-bloquants, analogues des prostaglandines…) ont une efficacité limitée et peuvent présenter des effets indésirables. Ainsi, le bénéfice attendu de ce projet est le développement d’une nouvelle classe thérapeutique pour traiter le glaucome qui touche plus de 800 000 personnes en France.

Procédures

Les lapins vont recevoir sous anesthésie (durée maximale de 45 minutes) une injection dans l'oeil d'un gel qui va provoquer une augmentation progressive de la pression intraoculaire qui va se maintenir pendant 21 jours. Avant l'injection intraoculaire, les animaux sont habitués pendant au moins 5 jours aux expérimentateurs et au dispositif de mesure de la pression intraoculaire : plusieurs mesures de la pression seront effectuées à l'aide d'un tonomètre vétérinaire sur l'animal éveillé. Des nouveaux composés ou des traitements de référence seront administrés de manière aigüe ou répétée (maximum 2 administrations par jour) afin de tester leur efficacité sur l'augmentation de pression intraoculaire. Des prélèvements sanguins et des du liquide intraoculaire (sous anesthésie) pourront être réalisés afin de vérifier les expositions aux différents traitements effectués.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -Le stress lié à la contention et à la réalisation des mesures de pression intraoculaire (geste non invasif et non douloureux) : pour limiter cet effet, les animaux auront une période d’habituation à la préhension, manipulation des yeux et des mesures de pression. - L’augmentation de la pression intraoculaire : selon la technique utilisée, l’augmentation de la pression devrait être modérée (50 mmHg) et ne devrait pas générer de douleur excessives. Cependant, nous avons mis en place un protocole de suivi et d’identification de points limites permettant de mettre en place des actions en cas d’apparition de douleurs non tolérées ou d'anomalies oculaires.

Devenir

A la fin de l'expérimentation chronique, les animaux sont mis à mort. En effet la procédure ne peut pas être répétée plusieurs fois sur un même œil. De plus au sein du laboratoire ces lapins ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.

Remplacement

Les modèles in vitro modélisant le fonctionnement d'un oeil ne permettent pas de tester les efficacités des molécules thérapeutiques : en effet le maintien de la pression intraoculaire fait intervenir l'interaction de nombreux mécanismes (production/élimination de l'humeur acqueuse, inflammation...).

Réduction

En raison de la variabilité liée au modèle, de la variabilité liée aux mesures de pression, un nombre de 8 à 10 lapins par groupe est nécessaire afin de mettre en évidence un effet éventuel d'un produit. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les 2 yeux de chaque lapin pourront être inclus dans la procédure. Les analyses statistiques pourront être de trois types : soit en comparant les données après administration du produit à tester aux données mesurées en conditions basales, soit en comparant les données sous traitement à celles recueillies aux mêmes temps dans le groupe contrôle, soit en comparant les données obtenues sur l'oeil d'un lapin en comparaison à l'autre oeil du même lapin qui n'aura pas reçu de traitement ou qui ne recevra pas d'injection intraoculaire afin d'obtenir des valeurs basales et faire des comparaisons appariées.

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour de l'expérimentation. Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Pendant une phase d’habituation d’au moins 5 jours, du foin est mis à disposition de manière journalière ce qui permet de créer un contact régulier avec le lapin et de le familiariser avec l'expérimentateur. A la fin de cette période d’habituation, des mesures de pression à l'aide d'un tonomètre seront effectuées afin de familiariser l'animal avec le dispositif. La mesure de pression à l'aide d'un tonomètre n'engendre aucune souffrance chez l'animal. Chaque mesure de la pression intraoculaire sera associée à une récompense (friandise). L'injection intraoculaire sera effectuée après administration sous forme de gouttes d'un anesthésique local chez un lapin au préalable sédaté. Des points limites stricts et spécifiques ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille relativement proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de nouvelles molécules sur la pression intraoculaire. De plus, cette taille de l'oeil facilite la précision du geste d'injection intravitréenne et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. L'expérimentation sera réalisée sur des lapins adultes. Le glaucome est une pathologie apparaissant avec l'âge, il n'y a aucune raison de travailler sur des individus en cours de développement.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome humain, des gavages quotidiens pendant trois semaines et des injections d'anticorps, pour tester une cible thérapeutique contre le mélanome métastatique. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et troubles respiratoires, la mise à mort intervenant à 2 cm³ de tumeur. Il vise une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la tumorigenèse.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que cibler une protéine exprimée de façon non conventionnelle par les cellules tumorales peut altérer la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour démarrer des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre la validation préclinique d'une nouvelle approche thérapeutique pour le mélanome cutané. Si les résultats obtenus confirment ceux des précédentes expériences in vitro, des essais de xénogreffes de tumeurs provenant de patients humains dans un modèle murin, pourront être envisagées. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d’immunothérapie lors d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.

