Troubles sensoriels

1 350 souris sont exposées à un traumatisme sonore pouvant durer deux heures, et 1 080 subissent une injection dans la cochlée, opérées pour certaines dès l'âge de deux jours. 2 700 souris sont utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec cinq tests auditifs de quarante minutes sous anesthésie puis une mesure terminale des potentiels de l'oreille interne. Le porteur qualifie la perte auditive provoquée de dommage permanent "sans impact autre sur la santé de l'animal", et affirme que l'exposition sonore ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. Les anciens reproducteurs, génétiquement modifiés et donc jugés non adoptables, sont tués au bout de six mois et remplacés.

Objectifs

Selon l’OMS, d’ici 2030, les atteintes de l’audition constitueront la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien soit plus de 500 millions de personnes. Dans plus de 80% des cas la surdité est liée à une atteinte de l’organe neurosensoriel de l'oreille (on parle de surdité neurosensorielle). Parmi les surdités neurosensorielles, on distingue les surdités d’origine héréditaire (on parle de surdité génétiques) et d’origine environnementale. La première cause environnementale des troubles de l’audition est la surexposition au bruit. De ce fait, un encadrement législatif de protection des travailleurs dans le milieu professionnel existe dans de nombreux pays. Mais selon l’OMS plus d’un milliard de jeunes sont confrontés au risque d’une perte auditive permanente en raison d’une exposition prolongée à des sons de forte intensité lors de loisirs tels que l’écoute de musique et les jeux vidéo. Il peut également y avoir un effet combiné : si la surdité génétique peut entraîner une perte d’audition dès la naissance (on parle de surdité congénitale), elle peut également entrainer une diminution des capacités au cours de la vie (on parle de surdité acquise) notamment par une sensibilité accrue au bruit. En d’autres termes pour un environnement acoustique donné, une personne présentant système auditif déjà fragilisé par une mutation génétique sera plus susceptible de développer une perte auditive qu’une personne n’en présentant pas. L’objectif de la présente étude est premièrement d’identifier quelles surdités génétiques entrainent une sensibilité accrue au bruit et deuxièmement de déterminer si un traitement symptomatique médicamenteux ou curatif par thérapie génique (nécessitant une chirurgie de l’oreille interne) de la surdité héréditaire permettrait de diminuer l’incidence ou la gravité de la surdité acquise qui s’y adjoint.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier les surdités génétiques entrainant une sensibilité accrue au bruit et d’en documenter les processus physiopathologiques et, si les résultats sont probants, contribuera à plus long terme à une meilleure prise en charge des patients et une meilleure sensibilisation du grand public à l’adoption de bonnes pratiques d’écoute.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests auditifs (40 minutes en comptant l’anesthésie) et ce 5 fois (reparti entre 1 mois et 2 mois d’âge). En fin de procédure, les animaux seront soumis à des mesures de potentiels endocochléaires qui nécessitent que l’animal soit vivant mais profondément sédaté et qui est une procédure terminale, sans réveil donc et qui dure 20 min. Parmi ces 2700 animaux, 1350 seront soumis à un traumatisme sonore (2h au maximum) Parmi ces 2700 animaux, 1080 animaux seront soumis à une procédure chirurgicale :injection dans la cochlée qui dure environ 10 à 15 minutes

Impact sur les animaux

Le dommage principal et permanent attendu pour cette étude est la perte/diminution des capacité auditive pour les animaux que l’on induit par une exposition sonore sans impact autre sur la santé de l’animal. Les autres dommages attendus pour cette étude sont une peur et un stress physique transitoire lors des traumatismes sonores et une douleur – modérée, contrôlée par des analgésiques - consécutive à la chirurgie de l’oreille interne.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Les animaux seront mis à mort pour réaliser nos analyses sur prélèvements.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central des rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). De plus, il n’est pas possible de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux, et aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les tailles des groupes de souris indiquées ont été calibrées pour répondre aux questions posées. Les groupes sont constitués afin de détecter un certain niveau de différences entre groupes. Les groupes seront constitués de 6 animaux et les expériences répétées 2 fois. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet.

