Troubles sensoriels

Rasées sur le dos, puis enduites chaque jour pendant cinq jours d'une crème qui provoque rougeurs, épaississement de la peau et desquamation, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la peau et des organes. Vingt d'entre elles sont gavées trois jours de suite, quarante reçoivent des injections quotidiennes d'un anticorps ciblant la molécule CD146 ou d'un placebo. Le projet cherche à savoir si cette molécule intervient dans le psoriasis et si la bloquer soulage la maladie, ainsi que l'athérosclérose qui l'accompagne souvent. Le porteur cite des études cliniques déjà menées sur des patients psoriasiques, les juge descriptives, et affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'animal" pour étudier cette maladie.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la physiopathologie du psoriasis et à évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Bénéfices attendus

Plusieurs études cliniques portant sur des patients psoriasiques ont été menées antérieurement pour évaluer les niveaux d’expression de la molécule d'adhésion cellulaire CD146/MCAM sur des biopsies de peau, quantifier les concentrations de sa forme soluble dans le sang ou pour étudier les différentes sous-populations leucocytaires exprimant ce marqueur cellulaire dans le sang. Cependant, ces études restent descriptives et ne permettent pas d’évaluer le rôle du CD146 global, du CD146 endothélial ou du CD146 exprimé par certaines cellules du système immunitaire sécrétrices de la cytokine proinflammatoire interleukine 17 dans la pathogenèse du psoriasis. Contrairement à notre projet qui compare des souris mutées ou non pour CD146, ces études ne permettent pas d’étudier les voies de signalisation régulées par CD146. De plus, ces études cliniques n’ont pas évalué l’effet de thérapies ciblant CD146. Ainsi, ce projet permettra d'identifier des mécanismes moléculaires régulés par CD146 dans la pathogenèse du psoriasis. Il permettra aussi d'évaluer dans un modèle murin le bénéfice thérapeutique d'anticorps monoclonaux ciblant CD146 pour traiter le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Procédures

Tous les animaux du projet seront rasés une fois sur le dos (2 minutes par souris). Ils recevront un traitement sous la forme d'une application quotidienne de crème sur le dos pendant 5 jours (30 secondes par application). 20 souris seront gavées avec une solution diluée dans de l'huile de maïs une fois par jour pendant 3 jours (30 secondes par gavage). 40 souris recevront des injections quotidiennes d'un traitement ciblant CD146 ou un placebo pendant 5 jours (30 secondes par injection). Un prélèvement sanguin sera effectué sur toutes les souris (30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

20 souris seront gavées une fois par jour pendant 3 jours avec une solution à base d'huile de maïs. Bien que le gavage ne soit pas douloureux, cela pourrait tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de sa répétition et de la contention. Les souris seront rasées sur le dos, ce qui pourrait générer un stress. L'application d'un traitement à base de crème sur la peau des souris pour induire le psoriasis devrait entraîner une inflammation associée à à l'apparition de rougeurs, un épaississement de la peau et une desquamation en plaques. Ce traitement peut entraîner une déshydratation et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions l'implication de la molécule d'adhésion cellulaire CD146, également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la pathogenèse du psoriasis. Cette pathologie autoimmune implique différents types cellulaires (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, cellules du système immunitaire), avec de nombreuses interactions biochimiques et cellulaires. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle in vitro, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier cette maladie.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires pour générer les effectifs de chaque groupe utilisé dans les procédures expérimentales, nous utiliserons des souris issues d'accouplements homozygotes et nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles, le psoriasis touchant chez l'humain autant les hommes que les femmes. En l'absence de toute étude antérieure sur le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 dans le psoriasis chez la souris, nous évaluerons son implication dans cette pathologie en comparant des groupes de 10 souris entre eux, effectif minimal déterminé par une approche statistique pour mettre en évidence de potentielles différences significatives.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux issus des établissements d'élevage. Les souris seront observées avant d’initier le protocole et les animaux présentant des symptômes type infection seront écartés des protocoles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés. Les animaux seront pesés une fois par jour et observés deux fois par jour pour prévenir tout risque de déshydratation liée à leur traitement. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement. Les animaux disposeront de nestlets, nids à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l ’environnement et matériaux de nidification, ainsi que de tunnels afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, sa manipulabilité génétique permet d'analyser l'effet de mutations du gène cible sur la pathogenèse du psoriasis. La souris permet également d'évaluer l'effet d'un traitement thérapeutique ciblant une protéine d'adhésion cellulaire potentiellement impliquée dans le psoriasis et une comorbidité associée, l'athérosclérose. Les souris utilisées seront âgées entre 8 et 16 semaines. Un âge compris entre 8 et 16 semaines est couramment utilisé dans la littérature pour ce modèle induit de psoriasis car l'épaississement de l'épiderme, l'érythème et la desquamation sont clairement visibles à cet âge là. De plus, cette tranche d'âge a permis de mettre en évidence dans plusieurs études les effets thérapeutiques chez la souris de différents traitements utilisés pour soigner le psoriasis chez l'homme.

