Maladies animales

Une demi-journée de tests par animal pour évaluer ses fonctions cognitives et émotionnelles, des chirurgies d'injection de virus dans le cerveau de trente à quatre-vingt-dix minutes, une biopsie de la queue : 3 421 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le cerveau de chacune étant prélevé après une chirurgie terminale sous anesthésie. Le projet porte sur la plasticité des circuits neuronaux dans des lignées modélisant l'X fragile, le retard mental, l'autisme et la schizophrénie, chez des animaux suivis du huitième jour après la naissance jusqu'à quinze mois d'âge. Les souris homozygotes de la lignée utilisée souffrent de troubles de la coordination qui leur donnent une démarche tournoyante et les empêchent d'atteindre la nourriture dans la semaine suivant le sevrage. Le porteur qualifie cette période de critique pour leur survie et dit avoir mis au point un protocole qui l'améliore, la modification génétique qui produit ces troubles restant, elle, le point de départ du projet.

Objectifs

Notre projet concerne l’étude des changements de l'organisation morphologique et fonctionnelle des réseaux neuronaux dans des modèles murins de maladies neuropsychiatriques telles que, l’X Fragile, le retard mental, l’autisme et la schizophrénie. La compréhension de ces mécanismes et de leur impact sur les comportements implique l'utilisation de modèles murins mutants qui reproduisent les altérations observées chez les patients souffrant de ces maladies. Le projet incorporera l’utilisation d’animaux des deux sexes étant donné l’existence de différences sexuelles en ce qui concerne la vulnérabilité et la prévalence des troubles neuropsychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apporter une preuve de concept de l'importance des facteurs génétiques dans l’émergence des maladies neuropsychiatriques. Il permettra de comprendre les mécanismes par lesquels les déficiences génétiques interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants dans le cerveau et le comportement. Les résultats issus de ce projet auront donc un fort impact en science fondamentale et dans le monde académique. Son caractère multidisciplinaire permettra des avancées significatives dans la compréhension de la santé mentale. Ces connaissances pourraient à leur tour avoir un impact sur des domaines connexes, tels que la psychologie, la psychiatrie et les sciences cognitives. A plus long terme, il serait envisageable de mener des études translationnelles pour relier les résultats des modèles animaux aux populations humaines. En effet, nous espérons proposer des stratégies de correction de certaines maladies neurodéveloppementales et neuropsychiatriques optimisées en fonction du sexe.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront amenés à subir plusieurs types d'intervention : a) une biopsie caudale, b) des chirurgies (30-90minutes) d'injection de virus, c) des tests de leur comportement afin d'analyser leurs fonctions cognitives ou émotionnelles (1/2 journée). A la dernière étape du protocole expérimental, l'encéphale sera prélevé post-mortem après une chirurgie terminale sous anesthésie soit pour analyser l’expression de différentes protéines dans les tissus, soit pour étudier l’activité des neurones sur tranches de cerveau.

Impact sur les animaux

Les chirurgies provoquent des douleurs post-opératoires minorées par les soins post-opératoires et l’administration d’antalgiques. La mutation de souris transgénique utilisée provoque un phénotype dommageable se traduisant par des troubles de la coordination des mouvements donnant une démarche tournoyante. La période critique de survie de ces animaux se situe dans la semaine suivant le sevrage car leur difficulté à se mouvoir pose des problèmes de prise de nourriture. Nous avons mis au point un protocole permettant d’améliorer significativement la survie de ces animaux homozygotes au cours de cette période critique.

Devenir

Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels des défauts génétiques interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants dans l’activité des réseaux neuronaux et leur impact sur les comportements sociaux. Par conséquent, l'utilisation de modèles in vitro n'est pas applicable pour ce projet. En termes de modèle animal, Mus musculus est un excellent modèle par rapport à d'autres (poisson zèbre) car il reproduit fidèlement les altérations observées chez les patients souffrant des maladies étudiées, à la fois au niveau anatomique et comportemental. Ce modèle permet donc de réaliser des tests de comportement transposables chez l'homme, ce qui est un aspect important au regard du fort potentiel de translationalité à long terme de notre projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés : - un même animal sera utilisé plusieurs fois pour différents tests au sein d’une même procédure et de façon longitudinale lorsque cela est possible - nous déterminerons le nombre minimal d'animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante en utilisant préférentiellement les tests permettant de comparer deux groupes non-pairés ou plusieurs groupes de facteurs.