Procédures

Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections se font sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections d'anticorps (2 fois par semaine, 100 microlitres) ou de produit luminescent (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages (1 fois par jour pendant 3 semaines maximum). L’introduction d’une aiguille pour les différentes injections entraine une légère douleur au point d’injection mais qui est brève. L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés notamment problèmes respiratoires liés aux métastases sur les poumons.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par un anticorps spécifique sur la croissance tumorale in vivo. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 200 réparti comme suit : 4 cohortes de 20 animaux injectés avec 4 lignées de cellules tumorales puis traités ou non avec l'anticorps et 3 cohortes de 40 animaux injectés avec 3 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec l'anticorps en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Les paramètres étudiés seront la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance et le développement des métastases pulmonaires. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes dont les cellules ont un potentiel d’invasion plus ou moins important. Leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique : il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires par différentes voies d'injection.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives que les mâles, elles seront hébergées en cohorte pour conserver l’interaction sociale. Les expérimentateurs établiront le contact avec les souris 8 jours avant le début de l’expérimentation les habituer à la manipulation et réduire leur angoisse. Les cages seront enrichies. Nous surveillerons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine pour suivre la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. Nous adapterons la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées en fonction de la vitesse de croissance tumorale. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d’imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. La souris est un modèle reconnu dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines afin de tester des traitements potentiellement transférables en médecine humaine. Pour éviter le rejet des cellules humaines de mélanomes après injection, nous utiliserons des souris immunodéprimées NOD/SCID/IL2GammaR. Ces souris présentent un système immunitaire déficient et nécessitent des conditions d'élevage stériles. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétro-orbitale. La croissance tumorale ne devrait pas être impactée par l'âge des souris. Il est cependant préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes n'entravent pas leur capacité de mouvement.

12 750 animaux non-humains, soit 5 100 souris, 5 100 rats et 2 550 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'œil leur est provoquée par injection oculaire ou systémique, suivie d'examens ophtalmologiques parfois sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur attend des modèles servant à évaluer de futurs traitements et décrit une inflammation, un gonflement au point d'injection et de possibles diarrhées. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".

Objectifs

Les uvéites sont des inflammations, réactions de défense de l'organisme à une agression, de la partie de l'oeil appelée uvée qui est composée de plusieurs structures internes de l’oeil. Elles entrainent une rougeur de l'oeil, altèrent la vision, occasionnant des troubles ou l'apparition de taches, et peuvent conduire à la cécité en l'absence de soins. Dans les pays occidentaux, elles seraient à l’origine de 5 à 20% des cas de cécité. Les causes des uvéites sont variées: d’origine infectieuse, associées à une autre pathologie ou auto-immunes. L’objectif du projet est la mise en place de modèles expérimentaux d'uvéite chez le rongeur et le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux pour diminuer les symptômes. Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif, nous devrons avoir recours à des animaux pour établir notre modèle. Les informations bibliographiques recueillies, les analyses statistiques ainsi que notre expérience, nous permettrons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre les signes et les origines des uvéites est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Selon la procédure, l'induction de la pathologie peut se faire soit par une injection directement au niveau de l'oeil soit par une injection systémique, intraveineuse pour le lapin, sous cutanée pour le rat, sous-cutanée ou intrapéritoneale pour la souris. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations par une lampe à fente d'phtalmologie). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur des recommandations et durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont une inflammation de tissus de l'oeil, conjonctive, iris, humeur aqueuse, rétine, vitré et photophobie. De même un gonflement au niveau du site d'injection de l'inducteur est attendu (patte, dos, et base de la queue). Des diarrhées peuvent se produire, les animaux seront pesés juste avant l’induction le lendemain et chaque semaine qu’à la fin de la procédure.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de produits...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Des évaluations non invasives des structures internes de l'oeil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum pour les rongeurs, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie légère pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les lapins 8-12 semaines, âge minimum pour la maturation de la rétine comme il convient au modèle.

