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Caractérisation du comportement de tétée chez le nouveau-né de la souris modèle du syndrome de Prader-Willi et rôle de l’ocytocine dans ce comportement.
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- Maladies animales
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés séparés de leur mère jusqu'à quatre heures, stimulés au pinceau puis au laser infrarouge au niveau du tronc cérébral: 708 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour des analyses post-mortem. Les mères reçoivent des injections intrapéritonéales d'anesthésique et se voient retirer une partie de leur portée. Le projet cherche à comprendre pourquoi les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi tètent mal et comment l'ocytocine rétablit la tétée, un essai clinique de phase 3 étant déjà en cours chez des bébés. Trente femelles sont réutilisées pour quatre à cinq portées avant d'être tuées, et 312 autres souris sont utilisées pour la reproduction de huit lignées puis tuées vers l'âge de six mois.
Objectifs
Ce projet porte sur la compréhension de mécanismes physiopathologiques impliqués dans la tétée chez des souris modèles d’une maladie rare (le syndrome de Prader-Willi) et le rôle d’une hormone qui restaure une activité de tétée normale. En effet, il a été montré qu’il y a un dysfonctionnement de l’activité de tétée chez les souris modèles d’une maladie rare, tout comme cela a été observé chez les bébés Prader-Willi et que l’administration de l’hormone étudiée rétablie une tétée normale chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques (PhaseI/II) chez des enfants atteints du syndrome de Prader-Willi, il résulte une amélioration (voire normalisation) de l’activité de succion. Toutefois le mécanisme d’action de cette hormone dans l’activité de tétée n’a jamais été investigué Les études associées à ce projet permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi, d’étudier comment l’hormone étudiée restaure une tétée normale chez ces souriceaux et quelles régions du cerveau sont activées, et donc d’argumenter l’intérêt d’utiliser cette hormone et définir les conditions optimales pour traiter les bébés Prader-Willi. Ce projet comprend 6 procédures. Au total, 708 souris, dont 678 issues de 164 croisements que nous effectuerons et 30 femelles provenant d'un fournisseur agréé, seront expérimentées.
Bénéfices attendus
Les bébés Prader-Willi présentent dans plus de 95% de cas un déficit de l’activité de tétée qui nécessite une intubation de quelques semaines. Cette intubation peut avoir des conséquences sur le développement et le comportement de ces enfants. Nos études précliniques ont montré que l’administration sous-cutanée d’une hormone (une seule administration à la naissance), permet de restaurer une activité normale de tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi et une amélioration dans le comportement cognitif et social de ces souris plus tardivement. A partir de ces études précliniques, une étude clinique de phase I/II a été mené chez des bébés Prader-Willi montrant une normalisation de la tétée chez ces bébés; une étude clinique en phase 3 est en cours. Il s’agit ici d’un projet qui est focalisé sur la tétée pour comprendre quelles sont les altérations mécaniques ou sensorielles qui empêchent les souriceaux modèles du Syndrome de Prader-Willi de téter normalement et comment une administration de l’hormone étudiée agit sur le plan fonctionnel (sensoriel ou moteur) et sur l’activité neuronale du cerveau pour rétablir une tétée normale chez ces souriceaux. Ce projet amènera : 1) une compréhension des mécanismes fonctionnels et cellulaires du déficit de la tétée dans un modèle du syndrome de Prader-Willi et par extension chez les bébés Prader-Willi ; 2) de mieux comprendre, en général, les mécanismes sous-jacents à l’activité de tétée qui est très peu étudiée ; 3) d’élucider comment l’administration de l’hormone étudiée corrige ce déficit; 4) plus généralement elle nous révèlera le rôle du de tout un système hormonal dans la tétée et cela nous permettra d’envisager d’élargir le traitement à des bébés qui présentent un déficit de tétée à la naissance (soit 10% des nouveau-nés). Les résultats attendus permettront donc de comprendre et de proposer un traitement approprié (en connaissance de cause) du déficit de tétée chez les bébés Prader-Willi mais aussi dans d’autres pathologies qui présentent un déficit de tétée. Cet aspect translationnel est vraiment très important.
Procédures
Sur les mères, les interventions sont : Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes. La séparation avec une partie de leurs nouveau-nés pour quelques heures (même si une partie des nouveau-nés restent avec elles). Sur les nouveau-nés, les interventions sont : Les injections sous cutanée sur les nouveau-nés. L’isolement de la portée de souriceaux de leur mère pendant 4 heures maximum. La manipulation des souriceaux pendant le test de saisie de tétine, La stimulation tactile des nouveau-nés à l’aide d’un pinceau. La stimulation externe (au niveau du tronc cérébral) de nouveau-nés à l’aide d’un laser Infra-rouge (peu énergétique) faite sur animaux non contraints Sur les souris génétiquement modifiées lors du maintien de lignée : caudectomie ; tatouage Il n'y a aucune procédure chirurgicale dans cette DAP. Un prélèvement de queue sera effectué sur animaux vigiles dans le cadre du génotypage si le génotypage ne fonctionne pas à partir d’une touffe de poils prélevée sur l’individu (des mises au point sont en cours) mais concernera au grand maximum 312 souris.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère douloureux. Malgré le temps très court de cette nuisance (
Devenir
Pour l’ensemble des animaux expérimentés en Procédures 1, 2, 4, 5 la mise à mort est justifiée par des analyses post-mortem sur des tissus prélevés. Procédure 3: 30 femelles réutilisées qui, après une première portée, seront utilisées deux fois dans notre étude et pourront aussi être utilisées comme génitrices 2 fois supplémentaires. Après 4 à 5 portées, les femelles seront euthanasiées. Procédure 6: 312 souris seront utilisées comme géniteurs (rices). Il s’agit du maintien de 8 lignées sur 4 ans et d’animaux qui seront géniteurs pour produire les animaux qui seront expérimentés. Ces animaux seront euthanasiés à l’âge adulte vers 6 mois.
Remplacement
Ce projet porte sur la physiologie et physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans le syndrome de Prader-Willi, qui est notre sujet d’étude. Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur le modèle de souris génétiquement modifié (qui mime ce déficit de tétée) et nous prenons en compte les analyses faites en parallèle sur les bébés Prader-Willi afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients.
Réduction
L'utilisation de souris qui sont identiques sur le plan génétique (ici une souche particulière de souris de laboratoire) permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour les tests de comportement depuis plus de 10 ans montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe, dans le test de saisie de tétine, pour valider la démarche statistique. En ce qui concerne les expériences pour étudier l’anatomie du cerveau ou l’activité électrique de neurones, nous utiliserons 6 animaux par condition. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, dépourvu de pathogènes spécifiques. La température et l’hygrométrie sont contrôlées, avec un cycle de lumière de 12h. Les cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Les souris sont entre 2 et 4 par cage, mais pas isolées ou exceptionnellement mais moins de 48 heures. La douleur/souffrance des animaux adultes et souriceaux est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes) en suivant la Grille de Score. Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie pourront être isolés de leur mère pendant 20min à 1h. Pendant le temps de séparation de leur mère, les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux au jour de la naissance et lors du tatouage des animaux de la procédure 6, un analgésique sera appliqué sur la peau pour diminuer la sensation de douleur.
Choix des espèces
L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude évalue des paramètres de comportement de tétée ainsi que l’anatomie du cerveau. Il est donc nécessaire d’étudier des mammifères, en particulier des modèles de souris de la maladies rare qui nous intéresse mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles de souris génétiquement modifiés. A ce jour, la souris est donc le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les stades choisis sont le jour de la naissance car le déficit de tétée observé chez les bébés Prader-Willi démarre à la naissance (tout comme dans le modèle souris étudié) et des souris femelles adultes, mères des nouveau-nés étudiés, sont aussi expérimentées.
Maintien de ressources génétiques pour l’étude de caractères de fitness et de variants morphologiques chez la poule
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- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Maintenir sur pied des lignées de poules pour de futures expériences et pour l'expertise utile aux sélectionneurs commerciaux : 3 640 poules vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, réutilisées ensuite comme reproductrices ou dans d'autres protocoles. Chaque animal subit une ou deux prises de sang de moins d'une minute, parfois au sinus occipital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut provoquer des lésions cérébrales. Le passage en cage collective ouvre des épisodes de picage pouvant aller jusqu'à des plaies cutanées profondes et des atteintes de l'appareil locomoteur, et les élevages de longue durée entraînent des dégradations d'état général dont la cause reste parfois indéterminée avant autopsie. Le porteur situe l'intérêt de ces lignées dans la coloration du plumage, caractère servant à distinguer les poulets commerciaux sur les marchés à l'export, et dans un déterminisme d'ovulations multiples encore inconnu.
Objectifs
Pour la lignée d'origine égyptienne , le présent projet vise à maintenir son originalité en limitant l'évolution de la consanguinité, inévitable dans une population fermée, et à caractériser son génome de manière approfondie. Pour les génotypes modèles, le projet consiste à produire des animaux de phénotypes contrastés au sein de familles informatives afin d'identifier la base moléculaire de ces phénotypes. Pour tous les caractères morphologiques, le déterminisme monogénique est déjà établi, mais la nature du gène responsable reste à identifier par séquençage du génome et analyses histologiques. Pour la lignée à ovulations multiples, un projet de séquençage est en cours pour identifier les régions du génome contrôlant ce caractère par différence avec les données de séquençage d’autres lignées de race identiques qui ne présentent pas ce phénotype.