Raffinement

Nous utilisons plusieurs stratégies de raffinement à différentes étapes des procédures afin de limiter l'impact de nos expérimentations sur le bien-être des animaux. Stabulation : Dans les cages d’hébergement, les souris bénéficient d’enrichissement pour diminuer l’ennui, l’anxiété et favoriser le bien être : dômes cartonnés, ou tunnels en carton et/ mini-rouleaux de papier foisonnant. Outre l’enrichissement de l’environnement, cela permet de favoriser la nidification de réduire l‘ennui, et d’augmenter le sentiment de sécurité. Suivant l’âge des animaux, la surface impartie dans la cage sera adaptée. Chaque intervention invasive, comme les chirurgies, est effectuée en conditions d'analgésie et d'anesthésie. Lors de la chirurgie, les canules sont descendues et remontées très doucement pour réduire le traumatisme tissulaire. Constantes biologiques et souffrance des animaux sont particulièrement surveillées dans les heures et jours suivant les interventions invasives afin de leur donner les soins post-opératoires nécessaires. Des grilles de suivis post-opératoire ont été mises en place, et le personnel a reçu toutes les habilitations nécessaires, notamment pour améliorer le bien-être des animaux (manipulation, enrichissement), reconnaitre les signes éventuels d'inconfort ou de souffrance, et pratiquer les gestes adaptés en fonction de la situation (administration d’analgésiques, d’antalgiques ou euthanasie si l’animal n’est pas soulagé par les médications). Tests comportementaux : pour limiter le stress, les souris sont familiarisées avec la salle d'expérimentation, et sont manipulées par le même expérimentateur. La température de la salle d'expérimentation et de la chambre d’enregistrement est maintenue constante. Pendant l’enregistrement du comportement, les souris ont eau et nourriture ad libitum. Les souris bénéficient d’enrichissement comprenant deux maisons et un tunnel en polycarbonate et de plusieurs cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle et diminuer l’ennui et le stress et faciliter la thermorégulation de l’animal et favoriser son bien-être.

Choix des espèces

Mus musculus est un modèle pertinent pour nos études car il présente une organisation des réseaux cérébraux et des réponses comportementales similaires à celles trouvés chez l’Humain. La souris est un modèle couramment utilisé en neurosciences, ce qui rend nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles de souris génétiquement modifiés qui reproduisent de manière très fidèle les pathologies neuropsychiatriques humaines. Une partie de nos expériences impose l’utilisation de souris modélisant le retard mental, l’autisme et de la schizophrénie. L’aspect neurodéveloppemental de notre projet qui repose sur l’étude des trajectoires développementales de l’activité et de la plasticité des circuits et des comportements nécessite l’utilisation de souris à différents stades postnataux (P) : périnatal jusqu’au stade adulte, i.e. P8 à P150 ainsi que des animaux âgés P450.

309 truites arc-en-ciel d'environ 100 g vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Lactococcus garvieae, soit par injection intramusculaire sous anesthésie, soit en restant seize heures dans une suspension bactérienne, et deux prises de sang sont réalisées sous anesthésie. L'objet du projet est de mettre au point cette infection expérimentale, étape préalable à l'évaluation de vaccins, le protocole s'arrêtant à l'observation de poissons moribonds reconnaissables au mélanisme, à la nage erratique sur le dos ou à l'exophtalmie. Le porteur écrit que la maîtrise de ce "challenge infectieux" est "obligatoire" et la vaccination "nécessaire" pour réduire l'usage d'antibiotiques face à une lactococcose que le réchauffement des eaux bretonnes favorise.

Objectifs

Afin de limiter l’usage des antimicrobiens, la vaccination est considérée comme la meilleure option pour contrôler les maladies infectieuses en aquaculture. Cette demande d'autorisation de projet est une partie d'une étude plus globale sur l'efficacité des protocoles vaccinaux utilisant des voies d'administration non invasives telles que la balnéation ou la voie orale plutôt que l'injection, pour faciliter l'administration et réduire le stress des animaux. La demande d'autorisation de projet présenté vise à mettre au point un essai d'infection contrôlée de la truite Arc en Ciel avec la bactérie Lactococcus garvieae pour permettre d'étudier l'efficacité de vaccin et ultérieurement, d'autres méthodes de contrôle.

Bénéfices attendus

La lactococcose est une maladie bactérienne dont l'impact augmente actuellement en Bretagne en lien avec le réchauffement des eaux de surface. La maîtrise par vaccination est nécessaire pour contrôler cette maladie et réduire l'usage d'antibiotiques. La maîtrise du challenge infectieux par Lactococcus garvieae est obligatoire pour tester des solutions innovantes de contrôle, notamment la vaccination, facilitant leur mise en oeuvre dans les élevages et limitant le stress des animaux.

Procédures

Prises de sang sur animaux anesthésiés : prélèvement de sang deux fois (T0 et Tinal). La durée d'intervention est d'environ 15 à 20 minutes au total, comprenant l'induction de l'anesthésie, la prise de sang et le réveil des animaux. Exposition à une infection bactérienne contrôlée : Pour l'essai d'infection contrôlée par voie intramusculaire, la durée d'intervention sera de 15 à 20 minutes au total (induction de l'anesthésie, injection, réveil). Pour l'essai d'infection contrôlée par balnéation, les animaux seront placés durant 16 heures dans une suspension bactérienne.

Impact sur les animaux

L'évaluation de l'efficacité vaccinale nécessite d'infecter des truites par L. garvieae. Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peuvent entraîner de la douleur chez les poissons. Le protocole sera arrêté dès l'observation de poissons moribonds (mélanisme, nage erratique sur le dos, arrêt d'alimentation) ou de signes caractéristiques de la lactococcose (exophtalmie).