3 204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques reproduisant une cécité héréditaire, elles reçoivent une injection sous-rétinienne d'une thérapie génique par CRISPR/Cas9, suivie de prélèvements de larmes et de sang, de fonds d'œil, de tomographies et d'électrorétinogrammes répétés jusqu'à neuf ou dix fois. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des décollements de rétine et des hémorragies oculaires. Il annonce viser une preuve de concept avant un éventuel passage en clinique.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est de mettre au point une thérapie génique permettant de limiter la progression de la rétinite pigmentaire autosomique dominante, une maladie génétique responsable d’une dégénérescence des photorécepteurs, cellules permettant la vision, et aboutissant à une cécité, dans deux modèles de souris atteintes de rétinite pigmentaire autosomale dominante. Cette thérapie génique reposera sur une stratégie de « Suppression », éliminer le gène responsable de maladie chez le patient en utilisant les ciseaux génétiques CRISPR/Cas9, associée à une stratégie de « Remplacement » qui consistera à apporter au patient une version saine du gène précédemment supprimé (gène médicament). La finalité étant le développement d’une thérapie curative accessible au plus grand nombre de patients atteints par cette cécité héréditaire.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’une thérapie génique indépendante des mutations et utilisant l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9 sur nos modèles murins de rétinite pigmentaire autosomale dominante. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique cette thérapie génique mutation indépendante pour la rétinite pigmentaire autosomique dominante, pour lesquelles le développement de traitement spécifique à chaque mutation identifiée n’est aujourd’hui pas possible.

Procédures

- Injection sous-rétinienne : les animaux recevront une injection intraoculaire (une seule par œil) de la thérapeutique à évaluer. L’injection est rapide (5 à 10 minutes) et sera réalisée sous analgésie et anesthésie générale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. - Prélèvement de larmes : le prélèvement est effectué sur souris vigiles (non anesthésiées). Le prélèvement de larmes est rapide (30 secondes) et considéré non douloureux chez l’animal. Les larmes des souris seront prélevées avant l’injection intraoculaire de l’élément thérapeutique testé (si l’âge des souris à l’injection le permet) puis une fois par semaine pendant 4 semaines, soit au maximum 5 fois. - Prélèvement de sang : le prélèvement est effectué sur souris anesthésiées. Le prélèvement de larmes est rapide (30 secondes) et considéré non douloureux chez l’animal. Le sang sera prélevé avant l’injection intraoculaire de l’élément thérapeutique testé (si l’âge des souris à l’injection le permet) puis une fois par semaine pendant 4 semaines, soit au maximum 5 fois. - Fond d’œil : suite à l’injection de la thérapeutique, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est rapide (5 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé 1 à 3 fois selon les conditions expérimentales. - Tomographie à cohérence optique : ce test permet de visualiser la structure anatomique de la rétine (différentes couches de cellules). L’acquisition d’images dure environ 5-10 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie gazeuse Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 10 fois par animal. - Electrorétinogramme : ce test permet d’évaluer la fonction de la rétine (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux). L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à cet examen, il sera réalisé au maximum 9 fois par animal. - Euthanasie par des méthodes réglementaires en vue de prélèvements : en fin de procédure expérimentale, toutes les souris seront euthanasiées pour collecter des échantillons pour des analyses microscopiques des tissus et des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. La majorité des gestes expérimentaux auxquels seront soumises les souris seront réalisés sous anesthésie (injection intraoculaire, prélèvement de sang, fond d’œil, tomographie à cohérence optique, électrorétinogramme) induisant une répétition des anesthésies. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les yeux pour des analyses histologiques post-mortem.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que dans un modèle in vivo car les propriétés pharmacologiques du traitement ne peuvent être évaluées que dans des conditions physiologiques, pour notamment étudier l’interaction entre les vecteurs d’injection de la thérapie génique et le système immunitaire de l’hôte. De même que le fonctionnement de la rétine et la vision ne peuvent être évalués qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (3204 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe (17 pour J2-3) est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Une anesthésie courte gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections sous-rétiniennes, intrapéritonéales et sous-cutanées. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Les deux modèles de souris transgéniques utilisés dans ce projet reproduisent la pathologie étudiée : la rétinite pigmentaire autosomale dominante. Comme chez l’Homme, une mutation présente dans le gène codant pour la rhodopsine, induit une dégénérescence progressive des photorécepteurs. De plus, chez ces deux modèles de souris la vitesse de dégénérescence des photorécepteurs diffère, notamment due aux différentes mutations, ce qui est également observé chez les patients. Le but de cette étude étant de tester l’effet de nouveaux composés thérapeutiques pour ralentir la dégénérescence rétinienne, l’intervention interviendra avant que la dégénérescence des photorécepteurs n’atteigne un stade avancé, soit chez des souris âgées de 2-3 jours, 7 jours, 14 jours afin de déterminer le temps d’injection ayant le meilleur avantage thérapeutique. Les souris âgées de 42 à 49 jours seront utilisées car celles-ci possèdent un système immunitaire pleinement mature, nécessaire à la comparaison avec les stades antérieurs.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'œil ou dans le cœur d'un vecteur viral, puis subissent jusqu'à six examens de la vue sous anesthésie répétée, dont fond d'œil, tests optocinétiques, tomographie et électrorétinogrammes, pour tester des thérapies géniques contre des dégénérescences de la rétine. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des décollements de rétine et des hémorragies oculaires, et que les anesthésies répétées exposent à l'hypothermie. Il affirme que l'étude du système visuel ne peut se faire que chez l'animal, faute de méthode de modélisation.