Raffinement

Pour la chirurgie : • emploi d’analgésiques et application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. • les souris nouveau-nées anesthésiées seront gardées sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage initiale. • surveillance pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence. Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour les mesures auditives : • Les mesures auditives sont réalisées sur des souris anesthésiées, application d’un gel ophtalmique. A la fin des enregistrements, les souris seront placées dans des cages sur un tapis chauffant, et surveillées jusqu’à leur réveil complet. Un gel nutritif et hydratant sera disposé dans les cages d’hébergement. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort. Pour l’exposition sonore : La procédure ne provoque ni douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste . • Avant l'exposition au bruit, les souris sont placées dans la cage d'exposition pendant 15 minutes par jour pendant une semaine afin de s'y habituer et d'éviter un stress chez les animaux. • Pendant le traumatisme sonore, les animaux seront surveillés pour s’assurer que les animaux ne présentent aucun signe de douleur aiguë immédiate ni détresse comportementale manifeste. • Surveillance et si nous observions l’atteinte d’un point limite, l’animal serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec des souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris en post natal. : Pendant les 8 premiers jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. Les chirurgies de l’oreille interne seront réalisées sur des nouveaux nés, 2 jours après la naissance. Les traumatismes sonores et les tests auditifs seront réalisés à l’âge adulte.

Toutes les souris subissent une chirurgie préliminaire de vingt minutes, puis deux séances de trente minutes de vidéo-oculographie sur animal éveillé pour mesurer leurs réflexes de stabilisation du regard. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole. Beaucoup sont sourdes et tournent en rond sans arrêt, ce que le porteur classe en "phénotype dommageable" tout en affirmant qu'elles sont "parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement" et ne demandent pas de soins particuliers. Le projet ne poursuit pas de question scientifique propre, il met une plateforme de mesure à disposition d'équipes extérieures qui y font phénotyper leurs lignées de souris sourdes ou vestibulaires.

Objectifs

Ce projet porte sur la quantification comportementale des réflexes vestibulaires et de souris présentant des suspicions de troubles vestibulaires et auditifs. Les pathologies vestibulaires sont caractérisées par des épisodes imprévisibles de vertiges accompagnés de déséquilibres oculomoteurs et posturaux. Les pathologies vestibulaires chroniques sont très invalidantes et conduisent à un isolement psychologique et social. La prévalence des vertiges en clinique est très importante, de l'ordre de 20 à 30%, et augmente avec l'âge. Les vertiges vestibulaires peuvent être liés à des atteintes du système nerveux périphérique et notamment des organes vestibulaires de l'oreille interne ou du nerf cochléo-vestibulaire. Les pathologies touchant l’oreille interne ont souvent des conséquences auditives et vestibulaires. Alors que les surdités partielles ou totales sont facilement identifiées et mesurées expérimentalement chez la souris, les troubles vestibulaires sont difficiles à identifier et rarement quantifiés. Chez l’homme, le meilleur test consiste à mesurer les réflexes vestibulo-oculaires par vidéo-oculographie, une pratique réalisée dans la plupart des centres ORL. Chez la souris, cette même technique qui permet la quantification des troubles vestibulaires est une expertise rare qui demande du matériel couteux. De nombreuses équipes travaillant sur des pathologies ORL nous contactent donc afin de bénéficier de notre expertise et de notre plateforme intégrée de vidéo-oculographie permettant de réaliser des tests comportementaux vestibulaires. Ce projet générique destinée à permettre le phénotypage de différentes souris sur notre plateforme expérimentale utilisera un total maximum de 720 souris sur 5 ans. Ce nombre permettra de couvrir les besoins d'au moins 7 études sur la période.

Bénéfices attendus

Les pathologies vestibulaires sont très invalidantes. De nombreuses pathologies congénitales d'origine génétiques conduisent chez l'enfant à des surdités qui sont détectées et traitées par des implants cochléaires, et depuis peu par thérapie génique. Dans la plupart des cas, seule la partie auditive de ces pathologies est prise en compte par l'entourage et les médecins, les aspects vestibulaires étant imparfaitement diagnostiqués et évalués. Alors que de nombreux modèles murins sont développés pour mimer les pathologies humaines et font l'objet de tests de thérapie génique, il est essentiel d'évaluer si ces thérapies peuvent également fonctionner sur les organes vestibulaires et permettre in fine une récupération des fonctions sensorimotrices et cognitives associées à ces déficits congénitaux.

Procédures

Tous les animaux (n=720) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont phénotypés à l'aide de tests sensorimoteurs: les réflexes de stabilisation du regard sont mésurées par vidéo-oculographie afin de mesurer précisément les fonctions vestibulaires et oculomotrices. Ces tests durent 2 fois 30 minutes et sont effectués chez la souris éveillée. Des tests locomoteurs et posturaux d'une durée totale de 6 minutes sont également effectués 2 fois chez la souris éveillée, afin de mesurer leur équilibre.