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons sanitaires (impossibilité de relâcher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par L. garvieae)

Remplacement

L'objectif du projet étant d'évaluer l'efficacité vaccinale contre la furonculose et la lactococcose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. La présente demande est une étape initiale de ce projet

Réduction

Le nombre de poisson par lot a été déterminé par une approche statistique. Pour vérifier la répétabilité de notre protocole, chaque condition sera réalisée en duplicat. Un total de 309 poissons est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute la durée du protocole. Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène < 80 %) et ne peuvent pas être rectifiés, l'expérimentation sera arrêtée. Les points limites concernent d'autre part la santé des poissons. Les poissons moribonds (nage erratique sur le dos, apathie, anorexie, mélanisme, exophtalmie) seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés par surdosage d'anesthésique. La densité animale en condition expérimentale est bien en deçà de ce qui est réalisé en élevage et les bacs seront enrichis de tubes permettants aux poissons de se cacher.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est l'hôte naturel de Lactococcus garvieae. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France. Les truites utilisées pèseront environ 100g. La lactococcose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage. L'étude sur des poissons de poids de 100 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant entrer dans l'étude. De plus, les protocoles vaccinaux par balnéation seront effectués sur des alevins de 4 à 5 g et leur efficacité sera testée après quelques mois d'élevage. Ainsi, les essais d'infection contrôlée des poissons vaccinés par balnéation seront effectuées lorsque les truites atteindront 100 g environ.

2 640 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une aiguille est enfoncée dans un disque intervertébral du dos ou de la queue pour y créer une lésion, opération de dix à quinze minutes, suivie trois semaines plus tard chez certains d'une seconde injection dans le disque abîmé, pour tester des molécules ciblant les cellules sénescentes. Le porteur décrit une douleur discale pouvant conduire l'animal à la prostration, à l'isolement et à l'arrêt du toilettage social, et une douleur nerveuse liée au passage de l'aiguille le long des racines spinales. Il conclut qu'il est "inévitable" de travailler sur des animaux et que le recours aux rongeurs est "nécessaire", les explants de disque de queue de bœuf restant réservés à l'étude de la diffusion des molécules.

Objectifs

La lombalgie chronique constitue la principale cause d’années de vie vécues en situation de handicap et affecte plus de 600 millions de patients dans le monde. Si elle peut avoir plusieurs causes, la Dégénérescence du Disque Intervertébral (DDIV) en représente le contributeur majeur. La physiopathologie de la DDIV associe la mort cellulaire, l'inflammation et la dégradation de la matrice extracellulaire, mais n'est pas encore totalement comprise. Bien qu'il existe des traitements symptomatiques pour limiter la douleur, il n'y a actuellement aucune stratégie thérapeutique permettant de freiner les mécanismes dégénératifs et d'atténuer l'inflammation à l'origine de la maladie. Parmi les acteurs centraux de l'apparition et de la progression de la DDIV, un mécanisme de survie aberrante des cellules discales, appelé « sénescence », semble directement impliqué et pourrait représenter une cible thérapeutique pertinente. L’objectif premier de cette étude est de mieux comprendre la physiopathologie de la DDIV en examinant la présence et l’activité des cellules sénescentes dans et autour du disque intervertébral, au cours du développement de la DDIV post-traumatique chez le rat, que ce soit dans le dos ou sur la queue. Le second objectif est d’évaluer la pertinence thérapeutique d’un ciblage spécifique de ces cellules sénescentes (élimination ou modulation). Ces deux modèles de dégénérescence discale post-traumatique sont induits chirurgicalement de manière mini-invasive afin de choisir le modèle avec les lésions les plus reproductibles et la dégénérescence la plus proche de la physiopathologie humaine, tout en limitant le risque de dommages liés à la procédure. Par la suite, des thérapies innovantes visant les cellules sénescentes, appelées 'sénothérapies' seront évaluées contre la DDIV du rat. Ces thérapies seront soit administrées à l’ensemble du corps, soit localement, dans le disque malade, à l’aide de gels injectables. L'évaluation se fera sur le modèle jugé le plus approprié, soit dans le bas du dos, soit dans la région de la queue.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comparer les deux modèles dégénérescence discale post-traumatiques mini-invasifs décrits chez le rat et d’évaluer l’expression de cibles thérapeutiques au cours du développement de la pathologie. La prise en charge des patients atteints de dégénérescence discale reste insuffisante, ne traitant que les symptômes, ce projet permettra également de réaliser une preuve de concept avant les essais cliniques, pour évaluer l'efficacité de thérapies innovantes contre la DDIV post-traumatique chez le rat. Ces thérapies seront distribuées sous formes libres à l'échelle du corps entier ou bien transportées dans des gels injectables afin d’être administrées localement dans le disque malade. Ce traitement adapté pour la clinique pourra à terme être proposé pour des essais cliniques vétérinaires chez le chien malade, puis des essais en clinique humaine.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à une chirurgie d’environ 10-15 minutes consistant à introduire une aiguille dans l’espace intervertébral afin de créer une lésion dans des disques intervertébraux au niveau dorsal ou dans la queue de l’animal. Certains animaux entrant dans un protocole de test de molécules thérapeutiques seront 3 semaines plus tard soumis à une deuxième intervention: soit à une seconde chirurgie mini-invasive unique d’environ 10-15 minutes permettant l'injection intra-discale de molécules thérapeutiques à effet prolongé ; soit à une injection systémique unique intra-péritonéale de quelques secondes de molécules thérapeutiques.

