Maladies animales

Fabriquer du matériel biologique : 2 000 poulets vont être utilisés pour faire se multiplier dans leur intestin des parasites du genre Eimeria, tous tués cinq à sept jours après l'inoculation pour que ces parasites soient récupérés. Chacun reçoit une inoculation orale par gavage ou une injection dans le cloaque, avec une contention d'environ cinq minutes. Le porteur affirme calibrer les doses pour ne pas abîmer la muqueuse intestinale, le rendement en parasites en dépendant, et annonce l'absence de symptômes cliniques, alors que les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Sa propre équipe a publié une méthode de culture in vitro couvrant la totalité du cycle parasitaire, qu'il écarte au motif qu'elle ne permet pas d'obtenir des parasites en grande quantité.

Objectifs

Il s’agit de produire la quantité de parasites requis pour l’obtention du matériel biologique nécessaire (ADN, ARN, protéine) à la compréhension du cycle des parasites et des mécanismes impliqués dans les processus infectieux, ainsi qu’à l’évaluation des propriétés anticoccidiennes d’extraits naturels, alternatifs aux anticoccidiens chimiques actuels.

Bénéfices attendus

Les études menées sur ces parasites doivent nous permettre à court terme de mieux connaitre la biologie de ces parasites, le rôle des protéines produites par ces parasites dans les interactions avec les cellules de l’hôte et enfin de mieux connaitre la physiopathologie de la coccidiose. A plus long terme, nos travaux visent à améliorer les moyens de contrôle de la coccidiose : i) en évaluant l’intérêt d’alternatives aux traitements chimiques et antibiotiques, qui existent actuellement pour lutter contre la coccidiose ; ii) en identifiant de nouvelles cibles thérapeutiques chez le parasite, iii) et en développant des stratégies thérapeutiques innovantes, qui neutralisent les protéines du parasite et restaurent les moyens de défense naturels de la cellule. La coccidiose est une maladie cosmopolite, présente dans tous les élevages de poulets. L’impact de notre recherche est donc très large. La coccidiose est bien connue pour compromettre l'efficacité de l'utilisation des nutriments. Le bénéfice direct pour l’animal sera donc un meilleur contrôle de sa santé, sa nutrition et son bien-être en élevage. De plus, la coccidiose a un impact environnemental important : augmentation de la consommation d’eau, de la production de dioxyde de carbone, de méthane et de protoxyde d'azote par les poulets infectés et libération d'ammoniac dans les fèces. Le contrôle de la coccidiose bénéficie aussi à la préservation de l’environnement.

Procédures

Inoculation orale par gavage de l'inoculum par animal (1 fois et environ 5 min contention comprise). Inoculation cloacale par injection cloacale par animal (1 fois et environ 5 min contention comprise).

Impact sur les animaux

En coccidiose aviaire, on ne parle pas de virulence mais plutôt de pouvoir pathogène des parasites car la gravité de l’infection est dépendante de la dose infectieuse. La coccidiose clinique est très symptomatique, avec une perte d’appétit, une perte de poids, une soif intense, des modifications du comportement (oiseaux prostrés, ailes pendantes, crête décolorée), et des diarrhées sanglantes. Ces signes impactent fortement la croissance des jeunes et le taux de ponte des poules. En élevage, la plupart des cas de coccidiose sont des infections subcliniques, qui impactent les performances zootechniques des oiseaux, sans symptômes visibles. Dans le cadre de nos travaux, les doses inoculées aux poulets sont faibles et n’induisent pas de symptômes cliniques. Le contention peut engendre un stressest estimé comme léger et de très courte durée.

Devenir

Tous les poulets inoculés seront mis à mort 5 à 7 jours après l’inoculation pour récupérer les parasites qui se sont multipliés dans la lumière intestinale afin de faire différents tests sur la virulence du parasite, la caractérisation des facteurs de virulence et déefficacité de produits anticcoccidiens.