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement déficientes vestibulaires présentent parfois des hyper activités ou locomotion anormales (circling) ce qui constitue des nuisances les classant en phénotype dommageable. Elles sont également fréquemment sourdes ou mal entendantes. Elles sont cependant parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement et ne nécessitent pas de soins particuliers. Ces déficits auditifs et locomoteurs constitent un point d’attention pour la gestion et le cas échéant le suivi plus particulier de ces animaux. Le traitement spécifique pour réduire ces nuisances consiste en une restauration de la fonction vestibulaire par thérapie génique qui fait l'objet d'une partie de l'étude de phénotypage, mais qui ne s'appliquera qu'à une partie des lots.

Devenir

Les souris, le plus souvent mutants génétiques et sujets de thérapie génique, doivent être euthanasiées en fin de protocole. Le cas échéant, après la mise à mort, des analyses post-mortem validant les effets des traitements seront réalisés.

Remplacement

Afin d'évaluer les déficits sensorimoteurs associés à des pathologies de l'oreille interne et de tester l'efficacité de thérapie génique, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, et une estimation des capacités maximales de tests offertes par notre plateforme, il est donc susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères, c'est le modèle animal privilégié pour les études génétiques et la mise au point de traitement de thérapie génique. L'utilisation de lignées génétiquement altérées permet de reproduire les pathologies génétiques conduisant à des surdités et pathologies vestibulaires congénitales chez l'homme, afin de développer des thérapies ciblées. Les tests sensorimoteurs sont effectués sur des animaux plus âgés que 6 semaines. Les réflexes oculomoteurs et locomoteurs étudiés se développent en effet au cours des 4 premières semaines de développement post-natal, et sont considérés comme acquis et matures chez l'ensemble des individus après 6 semaines.

Tuées pour que leurs yeux soient prélevés et l'innervation de leur cornée examinée, 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral leur est injecté dans la glande lacrymale et dans la cornée, avec des sutures posées dans la joue, puis un mois plus tard la surface de leur œil est abrasée ou le nerf cornéen sectionné pour mimer une blessure. Le porteur indique que les souris se frottent et peuvent perdre deux ou trois points de suture par joue, ce qui augmente le risque d'infection, et compare la douleur des 72 heures suivant l'abrasion à celle d'un grain de sable dans l'œil. Il conclut que la souris est "le seul modèle" permettant d'explorer cette maladie rare dans son ensemble.

Objectifs

L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neurodégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de thérapies innovantes constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. L’objectif du projet serait donc d’aider à la croissance de ces nerfs contenus dans la cornée qui auront été altérés par la maladie. Or, la repousse des nerfs une fois altérés est un processus long (plusieurs semaines). Le but ici est d’accélérer ce processus en se focalisant sur le facteur responsable de la repousse des nerfs. L’hypothèse de l’équipe repose sur la stimulation de la production d’un facteur particulier déjà contenu dans les larmes mais en quantité limitée. Pour atteindre une production satisfaisante et un effet bénéfique sur les nerfs de la cornée, la technique utilisée est l’injection du facteur en question dans la glande lacrymale (responsable de la production des larmes) ainsi que l’injection de son récepteur dans la cornée. Ainsi, en produisant les larmes, la glande lacrymale produira une grande quantité du facteur d’intérêt qui sera contenu dans les larmes. Ces dernières, une fois à la surface de l'œil, permettront au facteur de se lier directement à son récepteur qui aura été injecté au préalable dans la cornée. On parle donc de double injection (ou de double thérapie génique).

Bénéfices attendus

Dans ce contexte, notre approche innovante de thérapie génique ciblant à la fois la glande lacrymale et l’innervation de la cornée vise à induire la repousse des nerfs de la cornée. Ce travail pourrait ainsi ouvrir la voie à une stratégie thérapeutique curative pour la kératite neurotrophique (KN), en s’attaquant directement au manque d’innervation à l’origine de la maladie rare. Enfin, ce travail devrait aboutir à des publications scientifiques dans des revues à comité de lecture, et potentiellement à un ou plusieurs dépôts de brevet, assurant ainsi une valorisation scientifique et technologique du projet.