Impact sur les animaux

Des nuisances modérées pour les animaux sont à attendre des procédures mises en place dans ce projet. Lors du développement de la dégénérescence, de la douleur discale peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, diminuer son activité, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions, par exemple le toilettage social. L'intervention mini-invasive et percutanée minimise les risques d'infection au niveau des points de piqûre les rendant très peu probables. De plus, une douleur secondaire d’origine nerveuse (neuropathie), due au passage de l’aiguille le long des racines des nerfs spinaux pourrait être observée, n'allant pas au delà de 5 jours suivant la procédure dans le bas du dos de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Cette étude prend en considération la règle des 3R. Les expérimentations in vitro ne permettent pas à l’heure actuelle de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs tissulaires du disque intervertébral (noyaux pulpeux, anneau fibreux, plaques cartilagineuse, os vertébral…) et du système vasculaire. Il est ainsi inévitable de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors du développement de la maladie discale. Le recours aux rongeurs est ici nécessaire afin de valider le potentiel thérapeutique de nouvelles biothérapies. Il n’existe pas, pour le moment, de solution de remplacement in vitro complet, ni de modèles invertébrés.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les potentielles biothérapies seront testées et sélectionnées pour leur efficacité en amont, in vitro, sur les différents types cellulaires du disque intervertébral. Un modèle ex vivo d’explants de disque entier de queue de bœuf sera également utilisé pour étudier la biodistribution des biothérapies dans le tissu spécifique du disque intervertébral. In fine, uniquement les biothérapies les plus prometteuses seront utilisées dans cette étude in vivo. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au strict minimum. Ce nombre, fixé ici à 10 animaux par groupe expérimental, est calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative entre les groupes expérimentaux si celle-ci à un sens biologique dans le contexte spécifique de la maladie discale.

Raffinement

Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage avec de l’enrichissement physique (tubes en carton) pour stimuler leurs comportements naturels. Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. De façon générale, un suivi hebdomadaire des rats permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi postopératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 5 premiers jours pour s’assurer de la bonne cicatrisation et de l'absence de douleur, puis une fois par semaine. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptées, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Dans le cas de la dégénérescence discale, plusieurs modèles animaux post-traumatiques ont été développés, le rat restant la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette maladie, devant la souris, le lapin et la brebis. Le rat présentant le double avantage de présenter une taille de disques intervertébraux compatible avec une injection intra-discale et une voie d’abord accessible à l’échelle expérimentale, sans le recours à de gros animaux. Notre protocole débutera chez des rats arrivés à maturité squelettique et âgés de 12 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de la dégénérescence discale est possible et documentée dans des études précédentes.

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

Provoquer des démangeaisons chez des chiens en bonne santé pour trier des molécules candidates à la mise sur le marché : c'est l'objet de ce projet, qui concerne 200 chiens dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à cinq injections intraveineuses d'une solution prurigineuse, espacées d'une semaine, chaque crise durant environ deux heures pendant lesquelles il se gratte, se lèche et se mordille. S'y ajoutent des prises de sang sur animal éveillé et, à l'occasion, des raclages ou des biopsies de peau, le porteur affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit un comportement de prurit et que cette étape reste "indispensable". Aucun chien n'est tué : 180 seront réutilisés dans d'autres projets, 20 proposés à l'adoption.

Objectifs

L’objectif du projet est d’utiliser un modèle validé de prurit transitoire et modéré, provoqué par une administration intra-veineuse dune solution prurigineuse chez le chien, pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché pour traiter entre autres, la dermatite atopique canine (DAC) ou d’autres pathologies entraînant des comportements de prurit chez le chien. L’utilisation a de ce modèle maitrisé permettrait d’évaluer, premièrement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation dans notre modèle avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien avec environ 10% de la population canine mondiale touchée. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse liée à une prédisposition génétique associée au développement d’allergie à des allergènes variés entrainant des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du chien et de son propriétaire. Tout ceci pouvant, à terme, être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce de destination lors d’un épisode clinique. La maitrise et le maintien d’un modèle induisant des signes cliniques similaires aux crises de prurit observées chez les chiens souffrant de DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de prurit présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’un comportement de prurit expérimental, les caractéristiques du prurit sont suivies en temps réel et en continu pendant toute la période d’expression, standardisée lors de la validation du modèle. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation de l’efficacité. Ce modèle permet aussi une évaluation de la tolérance, du profil pharmacocinétique des molécules testées et offre la possibilité de rechercher et/ou de suivre l’évolution des bio-marqueurs d’intérêt. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce de destination par procédure expérimentale dans un modèle transitoire, représentatif d’un comportement observé dans la DAC spontanée.