Remplacement

L’équipe a publié une méthode de culture in vitro qui permet d’accéder à la totalité des stades du cycle parasitaire. Il s’agit là d’une preuve de concept et en aucun cas d’une méthode de production de parasites en grande quantité. La culture in vitro ne reproduit que la 1ere multiplication asexuée (production de mérozoïtes) et ne couvre pas les 2 autres multiplications asexuées puis la reproduction sexuée (qui génère les oocystes). Nous avons publié une preuve de concept : avec une souche vaccinale (qui ne fait qu’une seule multiplication asexuée) et sur culture primaire de cellule de rein de poulet, on a réussi à produire in vitro quelques oocystes. Mais la manipulation des Eimeria nécessite la reproduction de 10e7 oocystes (c’est le rendement obtenu pour chaque poulet infecté).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dépend de la prolificité de la souche et du nombre de parasites requis. Pour les souches utilisées au laboratoire, le rendement en parasites produits peut être déterminé. Les protocoles de multiplication sont planifiés en concertation avec l’ensemble des utilisateurs, les expériences sont organisées pour optimiser l’utilisation des parasites et utiliser le moins d’animaux possible.

Raffinement

Chaque inoculum fait l'objet d'une attention particulière pour administrer des doses définies et adaptées à l’espèce présente et ainsi éviter toute pathogénicité. Pour un rendement optimal, la muqueuse intestinale ne doit pas être trop abîmée. Il est donc inutile d’inoculer une dose trop forte de parasites qui pourrait induire des effets pathogènes et donc provoquer de la douleur. Même si la dose inoculée est calculée de manière à ne pas induire de pathogénicité, nous restons vigilants à l’état de santé des animaux : après inoculation de l’agent infectieux, deux visites quotidiennes sont réalisées dans la salle expérimentale afin de surveiller l’éventuelle apparition des premiers symptômes liés à la maladie : plumes ébouriffées, prostration. Ils sont hébergés par groupe de 20 sur litière de miscanthus pour éviter les poussières. Ils ont à disposition aliment et eau ad libitum. Pour le raffinement des conditions d’hébergement, des petites plateformes triangulaires ont été placées pour permettre aux poulets de se percher à l’intérieur des cages.

Choix des espèces

A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative suffisamment efficace (in vitro) pour multiplier les parasites. Les animaux sont utilisés entre 3 et 7 semaines d’âge (considéré comme l’âge optimum pour un meilleur rendement en parasites). Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites. Des poulets de statut sanitaire contrôlé sont utilisés. L’étroitesse du spectre d’hôtes des parasites du genre Eimeria empêche toute tentative de manipulation d’une espèce parasitaire aviaire sur un modèle animal autre que la poule.

Comparer les concentrations sanguines d'un candidat médicament selon qu'il est injecté dans la veine, avalé, glissé sous la peau ou envoyé dans la cavité abdominale : 3 600 rats vont être utilisés pour cela, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une administration unique puis jusqu'à huit prélèvements de sang sous anesthésie, sur une période allant de quinze minutes à un mois. Le porteur liste parmi les effets possibles des signes de douleur sur la face, des constrictions abdominales, du sang dans les urines, une perte de poids et une hypothermie, et annonce un arbre décisionnel fondé sur des points limites qu'il ne détaille pas. La mise à mort tient à l'âge : les rats ayant entre 6 et 12 semaines, il écrit qu'une seconde procédure ne peut pas être envisagée.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés par comparaison des concentrations sanguines après administration par voie intra veineuse (injection dans la circulation sanguine), qui est la voie de référence, versus une administration par voie autre qu’intra veineuse : orale (administration dans l’estomac), sous cutanée (injection sous la peau) ou intra péritonéale (injection dans la cavité abdominale). L’étude de la biodisponibilité a pour objectif de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la forme galénique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme galénique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les animaux sont administrés par voie intra veineuse (injection dans la circulation sanguine sur animaux anesthésiés), par voie orale (administration dans l’estomac sur animaux vigiles), voie sous cutanée (injection sous la peau sur animaux anesthésiés) ou voie intra péritonéale (injection dans la cavité abdominale sur animaux vigiles) Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique et sous anesthésie. 8 prélèvements maximum sont réalisés par animal (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. - Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin d’obtenir des données expérimentales robustes et des faire des statistiques, un minimum de 3 animaux pas lot sera utilisé (molécule, voie d’administration, dose, formulation) avec 2 lots nécessaires pour calculer les paramètres pharmacocinétiques (comparaison de l’administration directement dans le sang à celle hors circulation sanguine), soit un minimum de 6 animaux. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires et les recommandations (décret officiel et FC3R (société francaise des 3R : Remplacer, Réduire, Raffiner)) . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des rats est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les rats à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix du rat dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiquement de cette tranche d'âges permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches.