Procédures

Un vecteur viral est comme une petite « enveloppe » qu’on utilise pour transporter un message (le gène qu’on veut introduire) vers une cellule afin de soigner une maladie. Celui-ci va être injecté dans un organe cible, c’est ce qu’on appelle la thérapie génique. Dans notre cas, on réalise une injection dans la glande lacrymale, qui sécrète les larmes, couplée à une injection dans la cornée, communément réalisée chez l’Homme avec des antibiotiques. Pour cela, les animaux seront anesthésiés puis recevront une dose d’antidouleur. Les injections se réalisent en une fois pour une durée totale de 7 minutes environ. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil. Un mois après l’injection, on vient réaliser une blessure sur l’œil afin de mimer une maladie ou un accident : l’abrasion ou l’axotomie. Ces deux techniques (5min environ) ne traversent par la barrière protectrice de l'œil, elles restent donc des méthodes n’impliquant pas de défauts profonds à l'œil. Celles-ci sont réalisées en une seule fois sur animaux également endormis ayant à leur tour reçu une dose d’antidouleur. Les souris sont suivies de façon journalière après les procédures afin de prévenir les risques. Les prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne sont effectués en amont et en aval des chirurgies. Le test de sensibilité est réalisé 3 jours consécutifs afin d’avoir une moyenne la plus juste. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention.

Impact sur les animaux

Des résultats antécédents au projet ont montré que l’injection dans la cornée n'entraîne pas de traumatisme au niveau de la cornée. Toutefois, la qualité des injections peut varier en fonction de l’expérimentateur ; les souris seront donc scrupuleusement surveillées dans les jours suivant la chirurgie. En revanche, les sutures effectuées au niveau de la joue de la souris peuvent entraîner des sensations de tiraillement, malgré la réalisation minutieuse des points. Il arrive que les souris se frottent, ce qui peut provoquer la perte de deux ou trois points par joue, augmentant ainsi le risque d’infection de la plaie. C’est précisément pour cela que les animaux sont sous surveillance pendant les jours qui suivent l’opération. La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu. L’axotomie quant à elle ne détruit pas la surface de la cornée, la dégénérescence des fibres au centre de la cornée n’induit pas de douleur mais au contraire une perte de sensibilité. Pour le test de sensibilité cornéenne, les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 min, une fois par jour, pendant 3 jours consécutifs sur plusieurs semaines afin d’évaluer la régénération de l’innervation (4 +/- 1 semaines).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet des procédures sur l’innervation de la cornée.

Remplacement

La souris comme modèle de pathologie humaine, telle que la kératite neurotrophique, est un excellent système intégrant la complexité des interactions entre les différents éléments de la cornée (nerfs, cellules de surface et larmes). Ces intéractions, à l’origine de l’équilibre naturel de l’œil, se mettent en place durant des mois, et impliquent de nombreux types de cellules, elles ne peuvent donc pas être mimées in vitro (hors organismes vivants, c'est-à-dire dans des boîtes de pétri). Seuls les mammifères présentent la diversité des échanges cellulaires et moléculaires entre les structures de l'œil. Le modèle souris présentant une atteinte des nerfs de la cornée est donc le seul modèle qui permet d’explorer la maladie de la KN dans son ensemble (morphologie, aspect, chimie…). Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour étudier la complexité du projet et la pathologie. Le modèle murin présente l’avantage d’être peu coûteux et de se développer rapidement. Les souris que nous utiliserons présentent une forte variabilité génétique, reflétant celle observée chez les patients humains.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux (ici 189 souris) tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.

Raffinement

Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Puisque les animaux seront soumis à des manipulations et contentions journalières rapides (≤2min) nécessaires aux expérimentations, nous mettrons en place une période d’habituation afin de limiter l'angoisse et familiariser les animaux aux expérimentateurs. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute altération. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée des injections, de l’abrasion cornéenne, et de l’axotomie avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. Un suivi quotidien avec la grille de scoring permettra qu’en cas de douleur l’animal soit immédiatement pris en charge. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée. Nos précédentes expériences ont montré qu’une marge supplémentaire de 5 % est nécessaire afin de pallier les pertes potentielles liées à l’anesthésie, ainsi qu’aux complications post-opératoires telles que le développement d’ulcères cornéens. Les animaux développant de telles complications sont retirés de l’étude, les points limites sont décrits dans la procédure. Les animaux en sus seront intégrés aux expérimentations en cours, permettant ainsi d’augmenter la puissance statistique des analyses.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des humains. Nous étudions des souris âgées de 12 semaines car c’est à cet âge que la cornée est mature et que l’animal a dépassé la puberté.