Opérées de la cochlée entre leur sixième et leur neuvième jour de vie pour y recevoir un vecteur viral, 504 gerbilles de Mongolie attendent au moins huit semaines avant une seconde intervention dont elles ne se réveillent pas. Pendant celle-ci, leurs potentiels évoqués auditifs sont enregistrés de quatre à douze heures sous anesthésie entretenue par réinjections. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour la totalité de l'effectif, et le porteur ne mentionne comme nuisances que la douleur suivant l'injection intracochléaire et le stress lié aux piqûres. Toutes sont tuées pour que leur oreille interne et leur cerveau soient examinés au microscope, l'objet étant de préparer un implant cochléaire fonctionnant à la lumière plutôt qu'à l'électricité.

Objectifs

En 2050, près de 2,5 milliards de personnes dans le monde auront des problèmes d’audition. Pour 700 millions d’entre elles, ces problèmes seront très graves. Aujourd’hui, la meilleure solution pour les personnes qui n’entendent presque plus, c’est l’implant cochléaire électrique. C’est un petit appareil placé dans l’oreille interne. Il capte les sons et les transforme en courants électriques pour faire travailler directement les nerfs de l’oreille. Mais il y a un souci : l’électricité stimule trop large. Elle excite beaucoup de nerfs en même temps, ce qui fait perdre la précision des sons. Par exemple, dans un restaurant bruyant ou dans une classe, c’est difficile de comprendre une conversation. Pour améliorer ça, nous travaillons sur une nouvelle idée : utiliser la lumière au lieu de l’électricité. Comment ? On rend les nerfs sensibles à la lumière grâce à des petites protéines spéciales. Ensuite, on envoie de la lumière avec des mini-lampes dans l’oreille. Cette lumière active les nerfs, mais de manière beaucoup plus précise, un peu comme un rayon laser au lieu d’un éclair. Grâce à ça, on espère que les personnes entendront beaucoup mieux et comprendront les voix même dans le bruit. Notre projet a deux buts : Trouver la meilleure manière de rendre les nerfs sensibles à la lumière. Savoir exactement quels nerfs réagissent à cette lumière.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, un million de personnes qui ne pouvaient plus entendre utilisent déjà des implants cochléaires électriques. Grâce à ces appareils, la plupart arrivent à comprendre la parole quand il n’y a pas de bruit, par exemple dans une pièce calme. Mais dès qu’il y a du bruit autour – dans la rue, un restaurant, une salle de classe ou un bureau – ça devient très difficile. Parfois, ils n’arrivent presque plus à comprendre ce qu’on leur dit. Et il y a un autre problème : ils ne peuvent pas vraiment profiter de la musique, car les sons sont trop simplifiés. Pour améliorer ça, nous développons un implant cochléaire qui utilise la lumière. Cette nouvelle technologie devrait permettre d’entendre plus clairement, même quand il y a du bruit, et peut-être aussi de mieux profiter des sons comme la musique. Pour y arriver, il faut deux étapes importantes : Trouver la meilleure façon de rendre les nerfs de l’oreille sensibles à la lumière. Comprendre comment ces nerfs réagissent à la lumière pour pouvoir les contrôler de manière très précise. Ces recherches sont essentielles pour amener un jour cette nouvelle technologie aux patients et leur rendre une audition la plus naturelle possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales. La première procédure consiste à injecter un vecteur viral dans les cochlées des animaux entre le sixième et le neuvième jour de vie. Cette procédure permettra de photosensibiliser les neurones cochléaires. Cette procédure nécessitera environ 30 minutes par animal, en incluant l'induction de l'anesthésie et le réveil. La seconde procédure chirurgicale sera réalisée au moins 8 semaines après l’injection du vecteur viral, lors d’une procédure durant laquelle les animaux ne se réveilleront pas. Durant cette procédure, les potentiels évoqués auditifs seront enregistrés sur une durée de 4 à 12 heures. L'état de profonde anesthésie sera maintenu par reinjection régulière d'anesthésiant durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les différentes nuisances ont été identifiées: - suite à l’injection intracochléaire à 6-9 jours de vie, douleur post-opératoire; - injection d’antalgiques et anesthétiques : stress