Trois lignées de souris, dont une modifiée pour ne plus produire le sucre alpha-Gal, et des lapins blancs de Nouvelle-Zélande retenus parce qu'ils fournissent de gros volumes de sang : 300 souris et 9 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les souris portent sur le dos une capsule contenant des tiques qui se nourrissent sur elles, ce qui impose un hébergement individuel puisqu'elles arrachent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques. Les lapins reçoivent deux immunisations, puis un prélèvement dans la veine de l'oreille et enfin un prélèvement intracardiaque sous anesthésie. Toutes et tous sont tués pour récupérer sang et organes, alors que le calcul de puissance annonçait 33 souris par groupe et que le porteur en retient cinq.

Objectifs

Objectif 1 : Infection des souris pour obtenir des tiques infectées par Borrelia spp. La maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia spp., est une maladie transmise aux animaux et aux humains qui est en pleine expansion, notamment en Europe, où son incidence a considérablement augmenté ces dernières années, en particulier en France. Comprendre comment les tiques, principaux transmetteurs de cette maladie, sont infectées et comment la bactérie se transmet des animaux ou des humains aux tiques est essentiel pour développer des stratégies de prévention. En infectant des souris avec Borrelia spp., ce projet cherche à générer des tiques infectées de manière contrôlée, afin de mieux comprendre le cycle de transmission et d’examiner les interactions animaux/humains-Borrelia et les tiques. Cette connaissance est cruciale pour identifier de nouvelles cibles permettant d'interrompre la transmission de Borrelia spp. Objectif 2 : Induction d'anticorps spécifiques contre le sucre α-Gal pour protéger contre l'infection par Borrelia spp.Des études antérieures ont démontré que les anticorps contre le sucre α-Gal, générés naturellement en réponse à certains stimuli, peuvent offrir une protection contre divers pathogènes, y compris ceux qui exposent ce sucre à leur surface, comme Borrelia spp. La vaccination avec le sucre ou avec des variantes de la bactérie E. coli qui ne causent pas de maladies et exprimant ce sucre pourrait induire la production de ces anticorps protecteurs. L'objectif de cette partie du projet est de tester cette approche innovante. Si elle s'avère efficace, elle pourrait ouvrir une nouvelle voie pour la prévention de la maladie de Lyme, représentant ainsi une avancée majeure, car aucun vaccin n’est actuellement disponible pour les animaux ou les humains. Objectif 3 : vaccination des lapins pour des études in vitro. Les lapins seront utilisés pour produire des volumes importants de sérum riche en anticorps contre α-Gal et contre E. coli, ce qui est crucial pour les expérimentations complémentaires. Ce sérum permettra de tester en laboratoire, à plus grande échelle, l'efficacité des anticorps produits par les vaccins expérimentaux, garantissant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande précision dans les résultats. L’utilisation des lapins, qui permettent de récolter un plus grand volume de sérum que les souris, réduit le nombre total d’animaux nécessaires et améliore la qualité des études futures.