Objectifs

La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de trouver des thérapeutiques efficaces pour ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer chez les personnes l’ayant perdue. Notre objectif est de combattre les maladies dégénératives de la rétine en utilisant des thérapies géniques vectorisées par des virus adéno-associés (virus non pathogènes, non immunogènes et qui permettent un transfert efficace de gène dans les cellules). L’efficacité des différentes thérapies testées sera évaluée sur la structure anatomique de la rétine par tomographie à cohérence optique, sur l’acuité visuelle des animaux par des tests optocinétiques et sur la fonction rétinienne par des électrorétinogrammes, à différents points dans le temps, dans différents modèles de souris de dégénérescence rétinienne.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’une ou plusieurs thérapies géniques dans des modèles de souris de rétinite pigmentaire. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique cette/ces thérapies géniques pour des maladies dégénératives de la rétine.

Procédures

- Injection intraoculaire : les animaux recevront une injection intraoculaire (une seule par œil) de la thérapeutique à évaluer. L’injection est rapide (5 à 10 minutes) et sera réalisée sous anesthésie générale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intraoculaire de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intracardiaque. - Injection intracardiaque : les animaux recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à évaluer. L’injection est très rapide (30 secondes) et sera réalisée sous anesthésie locale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intraoculaire. - Fond d’œil : suite à l’injection de la thérapeutique, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est rapide (5 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé 1 à 3 fois selon les conditions expérimentales. - Test optocinétique : ce test permet d’estimer la fonction visuelle in vivo. L’acquisition d’images dure environ 10 minutes par animal et sera réalisée sur animal vigile. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Tomographie à cohérence optique : ce test permet de visualiser la structure anatomique de la rétine (différentes couches de cellules). L’acquisition d’images dure environ 5-10 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie gazeuse Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Electrorétinogramme : ce test permet d’évaluer la fonction de la rétine (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux). L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie générale. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Euthanasie par des méthodes réglementaires en vue de prélèvements : en fin de procédure expérimentale, les souris seront euthanasiées pour collecter des échantillons pour des analyses microscopiques des tissus et des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées et intracardiaques peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. La majorité des gestes expérimentaux auxquels seront soumises les souris seront réalisés sous anesthésie induisant une répétition des anesthésies. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) et lors des tests confinés d’optocinétiques.

