Maladies animales

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Tués pour analyse des tissus dans les études d'efficacité, ou réutilisés après retrait des points de suture pour la moitié des animaux utilisés dans la formation du personnel, 500 lapins et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La paupière d'un œil leur est cousue sous anesthésie générale pendant une vingtaine de minutes, opération qui peut irriter la cornée, déformer ou faire saillir la membrane nictitante, et dont les points peuvent s'arracher au grattage, les griffes étant coupées pour l'éviter. L'objet déclaré est d'améliorer l'absorption de traitements oculaires en empêchant le clignement, une partie des animaux ne servant qu'à entraîner du personnel à ce geste. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de mimer l'œil dans sa globalité fonctionnelle.

Objectifs

La blépharorraphie est une intervention chirurgicale courante en ophtalmologie vétérinaire pour des multiples indications thérapeutiques, notamment : le soin des ulcères de la cornée ou de plaies/érosions cornéennes, le soin des œdèmes cornéens, le soin des kératites. Le but de projet sera donc celui d'effectuer cette pratique chirurgicale dans le cas où cela améliorerait l'absorption de certains traitements oculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'optimiser l'efficacité de certains traitements en utilisant la blépharorraphie, qui permettra une meilleure libération de certains principes actifs en contrant le clignement des yeux.

Procédures

La seule intervention effectuée sera la suture de la paupière (blépharorraphie) d'un seul œil (sauf dans le cas particulier d’études pharmacocinétiques à temps courts si les animaux restent endormis) effectuée sous anesthésie générale avec administration d’anti-douleurs. L'intervention aura lieu une seule fois dans chaque étude et dure environ une vingtaine de minutes. Des prélèvements de sang pourront être effectuée en cours d'étude sur animaux vigiles, en suivant les recommandations scientifiques qui détaillent le volume maximum prélevable selon le poids de l'animal suivant un temps de repos adapté.

Impact sur les animaux

La blépharorraphie est une pratique chirurgicale couramment utilisée en ophtalmologie vétérinaire et humaine, sans difficultés techniques majeures et avec d'excellents résultats. Mis à part les manipulations lors des pesées des animaux et la contention des animaux pour les observations journalières ainsi que la piqûre pour l'injection des produits anesthésiants, cette technique pourrait induire : -irritation de la cornée par contact avec les fils de suture -déformation du cartilage de la membrane nictitante -protrusion de la membrane nictitante (souvent réversible) - infection à la suite de la chirurgie (risque très faible mais présent avec tout acte chirurgical). Ces phénomènes restent rares, réversibles et indolores. La douleur de l'acte chirurgical sera soulagée par injection d'un analgésique en plus de l'anesthésie. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant (lapin) ou d'armoires chauffantes (rats) selon les espèces. Les points de suture peuvent s’enlever (grattage de l’animal, par exemple) au bout de quelques jours, mais il sera possible de les refaire sous anesthésie et sans douleur. Afin d’éviter que les animaux s’arrachent des points de suture lors d’un éventuel grattage, une coupe des griffes sera effectuée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour analyse des tissus dans le cas des études d'efficacité des traitements. Pour la formation du personnel, la moitié des animaux seront euthanasiés pour analyse des tissus en histologie et l'autre moitié sera reutilisée une fois le retrait des points de suture effectué.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples suivant le choix du test (paramétrique ou non paramétrique). Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien- être. Les animaux auront des enrichissements adaptés. Aucun examen invasif ne sera réalisée sur les animaux à la suite de la suture des paupières. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Des enricchissements supplémentaires (une balle de cellulose en plus, par exemple) sont prévus dans le cas des lapins qui seront hebergés individuellement.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, cette pratique chirurgicale est largement connue en médecine vétérinaire et s'effectue très bien chez le lapin et chez le rat. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.