Procédures

Au cours de ces études, les animaux pourront recevoir, par voie intraveineuse, une solution entrainant des démangeaisons raisonnables et contrôlées. Ses administrations pourront être répétées au cours d'une étude, sans toutefois dépasser les 5 fois avec au minimum 1 semaine de récupération entre les administrations. Des voies d'administration telles que la voie intramusculaire, la voie sous-cutanée, la voie transcutanée ou la voie orale pourront être utilisée pour l'administration du produit a tester. Les volumes administrés seront en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires. Selon l’objectif de l’étude, des prélèvements sanguins pourront être réalisés. Ces derniers sont réalisés sur animaux vigiles. Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal. Exceptionnellement, selon l’objectif de l’étude, des prélèvements de cutanés par raclage ou biopsie pourraient être réalisés. Selon les prélèvements à réaliser, une anesthésie associée à une analgésie adaptées seront mises en place selon les procédures en vigueur de l'établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Les chiens recevant une injection d’une solution prurigineuse développent des signes modérés et transitoires de prurit, pouvant provoquer de l’inconfort : grattage, léchage, mordillements ou frottements de n’importe quelle partie du corps. Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 30 minutes après l’injection et tous les signes de prurit disparaissent spontanément quelques heures après cette injection (le plus généralement dans les 2 heures suivant l’injection). Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées peuvent également générer un inconfort et/ou une douleur légère à modérée. Avant de conduire des études d’efficacité en utilisant ce modèle, des informations de tolérance chez le chien sont disponibles pour les produits à tester (dose maximale tolérée chez le chien et/ou une autre espèce pertinente, effets secondaires potentiels). Des réactions d’intolérance sévère liées aux produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvements sur un animal vigile peuvent occasionner un(e) léger(e) stress/gêne/contrainte en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil des échantillons le cas échéant.

Devenir

Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire un comportement clinique de prurit chez le chien et d’évaluer l’impact de nouvelles molécules sur l’intensité de l’expression clinique de la crise de prurit. L’utilisation de techniques in vitro préalables à l’utilisation de ce modèle in vivo permet de sélectionner en amont des molécules avec un fort potentiel d’activité sur le processus d’apparition du prurit impliquant certaines interleukines et ainsi de minimiser le recours au modèle in vivo. Cependant, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant pas être reproduite in vitro, cette étape demeure indispensable avant de prendre une décision sur la potentielle efficacité clinique d’une molécule chez le chien et l’éventuelle poursuite de son développement à des fins thérapeutiques.

Réduction

Les comportements de prurit présentent une variabilité entre individus. L'expérience avec ce type de modèle nous montre qu'il faut déterminer le nombre minimal d'animaux par groupe permettant d’obtenir des résultats exploitables et répétables. Ce sont le plus souvent, des études de preuve de concept/pilotes, étapes précoces de l'évaluation d'un nouveau produit/composé actif utilisant 3 à 6 animaux par groupe, qui permettront de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour des études ultérieures réglementaires. L'évaluation et l'interprétation des résultats sont faites avec une échelle de score adaptée pour ce modèle. Il est possible de réduire le nombre d'animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d'étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d'étude, le nombre d'animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié sur la base des informations déjà disponibles, de manière à optimiser l'utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s'assurant que ce nombre d'animaux permette d'atteindre l'objectif de l'étude, c'est-à-dire que les résultats de l'étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l'efficacité du produit/des produits évalués. En plus d'étudier le contrôle du prurit (effet pharmacodynamique), l'utilisation d'un modèle permet d’obtenir éventuellement un profil pharmacocinétique en parallèle. Ces paramètres pourront être combinés et permettre par modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) d’établir une relation entre l’effet et la dose et ainsi proposer une dose thérapeutique adaptée. Lors de ce modèle pourra aussi être réalisée une évaluation de la tolérance générale de la molécule. Toutes les informations obtenues lors d’une seule étude sur ce modèle permettent de diminuer le nombre d’études à réaliser pour statuer sur l’intérêt d’une nouvelle molécule ou de contribuer au développement d’une molécule à des fins thérapeutiques, et de ce fait, de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont observés et manipulés quotidiennement depuis leur arrivée sur le site afin de les habituer à la contention et au contact du personnel formé et impliqué dans les études. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons, et elle n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau ), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Dans le cadre de ce Projet, les animaux sont préalablement testés pour leur capacité à exprimer un comportement de prurit modéré, reproductible, contrôlable et de durée limitée (environ 2h). Depuis leur inclusion dans une étude du projet jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes (toutes les 15 minutes) sont prévues après l’injection de la solution prurigineuse et l’administration des produits testés, pendant au moins 2h30, pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques attendus (prurit) n’entraine pas de dégradation importante de l’état général et du bien-être de l’animal ainsi qu'une bonne tolérance au traitement. Le comportement général, la respiration, le grattage et l’aspect de la peau sont évalués avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères. Ces critères constituent des points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront un examen vétérinaire et éventuellement l’administration d’un traitement adapté à sa condition clinique. La réaction aigue induite et l’inconfort que l’injection de prurigineux engendre, peuvent être contrôlés avec des molécules anti-prurigineux. La grille d’évaluation des observations et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés après analyse rétrospective par la SBEA, des résultats obtenus pendant chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent réglementairement être testés dans l’espèce pour laquelle le produit est développé (animal de « destination »), dans ce cas, le chien. Les modèles seront réalisés chez des chiens jeunes adultes sains, c’est à dire des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.