376 souris génétiquement modifiées pour développer un glaucome vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque jour pendant 28 jours, elles reçoivent un collyre conservateur dans les yeux, avec des prélèvements de larmes et des mesures de sensibilité cornéenne répétées trois jours de suite sur animaux vigiles, puis elles sont tuées pour que leurs yeux soient analysés. Leurs yeux peuvent grossir jusqu'à empêcher la fermeture des paupières, et l'animal est alors tué immédiatement. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne suffisent pas et que l'action du conservateur doit être observée sur un œil complet et fonctionnel, ce qui rend selon lui ces expériences "indispensables".

Objectifs

Les collyres, ou gouttes pour les yeux, sont très utilisés pour traiter certaines maladies comme le glaucome. On y ajoute souvent des conservateurs pour que le produit reste efficace et sans danger plus longtemps. Le glaucome est une maladie fréquente après 40 ans, qui touche jusqu’à 10 % des personnes après 70 ans. Elle abîme lentement le nerf optique, ce qui réduit le champ de vision, jusqu’à la cécité si elle n’est pas traitée à temps. Le traitement repose sur l’usage quotidien de collyres dont beaucoup contiennent des conservateurs. Mais au bout de quelques mois, beaucoup de patients ressentent une gêne : la surface de l’œil devient moins sensible, et les opérations deviennent plus difficiles à cause d’une inflammation. Nos recherches ont montré que les conservateurs peuvent abîmer les nerfs de la cornée, la surface transparente de l'œil, ralentissant la régénération naturelle de cette zone fragile. Cela rend l’œil plus vulnérable, et peut aller jusqu’à former des plaies (ulcères), nécessitant parfois une greffe de cornée : une opération lourde, avec des résultats souvent temporaires. Notre objectif est de mieux comprendre les effets de ce conservateur sur la cornée dans un contexte de glaucome. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris qui développe la maladie de façon naturelle et progressive, comme chez l’humain. Nous mesurerons différents indicateurs, comme la sensibilité de la cornée, la pression dans l’œil, ou encore la qualité des larmes. D’autres examens, comme des photos du fond de l’œil ou des tests de réponse à la lumière, permettront de suivre l’évolution de la maladie. Grâce à cette étude, nous espérons mieux évaluer les effets secondaires des collyres avec conservateurs et, à terme, améliorer les traitements pour les patients atteints de glaucome.

Bénéfices attendus

Dans le glaucome, surtout lorsque les patients sont traités avec des collyres contenant des conservateurs, la perte de vision peut évoluer lentement. Cela donne un certain délai pour agir, mais une fois les lésions installées, elles sont irréversibles. Aujourd’hui, les options de traitement restent limitées : certains collyres permettent de contrôler la pression dans l’œil au début de la maladie, mais quand celle-ci progresse, la vision peut être fortement altérée. Dans certains cas, les collyres irritants abîment aussi la surface de l’œil, ce qui complique les soins. Cela peut mener à des atteintes de la cornée graves, parfois nécessitant une greffe. Mais cette solution reste lourde, avec un risque de rejet et un bénéfice souvent temporaire. Notre projet vise à mieux comprendre les effets des conservateurs présents dans les gouttes et du glaucome sur la cornée. En identifiant les changements précoces au niveau cellulaire, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements plus ciblés et mieux tolérés. Ces recherches pourraient donner lieu à des publications scientifiques et peut-être à des dépôts de brevets, valorisant les résultats du projet à l’échelle médicale et technologique.

Procédures

Les souris génétiquement modifiées sont génotypées à l'aide d'un morceau de queue de moins de 2mm prélevé avant l’âge de 10 jours, le prélèvement dure environ 1min. Le projet implique ensuite l’administration quotidienne de gouttes (pendant 28 jours), ainsi que la réalisation de prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne avant et après traitement, sur des animaux vigiles. La mesure de la sensibilité se fait sur 3 jours afin de faire une moyenne des résultats. Ainsi, ces procédures sont de courte durée. Les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 minutes maximum par animal, mais leur caractère répété nécessite une attention particulière. Afin de limiter le stress induit par la contention, les souris seront habituées progressivement à la manipulation dès le sevrage. Cette habituation permet de réduire considérablement les réactions de défense, en favorisant une meilleure tolérance aux gestes techniques. Les traitements oculaires sont appliqués de manière non-douloureuse, avec une goutte de collyre déposée délicatement sur chaque œil pendant 30 secondes. Les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté, afin d’assurer une gestuelle rapide et précise, minimisant l’impact sur les animaux. Les animaux seront mis à mort pour prélever les yeux qui seront ensuite analysés. Aucun prélèvement invasif ne sera effectué sur animaux vivants.