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris recevront deux injections sous-cutanées et un maximum de trois prélèvements sanguins ; ces prélèvement dureront 10 minutes, anesthésie comprise.. Les lapins seront immunisés par voie souscutanée avec des variantes d'E. coli qui ne causent pas de maladies ou avec le sucre α-Gal, avec deux injections. Les jours 0 et 14 après la première vaccination, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; le prélèvement durera 8 minutes, anesthésie comprise. Le jour 30 après la vaccination de rappel, un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'alimentation des tiques pourrait provoquer un inconfort modéré chez les animaux, et ceux-ci pourraient également ressentir un léger inconfort en raison de la pose de la capsule sur leur dos. Aucune souffrance particulière n'est attendue en raison de l'infection, car les souris sont les transmetteurs naturels de Borrelia et ne présentent pas de symptômes. La pose des capsules a été optimisée pour minimiser l'inconfort tout en maximisant les résultats expérimentaux. Cependant, l'expérience sera interrompue en cas d'événements indésirables tels que : (i) un choc anaphylactique dû aux piqûres de tiques ou à l'infection bactérienne ; (ii) une réaction cutanée généralisée affectant les voies respiratoires ou gastro-intestinales après l'immunisation ; (iii) des blessures auto-infligées par les animaux tentant de retirer la capsule ; (iv) des signes graves après l'exposition aux micro-organismes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et, si nécessaire, l'expérience sera arrêtée. Les critères d'évaluation incluent une échelle de 3 niveaux, et tout animal atteignant un score de 3 sera mis à mort : (1) infecté sans signe visible ; (2) poils hérissés, activité réduite, légère posture voûtée ; (3) posture voûtée, difficulté à maintenir la position, prostration, respiration superficielle ; (4) décès.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet consiste à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec E. coli ou α-gal-BSA afin d'évaluer les effets protecteurs des anticorps anti-α-Gal contre Borrelia spp., ainsi que la survie des tiques et l'acquisition de Borrelia spp. par ces dernières. Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de reproduire la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne, ce qui empêche d'analyser adéquatement les effets protecteurs et la colonisation de Borrelia spp. chez les tiques. Pour obtenir un plus grand volume de sérum destiné à des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation supplémentaire de souris. L'immunisation des lapins permettra d'obtenir du sérum anti-α-Gal ou anti-E. coli, offrant un meilleur contrôle sur la qualité, la spécificité et l'affinité des anticorps, ce qui garantit la cohérence et la reproductibilité des expériences. De plus, elle permettra la production d'anticorps à plus grande échelle, répondant ainsi aux besoins expérimentaux spécifiques.

Réduction

Nous utiliserons 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux sera calculé pour être le minimum requis afin d'obtenir les tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Pour développer un test de puissance statistique robuste permettant d’analyser la relation entre les anticorps anti-alpha-gal et la protection, nous avons fixé le niveau de confiance à 5%, en nous basant sur les données publiées disponibles. Nous avons ciblé une puissance statistique de 0,8, en supposant un effet de taille modérée, ce qui indiquait un besoin de 33 souris par groupe pour un test ANOVA. En appliquant le principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), nous avons réduit la taille de l’échantillon à 5 souris par groupe afin de minimiser l'utilisation des animaux tout en maintenant des résultats significatifs.Chaque souris peut nourrir jusqu'à 100 larves ou 30 nymphes. Comme les larves sont plus petites et nécessitent moins de ressources que les nymphes, il est possible d'utiliser 100 larves et 20 nymphes par souris, sans affecter leur santé, tout en garantissant un nombre suffisant de larves et de nymphes infectées pour mener à bien les études expérimentales. Environ 30 % des tiques se détacheront sans avoir pris un repas complet ou mourront, ce qui nous permettra d'obtenir 70 larves ou 20 nymphes gorgées par souris. Parmi les 350 larves obtenues, 200 seront élevées jusqu'au stade de nymphe pour obtenir des nymphes infectées par Borrelia, utilisées dans des études in vitro. Les 150 larves restantes seront réparties de la manière suivante : 75 pour la quantification de Borrelia et 75 pour les études d'immunité des tiques, en lien avec l'immunisation des souris et l'infection. Pour les 100 nymphes, 50 seront dédiées à chaque type d'étude similaire. Par conséquent, il faut prévoir 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux a été calculé pour être le minimum nécessaire à l’obtention des tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Les souris seront gardées un maximum de 6 jours, temps nécessaire pour que les nymphes complètent leur repas. Nous avons également calculé le nombre minimal de lapins requis pour obtenir le volume de sérum nécessaire à nos futures expérimentations in vivo.