Bénéfices attendus
La lignée d'origine égyptienne a déjà été étudiée pour l'étude des mécanismes de résistance à la coccidiose, à la maladie de Marek et a montré un effet d'hétérosis important en croisement avec une lignée commerciale de poules pondeuses à oeufs bruns. C'est un génotype de référence à garder disponible sur pied pour de futures expériences sur l'adaptation à des conditions d'élevage diversifiées ou sub-optimales. Les modèles génétiques donnent lieu à des publications de haut niveau présentant le mode d'action de gènes importants pour le développement ou pour la pigmentation. La coloration est un caractère utilisé pour distinguer différents types de poulets commerciaux et se révèle importante pour les sélectionneurs visant des marchés à l’export. Le maintien de ces modèles permet de conserver une expertise utile pour des collaborations avec les sélectionneurs commerciaux. Le déterminisme des ovulations multiples est encore inconnu, en particulier dans les lignées légères comme la race Leghorn blanche. Le maintien de cette lignée nous permet d’appliquer une approche de génétique inverse pour identifier ce déterminisme et de pouvoir ensuite réaliser des prélèvements pour valider des gènes candidats suggérés par l’approche génétique.
Procédures
Une à 2 prises de sang d'une durée de moins d'une minute
Impact sur les animaux
Le passage en cage collective ou en parquets au sol de groupes de coqs modifie la structure sociale du groupe, entraînant des comportements de dominance-dominé qui peuvent être observés jusqu'à ce que la structure sociale se rétablisse. Le passage à la cage collective comporte intrinsèquement des risques de picage entre les animaux, pouvant entraîner des plaies cutanées plus ou moins profondes et étendues, ainsi que des atteintes à l'appareil locomoteur. Au cours des élevages de longue durée comme celui-ci, une dégradation de l'état général d'un individu peut également être observée, les causes étant parfois indéfinies avant une autopsie. La réalisation d'une prise de sang est susceptible de conduire à la formation d'un hématome. Si elle est effectuée au niveau du sinus occipital, des lésions cérébrales peuvent survenir. La contention au moment de la prise de sang peut également générer un stress chez l'animal, qui est momentanément privé de ses mouvements (maximum 1 minute).
Devenir
Nous utilisons les individus pour permettre la production d'une descendance. Les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de pouvoir les réutiliser dans des protocoles de recherche nécessitant des individus en bonne santé et de génotype connu.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de maintenir une population d'animaux vivants présentant des phénotypes d’intérêt. Cette démarche ne serait pas réalisable sans leur utilisation. Toutefois, il est possible de réaliser de la congélation de semence pour les animaux porteurs de mutations identifiées. Le taux d’éclosion en semence décongelée reste très variable et toujours inférieur à 50%, donc on ne peut utiliser cette solution de remplacement que pour conserver des coqs porteurs d’une mutation déjà identifiée, facile à suivre dans leur descendance. En revanche, pour la lignée Fayoumi, des essais antérieurs de congélation de semence ont montré une faible fertilité après décongélation, donc cette solution est un appoint pour sécuriser la lignée ou reconstituer des familles perdues, mais en aucun cas une solution de remplacement total.
Réduction
Nous avons déjà réduit au maximum les effectifs de reproducteurs pour les génotypes modèles et pour la lignée d'origine égyptienne. Toutefois, au fur et à mesure de l'identification des mutations causales et de leur publication, nous prévoyons de diminuer le nombre d'animaux porteurs, et d’augmenter le recours à la congélation de semence si la qualité de la semence des coqs le permet, afin d’espérer une fertilité suffisante après décongélation.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront maintenus en groupes sociaux tout au long de l’élevage. Les animaux en comportement collectif auront à leur disposition divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques, des bandelettes de tissus pour stimuler le jeu, et des isolateurs seront inclus dans certaines cages pour offrir aux animaux des zones de refuge. Pour prévenir le picage, des répulsifs anti-picage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite) a été développé et sera fourni aux zootechniciens en charge du suivi des animaux. Procédure : Dans le cas de la prise de sang au sinus occipital, afin de réduire les risques de lésion cérébrale associés à cette procédure, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille pour éviter toute enfoncée excessive. La facilité de visualisation de ce site d'injection évitera l'arrachage douloureux de plumes pour les animaux. Un point de compression de 30 à 60 secondes sera effectué pour limiter la formation d'hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour assurer une contention appropriée pendant la prise de sang, permettant ainsi de limiter les mouvements erratiques des animaux susceptibles d'entraver le prélèvement. Tout le personnel affecté à cette tâche sera formé à la contention et à la prise de sang sur la volaille. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital recevront une formation spécifique à cette procédure et auront l'habitude de la réaliser régulièrement pour assurer la fluidité des gestes. Dans le cas de la prise de sang effectuée à la veine alaire ou jugulaire, de l'alcool à 70°C sera appliqué pour désinfecter la zone de prélèvement et profiter des capacités de vasodilatation de ce produit, rendant ainsi la ponction plus aisée. De plus, un point de compression sera réalisé et deux expérimentateurs seront mobilisés.
Choix des espèces
Les applications attendues de nos travaux concernent la sélection et la gestion de la diversité génétique des volailles. La poule est l’espèce de volaille la plus utilisée en recherche et en production. C’est aussi celle dont le génome est le mieux connu parmi tous les oiseaux domestiques. Enfin certains phénotypes ne s’expriment que dans cette espèce. Pour toutes ces raisons nous avons choisi l’espèce Gallus gallus. Les animaux sont utilisés au stade jeune, pour l’observation des variants morphologiques, et au stade adulte pour les performances de ponte et de production de semence.
Détection de la Listeria monocytogenes en dormance dans les tissus dans un modèle lapin
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- Troubles urogénitaux
38 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation de Listeria monocytogenes dans l'œil, dont le porteur indique qu'elle va "certainement" provoquer une infection et une zone inflammatoire locales, puis subissent une prise de sang et un prélèvement vaginal par semaine pendant quatre semaines, maintenues éveillées sous contention. L'infection peut aussi entraîner fièvre, prostration, perte d'appétit, diarrhée voire des complications neurologiques, alors que la dose recherchée est justement celle qui installe un portage sans symptôme. Le recours à l'animal est présenté comme "indispensable" et le travail sur "organisme entier vivant" comme le seul possible, la mise à mort étant justifiée par la "nécessité" de prélever les tissus pour y chercher la bactérie en dormance.
Objectifs
La Listeria monocytogenes est une bactérie qui peut contaminer l’alimentation et induire chez la femme enceinte un accouchement prématuré ou une fausse couche. Il a été découvert ces dernières années, que la bactérie pouvait persister dans les cellules sans être détectable (dormance de la bactérie) par des méthodes classiques de bactériologie. Les objectifs du projet sont de mettre au point des outils et méthodes de détection de ces bactéries en dormance lorsqu’elles sont cachées dans les cellules en utilisant un modèle biomédical, ici la lapine. L’objectif est de définir la dose de Listeria, qui induit le portage de la bactérie mais sans symptôme de façon à tester les nouveaux outils de détection. Les résultats de cette étude, effectuée sur des lapines, permettront de valider les outils de détection de la Listeria et apporteront une meilleure connaissance des stratégies adaptatives développées par Listeria pour se cacher chez son hôte sans symptôme clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure connaissance des stratégies d’adaptation développées par Listeria monocytogenes pour se cacher (dormance) pendant plusieurs semaines, chez son hôte. Ces résultats serviront de preuve de concept pour étudier les échantillons d’endomètre humain prélevés chez des femmes présentant des fausses-couches à répétition.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure d’instillation oculaire (38 animaux, 1 seule fois, environ 3 minutes), prise de sang (2 ml, 1 fois par semaine pendant 4 semaines sur 20 animaux, environ 3 minutes) sur animal vigile, sous contention légère; à des prélèvements vaginaux (à 72h puis 1 fois par semaine sur 20 animaux), sur animal vigile, sous contention légère.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont ceux liés à la Listeria qui peut induire comme signes cliniques : de la fièvre, une prostration, une perte d’appétit, des toubles digestifs (plutôt diarrhée) voire des complications neurologiques. Ces signes peuvent potentiellement apparaître dans un pas de temps limité dans la mesure où les doses de Listeria choisies ne doivent pas induire de symptomes cliniques. Cependant l’instillation oculaire de la Listeria va certainement induire localement, au niveau des yeux, une infection et une zone inflammatoire transitoire (quelques jours). Concernant les prélèvements, des prélèvements vaginaux et une prise de sang seront réalisées, nécessitant une contention.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour plusieurs raisons : - infection à une souche de Listeria infectant l’espèce humaine - nécessité de prélever les tissus pour rechercher la Listeria entrée en dormance
Remplacement
Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier si le portage asymptomatique (hébergement sans exprimer de symptome de la maladie) de la Listeria est possible dans différents tissus, il peut donc y avoir des bactéries dans les tissus sans manifestation de signe clinique donc cela necessite de travailler sur organisme entier vivant pour prendre en compte la complexité des processus physiologiques engagés. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou un modèle de simulation informatique.