Une partie des souris utilisées est privée d'interféron gamma, donc incapable de contrôler le parasite qu'on lui inocule, et une autre partie est constituée de souriceaux de sept jours. 1 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inoculation de Cryptosporidium et l'administration des molécules candidates passent par un à cinq gavages par animal, sans anesthésie ni analgésie, le porteur indiquant qu'un anti-inflammatoire modifierait la réponse immunitaire et donc la prolifération du parasite. Les adultes immunodéficients peuvent se retrouver prostrés au bout d'une dizaine de jours, et toutes sont tuées en fin d'expérimentation, l'hébergement en zone confinée avec un pathogène transmissible à l'humain interdisant selon le porteur toute autre issue.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer (1) l’efficacité de molécules candidates anti-cryptosporidiennes présélectionnées in vitro sur des modèles murins (adulte et nouveau-nés) selon plusieurs schémas de traitements, (2) à vérifier si un mécansime de resistance vis-à-vis de celles-ci peut se produire rapidement et si ces traitements impactent le microbiote intestinal. La voie orale représente la voie privilégiée pour que la molécule soit en contact direct avec le parasite qui se développe dans la partie apicale des cellules épithéliales intestinales et qui n’est jamais plus invasif. Nous fixons comme prérequis aux expérimentations in vivo l’obtention d’un index de sélectivité (IS) qui soit supérieur à celui de la molécule de référence ie un antiparaistaire connu soit un index de sélectivité IS faible entre 2 et 3. A titre d’exemple, une molécule que nous avons identifié a un IS élevé et publié.

Bénéfices attendus

Le besoin de posséder des molécules efficaces et sures est un besoin fort que ce soit pour traiter la cryptosporidiose humaine ou animale. Nous attendons de ce projet l’identification de quelques molécules candidates capables d’entrer dans la suite du processus de validation de nouveaux composés, ie des essais de non toxicité- non carcinogène fins réalisées par des partenaires externes et après avoir pris contact avec un industriel intéresssé pour mettre ce produit sur le marché (la demande est forte). Ces étapes voient nombre de composés recalés. Il est donc important d’avoir un arsenal de composés pour qu’in fine quelques uns aient la chance de passer toutes les étapes et d’entrer sur le marché afin d’améliorer le bien être et la santé des animaux et de l’homme. L’objectif à moyen terme est bien de disposer d’un nombre suffisant de molécules pour traiter la cryptosporidiose et faire face à certains mécanismes de résistance. Leur repositionnement vers d’autres parasites apicomplexes sera envisagé avec nos collaborateurs afin d’en accroitre encore la portée thérapeutique.

Procédures

Inoculation et/ou traitement par gavage par voie orale des souris vigiles contentionnés, 1 à 5 fois et moins de 5 min.

Impact sur les animaux

L’infection par C. parvum conduit à des diarrhées chez l’homme et les ruminants. Chez les rongeurs, on n’observe pas de diarrhée mais un ramolissement des fèces. Pour les animaux témoins immunodéficient en interféron, on peut observer des prostrations des animaux après une dizaine de jours. Un suivi quotidien est réalisé et si un ou plusieurs points limites sont obervées. L’infection n’induit jamais de mortalité chez les souriceaux. Les animaux post-traitements sont suivis régulièrement pour observer si un effet indésirable est observé (baisse d’appétit, allergie au produit...), et s’il est constaté une atteinte des points limites tels que définis dans le protocole experimental. Un stress léger est attendu lors de la contention par gavage.

Devenir

Les animaux sont entrés dans des protocoles expérimentaux en zone confinée avec des pathogènes zoonotiques (risque pour l'homme) de classe II. Ils sont donc euthanasiés en fin d’expérimentation et des prélèvements seront réalisés (sang, tissus...) afin de comprendre l'efficacité thérapeutiques des différents traitements.

Remplacement

Nos protocoles expérimentaux sont programmés pour que les essais in vivo ne soient réalisés qu’une fois l’effet démontré de la molécule in vitro sur des lignées de cellules épithéliales ainsi que sa toxicité (test de mortalité cellulaire), sa solubilité dans un tampon compatible avec une administration orale et que la molécule à évaluer démontre un meilleur potentiel que la molécule de référence. L’utilisation d’organoïde n’apporte que peu d’informations supplémentaires. En effet nos cibles thérapeutiques sont localisées dans le parasite lui-même et pas au sein de la cellule hôte. De plus, les organoides n’intègrent pas l’environnement enzymatique agressif du tube digestif qui est susceptible de modifier la biodisponibilité et engendrer une modification chimique du composé. Les composés administrés in vivo peuvent en effet être modifiés par l’environnement complexe du tube digestif (pH, enzymes, etc.) ce qui est difficilement prédictif.

Réduction

Le criblage initital in vitro (efficacité, toxixité, solubilité) permet de réduire considérablement l’utilisation du nombre d’animaux. D’autre part notre organisation chronologique des expériences types est mis en place pour réduire à nouveau substantiellement (petits échantillons, non paramétriques), le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est d’autre part calculé au minimum pour pouvoir garantir l’utilisation de tests statistiques considérant le modèle cryptosporidium chez les rongeurs (modèle de souris sadulte immunodéficientes, modèle de souriceaux de 7 jours). Ces calculs sont basés sur notre longue expérience accompagnée d’une analyse de la littérature réalisée en amont notamment dans le cas ou le composé est repositionné par exemple, et sur un calcul de test de puissance sur nos données.