Raffinement

Souris : Les souris seront hébergées en groupes de 5 dans leurs conditions habituelles, avec un enrichissement nécessaire à leur bien-être (carrés de coton, maison en plastique). Elles seront surveillées quotidiennement pour détecter tout signe de malaise ou de symptôme. L’application des capsules contenant les tiques sur le dos des souris se fera sous anesthésie pour minimiser le stress et l'inconfort associés à cette manipulation. Une fois les capsules fixées, les souris seront placées dans des cages individuelles, car elles ont tendance à retirer les capsules des autres et à consommer les tiques. Malgré cet isolement, elles continueront de bénéficier des mêmes conditions d'enrichissement (carré de coton, maison en plastique), et, pour pallier leur isolement, des enrichissements supplémentaires, tels que des bâtonnets à ronger, seront ajoutés. Des points limites stricts seront appliqués pour identifier rapidement toute détérioration de leur état de santé, et les souris présentant des signes de douleur ou de détresse inhabituels seront retirées de l'expérimentation et recevront des soins appropriés. Lapins : À leur arrivée, les lapins seront logés dans des cages équipées de plateformes de repos et d’enrichissements spécifiques à leur bien-être, comme des balles, des branches en bois à ronger et des végétaux. Ils seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation pour garantir leur santé et leur confort. Étant sensibles aux manipulations, les lapins seront régulièrement contrôlés et manipulés par le personnel soignant et les expérimentateurs afin de les habituer à la présence humaine et aux différentes interventions. Avant les prélèvements sanguins, les lapins seront familiarisés avec les expérimentateurs pour réduire leur stress, et des techniques de contention douce seront appliquées pendant les prélèvements. L'anesthésie sera utilisée si nécessaire pour toute intervention susceptible de causer de la douleur ou un inconfort important. Des points limites spécifiques seront appliqués pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Si un lapin montre des signes d'inconfort significatif, il sera retiré de l’étude et recevra des soins adaptés

Choix des espèces

On utilisera trois variantes de souris et une de lapins : Souris très sensibles aux germes, comme la bactérie Borrelia spp, transmise par les tiques. Elles sont donc utilisées pour produire des tiques infectées par cette bactérie. Souris génétiquement modifiées pour qu'elles ne puissent pas produire le sucre α-Gal, mais elles peuvent créer des anticorps spécifiques contre celui-ci. Elles sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Souris non modifiées génétiquement. Elles sont utilisées comme groupe de contrôle pour comparer les résultats avec ceux des autres souris et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Lapins blancs de Nouvelle-Zélande : Ils sont utilisés car ce sont les meilleurs animaux pour prélever de grandes quantités de sang en une seule expérience, permettant d'obtenir suffisamment d'anticorps contre l'α-Gal pour les recherches. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge, et les lapins entre 4 et 5 semaines. Avant de commencer les expériences, une semaine d'adaptation sera accordée aux animaux pour qu'ils s'habituent à leur environnement.

Gardées vivantes et réintégrées au troupeau après un mois de repos minimum, 140 vaches laitières sont réutilisables d'une étude à l'autre. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une mammite leur étant provoquée par inoculation de bactéries ou d'un immunostimulant dans le canal du trayon. Suivent trois à six administrations de traitement par le trayon, dix à douze prélèvements sanguins en vingt-quatre à quarante-huit heures, des palpations de la mamelle à chaque traite et des prises de température rectale plusieurs fois par jour, le gonflement et la douleur de la mamelle pouvant durer une semaine. Le porteur range parmi les bénéfices attendus la guérison de l'animal, mais aussi "le rendement de l'éleveur" et le développement de médicaments par l'industrie vétérinaire.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer chez la vache laitière, l’efficacité de nouveaux traitements dirigés contre les mammites. Au cours de ce projet, l’efficacité de traitements sera évaluée sur des animaux présentant des mammites expérimentales infectieuses ou non infectieuses. Les modèles d’infection et d’inflammation sont des modèles mis en place d’après des modèles décrits dans la littérature et adaptés pour induire des signes légers à modérés de mammite sur une courte durée. Les traitements sont testés chez l’espèce de destination et de ce fait une sélection préalable de formulations ne présentant pas de risque pour l’animal sera réalisée (composants du médicament, volume à administrer). Les traitements seront administrés par voie intramammaire ou par injection (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée) selon les bonnes pratiques vétérinaires d’administration. Plusieurs études pourront être conduites afin d’améliorer le type de formulation, la combinaison de différents traitements, la voie, la dose ou la fréquence d’administration des traitements testés.