Réduction
Lors de la conception du protocole expérimental, nous avons déterminé le nombre minimum d'animaux à utiliser. Pour cette raison, nous avons prévu une étude pilote pour définir la plus faible dose permettant d’induire un portage asymptomatique de la Listeria (3 doses testées, 18 animaux en tout). Ensuite, la plus faible dose retenue permettant un portage asymptomatique de la Listeria sera testée sur 20 animaux de façon à collecter tous les tissus et valider les tests de détection de la listeria. Nous avons prévu un maximum de 20 lapines pour pouvoir valoriser ces données. L’hypothèse du portage asymptomatique a été validée in vitro sur plusieurs types cellulaires en culture, toutefois la littérature n’a pas de recul sur la proportion de lapines chez lesquelles Listeria sera soit complètement éliminée (lapines guéries) ou soit entrée en dormance chez des individus asymptomatiques après cette infection, cas de figure recherché, ou encore mortelle (non attendu). Un premier lot de lapines sera exposé, en fonction de la réponse de ces lapines et si nécessaire, un 2nd lot sera exposé pour conforter les premiers résultats et compléter les effectifs.
Raffinement
Les lapines seront hébergées en cage individuelle mais avec un contact visuel avec les autres lapines. Ces cages disposent de plateformes pour se mettre en hauteur ou, dessous, de se cacher, des jouets en plastique, des cubes de foin ou des batons de bois à ronger, du papier kraft ciselé sont également mis à disposition. Les paramètres d'ambiance de l'animalerie sont contrôlés. Une acclimatation d’une semaine sera réalisée pendant laquelle les lapines seront habituées à la présence humaine, au change des cages et aux manipulations par le personnel. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Ce suivi inclura l’observation du niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation et la manipulation d’une zone douloureuse. De plus, l’évaluation de l’état de l’œil, à savoir si l’œil est propre et brillant, sera suivie. Si la lapine présentait une douleur élévée alors une décision serait prise en concertation avec le vétérinaire quant à un recours à la mise à mort de cet animal. Des points limites reposant sur une grille de score intégrant ces différents paramètres ont été établis. Ainsi l'ensemble de ce suivi nous permettra d’intervenir rapidement et de manière graduelle si des signes de souffrance apparaissaient. En cas de signes de douleur, ceux-ci seront pris en charge par l'administration d'analgésiques adaptés (anti-inflammatoires, opioïdes).
Choix des espèces
L'objectif est de reproduire des expériences anciennes de contamination par la Listeria chez la lapine, par conséquent seule cette espèce peut être utilisée pour en explorer les mécanismes. A la suite de ce projet, notre objectif est d’explorer les effets de la Listeria rentrée en dormance sur la gestation. Or ce modèle est pertinent pour étudier le placenta dont la structure est plus proche de l’homme que celle des modèles rongeurs. Nous nous appuyerons sur ces résultats pour le futur projet, le cas échéant. Seules des lapines adultes seront utilisées car l’objectif est d’évaluer le portage asymptomatique de la Listeria chez des lapines pubères.
Evaluation de l’innocuité d’une souche de Bacillus cereus
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune suivie vingt et un jours après une injection sous-cutanée unique de bactéries dont on ignore si elles rendent malade. Elles sont observées toutes les quatre heures le premier jour, puis chaque jour. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles ne sont plus naïves immunologiquement et pourraient porter l'agent pathogène. Le bénéfice annoncé est de "préciser les conditions de manipulation" de cette souche au laboratoire, alors que le RNT reconnaît qu'en cas de virulence la mort peut survenir en quelques heures et qu'"aucun point limite ne peut donc être défini".
Objectifs
Les bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato rassemblent de nombreuses souches appartenant à des espèces de mieux en mieux caractérisées - 24 espèces actuellement. Dans ce groupe la dénomination ne renseigne pas sur la pathogénicité d’une souche. Les facteurs de virulence sont souvent portés par des plasmides. Chez l’humain, les souches les plus virulentes possèdent des caractéristiques génétiques proches d’une bactérie pathogène, Bacillus anthracis. Plusieurs projets menés ont permis de séquencer et analyser les génomes d’environ 200 souches de Bacillus cereus sensu lato Parmi ces génomes séquencés, celui de la souche B93 ou CRBIP3.5817 a retenu notre attention. La souche est positionnée comme une souche a priori non-virulente. Cependant, il n’est pas connu si par des mécanismes encore inconnus, cette souche pouvait produire des molécules lui conférant une virulence supérieure à la souche, ne correspondant pas au niveau habituel de l’espèce. Ce projet permettra de préciser les conditions de manipulation de cette souche.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont de préciser les conditions de manipulation de la souche B. cereus B93 et, en cas d'expression d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate, les mécanismes encore inconnus mis en oeuvre. Dans le cas où un certain degré de virulence serait observé, les conditions de manipulation seraient réévaluées et les facteurs bactériens en cause seront étudiés, faisant alors l'objet d'un nouveau projet scientifique spécifique.
Procédures
- Injection sous-cutanée (quelques secondes par animal) unique de bactéries, dont la capacité à causer une maladie n’est pas encore connue. Le suivi est de 21 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances seront : - Injection des bactéries (une fois par animal, par voie sous-cutanée ventrale peu douloureuse). - Les données actuelles sur cette souche de B. cereus permettent d'envisager l'absence de virulence, donc de maladie. - En cas de virulence détectable, les symptômes pourront aller jusqu’à ceux de la maladie du charbon, c’est-à-dire que la mort des animaux survient de façon foudroyante, quelques heures au maximum après l'apparition de signes cliniques (prostration); aucun point limite ne peut donc être défini, seule la mise à mort des animaux présentant des signes cliniques lors de l'observation est retenue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne seront plus naïfs immunologiquement, et présenteraient un risque de porter l’agent pathogène et ne peuvent donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Afin de satisfaire aux exigences de Remplacement, Réduction, Raffinement, nous avons mené des tests préliminaires in vitro, mais seuls les tests in vivo permettront de confirmer l'absence ou la présence d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate et d’apprécier son impact éventuel sur l'innocuité de la souche. Le projet porte sur des interactions entre l'hôte et une bactérie, et ne peut pas être remplacé par d’autres méthodes. Par exemple, l'expression d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate ne peut être évaluée que dans les conditions très complexes du milieu intérieur de l’hôte (composition complexe, compartiments, etc.) où la bactérie est confrontée à des conditions réelles complexes et encore non maîtrisées in vitro dans l’hôte. Les tests préliminaires in vitro ont évoqué une présence possible de capsule pseudoprotéique de polyglutamate à la surface des bactéries. Les facteurs de régulation connus pour la synthèse d'une telle capsule ne sont cependant pas présents dans la souche étudiée, les stimuli à l’origine de cette expression sont encore inconnus. Le milieu intérieur de la souris est complexe, avec l'existence de nombreux paramètres physiologiques pouvant induire l'expression de facteurs bactériens. S'il existe de telles conditions, leur caractérisation lors d’une suite au présent projet permettra de reproduire ces conditions in vivo dans des modèles in vitro, permettant de s'affranchir à terme des animaux.
Réduction
Le projet a été élaboré dans le souci de réduire le nombre de souris nécessaires à l’expérimentation à une valeur minimale et de valoriser chaque animal. Avec le raffinement des méthodes d’analyse, le nombre d’animaux a été défini et donc réduit au minimum nécessaire par usage des statistiques et l’usage d’une approche progressive d’évaluation afin d’exclure rapidement les tests inutiles. Le nombre d’animaux indiqué dans ce projet ponctuel résulte de l'expertise acquise dans le domaine de la virulence des bactéries étudiées pour l'évaluation de la virulence d'une souche. Il est réduit au minimum tout en permettant d'obtenir des données significatives quant au niveau de virulence de la souche. Dans la mesure du possible les animaux générés en trop par l’animalerie d’élevage de l’institution seront utilisés. L'optimisation des procédures et protocoles sera effectuée au cas où une certaine virulence serait observée initialement afin de coller au plus près à la réalité expérimentale et diminuer in fine le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux objectifs.
Raffinement
Durant les expériences, un suivi strict des animaux sera opéré tout au long de l’expérience via une observation régulière (aux 4 heures le premier jour puis chaque jour) pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précède généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (identifié via une grille de score) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques, des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de nourriture en gel hydrique, réhydratation sous-cutanée.
Choix des espèces
Les souris sont très sensibles à l’infection par le pathogène étudié. Les souris sont utilisées à l'âge de 7-14 semaines afin d’être représentatives de l’espèce à l’âge adulte et par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. Les infections étudiées ne dépendent pas de l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.
Impact de l’interaction entre le microbiome respiratoire et le glycome sur la sensibilité des bovins aux infections
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Des veaux de 15 à 30 jours sont retenus parce que l'immunité transmise par le colostrum commence alors à décliner, ce qui les rend plus vulnérables à l'infection qu'on va leur inoculer. Ils sont 28, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, l'autre d'un niveau modéré. Chacun subit huit prises de sang, huit sessions d'écouvillonnage nasal profond à trois écouvillons par narine, huit écouvillonnages rectaux et huit lavages broncho-alvéolaires, quatorze d'entre eux recevant en plus une co-infection virale et bactérienne par masque puis huit administrations d'antibiotique. Tous sont tués par injection à la fin du projet, pour des analyses post mortem sur leurs organes.