Impact sur les animaux

Le glaucome est une maladie chronique de l’œil qui évolue lentement et peut entraîner une perte totale de la vue s’il n’est pas traité. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris génétiquement modifié qui présente une mutation sur le gène jouant un rôle essentiel dans le développement de l’œil. Ce modèle est bien connu grâce à des recherches précédentes. Les souris glaucomateuses présentent une perte progressive de la vue, mais cela n’affecte ni leur santé générale ni leur espérance de vie. Chez la souris, la vue n’est pas le sens principal, et cette baisse de vision n’a pas de conséquences visibles sur leur comportement : elles continuent à manger, interagir normalement et prendre soin de leurs petits. Les souris peuvent développer une augmentation anormale de la taille des yeux, comme cela peut arriver chez les personnes atteintes de glaucome. Si les yeux deviennent tellement gros que l’animal ne peut plus fermer les paupières, il ne poursuivra pas l'expérimentation et sera euthanasié immédiatement pour éviter toute souffrance. Les traitements utilisés lors de cette étude sont couramment utilisés chez l’humain, agissant uniquement sur l’œil et n’étant pas douloureux. Toutes les expériences seront menées sur des animaux jeunes (moins de 5 mois), avant que la perte de vision ne devienne importante. Les souris recevront quotidiennement des collyres et seront manipulées brièvement pour ces soins. Ces gestes peuvent générer un peu d’angoisse, mais un programme d’habituation est prévu pour qu’elles s’y adaptent en douceur. Les manipulations seront aussi espacées et limitées dans le temps, afin d’éviter un stress inutile ou des anesthésies répétées, en accord avec les bonnes pratiques en matière de bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet du conservateur sur les différentes structures du segment antérieur (cornée, iris, cristallin).

Remplacement

Il est encore très difficile de reproduire toute la complexité d’un organe comme l’œil en laboratoire, notamment ses différentes structures et leur fonctionnement coordonné. C’est pourquoi les tests uniquement réalisés « in vitro » (c’est-à-dire sur des cellules en culture) ne suffisent pas pour étudier certaines maladies oculaires. Dans notre projet, nous utilisons un modèle animal qui développe le glaucome. Ce modèle est essentiel car il permet de mieux comprendre comment la maladie évolue dans un organisme vivant. De plus, les conservateurs présents dans les collyres peuvent avoir des effets secondaires sur l’œil. Pour les étudier de manière fiable, il est nécessaire d’observer leur action dans un contexte réel, c’est-à-dire sur un œil complet et fonctionnel, avec tous ses mécanismes de défense, d’irrigation et de régulation. C’est pour cela que les expérimentations doivent se faire sur un organisme vivant : elles sont indispensables pour comprendre précisément l’impact de ces substances dans un cadre pathologique comme celui du glaucome.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été soigneusement réfléchi. Il a été calculé à l’avance afin d’avoir assez d’animaux pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique, tout en évitant de multiplier inutilement les tests. Cela permet de limiter le nombre d’animaux tout en garantissant que les expériences n’auront pas besoin d’être répétées. Les analyses prévues permettront de comparer les différents groupes traités de manière rigoureuse, en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Au total, sur toute la durée du projet (42 mois), un maximum de 376 souris sera utilisé, avec une petite marge de sécurité de 16 animaux supplémentaires, pour pallier d’éventuelles pertes imprévues. Par ailleurs, des souris mâles et femelles seront incluses afin d’assurer une bonne représentativité dans les résultats.