Élevés par un fournisseur installé sur le même site que le laboratoire, 300 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis restent disponibles pour d'autres expériences après une période de repos. Chacun subit douze à trente prélèvements de sang, quatorze possibles sur les seules 24 premières heures d'après la description des procédures et seize d'après celle des nuisances, l'administration du produit testé, et parfois trois à six ponctions de la vessie à travers la paroi abdominale sous anesthésie locale. Le porteur reconnaît que le stress engendré par ces prélèvements répétés sera "non négligeable" pour l'animal. Aucune analyse statistique n'est prévue, le nombre d'animaux étant ajusté et justifié par le "Donneur d'Ordre" pour chacune des deux à cinq études menées chaque année.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouveaux produits vétérinaires chez le chien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux produits permettant de mieux protéger/traiter les chiens face à différentes maladies canines.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur l'ensemble des chiens : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la procédure (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement éventuel d’urine par ponction de la vessie échoguidée à travers la paroi abdominale sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendus suite à l’administration du produit d’essai dont la non-toxicité et la tolérance locale aura au préalable été vérifiée par le Donneur d'Ordre. Selon la voie testée (Sous-cutanée, Intra-musculaire), seule l’administration des produits pourra entrainer une nuisance correspondant à l’introduction de l'aiguille pour l’injection entraînera une douleur légère de courte durée . Les prélèvements des animaux peuvent entrainer un stress physique de l’animal lié à sa contention répétée et l’introduction de l’aiguille entraînera une douleur légère et transitoire au point de prélèvement. Jusqu’à 16 prélèvements sanguins pouvant être réalisés les 24 premières heures, le stress engendré par cette action répétée sera non négligeable pour l’animal.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du traitement. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament vétérinaire.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables, selon les guidelines européennes (EMA/CVMP/EWP/133/1999-Rev.1 et EMA/CHMP/CVMP/JEG :450091/2012). Le nombre d’animaux sera ajusté et justifié par le Donneur d’Ordre pour chaque étude en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques et des données bibliographiques existantes sur la molécule testée. Le nombre d’animaux pourra être réduit par des études en cross-over après un temps de repos suffisant.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les condition d'alimentation des animaux pourront être standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations internationales de bonnes pratiques. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique inatendu chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale. Ce projet incluant 300 animaux permettra de réaliser 2 à 5 études par an.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du nouveau traitement. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens en bonne santé de plus de 6 mois, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement vétérinaire.

Fournir un modèle expérimental pour tester des traitements des complications oculaires du diabète : 2 180 souris et 2 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques par une injection de streptozotocine qui détruit les cellules du pancréas produisant l'insuline, puis une kératopathie leur est provoquée sur un œil après huit à seize semaines de diabète. Le porteur indique qu'au bout d'un mois les rats malades pèsent 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, et décrit les examens oculaires comme semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet. Les gouttes peuvent être administrées six à huit fois par jour et les injections dans l'œil une à deux fois par semaine, pour des études d'efficacité relevant en partie de l'usage réglementaire.

Objectifs

Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements impliquant des médiateurs de l’inflammation qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des capillaires sanguins de la rétine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritonéale d’une molécule qui rend les animaux diabétiques. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à trois fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal ou au niveau de la mandibule. L'induction de la kératophatie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique après une période de 8 et 16 semaines de diabète, la procédure ne durera pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de Streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris et serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la cornée diabétique est bien documentée chez la souris pigmentée (Young L, et al 2014) ou le rat albinos. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Douze ponctions ovariennes par animal, sous anesthésie épidurale et sur bête vigile, avec pose et retrait répétés d'un dispositif vaginal et cinq injections de superovulation à douze heures d'intervalle avant chaque collecte : 12 génisses Prim'Holstein subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et sont gardées en vie à l'issue. L'ensemble sert à produire 400 embryons pour mettre au point la détection des anomalies chromosomiques dès le stade préimplantatoire, afin d'éviter les transferts sans issue et de réformer les animaux porteurs. Le porteur mentionne des hématomes possibles au point d'injection et un stress ponctuel lié aux contentions. Il classe la procédure en gravité modérée du fait de la répétition d'actes légers et, écrit-il, en l'absence de données objectives sur le sujet.

Objectifs

Depuis 2009, la sélection génomique s’est développée dans la filière bovine avec près de 300 000 analyses annuelles du génome réparties désormais dans une quinzaine de races, dont 80% pour une gestion du renouvellement en élevage. La lecture du génome peut également être effectuée plus précocement, dès le stade embryonnaire préimplantatoire après analyse de l’ADN préamplifié issu d’une biopsie de quelques cellules d‘un embryon (utilisation dans le cadre des schémas de sélection). Ces données génomiques sont principalement utilisées aujourd’hui pour prédire les performances futures de chaque individu mais ne sont pas valorisées pour détecter des problèmes d‘aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) qui peuvent survenir à chaque génération. Ces anomalies chromosomiques entrainent souvent l’arrêt du développement voire des problèmes d’infertilité ou de stérilité sur l’individu né. Le projet présenté vise à développer des approches méthodologiques permettant valoriser les données de génotypage pour détecter les anomalies chromosomiques (monosomie, trisomie) le plus précocement possible chez l’embryon et chez le veau afin de les prévenir et les gérer. Le projet justifiant cette demande d’autorisation porte uniquement sur la détection des anomalies chromosomiques chez les embryons, les approches chez les veaux nécessitant uniquement l’exploitation de données de génotypages déjà disponibles dans les bases de données nationales.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de développer et valider des méthodologies de détection des problèmes de ploïdie (monosomie, trisomie) dès le stade embryonnaire préimplantatoire chez les bovins. Ces indicateurs permettront à la fois d’éviter de transférer les embryons aneuploïdes (probabilité de gestation et naissance quasi-nulle alors même que l’aspect morphologique semble bon) mais également de mieux diagnostiquer des problèmes de fertilité chez des animaux aneuploïdes et ainsi les réformer pour éviter la dissémination de ces tares génétiques.