Objectifs
Le complexe respiratoire bovin revêt une importance capitale, tant en France que sur le plan international, en raison de son impact sur la santé et le bien-être des animaux, ainsi que des pertes économiques significatives qu’il entraîne. Les principaux agents pathogènes de cette affection sont des bactéries et des virus qui agissent de concert de façon synergique. Chez les animaux en bonne santé, le mucus des voies respiratoires forme une barrière protectrice, composée de mucines et d’un écosystème microbien diversifié, qui joue un rôle crucial dans la prévention de l’invasion pathogène et dans la facilitation de leur élimination. Ces pathogènes exploitent souvent les glycanes présents sur les cellules eucaryotes et les mucines (le « glycome ») pour infecter l’hôte. Alors que chez l’homme, des études indiquent un rôle essentiel du complexe microbiote-glycome respiratoire dans la modulation de la colonisation par les agents pathogènes, les données relatives aux animaux restent encore limitées. Dans ce cadre, l’objectif principal de notre projet est d’explorer les interactions régulatrices entre le microbiome et le glycome des voies respiratoires chez les veaux, et leur réponse à une infection polymicrobienne ainsi qu’à un traitement antibiotique précoce. De manière plus spécifique, ce projet vise à : (1) caractériser les variations temporelles du microbiote et du glycome des mucines respiratoires, (2) identifier les profils de glycome et microbiens post-infection qui sont indicatifs de processus moléculaires liés à l’adhésion et la réplication virales, à la réponse immunitaire, à la guérison ou à la résilience, (3) décrire la dynamique du résistome microbien, et (4) confirmer la corrélation entre les profils de glycanes et le tropisme viral.
Bénéfices attendus
Notre projet se distingue par trois innovations majeures. Tout d’abord, il vise à identifier des biomarqueurs microbiens et glycomiques qui sont associés à la réaction, la récupération ou la résilience face aux infections respiratoires et à l’administration d’antibiotiques. Ces biomarqueurs viendront compléter les stratégies conventionnelles telles que la vaccination, les mesures de biosécurité, une nutrition et une hygiène adéquates, le contrôle des vecteurs et les soins vétérinaires réguliers. Ensuite, nous évaluerons les biomarqueurs glycomiques tant in vitro qu’ex vivo, notamment en testant la capacité des virus à se lier aux glycanes et leur potentiel de transmission entre espèces, une donnée actuellement inexistante pour les pathogènes affectant le bétail. Enfin, l’analyse comportementale et l’utilisation de capteurs pour le suivi du bien-être animal pourraient mener à l’identification de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies. Au-delà de ces avancées, les biomarqueurs glycomiques et microbiens issus d’animaux résistants pourraient conduire au développement de glycanes à effet prébiotique et à la création de consortiums microbiens synthétiques (SynComs), qui seront expérimentés en tant que probiotiques de nouvelle génération.
Procédures
1/ co-infection expérimentale par voie nasale, à l'aide d'un masque : n = 14 veaux, une seule fois, durée : 8 à 12 minutes ; 2/ administration d'un antibiotique (tilmicosine) par voie orale : n = 14 veaux, 2 fois par jour pendant 4 jours soit 8 administrations au total, durée : 2 minutes maximum par administration ; 3/ prises de sang : n = 28 veaux, 8 prélèvements sanguins/veau, durée : 2 minutes maximum/prélèvement, 4/ écouvillonnages nasaux profonds : n = 28 veaux, 8 sessions/ veau avec, pour chaque session, 3 écouvillons dans chaque narine, durée : 3 minutes maximum/session ; 5/ écouvillonages rectaux : n = 28 veaux, 8 prélevements/veau, avec 2 écouvillons par veau, durée : 15 secondes//prélèvement ; 6/ lavages broncho-alvéolaires : n = 28 veaux, 8 prélèvements/veaux, durée : entre 5 et 10 minutes par prélèvement (en fonction de la acilité d’introduction de la sonde dans la trachée).
Impact sur les animaux
La co-infection IDV/BCoV/Mycoplasma bovis, peut provoquer des effets indésirables potentiels sur la santé et le bien-être des veaux : 1/ signes cliniques de maladie respiratoire : toux, écoulement nasal, augmentation de la fréquence respiratoire, difficultés à respirer, hyperthermie, baisse de l'apport alimentaire. 2/ Perte de poids : les veaux peuvent connaître une perte de poids en raison de la combinaison d'une diminution de l'apport alimentaire et des dépenses énergétiques liées à la lutte contre l'infection. 3/ Déshydratation : la fièvre et l'augmentation du rythme respiratoire peuvent contribuer à la déshydratation chez les veaux infectés. 4/ infections bactériennes secondaires (bronchopneumonie alvéolaire) consécutives à un affaiblissement du système immunitaire et aggravant les troubles respiratoires initiaux. 5/ Stress : la manipulation/contention et la collecte d'échantillons peuvent induire du stress chez les veaux. 6/ Changements comportementaux : les veaux infectés peuvent présenter des changements de comportement, tels qu'une activité réduite et des interactions sociales diminuées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par injection à la fin du projet., afin de réaliser des analyses post mortem sur leurs organes, dont les résultats viendront compléter les données obtenues de leur vivant.
Remplacement
Il n'existe pas de système in vitro capable de simuler fidèlement l’interaction complexe entre les pathogènes respiratoires, le microbiote et les mucines respiratoires. Les cultures in vitro ne permettent pas de reproduire les conditions nécessaires pour l’étude des virus, des mycoplasmes et de l’ensemble des microorganismes et mucines du système respiratoire.
Réduction
Un effectif de 7 veaux par lots expérimentaux assure la faisabilité de l’étude tout en permettant d’obtenir des données statistiques robustes pour observer un effet potentiel. Cette stratégie s’appuie sur les données d’une étude précédente, dans laquelle un modèle de coinfection IDV-M. bovis avait été utilisé sur de jeunes veaux. Malgré une variabilité individuelle notable dans la réponse clinique, un effectif de 5 animaux avait suffi à démontrer des différences significatives par rapport à des veaux témoins non infectés. Une ANOVA à un facteur a été utilisée pour comparer les moyennes des aires individuelles sous les scores cliniques quotidiens (ACS). Lorsque l’effet du facteur “traitement” était significatif, un test de Newman-Keuls a été utilisé pour comparer les effets des traitements à chaque point de temps. Un test t (test de Mann-Whitney) a également été effectué pour ces paramètres.De plus, les données virologiques et bactériologiques s'étaient révélées relativement homogènes entre les individus, offrant une corrélation directe avec la pathogénicité dans l’appareil respiratoire profond. Par sécurité, nous avons choisi d'inclure 2 veaux supplémentaires par lot afin de pallier d'éventuelles exclusions d'individus pour des raisons sanitaires (infections intercurrentes) ou éthiques (atteinte des points limites).
Raffinement
Les veaux seront logés dans un bâtiment divisé en quatre aires paillées, chacune accueillant 7 animaux et mesurant 60 m². L’environnement sera enrichi avec des jouets robustes et flexibles de différentes matières et couleurs, ainsi qu'avec des bidons et des cônes de chantier pour stimuler leur curiosité. Avant le début de la procédure expérimentale, ils bénéficieront d'une période d'acclimatation à leur nouvel environnement de 14 jours. Si l'un des veaux manifeste des signes de détresse ou d’inconfort lors de l'inoculation intranasale, la nébulisation sera immédiatement interrompue et l’animal sera réconforté puis surveillé jusqu'à récupération complète. Lors de la procédure, les prélèvements seront effectués par des personnes préalablement formées. A chaque point d'étape, les 3 types de prélèvement (prise de sang, écouvillons nasaux, écouvillons rectaux, lavages broncho-alvéolaires) seront réalisés à la suite, de manière à attraper et à contenir une seule fois les animaux. Les prises de sang seront effectuées en alternance à la veine jugulaire droite et à la veine jugulaire gauche, de manière à minimiser les risques de phlébite. Lors des lavages broncho-alvéolaires (LBA), un anesthésique local (lidocaïne) sera pulvérisé sur la muqueuse nasale (Xylocaine spray 10%, 50mL), 2 minutes avant introduction de la sonde dans le naseau et l'extrémité de celle-ci sera enduite d'une pommade anesthésique composée de lidocaïne et prilocaïne, agissant par diffsion et induisant una anesthesie de quelques millimètres (EMLA). Les animaux présentant des symptômes respiratoires marqués à sévères seront exemptés de LBA. Suite à l'infection expérimentale, le comportement et le bien-être des animaux seront évalués quotidiennement. Une surveillance sanitaire rigoureuse sera également assurée par un personnel qualifié : un vétérinaire évaluera l’état clinique de chaque animal deux fois par jour, mesurant la température rectale, la fréquence cardiaque et respiratoire, et notant tout comportement anormal tel que le refus de s’alimenter, l’agressivité, le retrait social ou l’abattement.
Choix des espèces
Le projet visant à étudier l'impact de l'interaction entre le microbiome respiratoire et le glycome sur la sensibilité des bovins aux infections, il est nécessaire d'utiliser un modèle bovin. Des veaux âgés de 15 à 30 jours seront sélectionnés pour notre étude. Ils seront infectés entre 30 et 45 jours, ce qui correspond à la période critique où les bronchopneumonies infectieuses se manifestent fréquemment dans les élevages bovins sous des conditions naturelles. L’âge de 22-30 jours est particulièrement significatif car il marque le début de la diminution de l’immunité maternelle colostrale, rendant les veaux plus susceptibles aux infections et donc un moment idéal pour étudier la réponse immunitaire face aux agents pathogènes. Cette fenêtre temporelle est donc stratégique pour reproduire les conditions d’apparition des maladies respiratoires et pour évaluer l’efficacité des interventions thérapeutiques.