Bénéfices attendus

Une mammite se traduit par une diminution de la production de lait et une modification de sa composition avec des variations importantes selon la bactérie responsable de la mammite et selon sa gravité, une modification possible de la mamelle et de l’état général de l’animal. Certains cas de mammites sévères peuvent entrainer des dommages permanents à la glande mammaire avec un arrêt de la production de lait, et dans le pire des cas, la mort de l’animal. L’efficacité d’un traitement dirigé contre les mammites peut se démontrer par la guérison de l’infection (élimination de la bactérie infectante) mais aussi par une amélioration clinique (disparition des signes inflammatoires induits par l’infection). Dans le cadre de la recherche et du développement de médicaments vétérinaires, les produits destinés à prévenir ou guérir les infections permettent de limiter les conséquences d’une maladie, d’améliorer de façon notable le bien-être de l’animal et le rendement de l’éleveur. La preuve de concept d’efficacité de nouveaux traitements doit être évaluée sur l’animal présentant les caractéristiques de la maladie ciblée. Au-delà du bénéfice pour l’animal avec la guérison de la maladie, ce projet bénéficiera aux producteurs laitiers, vétérinaires d’exploitation et à la santé publique.

Procédures

Tous les gestes techniques seront réalisés sur animaux vigiles. Tous les animaux entrant dans une procédure auront tous les gestes techniques associés à l’exception de la voie d’administration des traitements qui pourra varier selon les groupes dans une même procédure (exemple comparaison d’une voie d’administration intramammaire par rapport à une administration intraveineuse) et des prélèvements sanguins qui ne seront pas obligatoirement réalisés lors des procédures impliquant des traitements par voie intramammaire. Voici l'ensemble des gestes pouvant être effectué sur un animal : - Inoculation de la solution induisant la mammite (1 à 10 mL) via le canal du trayon, 1x par procédure - Administration du (des) traitements : Par voie intramammaire via le canal du trayon, 1 ou 2 applicateurs / quartier, généralement 3 à 6 administrations à 12h/24h d’intervalle (après chaque traite). Par voie générale, une administration unique - Prélèvements Lait : lors de la traite biquotidienne sur tout ou partie de l’étude. - Prélèvements Sang : 10 à 12 prélèvements pendant les 24 à 48 heures suivant l’administration du traitement - Mesures de température rectale : 1 à plusieurs fois par jour sur tout ou partie de l’étude. - Palpation de la mamelle : lors de la traite biquotidienne sur tout ou partie de l’étude.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de l’évaluation de l’efficacité d’un traitement, les vaches devront d’abord présenter les signes de mammite. A cette fin, des mammites expérimentales seront induites chez l’animal. Les nuisances ou effets indésirables attendus seront plus ou moins importants selon le type de mammite induite et seront principalement : - une modification de l’apparence du lait (présence de quelques grumeaux dans le lait), - un gonflement de la mamelle, - une douleur de la mamelle à la palpation ou lors de la traite, - une diminution de la production laitière, - une augmentation transitoire de la température rectale de l’animal, - une légère modification de l’état général de l’animal, - un stress modéré dû aux manipulations multiples et inhabituelles dans les conditions d’hébergement hors procédure. Selon l’agent utilisé pour induire la mammite, ces nuisances et effets indésirables pouvant impacter le bien-être de l’animal pourront persister jusqu’à 1 semaine. Des nuisances légères liées à certaines interventions sur l'animal sont attendues (Par exemple, lors de la réalisation d'injections ou de prises de sang).

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront réintroduits dans le stock des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. L’effet cumulatif est évalué par le vétérinaire de l’EU en collaboration avec le(s) directeurs(s) d’étude(s) selon le type de produits administrés. Les animaux peuvent être réutilisés après une période de repos suffisante entre 2 études pour s’assurer de l’élimination totale de l’organisme du dernier traitement administré ; cette durée ne peut être inférieure à 10 fois la demi-vie du produit si celle-ci est connue ou 1 mois si celle-ci n’est pas connue. Tout autre délai devra être justifié et validé par le vétérinaire de l’EU. De plus, tout animal réutilisé fait l’objet d’une visite du vétérinaire de l’EU qui certifie que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général et peut être ré-inclus dans une nouvelle étude sans dommage pour lui.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire une infection ou une inflammation de la glande mammaire et évaluer l’efficacité d’un traitement. Une mammite est une maladie multifactorielle impliquant : • L’animal : statut physiologique, état de santé… • L’agent déclencheur : virulence, capacité à pénétrer les cellules de l’hôte, à former des biofilms pour les bactéries, / dose ou puissance des immunostimulants… • L’environnement : conditions d’élevage, qualité de l’alimentation, hygiène de traite…