Devenir

À la fin de chaque étape, les animaux devront être euthanasiés (endormis définitivement sans douleur). C’est nécessaire car nous devons analyser leur oreille interne (cochlée) et leur cerveau pour vérifier si la thérapie génique a bien fonctionné. Pour cela, il faut prélever ces organes afin de les examiner au microscope.

Remplacement

Les travaux prévus nécessitent une organisation cellulaire extrêmement complexe, formant un réseau qui ne peut pas encore être reproduit en culture cellulaire ou dans les modèles in silico les plus sophistiqués. Une telle organisation cellulaire complexe ne peut être trouvée que chez d'autres mammifères, tels que les rongeurs. En outre, l'objectif du présent travail est de prédire les performances d'un implant cochléaire optique pour l'homme. Nous devons donc utiliser un modèle animal dont le système auditif est anatomiquement et physiologiquement aussi proche que possible de celui de l'homme. Nous avons donc choisi la gerbille de Mongolie. Les données générées seront partagées avec les scientifiques qui développent des modèles informatiques des voies auditives, ce qui permettra, nous l'espérons, d'utiliser des modèles in silico plutôt que des modèles animaux dans le cadre d'études futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin grâce à un outil statistique. L’objectif est d’utiliser le moins d’animaux possible, tout en s’assurant que les résultats soient fiables. Pour cela, nous avons choisi des critères précis pour garantir que les expériences soient assez puissantes pour montrer un effet réel. Dans ce projet, les deux sexes (mâles et femelles) seront inclus sans faire de distinction.

Raffinement

Le bien-être des animaux est notre priorité pendant toute la durée du projet. Si un animal se retrouve seul, nous ferons en sorte qu’il ne reste pas isolé en le mettant avec d’autres animaux. Au début, un séparateur percé sera utilisé pour qu’ils puissent s’habituer les uns aux autres sans risque. Nous savons que manipuler les animaux peut être stressant pour eux. C’est pourquoi nous allons les habituer doucement à venir d’eux-mêmes sur la main des chercheurs, plutôt que d’être attrapés. Après l’injection (faite très tôt après la naissance), les animaux seront surveillés tous les jours et recevront des médicaments contre la douleur pendant deux jours. Ces médicaments seront donnés après une courte anesthésie (moins de 5 minutes) pour éviter tout stress. Si nous voyons qu’un petit n’est pas bien (par exemple, s’il n’est plus soigné par sa mère), il recevra des soins supplémentaires après avis d’un vétérinaire. Si malgré tout son état ne s’améliore pas, il sera endormi sans douleur. De même, si un animal montre des signes de souffrance plus tard, nous utiliserons une grille d’évaluation spéciale et, après avis du vétérinaire, il recevra des soins ou sera euthanasié.

Choix des espèces

Notre objectif est de savoir si l’implant cochléaire optique pourrait bien fonctionner chez l’être humain. Pour cela, nous devons faire des tests sur un animal qui a une oreille très semblable à celle de l’homme. Nous avons choisi la gerbille de Mongolie, un petit rongeur. Elle entend presque comme nous et sa grande oreille facilite l’accès à la cochlée pour y mettre un implant ou injecter le vecteur viral. Le vecteur viral (qui sert à rendre les nerfs sensibles à la lumière) sera injecté quand les petits ont entre 6 et 9 jours. Pourquoi ? Parce que le traitement marche beaucoup mieux à cet âge. Parce qu’à cet âge, l’os autour de l’oreille n’est pas encore formé, ce qui permet de faire l’injection sans opération lourde. Après 10 jours, cet os se durcit et il faudrait une chirurgie beaucoup plus invasive. Enfin, les mesures (tests) seront faites au moins 8 semaines plus tard, quand les animaux seront adultes et que leur système nerveux sera complètement développé.