Procédures

La production des embryons nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 12 collectes d'ovocytes (1 collecte d'ovocytes tous les 15 jours par animal) réparties en deux séries entrecoupées d’une période de repos de plusieurs semaines. Au début de chacune des deux séries de collecte d'ovocytes, un traitement de synchronisation des chaleurs sera effectué comprenant la pose et le retrait d'un dispositif vaginal ainsi qu'une injection intramusculaire (chaque intervention durant moins d'une minute à chaque fois). Chacune des collectes d'ovocytes nécessite une succession d'interventions sur les animaux : ponction ovarienne (15 minutes) et pose d'un dispositif vaginal (moins d'une minute) suivi 2 jours plus tard d'un traitement de superovulation (5 injections intramusculaires à 12 heures d'intervalle; chaque injection durant moins d'une minute à chaque fois) et enfin ponction ovarienne multiple sous contrôle échographique (30 minutes) avec changement de dispositif vaginal (moins d'une minute). Les ponctions ovariennes seront systèmatiquement effectuées sur animaux vigiles anesthésiés.

Impact sur les animaux

Du fait des injections intramusculaires liées aux traitements de superovulation, un hématome peut apparaitre au niveau du site d’injection. Afin de limiter ces risques, les injections seront réalisés alternativement de chaque côté de l'encolure. De plus, les différentes interventions et contentions prévues dans le projet peuvent engendrer un stress ponctuel chez les animaux. Néanmoins, du fait de la répétition d'actes induisant des nuisances légères et en l'absence de données objectives sur le sujet, la procédure expérimentale est considérée en degré de sévérité modérée dans ce projet.

Devenir

Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

Avant de passer à l’utilisation de l’animal, les méthodes de détection de l’aneuploïdie ont d’abord été développées et validées sur embryons produits in vitro à partir d’ovaires prélevés post-mortem en abattoir. Néanmoins, compte-tenu des différences de qualité ovocytaire avec le modèle de prélèvement sur animaux vigiles et de la volonté d’étudier l’impact de la répétition des sessions de production sur le taux d’aneuploïdies des embryons, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, la production d’embryons in vitro après ponction folliculaire sur animaux vigiles représente le protocole principalement utilisé par les professionnels de la filière. Le développement méthodologique effectué doit donc nécessairement être validé en conditions de production réelles avant d’être mis en œuvre en routine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire pour étudier le taux d’aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) des embryons selon les facteurs étudiés (protocole de production des embryons, taureau utilisé pour la fécondation, rang de collecte des ovocytes) et en tenant compte des impératifs pratiques imposés par le protocole de production (nombre de femelles traitées par jour et intervalle de temps entre les sessions). Ainsi, l’utilisation de 12 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal avec 12 ponctions ovocytaires par individu permettant la production de 400 embryons sur l'ensemble du projet. Ces effectifs sont à priori nécessaires pour mettre en évidence, s'ils existent, les effets du taureau (présumés faibles), du protocole de production d’embryons (présumés importants) et du rang d’OPU (inconnus; aucune donnée bibliographique n'étant disponible sur le sujet) avec les exigences statistiques fixées (risque de 5% de conclure que l'effet existe alors qu'il n'existe pas; risque de 20% de conclure que l'effet n'existe pas alors qu'il existe).

Raffinement

L’étude est mise en place sur 12 génisses qui seront hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales, enrichissement de milieux avec différents objets,...). Afin de limiter les risques d’hématomes, au niveau du site d’injection IM du traitement de superovulation, nous alternerons le lieu et le coté des injections. De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention, lors de la phase d’acclimatation ainsi que pour les collectes d'ovocytes.

Choix des espèces

Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse est représentatif de la population de donneuses d’embryons en France et à l’étranger. De plus, il a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).

Du sang est injecté sous les méninges de rats anesthésiés pour reproduire une hémorragie cérébrale, avec pose d'une mini-pompe sous la peau du dos et d'une canule dans le ventricule cérébral droit, trente-cinq à quarante-cinq minutes de chirurgie. 112 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des céphalées, des douleurs faciales et oculaires et des troubles de la vision, qui "peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l'animal voire à un coma". Au quatorzième jour, tous les rats sont tués pour prélèvement du sang et du cerveau après fixation des tissus.

Objectifs

Le but de l'expérience est de déterminer si la molécule à tester peut réduire l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux) chez le rat Sprague Dawley.