Etude du rôle d’une nouvelle protéine du système immunitaire dans l’infection à Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées dans l'abdomen avec une souche de salmonelle qui provoque chez elles une infection généralisée mortelle, 156 souris vont toutes être tuées, 60 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 96 un niveau modéré. Le porteur décrit l'état fébrile, les poils hérissés, le dos recourbé, les écoulements oculaires et la mobilité réduite qui suivent l'infection, et écarte tout traitement de la douleur au motif qu'il modifierait la cinétique de la létalité. L'enjeu est de vérifier si une protéine repérée en culture cellulaire joue le même rôle dans un "organisme vivant intégré et autonome", étape qu'il juge "nécessaire" avant d'envisager des applications contre les bactéries résistantes. Le résumé annonce trois interventions et n'en décrit que deux, l'inoculation et une prise de sang à la joue.
Objectifs
La réponse immune anti-bactérienne dépend de l’activation de récepteurs spécialisés par des molécules bactériennes, résultant en la production de cytokines pro-inflammatoires. Nous avons récemment identifié une protéine, qui participe à une cascade de signalisation de la réponse immunitaire. Nos données in vitro en culture cellulaire indiquent que cette protéine est centrale pour cette cascade de signalisation, notamment lors de l’infection par la bactérie Salmonella. Dans ce projet, nous avons pour objectif d’interroger le rôle de cette protéine dans l’activation de la réponse immune anti-bactérienne durant une infection à Salmonella in vivo. Ce projet répond à la fois à une question scientifique (améliorer notre compréhension de la voie de signalisation de l’immunité innée) mais aussi médicale (la protéine d’intérêt peut-elle être ciblée pour « booster » la réponse anti-bactérienne ? Question d’autant plus importante au vu de l’augmentation du nombre de souches antibiorésistantes.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de comprendre le rôle d’une protéine dans une voie de signalisation de réponse aux infections bactériennes, en utilisant Salmonella comme modèle. Cela va tout d’abord faire progresser la connaissance scientifique en décrivant une voie majeure d’activation de l’immunité chez l’humain. Nos données in vitro avec des cultures cellulaires indiquent que la protéine étudiée participe à cette voie, mais il est nécessaire de questionner ce fait dans un organisme vivant intégré et autonome, ici chez la souris. Il s’agit d’un bénéfice à court terme, obtenu à la complétion du projet. À plus long terme, ce projet ouvre des perspectives cliniques et vétérinaires. En effet, cette voie d’activation de l’immunité est majeure dans le contrôle de l’infection bactérienne, mais aussi dans les pathologies de sur-activation de l’immunité (choc septique). Si ce projet apporte la preuve que la protéine étudiée participe à la la réponse immunitaire in vivo, nous pouvons imaginer des approches thérapeutiques d'activation de cette protéine (dans le cas d’infections bactériennes résistantes aux antibiotiques) ou d’inhibition de celle-ci (dans le cas du choc septique).
Procédures
3 interventions prévues : inoculation d’une bactérie pathogène par voie intra-péritonéale (1 seule fois, moins de 3 min) et prélèvement de sang à la veine submandibulaire (1 seule fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Salmonella Typhimurium cause une infection systémique létale chez la lignée de souris utilisée, reproduisant les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes chez l’homme. Les symptomes suivants apparaissent au cours de l’infection : état fébrile, poils hérissés, dos recourbé, écoulements oculaires, mobilité réduite. La contention peut générer également du stress. L’inoculation par voie intra-péritonéale et la prise de sang dans la veine submandibulaire peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection de l’inoculum et de la prise de sang respectivement.
Devenir
Les animaux de la procédure létalité sont euthanasiés à l’atteinte du point limite. Les animaux qui servent à évaluer le niveau de colonisation des organes et aux prélèvements de sang sont euthanasiés pour faire les prélèvements.
Remplacement
Avant de proposer ce projet, nous avons implementé des approches de remplacement basée sur de la culture cellulaire : 1) Génération d’une lignée de macrophages murins n’exprimant pas la protéine d’intérêt. Il a été observé une perte de la production de cytokines pertinentes et une augmentation de l’infection à Salmonella dans ces cellules comparées aux cellules contrôles. 2) Modèle de sur-expression de la protéine d’intérêt, la production de cytokines pertinentes est augmentée de manière dose-dépendante dans cette lignée. Ces résultats documentent le rôle central de la protéine d’intérêt dans l’activation cytokinique bactério-induite in vitro. Il s’agit maintenant de tester l’importance de la protéine d’intérêt lors d’une réponse immunitaire à l’infection bactérienne in vivo pour démontrer définitivement son rôle essentiel dans un modèle complexe. Il n’existe pas à ce jour de modèle expérimental autre qu’animal récapitulant de manière convaincante une réponse immune.
Réduction
Différents scénari ont été testés avec une ou 2 études pilotes avant l’expérimentation finale. C’est le scénario avec une étude pilote qui utilise le moins d’animaux. L’étude pilote prévue permet de choisir la dose la plus adaptée à notre question scientifique. Elle permet également de déterminer le pic d’infection afin de déterminer les time-points d’autopsies les plus pertinents de l’expérimentation finale. Le nombre d’animaux par lot a été choisi sur la base de la littérature qui montre que 15 souris par lot permettent de voir une différence significative entre les 2 modèles murins que l’on souhaite tester suite à l’infection par Salmonella et sur le calcul de la puissance du test stastistique utilisé lors de la comparaison des résultats obtnenus sur les deux modèles.
Raffinement
Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Les animaux sont hébergés selon les conditions de l’établissement utilisateur agréé, en tenant compte de l’état physiologique des animaux avec contrôle (relevé télémétrique de la température, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général) et enregistrement de la température ambiante. Du papier sopalin est utilisé dans les cages de souris comme raffinement au cours de l’expérimentation. Des igloos, tunnels ont été testés il y a plusieurs années mais ils rendent le suivi des symptomes plus compliqués. Il est alors nécessaire de faire sortir les souris pour les observer. Ce « dérangement » des souris malades nous a paru être plus embêtant que le bien-être que peuvent apporter ces structures en début d’expérimentation lorsque les souris vont bien. Nous avons donc choisi de nous en tenir au papier sopalin comme raffinement. L’utilisation de méthode pour réduire la douleur liée à l’infection par Salmonella n’est pas possible car elle modifierait la cinétique d’apparition des symptômes et la cinétique de létalité et ne reproduirait donc plus la maladie.
Choix des espèces
La lignée de souris inoculées avecSalmonella est un modèle d’infection systémique létale naturel qui reproduit les infections systémiques létales observées chez l’homme et causées par S. Typhi, S. Paratyphi A/B/C ou S. Sendai. Ces souris sont naturellement sensibles à l’infection par Salmonella. Ce modèle est donc particulièrement pertinent pour notre étude. Les souris utilisées sont adultes. Elles ont entre 6 et 8 semaines d’âge, et ce, conformément au modèle publié dans la littérature.
Etude longitudinale par IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) in vivo de l’effet d’une supplémentation en phosphate sur l’ostéodystrophie dans un modèle de souris d’insuffisance rénale par néphrectomie.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Ablation des deux tiers d'un rein, puis ablation complète du second une semaine plus tard : 173 souris subissent cette double néphrectomie, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent ensuite dans un imageur à résonance magnétique à 22, 26, 28 et 32 semaines, avec un prélèvement sanguin après chaque séance, pour suivre la dégradation osseuse qui accompagne l'insuffisance rénale et tester l'effet d'un régime enrichi en phosphate. Le porteur écrit ne pas prévoir d'analgésique pour l'imagerie, celle-ci n'étant pas douloureuse, et juge négligeable le risque d'infection des incisions chirurgicales. Il indique dans le même temps que le taux de survenue des effets secondaires de ce modèle, hypertension et modifications de la production d'urine comprises, n'est pas mentionné dans les publications.
Objectifs
Nous proposons donc de réaliser une étude prospective longitudinale dans un modèle murin afin d’étudier les corrélations entre plusieurs techniques d’évaluation osseuse - de la biologie à l’imagerie IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et SRM (Spectrsocopie par Résonance Magnétique) hautes résolutions- in vivo. L’objectif principal sera de rechercher la meilleure combinaison de marqueurs, biologiques, imagerie, corrélés entre eux et comparée au gold standard (l’histologie) afin de caractériser le TMO MRC (trouble du métabolisme minéral et osseux de la maladie rénale chronique) en suivant son évolution au cours de la dégradation de la fonction rénale chez la souris, pour se rapprocher des stades 3 à 5 définis chez l’Homme. Le deuxième objectif est d’évaluer l’impact du régime phosphaté sur les marqueurs du remodelage osseux. En effet il a été montré depuis longtemps que le phosphate joue un rôle important dans la minéralisation osseuse. A long terme l’objectif clinique est une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Procédures
Les souris seront soumises deux chirurgies (néphrectomie 5/6eme) : Ablation des 2/3 d'un rein et ablation complète du second rein 1 semaine plus tard. Les souris passeront dans le spectromètre imageur IRM/SRM avant chirurgie (à 22 semaines) et toutes les 4 semaines après (à 26, 28 et 32 semaines). Des prélèvements de sang seront réalisés après chaque IRM/SRM
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à la chirurgie néphrectomie de l’insuffisance rénale et feront l'objet de points limites. La fonction rénale de la souris sera réduite. Comme toute chirurgie, il peut y avoir un risque d’infection au niveau des incisions. Même si ce risque est négligeable vu que la chirurgie sera réalisée dans une salle dédiée à l’expérimentation animale avec des mesures d’asepsie. Dans ce modèle il peut être observé parfois une hypertension ainsi que des modifications de la production d’urine et du métabolisme des protéines. Dans les publications le taux de survenue des effets secondaires n’est pas mentionné. L’injection ntraveineuse (IV) des agents de contraste ne provoque pas de douleur supérieure à celle d'une piqure d'aiguille . Pas d’effets indésirables liés à l’IRM qui est une technique d’imagerie totalement non invasive et atraumatique. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse (isoflurane à 1.5%) pendant toute la durée des acquisitions IRM. Leur rythme respiratoire est surveillé tout au long de l'imagerie par un ballonet placé sous la cage thoracique. De plus la souris est placée sur un petit tapis chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37,4°C.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin des acquisitons IRM/SRM à chaque stade pour l'étude par stade et au dernier stade (36 semaines) pour l'étude longitudinale. La mise à mort est faite pour des études post mortem.