Apporter aux autorités sanitaires les preuves d'innocuité exigées avant la mise sur le marché de dispositifs médicaux censés reconstituer le collagène de la peau : 300 rats sains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leur peau. Le dos rasé, chaque animal reçoit le même jour jusqu'à six injections d'hydrogels différents en sous-cutané ou en intradermique, sous anesthésie et après administration d'un analgésique opiacé. Le porteur présente cette accumulation de six produits sur un même individu comme une mesure de réduction qui divise par six le nombre d'animaux utilisés. Il énumère les limites des modèles de peau humaine, explants qui ne survivent que sept à huit jours et échantillons d'abdominoplastie au derme épaissi, pour conclure que l'évaluation chez l'animal reste "nécessaire".

Objectifs

Les traitements contre le diabète, l’obésité (anti-GLP1) ou l’infection par le virus du SIDA (VIH) ont pour effets secondaires une atrophie des tissus adipeux sous-cutanés (lipoatrophie) et un vieillissement cutané (perte de collagène) accéléré. L’infection par d’autres virus chroniques ainsi que certains troubles métaboliques peuvent aussi être à l’origine de ces effets. La perte de collagène est une cause sous-jacente majeure du vieillissement cutané observé chez ces patients. Il est donc nécessaire de développer des thérapies susceptibles de stimuler la régénération cutanée (production de collagène, régénération du tissu adipeux dermique) et de combler les zones atrophiées afin de limiter l’impact structurel. Ces effets secondaires présentent également un impact psychologique délétère qui dégrade fortement la qualité de vie de ces patients. Ce programme de recherche s’intéresse à caractériser chez le rat la régénération tissulaire et la stimulation de la fabrication naturelle de collagène grâce à de nouvelles formulations ou composés (efficacité), et vérifier l’absence de réactions inflammatoires délétères autour du site d’injection (innocuité). Ces études consistent à injecter, en une seule fois, par voie sous cutanée ou intradermique, plusieurs composés sous forme d’hydrogel à potentiel régénérateur de collagène, sur des sites différents d’un même animal, dans le but d’évaluer la réponse induite par la stimulation sur la peau. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse, des prélèvements post mortem de peau, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre la régénération tissulaire dans le temps et de comparer la stimulation induite par différents composés ou formulations (augmentation du collagène, élastine et autres protéines de la matrice extracellulaire). Des prélèvements sanguins longitudinaux seront également possibles pour suivre certains biomarqueurs de l’activité tissulaire. La production de collagène supplémentaire est étudiable chez l’animal sain, et ces études seront donc réalisées sur animaux sains, en amont d’éventuelles études sur animaux présentant des anomalies cutanées comparables à celles observées chez les patients. Cela permettra donc de cribler au mieux plusieurs composés avec le minimum d’impact sur le bien-être animal, avant d’envisager des études plus impactantes pour le bien-être animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles formulations et composés pour une utilisation dont l’innocuité et l’efficacité doivent être testées avant des essais cliniques. Les expériences menées chez le rat, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettront l’introduction en clinique de nouvelles stratégies pour la régénération tissulaire cutanée dans le cadre des lipoatrophies. Un bénéfice supplémentaire sera de sélectionner un nombre réduit de composés candidats qui seront testés sur des modèles pathologiques plus complexes.

Procédures

Les animaux (rats) seront exposés à des composés multiples. Les zones à injecter seront rasées (manipulation de 5 minutes) ce qui pourrait créer une légère rougeur transitoire. Les animaux recevront le même jour et une seule fois dans toute la procédure, plusieurs injections successives en sous-cutané ou intradermique de produits non dispersibles sur des sites différents localisés sur le dos de l’animal (maximum 6 sites = 6 injections pour le rat) en respectant le volume d’administration maximum recommandé par la SBEA sur une journée (ex : rat en sous cutané). Pour les traitements multiples et pour les intradermiques une administration préalable d’un analgésique opiacé en sous cutané sera réalisée (30 min avant) et l’administration des composés sera ensuite réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Les traitements seront administrés sous anesthésie d’un total d’enviton 30 minutes. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 1 fois par semaine (manipulation de 5 minutes). Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone (par ex. irritation, pétéchie, œdème, érythème…), effets cependant extrêmement peu probables, et l’état général des animaux sera vérifié. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible (manipulation de 5 minutes sans anesthésie ou anesthésie d’un total de 30 minutes). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront être effectués après mise à mort.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, aucun effet sur l’évolution du poids des animaux n’est attendu. Les animaux seront rasés au niveau des sites d’injection. Une rougeur pourra être présente juste après le rasage. Les animaux recevront plusieurs traitements en une seul occurrence sur des sites différents . Des douleurs transitoires aux différents sites d’injection peuvent être observés, nécessitant administration d’un analgésique. Nous n’attendons pas d’effets nuisibles au site d’injection, cependant nous surveillerons l’apparition éventuelle de signes d’irritation de la peau, de lésions cutanées, pétéchies, d’érythèmes, nécroses cutanées, d’œdèmes ou toute autre altération macroscopique de la peau. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés principalement pour des mesures de poids qui pourront entraîner un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la formation des groupes, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress modéré de 1-2 jours. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre la récupération de différents échantillons biologiques d’intérêt (notamment peau).