Devenir

Tous les animaux de l’étude (1440) seront euthanasiés à la fin des procédures afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem

Remplacement

Nous étudions dans ce projet le fonctionnement du système visuel après un traitement thérapeutique à plusieurs niveaux. Ceci ne peut être étudié que chez l’animal puisque le fonctionnement du système visuel doit être intact. Il n'existe pas de méthodes alternatives par modélisation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (1440 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris par groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les utilisateurs et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation. - Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (tunnel en carton, coton), alimentation et abreuvement à volonté. - Une anesthésie courte gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale gazeuse pour les procédures courtes (injection intraoculaire, imagerie), et d’une anesthésie générale par injection d'anesthésiants pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intraoculaires et les électrorétinogrammes. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intraoculaires/intracardiaques/intrapéritonéales (dans la cavité abdominale)/sous-cutanées. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire et à la fin des électrorétinogrammes. - Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie gazeuse et une anesthésiepar injection d'anesthésiants et de 7 jours entre deux anesthésies par injection d'anesthésiants. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée sur des modèles de souris car il existe différents modèles génétiques de rétinopathie proches du phénotype humain. Nous utiliserons plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ayant des mutations différentes et une vitesse de dégénérescence rétinienne différente, pour modéliser la variabilité observée chez les patients. L’âge auquel les animaux entreront dans la procédure dépendra du phénotype et de la stratégie utilisée (selon si nous voulons injecter avant ou après que la dégénérescence rétinienne ait commencée). Les souris seront donc injectées soit au stade « nouveau-né » (entre 2 et 4 jours de vie, avant le développement définitif de la barrière hémato-rétinienne), soit à l’âge de 15 jours (avant que la dégénérescence des photorécepteurs ne soit trop avancée), soit à l’âge de 5 ou 8 semaines (lorsque la dégénérescence des photorécepteurs est quasiment complète).

6 000 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois avec adjuvant, et des prélèvements de sang pouvant aller jusqu'à quatre par jour, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et des médicaments. Hébergés seuls alors que l'espèce est sociale, ils sont tués en fin de protocole, un prélèvement de sang final important rendant leur maintien en vie impossible selon le porteur. Celui-ci reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques).

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 2 mL répartis sur 4 à 8 sites maximum pour la voie sous-cutanée, 0.5 mL sur 4 sites maximum pour la voie intra-musculaire, 5 mL/kg pour la voie intraveineuse, 2mL sur 40 sites maximum pour la voie intra dermique. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique mais seront au maximum espacés d’un à deux jours sur une durée totale d’un mois. En cas de durée supérieure à un mois, la structure en charge du bien-être animal sera contactée pour évaluer le bénéfice / risque. Concernant les prélèvements, les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de 5 minutes. Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à une anesthésie générale par injection d’un anesthésique par voie intraveineuse ou à une anesthésie locale répétée par application d’une pommade anesthésiante. Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Il est en effet impossible de : réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre protocole d’immunisation, réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre projet effectué par l’établissement utilisateur. Lors du prélèvement final de la procédure, un volume significatif de sang est récupéré et cela rend incompatible la réutilisation de l’animal.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

Également, à travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin, anneau en plastique, mousqueton…) Un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Durant cette pesée, un examen approfondi de l’état clinique des lapins est effectué par le technicien (e.g. : vérification des points d’injection, maux de patte éventuels, dentition…). Également, durant ce processus, des caresses aux animaux sont prodiguées. Des points limites intermédiaires associés à des actions spécifiques et des points limites terminaux sont en place. Par exemple, en cas de perte de poids ≥ 20% sur une semaine, une nourriture appétante est proposée à l’animal. Également, en cas d’apparition de certains signes cliniques (exemples : masses sans douleur pour l’animal, abcès sans lésion, fécalome) des protocoles de soins validés par un vétérinaire sont prodigués aux animaux. Certains gestes douloureux (injections intra-dermique) sont réalisés sous anesthésie générale et les injections répétées sont effectuées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Choix des espèces

Le lapin est l'animal le plus utilisé pour la production d’anticorps étant l’espèce animale la plus adaptée pour cela, de par la production de volumes suffisants d'antisérum qualitatif et à titre élevé. Cela permet donc d’utiliser moins d’animaux pour l’objectif scientifique requis. Age minimum des lapins : 10 semaines. A cet âge, les lapins ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