Raffinement

Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Points limites pour les souris selon l’âge de l’animal pendant au plus 24 à 48h, conduira de fait à l’euthanasie des animaux. Cela s’applique à toutes expériences et procédures citées dans ce document. Adulte (IFNg-/-) : Points limites = au moins un des points suivant en sus des poils hérissés : dos arqué, prostration, mobilité hésitante et aléatoire, yeux mi-clos. Souriceaux : Points limites = mobilité réduite, ou mise à l’écart du nid de façon prolongée par la mère. Toute atteinte du point limite déclenche l’euthanasie de l’animal Les animaux sont hébergés au minimum par 2 dans des cages sur litière et un enrichissement avec des feuilles de papier cellulose, bâtonnets de bois et maison rigide rouge. Et en plus des fils fins de papier kraft non blanchi sont mis pour que les femelles gestantes constituent leurs nids adin de positionner les souriceaux. Ils créent ainsi un tapis doux, élastique et confortable, ce qui en fait un matériau de nidification idéal. L’eau et l’aliment sont ad-libitum. On a une procédure légère à modérée et l’utilisation d’anti-inflammatoires agirait sur la réponse immune et donc sur la prolifération du parasite. Il est décrit dans la littérature, que l’anesthésie peut modifier la réponse immunitaire, le développement du parasite et leur voie de signalisation ce qui serait incompatible avec la finalité de la procédure et l’objectif du projet. Des interactions médicamenteuses peuvent aussi avec lieu entre les antiparasitaires testés et les des anesthésiants et analgésiants déjà décrits des études similaires. Une récompense positive, telle que popcorn ou graine de tournesol, est prévue après un acte.

Choix des espèces

Tout comme les chercheurs internationaux sur ce modèle, nous utilisons en première intention le modèle murin (avant les ruminants) qui reproduit bien l’infection et permet d’évaluer efficacement l’efficacité des drogues. Deux modèles sont utilisés, le modèle de souriceaux de 7 jours qui reproduit la susceptibilité des jeunes ruminants à cryptosporidium et le modèle de souris déficientes pour l'interféron gamma (une cytokine clé dans le contrôle du parasite) qui reproduit la susceptibilité des patients immunodéprimés. Le même parasite zoonotique, C. parvum infectant ces différentes espèces (ruminants, rongeurs, Humain) et nos antiparasitaires ciblant le métabolisme du parasite et non pas l’hôte, tous les modèles animaux susceptibles sont pertinents ; seules les conditions gastrointestinales varient ce qui nous conduit à une validation, en deuxième intention sur l’espèce d’intérêt ruminant. Nous utilisons des souris adultes entre 6 semaines et 15 semaines (souris déficientes pour inteféron gamma) et des souriceaux de 7 jours au démarrage de l’expérimentation (âge qui a été défini pour mimer celui des jeunes ruminants touchés par la cryptosporidiose et celui des jeunes enfants affectés par la maladie. Au-delà de 15 jours les souriceaux conventionels sont naturellement résistants à l’infection grâce au développement rapide de leur système immunitaire digestif.

Neuf vomissements en moyenne par séance, survenant entre quatre et trente-cinq minutes après l'injection, et une léthargie qui dure jusqu'à cinquante-cinq minutes : 30 chiens sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun n'étant tué dans ce projet, tous restant disponibles pour une autre expérience après une période de repos. L'apomorphine leur est injectée sous la peau jusqu'à cinq semaines de suite pour provoquer nausées et vomissements, puis un antiémétique vétérinaire en développement est testé, avec douze à quatorze prélèvements sanguins en cinq jours pour ceux qui le reçoivent. Le porteur écrit que le chien est "l'espèce cible" et qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement", le modèle devant aussi servir au développement de médicaments humains. Le point limite ne se déclenche qu'au-delà de dix vomissements en trente minutes ou de trois heures de symptômes.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : de développer et valider un modèle de nausées/vomissements induit par l’apomorphine chez le chien provoquant des signes cliniques mesurables, répétables, homogènes entre les animaux et pouvant être inhibés par l’utilisation d’antiémétiques; et d’évaluer l’efficacité d’un antiémétique vétérinaire en cours de développement sur ce modèle induit.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle de nausées/vomissements chez le chien contribuera au développement de nouveaux médicaments vétérinaires antiémétiques. Ce modèle pourra également être utilisé pour le développement de médicaments à visée humaine car le chien a une sensibilité aux vomissements proche de celle de l’homme. Le développement de ces nouveaux médicaments permettra de prévenir les nausées et vomissements et de pallier aux effets secondaires de certains médicaments. Le vomissement est en effet l’effet secondaire le plus fréquent des différents médicaments en pratique vétérinaire ou en chimiothérapie. Ce signe clinique peut limiter l’efficacité des doses administrées et cause une gêne considérable qui diminue le confort et la qualité de vie des patients. De plus, une première étude pilote sur un nouveau médicament avec un faible nombre de chiens permettra de valider la poursuite de son développement ou non avant de passer aux études réglementaires de sa mise sur le marché. Le développement de nouveaux produits permettra également la mise sur le marché de médicaments pouvant être moins douloureux à l’administration ou encore permettant de palier à de potentielles ruptures de stock de médicaments déjà sur le marché.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : 1) Administration d’apomorphine en sous-cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur un maximum de 5 séances consécutives, puis un repos de minimum 4 semaines sera appliqué avant de nouvelles administrations si besoin. 2) Administration de maropitant en sous-cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur 2 séances. 3) Administration d’un anti-émétique en cours de développement en sous cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur 2 séances. 4) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes), uniquement sur les animaux traités avec le produit en développement : 12 à 14 prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant les 5 jours suivant l’administration de produit d’essai.