Remplacement

Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de régénération tissulaire et sont utilisés pour pré-sélectionner les composés les plus intéressants. Ces études sont réalisées en amont dans nos laboratoires. Cependant, aucune ne reproduit la complexité observée in vivo, et les meilleurs composés sélectionnés in vitro doivent être évalués in vivo. En effet, il est possible de travailler dans un premier temps avec des modèles 3D de peau, des cultures de cellules de tissu adipeux et des échantillons de peau humaine mais ceux-ci présentent plusieurs limites : - Toxicité des gels sur cellules isolées du fait de l’absence de matrice extra-cellulaire - Modèles incomplets ne récapitulant pas tous les effets (par exemple inflammation) - Origine de la peau : les échantillons proviennent de chirurgies de type abdominoplasties et présentent donc en général un derme hypertrophié et non hypotrophié (patients en surpoids) - Durée de vie des explants : les échantillons de peau ne peuvent survivre qu’environ 7-8 jours, ne permettant pas une évaluation sur le long terme De plus, s’agissant de dispositifs médicaux, des preuves d’innocuité et d’efficacité doivent être apportées aux autorités sanitaires avant essais cliniques et mise sur le marché. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal de la régénération tissulaire par biostimulation de composés chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé avant un passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

Dans les études de ce projet, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux (en général de 6 à 8 animaux) selon le poids en début d’étude (randomisation). Grace à l’injection de plusieurs composés sur un même animal (maximum 6, sous forme de matrices hydrogel restant au niveau de l’emplacement d’injection sous-cutanée), le nombre d’animaux utilisé en est d’autant réduit. En pratique, le nombre d’animaux utilisés est divisé par 6 si on ne se limite pas à un produit par animal. Le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé sur la base de tests statistiques.

Raffinement

Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes (comportement, masque facial de douleur). Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les traitements simultanés sur plusieurs sites en sous-cutané ou intradermique sur un même animal sont réalisés sous anesthésie générale précédé d’une analgésie (30 minutes minimum avant). Pour l’administration intradermique, la zone sera préalablement stérilisée. La possibilité de réaliser les intradermiques par « microneedling » sera évaluée, afin de répartir le volume au niveau des sites d’injection ID . De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie (nids, jouets en bois, niche). Des graines de tournesol pourront être utilisées comme enrichissement positif après la manipulation des animaux. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et aux recommandations de la SBEA. Toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après mise à mort de l’animal. En cas d’apparition de signes cliniques indésirables, les animaux seront observés quotidiennement et des mesures seront mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal.

Choix des espèces

Les études à l’aide des rongeurs, notamment les rats, sont utilisées pour l’exploration de la régénérescence tissulaire ou l’évaluation de l’efficacité de tout nouveau composé stimulateur de la régénérescence, qu’il soit d’origine chimique, issu de la biotechnologie ou naturel. La connaissance de la peau des rongeurs et de son organisation extracellulaire, conduit à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme et permet d’explorer de nouvelles pistes pour la médecine. Les animaux seront immunocompétents pour répondre à l’objectif du projet et se rapprocher le plus possible du phénomène de régénérescence tissulaire humaine. De plus, le rat en raison de sa taille, est l’espèce la plus adaptée à ce projet pour la co-implantation de plusieurs matrices simultanées (réduction). Les rats sont par ailleurs de loin l’espèce la plus utilisée dans la littérature pour ce type d’évaluation, permettant de comparer les données obtenues avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adultes et afin qu’ils présentent une peau et un système immunitaire matures.