3 000 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par un dysfonctionnement des glandes de Meibomius, avec administrations souvent quotidiennes de produits par gouttes, injections ou voie intraconjonctivale, entraînant picotements, brûlures, rougeurs et gonflements des paupières, avant mise à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur présente les examens comme non invasifs et proches de ceux pratiqués en cabinet. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'œil "dans sa globalité" et retient trois espèces pour couvrir leurs particularités anatomiques.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire, plus fréquente chez les femmes et les personnes âgées. Elle concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien décrits dans la littérature. Les dysfonctionnements des glandes de Meibomius (DGM ou MGD) sont des troubles chroniques répandus affectant la santé et le bien-être de millions de personnes dans le monde. Ces dysfonctionnements constituent une anomalie chronique et diffuse des glandes de Meibomius, caractérisée, en principe, par une obstruction des canaux excréteurs et/ou des modifications qualitatives/ quantitatives des secrétions glandulaires, dont les conséquences potentielles sont : Altérations du film lacrymal, symptômes d’irritation oculaire, inflammation clinique, maladie de la surface oculaire. Les DGM sont classifiés selon deux grandes catégories, en fonction des sécrétions meibomiennes : hypoexcrétion (la cause la plus fréquente du DGM) et hyperexcrétion. En conclusion, les DGM peuvent provoquer des altérations du film lacrymal, des symptômes d’irritation, d’inflammation et de sécheresse oculaires. C’est de loin la première cause de sécheresse dite « évaporative ».

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intraconjonctivale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles, sous anesthésie locale ou sous anesthésie légère. Leurs durées sont réduites au maximum pour le bien-être de l'animal. Ces examens ne durent que quelques secondes pour la plupart, 5 minutes environ pour le plus long.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la maladie à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, des rougeurs palpébrales, des gonflements des paupières. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques sur tissus, dosages de produits...).

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide des tests statistiques Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

242 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles inhalent du styrène ou des isomères du xylène six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant une à quatre semaines, et une partie subit une chirurgie du crâne pour implanter un système de contention à vis destiné à mesurer les mouvements oculaires, avant la mise à mort et le prélèvement des oreilles. Le porteur indique que les fortes concentrations peuvent déprimer le système nerveux et provoquer des effets narcotiques et des troubles de l'équilibre. Il présente l'étude comme la validation in vivo d'une toxicité déjà suggérée in vitro, en vue d'un éventuel test de criblage des polluants industriels.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la potentielle toxicité de quatre solvants aromatiques présents dans l’industrie, le styrène et les trois isomères du xylène, sur l’organe périphérique de l’équilibre, le vestibule, situé dans l’oreille interne. Il s’agit également de comparer cette potentielle toxicité à celle décrite avec ces solvants sur la cochlée, organe périphérique de l’audition, également situé dans l’oreille interne.

Bénéfices attendus

La toxicité vestibulaire de certains solvants aromatiques a été suggérée précédemment par une étude in vitro. La présente étude permettra de valider (ou d’infirmer) ces informations grâce à une approche in vivo. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro, alors ce test pourra potentiellement être proposé comme test de criblage afin d’identifier les polluants industriels susceptibles de perturber l’équilibre des salariés.