Remplacement
L’ostéodystrophie osseuse ne peut être étudiée autrement que sur un système vivant car elle est une des conséquences de l’insuffisance rénale. Cette pathologie osseuse ne peut être induite sur cellules. Dans la bibliographie il existe plusieurs modèles d’insuffisance rénale ou transgénique mais aucun mais ils n’entraînent pas forcément une ostéodystrophie qui se maintient au cours du temps (pas de remodelage osseux).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi du développement de l’ostéodystrophie ainsi que la SRM permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Ce projet nécessitera 173 souris.
Raffinement
PPendant toute la durée de l’expérimentation, les souris sont hébergées en portoir ventilé. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Pendant les actes d’imagerie les souris sont sous anesthésie à l’isoflurane. Pas d’analgésique puisque l’IRM n’est pas douloureuse. L’hypothermie est évitée puisque les souris sont placées sur un tapis chauffant (circulation d’eau chaude). Pour la chirurgie, une analgésie préopératoire sera réalisée par injection sous cutanée La souris sera alors anesthésiée à l'isoflurane. En post opératoire, afin d’éviter les douleurs post-opératoires, des injections sous cutanées d'antalgique seront réalisées. Pour la nuit une gelée àd'analgésique sera réalisée.
Choix des espèces
Le modèle d’insuffisance rénale peut être réalisé sur souris ou sur rat. Nous avons choisi la souris pour deux raisons : 1) nous nous sommes appuyés le modèle souris déjà publié et validé (Shobeiri N., Am J Nephrol 31(6), 471-481, 2010) 2) et 2) Notre spectromètre imageur IRM 7T possède tout le matériel optimisé pour réaliser les études chez la souris.
Elevage des tiques dures sur lapins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
L'objet réel de ce projet est de nourrir avec du sang de lapines vivantes un élevage de tiques que l'unité entretient depuis quinze ans. 10 lapines vont être utilisées sur cinq ans, cinq tuées et cinq adoptées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tiques restent fixées sur leurs oreilles quatre à sept jours, sans anesthésie ni pendant la pose ni les jours suivants, et chaque lapine sert trois fois en quatre mois pour couvrir un cycle complet du parasite. Le devenir dépend du caractère de l'animal, celles que le porteur juge trop agressives seront tuées après avis du vétérinaire, les plus dociles proposées à des particuliers.
Objectifs
L’élevage des tiques est bien établi dans l’unité depuis 15 ans. L’objectif principal de ce projet est d’établir et de maintenir des élevages de tiques qui sont les vecteurs de certaines maladies humaines et animales et d’étudier le rôle des tiques dans l’acquisition et la transmission de certains microorganismes aux humains et aux animaux.
Bénéfices attendus
Cet élevage permettra de maintenir des espèces de tiques nécessaires pour différents projets de recherche évaluant les interactions entre les pathogènes et les vecteurs (tiques) pour la compréhension de la transmission des maladies humaines et animales (zoonose).
Procédures
Une lapine sera utilisée pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (oeufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Les lapines ne sont pas anesthésiées ni durant la pose des tiques, ni les jours suivants. Les tiques restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont dues à la piqure des tiques qui restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement de la tique. Cette fixation provoque des lésions peu importantes et parfois des démangeaisons.
Devenir
Les animaux qui sont trop agressifs pour être adoptés et ceux qui auront d’autres anomalies seront euthanasié après avis du vétérinaire de notre laboratoire. Par contre, les animaux en bonne santé et les moins agressifs seront adoptés pas des particuliers.
Remplacement
Les tiques sont des acariens strictement hématophages à tous les stades de développement. Actuellement, aucune alternative de remplacement des lapins pour l’engorgement des tiques n’est disponible, malgré les différents essais que nous avons réalisé dans notre laboratoire pour gorger les tiques sur des membranes artificielles comme c’est le cas des moustiques, puces, punaises de lit et triatomes que nous élevons également au sein de notre laboratoire.
Réduction
Un lapin sera utilisé pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (œufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 3 à 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Un lapin sera donc utilisé 3 fois/an/espèce de tiques. Donc, seulement 2 lapins seront utilisés par an (un pour chaque espèce de tiques de notre élevage) soit 10 lapins pendant la durée totale de ce projet (60 mois).
Raffinement
Pendant la période d’engorgement nous allons proposer le gel Diet Energy de Safe dites qui est un aliment hydraté contenant 63% d’eau. Après engorgement des tiques les oreilles des lapins seront nettoyées avec de la bétadine et les jours suivants jusqu’à guérison des lésions causées par les tiques. Les lapins sont visités chaque jour y compris les week-end et jours fériés pour s’assurer que les animaux ont de la nourriture et de l’eau. Ils seront manipulés en dehors des procédures expérimentales, dans un espace calme, par du personnel formé et habitué. Les cages de chaque lapin seront enrichies avec des foins, des jouets en bois.
Choix des espèces
Le lapin (New Zealand) est l’espèce animale la plus appropriée pour nourrir les trois stades de développement des tiques, compte tenu du fait que c’était l’espèce qui a été utilisée pour adapter et établir un élevage des tiques au laboratoire. Ces lapins sont de grande taille à l'âge adulte, ils sont dociles et donc faciles à manipuler, ce qui est un avantage. Ce projet n'inclura que des lapins adultes en raison de leur taille. La taille des adultes permettra de les manipuler facilement et de nourrir plus de tiques sans utiliser d'animaux supplémentaires. La grande taille des oreilles permet un nourrissage d'un grand nombre d'individus. De plus, cette taille d'oreille nous permet une fixation facile des chaussettes et carcans.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
1 888 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 580 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection unique de virus modifié, soit dans la veine, soit directement dans le cerveau après ouverture du crâne sous anesthésie de quatre-vingt-dix à cent vingt minutes, avec barres d'oreille et risque de saignement. Deux tests de mémoire à court terme et d'apprentissage sont menés sur une journée ou après quatre à huit jours d'entraînement, avant un prélèvement de liquide céphalo-rachidien suivi de la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ni système synthétique ne reproduit la complexité architecturale des cellules du cerveau, et tient le recours aux modèles animaux pour "essentiel".
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives. La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative affectant les fonctions cognitives, notamment la mémoire, l’apprentissage ou encore le langage, et responsable d’une perte d’autonomie des patients. La maladie d’Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives et représente plus de 70 pourcents de l’ensemble des démences de la personne âgée. Environ 1 million de personnes sont touchées en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Plus de 35 millions de personnes sont touchées dans le monde.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les animaux seront génotypés par un prélèvement de l'extrémité distale de la queue. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d’un anti-douleur et injection d'analgésique en post-opératoire). Deux tests comportementaux permettent de mesurer la mémoire à court terme, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, les animaux seront anesthésiés et analgésiés, puis nous réaliserons un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes) et sanguin (1 minute) préalablement à l'euthanasie (pas de réveil entre les actes).
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) pourrait être observée (5 à 7 pourcents du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux. 8) douleur de courte durée engendrée par le génotypage invasif par prélèvement de l’extrémité distale de la queue. 9) le phénotype dommageable de la lignée (modèle de maladie neurodégénérative (Maladie d’Alzheimer), déficits cognitifs).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1888) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Le geste de génotypage invasif est parfaitement maitrisé par les zootechniciens : prélèvement de la queue réalisé sur un animal très jeune où l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite, au même moment que le tatouage pour limiter les manipulations, dans une pièce dédiée au calme, rapidement avec des ciseaux adaptés et désinfectés après chaque portée. Le souriceau est surveillé immédiatement après (absence de saignement et bonne reprise en charge par sa mère), puis 20-30 minutes après avant de replacer la cage sur le portoir d’hébergement. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’application locale d’anesthésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection sur les yeux de l’animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post-opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L’applicateur est formé au geste d’injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. A partir de 9 mois, les animaux seront pesés deux fois par semaine avec ajout de croquette/poudre sur le fond de la cage et observation attentive à chaque pesée. De plus, certains tests comportementaux étant réalisés sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (jusqu’à 14 mois d’âge) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes (entre 5 et 7 mois d'âge) et évaluerons les effets du traitement (entre 6 mois et 14 mois d'âge) à différents âges et stades de la neuropathologie afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Modèle expérimental de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1425
Lapins : 1425
Une lésion est provoquée sur un seul œil de chaque animal, puis des gouttes sont instillées jusqu'à six à huit fois par jour et des produits injectés dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical. 1 425 souris, 1 425 rats et 1 425 lapins vont être utilisés, soit 4 275 individus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une gêne ou une douleur limitée à quelques heures après l'induction, tout en indiquant ailleurs que la lésion entraîne une altération partielle et permanente de la vision. Tous les animaux ayant suivi la procédure entière sont tués pour des analyses histologiques et des dosages.