Impact sur les animaux

L‘objectif de ce projet est d’induire des nausées/vomissements chez le chien. De nombreuses publications sur ce sujet montrent que la durée moyenne de ces symptômes est d’environ 30 minutes après l’administration d’Apomorphine avec une durée maximum de 2,5h. A la suite de la réalisation des 2 premières phase, nous savons aujourd’hui que ces données sont confirmée avec une administration de 0.05 mg/kg d’apomorphine . Le nombre moyen de vomissement observé sur les 12 chiens inclus dans ces deux premières phases est de 9, tous survenus entre 4 et 35 minutes après induction. Des signes de nausées (léchage des babines chez tous les chiens et plus occasionnellement une accélération de la respiration, une hypersalivation et des vocalisations) ont été observés rapidement après l’induction. Une léthargie a été observée chez tous les chiens, durant jusqu'à 55 minutes avant une récupération complète. Des autres signes incluant des évènements de prurit, de léchage corporel ou des tremblements passager ont également été observés de façon occasionnelle. L’apomorphine est un émétique commercialisé (EMEDOG) dont les effets secondaires fréquents sont une somnolence, diminution ou perte de l’appétit, augmentation de la salivation, déshydratation légère, troubles du rythme cardiaque transitoire et une douleur légère à modérée au point d’injection. Le Maropitant est également une substance active présente dans un produit vétérinaire ayant une AMM (ex. CERENIA). L’effet indésirable fréquent est une douleur au point d’injection. Il n’est pas attendu d’effets majeurs indésirables avec le nouveau produit en développement car les premiers tests de toxicité auront déjà été réalisés par le donneur d’ordre. En revanche, quelques effets secondaires liés à ce produit peuvent éventuellement ne pas avoir encore pu être anticipés. Les nuisances attendues liées aux prélèvements des animaux (12 à 14 prélèvements en 5 jours) durant la phase 4 sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens pour mettre en place ce modèle de vomissement est justifié car il n’existe pas de méthode alternative pour vérifier l’efficacité d’un traitement antiémétique. L’utilisation d’un modèle in vivo permettra d’utiliser un nombre restreint d’animaux tout en testant des candidats médicaments dans un environnement contrôlé et standardisé.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour cette étude. Des recherches bibliographiques ont permis d’établir le protocole pour mettre en place un modèle de vomissement avec un nombre restreint d’animaux et de périodes dans chaque phase du projet. La molécule choisie (Apomorphine), la dose à administrer, la voie d’administration, les effets attendus seront ainsi déjà estimés. Le nombre d’animaux utilisés correspondra au minimum pour obtenir des résultats interprétables. Le nombre d’animaux sera réduit avec leur réutilisation sur plusieurs phases si possible et une dernière phase en cross-over. L’étude pilote de preuve de concept sur le médicament en développement permettra de valider la poursuite de son développement avec un nombre restreint d’animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnel/plateforme). Avant l’inclusion dans une nouvelle phase, l’état de bonne santé des chiens sera confirmé par un examen clinique et un bilan hémato-biochimique. Pour limiter les quantités de vomissement en volume, les animaux auront été mis à jeun environ 4 heures avant l’administration d’apomorphine. Les phases 1 et 2 ont montré que ces conditions d’alimentation sont adaptées pour le bien-être de l’animal qui vomit de nombreuses fois en très petites quantités. Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués maximum quatre heures après l’administration du traitement pour le suivi des observations. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Les animaux seront observés pendant deux heures après l’induction du vomissement afin de caractériser les signes apparus. Puis toutes les 30 minutes jusqu’à au moins 4 heures post-traitement et jusqu’à disparition des signes (durée maximale des signes est de 2.5h selon le résumé des caractéristiques du produit). Lors de la phase 3 et 4, l’administration du Maropitant (Cerenia) sera faite à température réfrigérée pour diminuer la douleur au site d’injection comme indiqué dans la notice du produit. Lors de la phase 4 un suivi au point d’administration du produit d’essai sera réalisé pour vérifier les éventuelles réaction locale. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal les points limites suivants ont été définis : vomissements très intenses à répétition (plus de 10 en 30 minutes ou qui durent plus de trois heures et sur appréciation vétérinaire), prostration de l’animal, difficultés respiratoires. Dès l'apparition de ces symptômes, l'animal sera pris en charge par le vétérinaire désigné et un traitement adapté sera prescrit pour le soulager.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible pour la mise en place du modèle de nausées/vomissements qui sera utilisé pour le développement d’un traitement antiémétique. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Ce modèle pourra également être utilisé pour le développement de médicaments à visée humaine car le chien a une sensibilité aux vomissements proche de celle de l’homme Chiens adultes correspondant à l’âge cible des traitements administrés.