Procédures

Les animaux seront exposés par inhalation à différentes doses de styrène ou d’un des 3 isomères du xylène. Cette exposition durera entre une et quatre semaines, à raison de 6 heures / jour, 5 jours par semaine. Afin de déterminer les effets de ces différentes substances sur l’oreille interne, l’audition et l’équilibre des animaux seront testées avant exposition, à la fin de l’exposition puis 4 semaines après. L’audition sera estimée par la mesure des produits de distorsion, une méthode non invasive utilisée pour le dépistage des surdités chez les nouveaux nés. Chez le rat, elle nécessite une anesthésie médicamenteuse légère. L’équilibre sera estimé par des tests comportementaux et par la mesure de la persistance des saccades oculaires après rotation (nystagmus post-rotatoire). Cette dernière mesure demande une contention de la tête, qui nécessite l’implantation à demeure d’un système de contention (pas de vis). Cette chirurgie crânienne est réalisée, une seule fois, 4 semaines avant le début de l’exposition. Chez la moitié des animaux, un prélèvement sanguin à la queue sera réalisé sous anesthésie gazeuse en sortie d’exposition. Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort et les oreilles prélevées pour observer les dommages causés par les expositions aux solvants.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront opérés afin de recevoir un dispositif de contention pour mesurer les mouvements oculaires. Afin d’éviter les douleurs post-chirurgicales, un antalgique morphinique sera délivré avant de réaliser l’anesthésie. Par ailleurs, il n’est pas exclu, que les animaux recevant une anesthésie par voie générale ou gazeuse, dans le but de réaliser des tests auditifs ou des prélèvements sanguins, ressentent du stress. Néanmoins, celui-ci devrait être mineur car les animaux sont habitués à être manipulés et les gestes sont opérés par du personnel qualifié. Les tests comportementaux, mais également la mise en rotation des animaux lors de la mesure des saccades oculaires, pourraient générer chez les animaux, pendant un court instant, un désagrément se traduisant par des troubles de l’équilibre. Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études sur l’animal et par des approches épidémiologiques en entreprise. En revanche, les effets de ces substances sur le vestibule (récepteur de l’équilibre), qui se trouve également dans l’oreille interne, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture de l’organe récepteur, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. La présente étude se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène par inhalation. L’évaluation de la toxicité se fera par des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui permettront de comparer de manière objective les effets toxiques sur la cochlée et sur le vestibule. Des analyses histologiques seront également réalisées post mortem. Cette étude évalue donc la fonction de deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être appliquées que sur des organismes vivants. D’autre part, pour modéliser la toxicité de ces agents chimiques chez l’Homme, il est nécessaire qu’ils soient métabolisés par des organismes vivants

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures des saccades oculaires après rotation ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure des saccades oculaires après rotation et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie). Aucune expérimentation ne sera réalisée lors de la première semaine afin de laisser le temps aux rates de s’habituer à leur nouvel environnement. Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de réaliser les expérimentations pendant leur phase d’activité. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage pour permettre les liens sociaux de s’établir. Les animaux seront habitués à être manipulés en amont des expérimentations. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Ils seront hébergés en cage individuelle pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignées à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle recommandé pour les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Des femelles ont été choisies pour réaliser les expérimentations car celles-ci grossissent moins avec l’âge que les rats mâles et le dispositif pour enregistrer le mouvement oculaire après mise en rotation de l’animal ne permet pas de faire ces mesures sur des animaux de plus de 300 g. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les enzymes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.

48 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur inflige des plaies cutanées chirurgicales sur le dos puis on les anesthésie tous les trois jours pendant 21 jours pour suivre la cicatrisation, afin de tester des biopansements et des molécules bioactives. Le porteur situe les retombées à court terme, les produits étudiés étant déjà commercialisés pour d'autres usages. Il affirme avoir besoin d'un animal vivant pour étudier la cicatrisation dans son ensemble, avec les contraintes que subit la peau au quotidien.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’amélioration du processus de cicatrisation par l’usage de molécule bio actives et de nano biomatériaux sur un modèle de plaies cutanées dans un contexte diabètique en utilisant une lignée de souris qui exprime les paramètres physiologiques de la maladie (diabète). Le processus de cicatrisation comporte 4 étapes en condition physiologique : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Elles se succèdent grâce aux recrutements des cellules immunitaires et la migration de cellules résidentes qui vont sécréter des facteurs permettant d’aboutir à la complète réparation de la lésion cutanée. En situation pathologique, ce processus peut être altéré (infection, maladie métabolique, irradiation…) et entrainer un retard de la cicatrisation et/ou une cicatrisation de moins bonne qualité, avec un risque de réouverture récurrente des plaies qui deviennent alors chroniques. Il est donc important d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation de molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-microbiennes. A ce titre certaines molécules semblent être de bons candidat innovants. Nous testerons ici deux molécules : les HDL reconstitués (rHDL) ainsi que l’Alpha 1 Antitrypsine (AAT). Ces deux molécules seront incorporées dans un gel neutre miscible (gel neutre Cooper) afin de pouvoir les appliquer et les maintenir sur les plaies. Cependant il manque encore des données scientifiques pour étayer cela. Nous voulons également tester en parallèle deux scaffolds : un scaffold solide et un scaffold sous forme d’hydrogel que nous avons déjà testé sur un modèle de plaies cutanés sur des Rats Wistar, non diabétiques, en amont du projet et dont les résultats préliminaires nous amènent à penser qu’ils peuvent être de bon candidats dans le processus de cicatrisation cutanée dans un contexte pathologique comme le diabète. Nous souhaitons évaluer les propriétés cicatrisantes des rHDL , de l’AAT , de la synergie de ces deux molécules ainsi que certains nano bio matériaux sur des plaies aigües en condition hyperglycémique liée au diabète. Nous pourrons ainsi étudier d’une part la potentielle amélioration de la qualité de la cicatrisation et d’autre part la possible normalisation du processus de cicatrisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la santé humaine, et en particulier les personnes souffrant de retard de cicatrisation comme les diabétiques. Les données scientifiques feront l’objet de publications dans des journaux internationaux permettant ainsi une valorisation d’un développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante. Ces bénéfices auront une échéance à court terme puisque les molécules actives étudiées sont déjà commercialisées (pour d'autres applications), et les scaffolds étudiés sont accessibles pour une fabrication industrielle.