Pour comparer trois crèmes brevetées à un placebo et à une crème de pharmacie, 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une plaie leur est ouverte sur le dos sous anesthésie et maintenue ouverte par un anneau de silicone posé autour, pour empêcher la peau de se contracter. Pendant trois semaines, chacune vit seule en cage, anesthésiée trois fois par semaine le temps d'être photographiée et traitée, jusqu'à cicatrisation complète. Un point limite atteint fait mettre l'animal à mort avant la fin de l'étude, sans que le porteur précise lequel.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez la souris de nouveaux dispositifs médicaux sous forme de crèmes qui seront appliqués directement sur les plaies cutanées. Des études effectuées sur modèles cellulaires et modèles de peau reconstruite ont permis de démontrer des activités pro-cicatrisante et anti-inflammatoire des principes actifs sélectionnés qui composeront les 3 formulations de crème à évaluer. Ce projet constituera la toute première évaluation sur un modèle de plaie cutanée chez la souris de ces formulations sous forme de crème, en comparaison avec un placebo et une crème de référence disponible en pharmacie. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. A l’issue de l’étude, des analyses biologiques seront effectuées sur le sang, la peau cicatrisée et des organes vitaux. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner la ou les formulations de crème ayant la meilleure efficacité pour en poursuivre leur développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales, les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux expérimentaux brevetés se présentant sous forme de crème, tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez la souris saine et diabétique. Ces nouveaux dispositifs médicaux pourraient ainsi à terme, être utilisés chez l’Homme, pour le traitement de plaies cutanées chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 50 souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos et la pose d’un anneau en silicone pour éviter la contraction de la plaie cutanée, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 15 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis réitéré après si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète, sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un maintien des souris en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles l’anneau en silicone, le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux, en 2 minutes environ.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée et la pose d’un anneau en silicone, effectuées sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. L’hébergement en cage individuelle des souris est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles l’anneau en silicone, le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci. Cet hébergement en cage individuelle des souris, pendant une durée de 3 semaines maximum, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiées et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble de tissu et d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez la souris ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. En cas d'atteinte d'un point limite, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront hébergées dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des petites briques de bois, des carrés de papier absorbant et une balançoire seront placés dans chaque cage de souris comme dispositifs d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille ne nécessitant pas l’utilisation d’un gros volume de formulation très coûteuse à produire, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez la souris saine puis diabétique. Les animaux seront de jeunes souris mâles et femelles âgées de 6 semaines et d’un poids de 18-20 g à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines et d’un poids de 20-22 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de souris utilisées lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

Les rats qui présentent une cachexie, des vocalises ou des convulsions sont mis à mort avant la fin de l'étude. 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est ouverte chirurgicalement sur leur dos sous anesthésie, puis pansée, photographiée et traitée trois fois par semaine jusqu'à cicatrisation, chaque animal restant seul en cage trois à quatre semaines pour qu'il n'arrache pas le pansement. Le porteur teste sur ces plaies quatre formulations liquides brevetées, dispositifs médicaux qu'il destine à un développement préclinique puis clinique.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez le rat de nouveaux dispositifs médicaux sous forme liquide qui seront appliqués directement sur les plaies cutanées. Des études effectuées sur modèles cellulaires et modèles de peau reconstruite ont permis de démontrer des activités pro-cicatrisante, antimicrobienne et anti-inflammatoire des principes actifs sélectionnés qui composeront les 4 formulations liquides à évaluer. Ce projet exploratoire constituera la toute première évaluation sur un modèle de plaie cutanée chez le rat de ces formulations liquides, en comparaison avec un placebo. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. A l’issue de l’étude, des analyses biologiques seront effectuées sur le sang, la peau cicatrisée et des organes vitaux. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner la ou les formulations liquides ayant la meilleure efficacité pour en poursuivre leur développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales, les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux expérimentaux brevetés se présentant sous forme liquide, tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques et infectées ou non chez le rat sain et diabétique. Ces nouveaux dispositifs médicaux pourraient ainsi à terme, être utilisés chez l’Homme, pour le traitement de plaies cutanées chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 50 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis éventuellement 6 heures, 12 voire 24 heures après celle-ci si nécessaire, durée suffisante selon notre expérience sur ce modèle de plaie cutanée. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète, sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux, en 2 minutes environ.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée, effectuée sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci. Cet hébergement en cage individuelle des rats, pendant une durée de 4 semaines maximum, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez le rat ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. Si une perte de poids très importante est observée, ou si des signes d’infection ou d’ulcération de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront hébergés dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des dispositifs d’enrichissement seront placés dans chaque cage de rat pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez le rat sain puis diabétique. Les animaux seront de jeunes rats mâles et femelles âgés de 8-10 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-11 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de rats utilisés lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.