Raffinement

Pendant la période d’adaptation, les souris seront suivies chaque jour par les soigneurs, logées par petits groupes (au moins deux par cage) et bénéficieront d’un environnement confortable et stimulant. La mise en place de points limite permet de retirer les animaux de l'expérimentation afin d'éviter toute forme de souffrance (physique et psychique). Pour les examens comme le fond d’œil, la mesure de la pression oculaire, les animaux seront endormis grâce à une anesthésie générale. Ils ne ressentiront donc ni douleur ni gêne pendant les procédures. De plus, les souris ne seront pas gardées au-delà de 16 semaines, ce qui permet d’éviter les effets tardifs du glaucome, notamment la perte de vision qui apparaît habituellement vers 8 mois.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car c’est un modèle bien connu, couramment utilisé en recherche médicale, notamment pour les maladies de l’œil. Sa petite taille, sa reproduction rapide et le fait qu’elle partage de nombreuses similarités génétiques avec l’être humain en font un outil précieux pour mieux comprendre certaines pathologies. Dans notre étude, nous utilisons des souris transgéniques porteuses d’une mutation connue pour provoquer un glaucome, une maladie oculaire fréquente chez l’humain. Ce modèle a déjà été bien étudié et permet de reproduire les signes du glaucome de manière fiable. Les expériences seront réalisées sur des souris jeunes, âgées de moins de 16 semaines. À cet âge, les animaux sont en bonne santé, ne présentent pas encore de perte de vision liée à la maladie, et les examens seront effectués sans douleur, sous anesthésie. Ce choix permet également de limiter le stress et d’éviter toute souffrance liée à l’évolution de la maladie. Ainsi, ce modèle permet d’étudier de manière précise l’impact de certains traitements sur l’œil, dans un cadre contrôlé, tout en garantissant des conditions éthiques et respectueuses du bien-être animal.

123 cobayes vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue, 29 d'entre eux devant être réutilisés dans un autre modèle d'otite parce que leurs deux tympans se sont refermés spontanément avant le traitement. Chacun subit une perforation des tympans sous anesthésie générale, une trentaine une seconde intervention, puis onze semaines d'examens otoscopiques hebdomadaires, trois mesures d'audition et deux à trois prélèvements de microbiote, chaque fois sous anesthésie. L'objectif est de tester des gels et des patchs chargés de probiotiques pour refermer un tympan perforé sans chirurgie, une approche destinée en priorité aux enfants des pays mal équipés. Le porteur qualifie ces méthodes de moins invasives et moins douloureuses actuellement disponibles, et conclut que le recours à l'animal est "incontournable".

Objectifs

L'otite moyenne chronique est la maladie infantile la plus fréquente dans le monde. Elle se caractérise par des écoulements auriculaires dus à une perforation persistante du tympan. Cette membrane sépare l'oreille moyenne de l'oreille externe. Sa fonction principale est la transmission des sons. L'otite moyenne chronique est une cause fréquente de perte auditive, voire de décès dûs à des complications intracrâniennes, notamment dans les pays en développement. L'administration d'antibiotiques à large spectre induit des effets secondaires et est en partie responsable de l'augmentation de la résistance aux antibiotiques. Si la perforation ne se répare pas d'elle-même, une intervention chirurgicale (sous anesthésie générale) est nécessaire mais son accès peut être compliqué dans les pays en développement qui ne sont pas bien équipés (par exemple, absence de loupe binoculaire pour la chirurgie). Ce projet propose une nouvelle approche de soins combinant une procédure simple de réparation du tympan et une alternative aux antibiotiques. Des biomatériaux actifs de type gel ou patch avec des propriétés mucoadhésives et cicatrisantes faciles à administrer et contenant des probiotiques seront introduits dans l’oreille pour fermer la perforation du tympan et ainsi faciliter sa cicatrisation tout en restaurant le microbiote local. Nous faisons l'hypothèse qu'une telle stratégie sans chirurgie associée à des probiotiques pourrait être une approche pertinente pour traiter l’otite moyenne chronique chez l'enfant et prévenir les récidives d'otites. Cette étude a pour objectif de tester différentes stratégies de réparation tympanique (gel ou patch ou patch+gel, avec ou sans probiotiques) sur un modèle animal afin de trouver la solution la plus adaptée et efficace possible.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’otite moyenne chronique chez l'enfant sont confrontés à plusieurs limitations : résistance croissante aux antibiotiques, accès à des chirurgiens et des centres médicaux experts, procédures coûteuses et longues, risque de complications anesthésiques, inégalité d'accès aux traitements dans les friches médicales et les pays en développement. Compte tenu de la forte prévalence de cette pathologie chez les enfants et de son impact négatif sur la qualité de vie et le développement de ces jeunes patients, il est crucial d'ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à développer un dispositif biomédical pour régénérer le tympan perforé en utilisant des gels et des patchs aux propriétés mucoadhésives et cicatrisantes associés à des probiotiques. Ce projet est particulièrement novateur car il va au-delà de l'état actuel de l'art. À notre connaissance, il n'existe pas de système permettant simultanément l'administration de probiotiques dans l'oreille moyenne et la réparation du tympan. En cas de succès, ce projet serait poursuivi par des études cliniques en collaboration avec des hôpitaux pédiatriques. L'approche probiotique locale pourrait également être proposée en cas de perforation recente dans les pays en développement.