Procédures

Les animaux seront tous soumis à une procédure chirurgicale sur le tissu cutanée, d'une durée de 15 minutes environ, sous anesthésie et analgésie. Ils seront tous anesthésiés brièvement (5 minutes) pour l'examen des plaies, tous les 3 jours. La procédure totale aura une durée de 21 jours pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont celles imputables à la chirurgie à savoir : anesthésie, injections, stress et douleurs. Le suivi des plaies se faisant tous les deux jours sous anesthésie, peut engendrer des réveils difficiles et augmenter le risque d’hypothermie. De plus, le positionnement des pansements peut constituer une gène (risque de retrait du pansement, difficultés à se mouvoir). L’isolement des animaux en cas d’atteinte de points limites peut également constituer une source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyser les tissus étudiés.

Remplacement

Des tests préliminaires in vitro ont été réalisés préalablement sur un modèle de cellules épithéliales humaines de la peau (HaCat), en condition huperglycémique(MGO) afin d’extrapoler la concentration des molécules à utiliser sur notre modèle animal. De même, les propriétés anti-inflammatoires et de migration cellulaire ont été évaluées in vitro. Afin de répondre à notre objectif scientifique, nous avons besoin d’un modèle animal vivant pour étudier le processus cicatriciel dans son ensemble, notamment les phases telles que l’angiogénèse et la réinnervation, avec les contraintes que peut subir la peau au quotidien à savoir étirement, relâchement, inflammation locale.

Réduction

Nous avons pu réduire au maximum le nombre de souris grâce à une revue systématique bibliographique et à l’utilisation de l’outil statistique R. La taille des plaies induites de 6 mm permettra de réaliser 2 plaies par animal ce qui permettera d’avoir un contrôle négatif pour chaque animal.

Raffinement

Notre protocole a été optimisé afin de minimiser au maximum les contraintes subies par les animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie avec une couverture analgésique en respectant strictement les règles d’asepsie. Le matériel chirurgical utilisé sera rigoureusement stérilisé au préalable. Le gel utilisé comme matrice pour les molécules à tester est un gel neutre et sera appliqué en plus de la plaie sur une partie de la peau du dos rasée préalablement comme contrôle de biocompatibilté. Les animaux seront surveillés et manipulés tous les jours pour détecter tout inconfort lié à la procédure, avec un suivi post-opératoire renforcé dans les premières 48h ainsi que dans les phases de réveil faites en chambre de réveil thermostatée. Nous allons également effectuer un scoring de la douleur.

Choix des espèces

Le modèle souris Db/Db (dabiétique) a été selectionné dans cette étude. La souris Db/Db est un modèle largement utilisé dans la recherche dès lors que nous devons travailler sur un modèle pathologique de diabète. Par ailleurs, la souris possède une architecture de la peau proche de celle retrouvée chez l’Homme : présence d’épiderme, lame basale, derme, hypoderme et présence de follicules pileux. La taille de 6mm de la plaie effectuée nous permettra de faire 2 plaies par souris et donc de réduire notre nombre total d’animaux. Nous travaillerons avec des souris mâles adultes de 8 semaines. Les jeunes souris adultes ont une meilleure récupération post-chirurgicale et nous n’ajouterons pas de biais de cicatrisation lié à l’âge de l’animal qui aura une peau plus souple à 8 semaines. Cela permettra d’avoir un processus de cicatrisation optimal.