Bénéfices attendus

L'hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est un type d'accident vasculaire cérébral causé par un saignement dans l'espace sous-arachnoïdien situé entre le cerveau et les méninges. Les lésions cérébrales précoces consécutives à une HSA sont responsables d'une grande partie des handicaps à long terme chez les patients atteints d'HSA. En outre, ils sont plus susceptibles de souffrir de troubles neurodégénératifs et cérébrovasculaires plus tard dans leur vie. Les mécanismes des lésions cérébrales précoces comprennent l'inflammation, la mort cellulaire, l'accumulation de liquide cérébral et la rupture de la barrière hémato-encéphalique. Les traitements actuels sont chirurgicaux et empêchent les saignements ou réduisent la pression cérébrale (insertion d'une dérivation pour drainer le liquide du cerveau), il est donc nécessaire de développer des thérapeutiques alternatifs pour cibler les mécanismes de lésions cérébrales précoces de l'HSA. Cette étude pourrait mettre en évidence un effet via un thérapeutique sur la réduction de l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux). Cela permettrait ainsi de développer une stratégie thérapeutique moins lourde des hémorragies sous-arachnoïdiennes car sans intervention chirurgicale ni dispositif implanté à subir par le patient.

Procédures

Les animaux réaliseront un test comportemental (répété à J-1, J+1, J+7 et J+14 post chirurgie) visant à quantifier et à observer des différences (et donc d’observer une récupération fonctionnelle ou pas) entre les différents groupes sur des déficits sensoti-moteurs induits par le modèle de chirurgie d’hémorragie sous-arachnoïdienne. Un prélèvement de sang au niveau de la queue sera réalisé ces mêmes jours. A J0, ils seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter du sang sous les méninges, simulant ainsi une hémorragie sous arachnoïdienne. Une pose de cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour récupérer le sang à injecter. Cette chirurgie sera suivie de la pose d’une mini-pompe osmotique en sous-cutané dans le dos ainsi que de la pose d’une canule par stéréotaxie dans le ventricule cérébral droit. Une injection sous-cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour contrer la déshydratation subie suite à l’anesthésie et à l’acte chirurgical. Cette phase de chirurgie prendra entre 35 et 45 minutes. A J1 et J14, les animaux anesthésiés seront placés au sein d’un IRM pour imagerie. Cette phase d’imagerie sera réalisée en 10 minutes. A J1, une analgésie complémentaire sera réalisée après le 1er test comportemental et en fin de journée. A J14, Une injection d’un traceur fluorescent sous les méninges sera réalisée. Pour se faire le même protocole que pour l’injection de sang sera réalisé (aucune pose de cathéter ne sera nécessaire pendant cette étape). Enfin, à la fin du projet a J14, les animaux seront mis à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé avant fixation des tissus puis prélèvement.

Impact sur les animaux

Suite au modèle d’hémorragie méningée, les rats pourront présenter des déficits neurologiques (moteurs et cognitifs) susceptibles d'induire des céphalées, des douleurs faciales et occulaires ainsi que potentiellement des troubles de la vision, accompagnées donc d’un stress de l’animal. Ces symptômes peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l’animal voire à un coma. À cette fin, une surveillance sera mise en place pour contrôler la douleur et le stress afin d'adapter la couverture analgésique. Une coupelle de granulés humidifiés pour offrir une meilleure transition vers l’alimentation solide sera disposée dans la cage suite à la chirurgie.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement de sang et du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Les alternatives n’utilisant pas d’animaux ne peuvent être utilisées en raison de la complexité clinique de l'HSA et des interactions des systèmes du corps intervenant, y compris les systèmes immunitaire et nerveux, qui ne peuvent pas tous être modélisés actuellement dans des modèles de culture cellulaire ou informatiques. La voie des fluides cérébraux, en particulier, est étroitement régulée pour maintenir la pression cérébrale, les fluides étant produits par les plexus choroïdes et évacués par le système glymphatique dans une autre partie du cerveau, c'est pourquoi la structure entière du cerveau dans une cavité fermée (crâne) est nécessaire pour évaluer la dynamique des fluides et le système glymphatique.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les rats seront 2 par cage, isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et bûchette de peuplier), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Une injection sous-cutanée de sérum physiologie sera réalisée après la chirurgie. La surveillance des animaux sera accrue pendant les premières heures de réveil. A J1, un analgésique sera administré en début et fin de journée. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera soit soigné jusqu’à amélioration ou mis à mort. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivant l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites (2 fois par jour). Avant la mise à mort, les animaux seront mis sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat (Rattus norvegicus) est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les animaux utilisés seront âgés de 3 mois soit un poids d’environ 500g pour les mâles et 300g pour les femelles. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’HSA.