Objectifs
La cornée, partie du globe oculaire située en avant de l'œil est un tissu transparent. Dans certaines pathologies, des vaisseaux sanguins envahissent de façon anormale l’intérieur de la cornée. Ce phénomène appelé « néovascularisation cornéenne », est un problème majeur de santé publique car la perte de la transparence de la cornée empêche une vision correcte et peut conduire à une cécité. Les origines de ce phénomène sont multiples : maladies héréditaires, séquelles d’un traumatisme ou d’une brûlure, complications d’infections virales ou bactériennes, complications de greffes de cornées, port prolongé de lentilles de contact. La majorité des traitements actuels ciblent la régression des vaisseaux par : - Application de produits anti-inflammatoires, - Coagulation des vaisseaux à l’aide d’un laser ophtalmique, - Transplantation de membrane amniotique. Ces traitements ne sont pas toujours efficaces et les effets secondaires fréquents ne sont pas à négliger : - Augmentation de la pression intra oculaire avec risque de glaucome, - Apparition de cataracte (opacification du cristallin, autre structure de l’oeil dont la transparence est capitale pour la vision). Les récents traitements visent les facteurs directement impliqués dans la formation de ces nouveaux vaisseaux au niveau moléculaire. L’objectif du projet est la mise en place au sein de l’établissement utilisateur de modèles expérimentaux de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur afin de participer au développement de nouvelles thérapies pour cette pathologie. Le principe est d’induire sur un seul oeil, par différentes méthodes, la prolifération de vaisseaux suite à une lésion cornéenne.
Bénéfices attendus
Les pathologies de la cornée sont un réel handicap puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. L’assemblage en couches cellulaires très organisées et dépourvues de vaisseaux, garantit la transparence du tissu essentielle à la vision. Ce « privilège » anti-angiogénique résulterait d’un équilibre entre production de facteurs anti-angiogéniques et répression de facteurs pro-angiogéniques. Lors d’une atteinte de la cornée, il y a une rupture dans cet équilibre, en faveur de la production de facteurs angiogéniques. Cette rupture entrainerait le développement de nouveaux vaisseaux à partir du limbe vers le centre de la cornée, le limbe étant la zone de transition entre la sclère opaque et la cornée transparente.
Procédures
La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, l’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.
Effet du cannabidiol (CBD) sur la qualité de vie de chiens âgés atteints d’arthrose ou d’un dysfonctionnement cognitif
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
240 chiens de sept ans ou plus, atteints d'arthrose ou d'un dysfonctionnement cognitif, reçoivent du cannabidiol par voie orale toutes les douze heures pendant six mois, soit environ 360 administrations par animal. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger et les chiens restent chez leur propriétaire ou en refuge, sans mise à mort prévue. Chacun porte un collier d'activité 24 fois sur six mois par périodes de 72 heures, passe huit séries de tests filmés dont une résolution de problème et une mesure d'attention soutenue, et subit trois prélèvements de sang et d'urine ainsi que des radiographies répétées. Le porteur part de l'expansion du marché légal du cannabidiol pour animaux de compagnie et attend du complément qu'il retarde la progression des signes cliniques, effets indésirables digestifs, salivation excessive, somnolence et ataxie légère compris.
Objectifs
Le marché légal du cannabidiol (CBD) pour la consommation humaine et animale est en pleine expansion dans le monde entier. La médecine vétérinaire a augmenté la longévité des animaux de compagnie et à mesure que la population vieillit, il y a une augmentation des maladies liées à l'âge susceptibles de compromettre leur qualité de vie (QV). Nous souhaitons donc étudier dans un second temps les effets du CBD dans la prise en charge de chiens âgés atteints d’arthrose pour augmenter les connaissances actuelles (limitées en taille de population et de durée des études), et de chiens âgés atteints de dysfonctionnement cognitif, syndrome avec une gestion complexe (où à l’heure actuelle aucune étude n’a été réalisée sur les effets du CBD), afin d’évaluer le potentiel de cet outil dans l’amélioration de la qualité de vie des animaux de compagnie.
Bénéfices attendus
La première partie du projet permettra d’obtenir une base d’information sur le profil des populations canine et féline en France et la perception vis-à-vis du CBD des propriétaires de chiens/chats, du personnel de refuge, des vétérinaires/ASV, ainsi que son utilisation. Au vu des résultats d’études sur les effets du CBD chez des chiens et/ou autres mammifères, nous nous attendons à ce qu’un complément à base de CBD, associé au non à d’autres traitements, retarde la progression, voir réduisent les signes cliniques liés à l’arthrose ou au dysfonctionnement cognitif dans notre population, et par conséquent améliore la qualité de vie de ces chiens. Dans ce cas, cette molécule pourrait être recommandée et participer à l’amélioration de la qualité de vie de nombreux chiens. Par ailleurs, ces études pourraient permettre d’encourager d’autres études sur les effets du CBD chez le chien dans des situations différentes (maladies etc.) ou chez d’autres animaux, afin de voir tout le potentiel de cette molécule.
Procédures
Le projet implique une administration orale du produit par le propriétaire ou personnel du refuge toutes les 12h pendant 6 mois, des tests réalisés et filmés par le propriétaire ou personnel du refuge (8 fois sur 6 mois), un port du collier d’activité (24 fois sur 6 mois, durant 72h), un suivi vétérinaire avec prélèvements sanguins et urinaires (trois prélèvements par chien sur toute la durée de l’étude). Les chiens seront dans un état vigile. Les tests seront les suivants : Time Up and Go (distance parcourue égale à 10 fois la taille du chien avec mesure du temps et score associé, jusqu’à 2 min, 3 essais) ; résolution de problème (atteindre une friandise rendue difficilement accessible, jusqu’à 2 min, 3 essais) ; attention soutenue (mesure du temps durant lequel l’individu maintient son regard vers le visage du propriétaire/soigneur ou de la friandise tenue proche du visage, jusqu’à 2 min, 3 essais). Des radiographies, échographies, examens d’ophtalmologies et ECG (électrocardiogramme) seront réalisés à l’inclusion. Les radiographies et échographies dureront entre 10 et 30 minutes environ, l’ECG est plus rapide. Les radiographies pourront être répétées pour l’arthrose aux mois 3 et 6 en plus de l’inclusion. Des analyses biochimiques seront effectuées à l’inclusion, puis aux mois 3 et 6 des études. Les endocannabinoïdes et les métabolites seront analysés à l’inclusion et au mois 6. Aucune anesthésie, aucun appareillage, aucune médication et aucune contention n’est prévue pour les différents examens. La méthode d’approche attentive et de contrôle doux sera adoptée, la réaction des individus sera observée et la méthode réadaptée si nécessaire.
Impact sur les animaux
Le projet implique une administration orale du produit par le propriétaire (ou personnel du refuge), des tests réalisés et filmés par le propriétaire (ou personnel du refuge), un port de collier d’activité non constant mais régulier, un suivi vétérinaire avec prélèvements sanguins et urinaires. Ces événements peuvent être sources de stress et de douleur de courte durée pour les prélèvements. Aucune anesthésie, aucun appareillage, aucune médication et aucune contention n’est prévues pour les différents examens. Nous appliquerons les pratiques "pet friendly", les patients individus animaux seront les agents de leur coopération ou pas. La méthode d’approche attentive et de contrôle douce sera adoptée, la réaction des individus sera observée et la méthode réadaptée si nécessaire. L’administration de CBD peut être source d’effets indésirables (rares cas documentés au sein des études). Ces effets peuvent notamment être des symptômes gastro-intestinaux légers, une sécrétion excessive de salive, une somnolence, une légère ataxie, une réaction cutanée, des vomissements, une augmentation du taux de phosphatase alcaline, un gonflement local mineur pendant plusieurs jours.
Devenir
Les animaux étant des chiens vivant chez leur propriétaire en tant qu’animal de compagnie, ou vivant en refuge, ils resteront dans leur lieu de vie et poursuivront leur vie habituelle à l’issue du projet. Les chiens qui seront exclus des études, seront suivis jusqu’à l’établissement des causes de cette exclusion et suivis jusqu’au rétablissement si la cause s’avère être liée à notre étude. Les propriétaires et le personnel soignant pourront indiquer au-delà de la durée des études (jusqu’à 6 mois) tout éventuel événement indésirable et pourront remplir un questionnaire sur le long terme.
Remplacement
Le projet consiste notamment à comprendre les effets du CBD (cannabidiol) chez des chiens âgés atteints d’arthrose ou de dysfonctionnement cognitif. Cela implique par exemple des observations comportementales. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité cognitive et comportementale d’organismes entiers.