Procédures

Les cobayes seront soumis à différents gestes techniques : une chirurgie sans incision sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes et pour une trentaine de cobayes une deuxième chirurgie sans incision de courte durée (10 minutes) après récupération complète de la première chirurgie ; une mesure de l’audition sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes, répétées 3 fois sur 11 semaines (procédure non douloureuse) ; des prélèvements du microbiote du conduit auditif et de l’oreille moyenne sous anesthésie générale, répétés deux à trois fois, d’une durée de quelques secondes (procédure non douloureuse) ; une administration des traitements sous anesthésie générale, par voie locale, d’une durée de 5 minutes ; un examen otoscopique du tympan une fois par semaine sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes pendant 11 semaines (procédure non douloureuse).

Impact sur les animaux

Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. La perforation du tympan peut entrainer une douleur faible à modérée qui sera traitée par des antalgiques. Elle peut aussi induire une perte auditive légère. Dans des cas exceptionnels, un écoulement purulent de l’oreille qui marque une infection peut apparaitre.

Devenir

Tous les cobayes inclus dans les groupes expérimentaux au moment du traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Des analyses histologiques sur les organes d’intérêt seront réalisées. Les animaux dont les 2 tympans se sont refermés spontanément avant l’application du traitement seront réutilisés dans une procédure modérée dans un autre modèle d’otite. Cela concernera 29 cobayes. La décision sera prise par notre vétérinaire référent.

Remplacement

L’oreille est un organe complexe et il n'existe pas, à ce jour, de modèle cellulaire permettant de reproduire le tympan qui est une membrane séparant deux compartiments aériens. Le seul moyen permettant d’étudier des traitements pour soigner l’otite moyenne chronique impliquant la cicatrisation du tympan perforé reste l’utilisation d’un modèle animal vivant. Le maintien d’une bonne audition est aussi un paramètre primordial et seul l’animal nous permet de mesurer et d’évaluer la fonction auditive. Ainsi, le recours à l’animal est incontournable pour évaluer des traitements innovants sur la capacité régénérative du tympan et la fonction auditive.

Réduction

Dans chaque groupe, le nombre d’animaux a été fixé afin de s’affranchir des variations individuelles et garantir la validité statistique de l’étude. La mise au point permettra de valider le modèle de perforation chronique de la membrane tympanique et nécessitera au maximum 25 animaux. Le tympan est une membrane avec des fortes capacités de régénération et un modèle chronique de perforation (> 8 semaines) est difficile à obtenir. Dans la littérature, le pourcentage de succès varie de 0 à 84% selon les études Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui a permis de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Une étude pilote avec un nombre limité d’animaux permettra la mise au point du modèle avant de tester les différents traitements. Un plan d’expérience rigoureux a été pensé afin d’optimiser les groupes expérimentaux et réduire le nombre d’animaux. Si les traitements ne présentaient pas l’efficacité escomptée, la procédure serait arrêtée. Certains cobayes dont les tympans se seront refermés spontanément et qui par conséquent ne seront pas inclus dans les groupes expérimentaux seront réutilisés dans une autre procédure.

Raffinement

La semaine précédant l’expérimentation, les cobayes seront manipulés afin de les habituer au contact de l’expérimentateur et ainsi minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. Chaque geste chirurgical sera court et réalisé sous anesthésie générale par un chirurgien ORL expert. D’après notre expérience, l'altération potentielle de la fonction auditive n'entraine pas de trouble du comportement ni d'agressivité chez le cobaye. Les points limites seront déterminés, à partir d’une grille d’évaluation de l’état général de l’animal, pour détecter une éventuelle souffrance, détresse ou inconfort et seront strictement appliqués. Des mesures de gestion de la douleur seront mises en place en fonction du score avec un protocole antalgique adapté. Les cobayes seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi afin de favoriser des comportements naturels.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est le cobaye. C’est une espèce très utilisée dans la littérature en recherche ORL. L’anatomie du tympan est similaire à celle de l’homme et la surface du tympan est adaptée à la réalisation des gestes techniques. Son conduit auditif court permet un accès facile et une bonne visualisation du tympan. Des cobayes adultes, avec un poids entre 300 et 350 grammes seront utilisés. La taille du tympan chez le cobaye adulte est plus adaptée pour ce travail.