Réduction

Dans la mesure du possible, des approches in vitro sont réalisées afin de sélectionner les meilleurs candidats pour un passage in vivo et limiter le nombre d’animaux inclus dans les procédures. La mamelle de la vache est constituée de 4 quartiers anatomiquement et physiologiquement indépendants. Afin de réduire le nombre d’animaux en limitant l’impact sur le bien-être de l’animal, les infections expérimentales seront induites autant que possible sur deux quartiers. Le calcul du nombre d’animaux minimum nécessaire a de plus été estimé grâce à des études préliminaires. Si plusieurs études sont nécessaires, elles seront réalisées successivement, et les animaux pourront être réutilisés dans les études suivantes après totale guérison et une période de repos de 30 jours minimum. Il sera possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de l’étude. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique à la procédure suivie dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions standards d’élevage d’un troupeau laitier à savoir hébergement en groupe, en stabulation ou en extérieur selon la saison. Les vaches incluses dans une procédure expérimentale sont généralement hébergées en intérieur sur tapis de sol dans les zones prévues pour le repos et avec des tapis antidérapages sur les zones de circulation. Un système de ventilation et d’aspersion est prévu en période de forte chaleur. La stabulation est nettoyée quotidiennement (robot racleur) et des brosses automatiques sont à disposition des animaux en permanence. Tous les actes sur les animaux seront réalisés par du personnel expérimenté ou par le vétérinaire. L’utilisation d’un modèle de mammite non infectieuse permettra d’induire des signes transitoires de mammite en s’affranchissant de la stimulation par les bactéries présentes lors d’un infection bactérienne. Les administrations intramammaires (bactéries ou immunostimulants pour l’induction des mammites et traitements) seront effectuées en salle de traite et aucune contention particulière des animaux ne sera nécessaire. Dans le cas d’un traitement par voie générale (intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée), les animaux seront maintenus au cornadis durant la période du traitement (généralement moins de 5 min) en accord avec les pratiques vétérinaires habituelles. Dans le cas de prélèvements de lait réalisés lors des procédures (1 et 2), les animaux seront en salle de traite et aucune contention particulière des animaux ne sera nécessaire pendant les prélèvements. Dans le cas des prélèvements sanguins ou des prises de températures rectales réalisés si besoin lors des procédures, les vaches seront maintenues au cornadis durant la période nécessaire à l’activité (généralement moins d’1 heure). Le maintien des vaches au cornadis sera fait en accord avec les pratiques vétérinaires habituelles et facilitera la collecte des échantillons et/ou des données, permettra de diminuer le stress de l’animal, et réduira les risques pour le personnel.

Choix des espèces

L’espèce de destination des traitements contre les mammites étant la vache laitière et l’absence d’alternative à l’utilisation d’animaux justifie l’utilisation des vaches dans ce projet. L’objectif du projet est l’évaluation de nouveaux produits destinés au traitement des mammites chez des vaches laitières en lactation. Ceci correspond à des animaux adultes de plus de 2 ans dans les pratiques classiques d’élevage laitier. Les mammites pouvant apparaitre à tout stade de la lactation, les études pourront inclure des animaux à partir de 15 après vêlage jusqu’au tarissement.

Six chevaux subissent jusqu'à vingt-cinq prises de sang par phase expérimentale, répétées sur huit phases, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque phase comporte une administration d'antibiotique, l'objectif étant de recalculer doses et intervalles pour des molécules anciennes déjà utilisées chez le cheval, afin de préserver les antibiotiques récents pour la médecine humaine. Le porteur indique que le stress des prélèvements répétés sera limité par du renforcement positif, récompenses alimentaires à l'appui. Les six animaux viennent d'un centre équestre où ils travaillent quotidiennement, et ils y retourneront à la fin du projet, choix que le porteur justifie aussi par le souci de ne pas mobiliser des chevaux pour cette seule étude.