Réduction
Nous avons choisi d’utiliser environ 240 individus au total (environ 120 atteints d’arthrose et 120 de dysfonctionnement cognitif). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. L’effectif total pourrait être réduit dans le cas d’individus à la fois atteints d’arthrose et de dysfonctionnement cognitif.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à leur domicile habituel (chez leur propriétaire ou en refuge). Nous mettrons en place des séances de familiarisation progressive pour chaque élément potentiellement source de stress (objets pour les tests, collier d’activité). L’ensemble des gestes techniques nécessaire au suivi physiologique des animaux seront effectués par un vétérinaire garantissant ainsi la réalisation des prélèvements selon les bonnes pratiques. En dehors du suivi vétérinaire avec prélèvements, les manipulations/mesures seront réalisées par le propriétaire et au domicile (ou personnel soignant au refuge) limitant le stress. Les propriétaires/personnels seront formés à la réalisation des tests comportementaux. Le collier d’activité mesurera la durée et fréquence de l’activité (course, marche, grattage, agitation de la tête) et de l’inactivité (repos et sommeil). Les individus montrant des signes d’effets indésirables (dûs ou non à l’administration de cannabidiol), de douleur ou de stress élevé seront exclus des études et suivis par un vétérinaire au besoin (point limite).
Choix des espèces
Un des objectifs du projets est d’améliorer les connaissances sur les effets du CBD (cannabidiol) chez les animaux de compagnie et plus particulièrement dans le vieillissement. En effet, la commercialisation de CBD pour animaux de compagnie se développe, il est donc nécessaire d’apporter des connaissances quant à cette utilisation. Peu d’études ont déjà été réaliser chez les chiens et ceux-ci sont connus pour être touchés par l’arthrose influencée par l’âge, qui est la première cause de douleur chronique chez les chiens. De plus, le dysfonctionnement cognitif représente un problème de santé considérable pour les chiens âgés, sa prévalence y est extrêmement élevée. Nous prévoyons d’utiliser des chiens âgés de 7 ans ou plus. En effet, la médecine vétérinaire a augmenté la longévité des animaux de compagnie et à mesure que la population vieillit, il y a une augmentation des maladies liées à l'âge susceptibles de compromettre leur qualité de vie. Notre objectif est d’évaluer les effets du CBD chez des chiens âgés atteints d’arthrose ou de dysfonctionnement cognitif, tous les deux influencés par l’âge. Lorsque les chiens sont âgés de sept ans ou plus, on considère qu'ils sont des chiens seniors ou gériatriques à risque de développer un problème de santé lié à l'âge.
Etude de la réponse immunitaire induite chez le furet après vaccination BCG par voie orale ou sous-cutanée
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Commandés à un fournisseur après une première série de quatre furets utilisés entre novembre 2023 et février 2024 pour que les expérimentateurs acquièrent les gestes, 12 furets vont être utilisés à leur tour, tous tués à l'issue pour constituer une banque de tissus. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Sur onze semaines, chaque furet reçoit un implant télémétrique, jusqu'à huit prises de sang, une vaccination BCG par voie orale ou sous-cutanée, une administration intratrachéale et un lavage broncho-alvéolaire, tous ces actes sous anesthésie générale de 5 à 30 minutes. Le furet est retenu parce qu'il est sensible à Mycobacterium bovis comme le blaireau, espèce sauvage visée par le programme de vaccination, dont l'expérimentation est soumise à une réglementation plus contraignante.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un projet scientifique plus global visant à étudier la vaccination contre la tuberculose, dans la faune sauvage. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Les objectifs sont d’analyser l’influence de la voie de vaccination (orale vs sous cutanée) sur la mise en place d’une réponse immunitaire contre les mycobactéries. Le modèle furet est utilisé pour la première fois dans nos conditions « infectieuses » d’expérimentation. Une première expérimentation a eu lieu avec 4 furets entre novembre 2023 et février 2024 afin de permettre aux expérimentateurs d’acquérir les gestes techniques. Le présent projet est prévu pour au maximum 12 furets : 1 lot de 6 qui recevra le vaccin par voie orale et 1 lot de 6 qui recevra le vaccin par voie sous-cutanée. Le sexe ratio sera adapté selon les capacités du fournisseur à nous fournir au moment de la commande. La voie sous cutanée a été testée sur des blaireaux mais elle nécessite une capture des animaux. Si ce projet démontre que la voie orale est aussi efficace, elle serait plus adaptée pour une vaccination à grande échelle. La voie sous-cutanée est une référence car elle est bien décrite dans différents modèles pour son efficacité. La voie intratrachéale est utilisée pour mimer l’exposition des animaux au pathogène (voie pulmonaire) afin de visualiser la réponse protectrice développée par la vaccination. Il s’agit d’un boost pour pouvoir quantifier la réponse immunitaire. Dans le modèle murin il s’agit d’une voie classique d’exposition. Ce projet a 3 finalités : 1) Répondre à la réglementation en expérimentation animale en vigueur concernant la maitrise et le maintien du savoir-faire du personnel. Ce projet permettra de perfectionner la mise en œuvre de gestes techniques sur modèle furet (manipulation, anesthésie générale, prise de sang, pose de puces télémétriques, administration par voie intratrachéale, injection sous-cutanée et lavage broncho-alvéolaire) 2) Valider les outils d’analyse de la réponse immunitaire developpé sur des furets sains « non infectés » 3) Quantifier la reponse immunitaire des furets suite à une vaccination BCG.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont doubles : 1) valider les outils nouvellement developpés (analyse des cellules immunitaires par cytométrie en flux, analyse des réponses immunitaires par transcriptomique) 2) définir la meilleure voie d’administration du vaccin BCG (voie sous cutanée ou orale), permettant la mise en place d’une protection optimale contre les mycobactéries.
Procédures
Au cours des 11 semaines du projet, chaque furet sera soumis au maximum à : - 1 pose de puces télémétriques qui durent quelques secondes - 8 prises de sang : au maximum 1 prélèvement par semaine. Une prise de sang dure quelques secondes - 1 LBA (lavage-broncho-alvéolaire) qui dure 2 à 5 min - 1 administration en SC (sous cutanée), qui dure quelques secondes - 1 administration en intra-trachéale, qui dure quelques secondes.Tous ces actes se feront sous anesthésie générale pendant 5 à 30 minutes selon la nature et le nombre d’actes effectués.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourraient être liés à une mauvaise réaction des animaux à l’anesthésie générale ou à un des gestes techniques qui induirait une réaction inflammatoire locale, un hématome ou une infection. En raison de leur hébergement en couple, d'éventuelles blessures infligées par les congénères sont possibles (griffure, morsure, abcès…).
Devenir
La totalité des animaux sera mis à mort à l’issue du projet afin de constituer une banque de tissus d’animaux qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun système in vitro ou méthode alternative permettant de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimal d’animaux a été fixé à 6 par lot pour favoriser d’une part le lien social entre les animaux (hébergement en couple) et pour avoir suffisamment d’échantillons biologiques qui soient statistiquement pertinents pour la suite du projet. En fonction de ce que le fournisseur sera en mesure de nous fournir au moment de la commande, le sexe ratio de chaque lot pourra être adapté. L’expérimentation contient 2 lots : un lot pour lequel le BCG est administré par voie orale et un lot avec une administration par voie sous-cutanée. Le nombre d’animaux utilisés pour fournir des échantillons a été déterminé grâce à un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants.
Raffinement
Dans les 2-3 jours suivants leur arrivée, les furets seront anesthésiés pour permettre la pose des implants télémétriques puis une période d’acclimatation à l’environnement et d’habituation au personnel sera mise en place pendant 21 jours. La seule intervention du personnel sera de les habituer à leur présence et aux contacts : jeux, friandises. Ils seront également vermifugés. Les animaux seront hébergés dans des cages conçues spécifiquement pour le furet. Chaque furet disposera de sa propre cage mais elles seront interconnectées par 2 avec un système de tunnel permettant aux furets de se regrouper. Un hamac en tissu sera suspendu à l’intérieur de chaque cage permettant aux furets d’avoir un coin repos. Différents types de jouets seront utilisés (balle, tissus…). Des récompenses alimentaires (saumon, jus de thon, pâte appétente) seront données après les interventions qui ne nécessitent pas d’anesthésie (pesée, traitement anti-parasitaire). Ces récompenses alimentaires qui seront données au cours de la période d’acclimatation permettront d’habituer les animaux pour l’administration orale du vaccin à J0. Les furets seront maintenus sous anesthésie générale gazeuse. Tout au long de l’anesthésie, ils seront sous monitoring (fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, température), sous lampe et/ou tapis chauffant et sous la supervision du personnel en charge des anesthésies. Lors de l’intubation intra-trachéale, du gel sera mis sur la sonde pour anesthésier la gorge. Lors de la phase de réveil, une surveillance rapprochée de l’animal sera faite, jusqu'à son réveil complet. En cas de besoin, des traitements seront mis en place pour faciliter le réveil et gérer une éventuelle douleur. En cas d'infection, un traitement antibiotique sera mis en place. La vétérinaire de l'unité sera systématiquement consultée en amont. Deux visites quotidiennes seront réalisées afin d'assurer les soins quotidiens, de surveiller l’état de santé des animaux. Des point limites adaptés ont été définis et la vétérinaire de l’unité sera avertie en cas d’apparition de signes cliniques.
Choix des espèces
Le furet est un modèle validé pour l’étude d’espèces de la faune sauvage (blaireau) qui constitue l’espèce ciblée par le projet de vaccination contre la tuberculose animale. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Animaux adultes âgés d’environ 1 an (poids d’environ 1400 g pour les mâles et 1200 g pour les femelles). Le choix d’animaux adultes est conditionné par le fait que la vaccination est plus pertinente sur animaux adultes que chez des jeunes dont le système immunitaire est en cours de développement.