Objectifs

Pour préserver l’efficacité des antibiotiques « récents » en médecine humaine, il est recommandé d'utiliser des antibiotiques « anciens » en médecine vétérinaire. Ces antibiotiques « anciens » sont déjà utilisés chez le cheval mais du fait de l'ancienneté des autorisations de mise sur le marché de ces antibiotiques, une révision et une optimisation des modalités de traitement (doses, voies d'administration, intervalles de traitement) sont nécessaires pour garantir l'efficacité des molécules pour traiter les infections chez le cheval. Les objectifs de ce projet seront donc de (1) déterminer le devenir de certains antibiotiques « anciens » dans l’organisme de chevaux selon plusieurs modalités d'administration, (2) prédire par des modèles mathématiques l'efficacité ou non des différents traitements antibiotiques contre des bactéries rencontrées fréquemment chez les chevaux, et (3), dans l'éventualité d'une inadéquation des protocoles de traitements actuels, proposer par des modèles mathématiques des doses et intervalles d'administration permettant une lutte efficace contre les bactéries les plus fréquemment responsables d’infection chez le cheval.

Bénéfices attendus

Les applications attendues sont (1) l'utilisation plus efficace des antibiotiques « anciens » pour améliorer le traitement des chevaux malades tout en limitant les durées de traitement et les utilisations inutiles (2) la réduction de l’utilisation des antibiotiques « récents » en médecine vétérinaire ce qui permettra de les préserver pour la médecine humaine.

Procédures

Il y aura 8 phases expérimentales comportant chacune 25 prises de sang au maximum et une administration d'antibiotique. L'administration durera de 2 min à 10 min environ. La durée des prises de sang sera de 30 secondes au maximum (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins nécessaires à l’obtention de plasma seront réalisés de manière répétée et peuvent entrainer un stress qui sera diminué au maximum notamment en utilisant le renforcement positif. En ce qui concerne les effets indésirables attendus, aux doses utilisées dans notre étude, leur survenue sera peu probable. Néanmoins, les chevaux auront des examens cliniques quotidiens, la consistance des crottins sera monitorée, et une observation détaillée sera réalisée dans l’heure suivant l’administration.

Devenir

Les chevaux utilisés travaillent quotidiennement en centre équestre. Les actes prévus sur ces animaux (administration d'antibiotiques selon les modalités prévues pour cette espèce et prises de sang) sont compatibles avec un retour à leur activité normale à la fin du projet.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...).

Réduction

Seulement 6 chevaux seront utilisés lors de cette étude. Ce nombre est suffisant pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'une substance tout en étant nécessaire pour détecter une éventuelle variabilité interindividuelle. L'avantage de l'utilisation de chevaux permet également de réaliser plusieurs cinétiques sur le même animal tout en ayant un impact limité sur le bien-être des animaux. Enfin, afin de ne pas utiliser des animaux exclusivement pour ce projet, les animaux utilisés seront des chevaux provenant d'un centre équestre.

Raffinement

Les chevaux utilisés pour ce projet travaillent régulièrement en centre équestre ce qui permet d'avoir des chevaux habitués au contact humain, manipulés quotidiennement, avec un suivi régulier de leur état général par un vétérinaire. Ils vivent au pré en groupes constitués selon leurs affinités et ne seront placés en boxs que ponctuellement pour les administrations et les prises de sang. Au cours de l'étude, les chevaux auront des examens cliniques quotidiens, la consistance des crottins sera monitorée, et une observation détaillée sera réalisée dans l’heure suivant l’administration. Si le suivi clinique d'un animal révèle une intolérance ou un effet secondaire majeur, l'expérimentation sera arrétée sur l'animal en question et des soins appropriés seront effectués. Le stress des prélèvements sanguins sera diminué au maximum notamment en utilisant le renforcement positif (récompenses alimentaires lors de la réalisation des prises de sang).

Choix des espèces

Ce projet concerne la détermination des paramètres pharmacocinétiques d'antibiotiques chez l'espèce cible, le cheval. Nous utiliserons des chevaux adultes, entre 2 et 20 ans, pour pouvoir étudier la pharmacocinétique de chevaux adultes. On évitera les chevaux trop âgés qui pourraient présenter des paramètres pharmacocinétiques différents et non représentatifs des chevaux de sport et de loisir.