Maladies animales

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le gros intestin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par gavage ou par injection intramusculaire, et leur abdomen est massé jusqu'à neuf fois pour provoquer la défécation. Le porteur prévoit douleur, stress, réactions d'hypersensibilité locale et diarrhées, et indique que les rats perdant 15 à 20 % de leur poids ou montrant des signes de douleur persistants seront mis à mort. L'objet du projet reste l'effet d'un antibiotique courant sur la flore intestinale, une question que le porteur affirme ne pouvoir trancher qu'in vivo pour mesurer directement la quantité d'antibiotique au contact du microbiote.

Objectifs

Le microbiote intestinal (MI) est fondamental pour la santé des mammifères. Les traitements antibiotiques causent un déséquilibre qui comporte l'augmentation d'espèces pathogènes et/ou porteurs de mécanismes de résistance, au détriment d'espèces bénéfiques à la santé de l'hôte. De plus, les antibiotiques sont souvent associés à l'inflammation des tissus intestinaux. Les voies d'administration par injection semblent avoir un effet moins important sur la sélection des résistances dans le MI, mais peuvent l'affecter en causant des déséquilibres au niveau de la composition du MI. L'association amoxicilline - acide clavulanique (AMC) est active contre plusieurs espèces bactériennes. L'AMC est utilisé chez l'Homme et les animaux. Les études sur l'impact de l'AMC sur la composition du MI, conduites chez l'Homme et certaines espèces animales, ne sont pas concluantes. Deux limites principales ont été observées: i) l'absence de comparaison avec un groupe contrôle constitué de sujets sains non traités; ii) dans certaines expérimentations chez l'animal, l'administration de l'AMC via la consommation ad libitum d'eau ne reflète pas la réalité d'un traitement et de l'exposition de l'indivdu à l'antibiotique. Les objectifs de cette étude sont : i) étudier l'impact de l'AMC sur la composition du MI chez le rat après administration par voie intramusculaire ou orale, versus des groupes contrôles sains non traités ; ii) quantifier les gènes de résistances dans les fèces avant et après l'administration d'AMC et en absence de traitement; iii) évaluer l'exposition du MI, selon les deux voies d'administration, par dosages de l'AMC dans les fèces et le gros intestin ; iv) évaluer la résilience (retour à la composition initiale) du MI après un traitement à l'AMC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet concernent plusieurs aspects. L'analyse du MI via une analyse métagénomique par séquençage aléatoire à haut débit permettra de déterminer quelles communautés bactériennes et fonctions biologiques sont perturbées par l'AMC. Ces connaissances mettront les bases pour développer des stratégies afin de préserver les fonctions du MI. Chez l'Homme, la voie par injection est plus courante dans les hôpitaux avec un relais par voie orale dès que possible. En santé animale, selon les espèces, l'une des deux voies est privilégiée (injectable chez les bovins, orale chez les carnivores domestiques). Cette étude permettra de confirmer l'éventuel impact de la voie injectable sur le MI et donnera les bases pour privilégier une voie d'administration. La plupart des études se sont focalisées sur l'impact d'un traitement antibiotique sur la composition du MI sans évaluer, en parallèle, la quantification des gènes de résistance aux antibiotiques. Cette étude fournira, pour la première fois, une connaissance plus approfondie sur ces deux aspects.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration d'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par voie orale (groupe B), soit par voie intramusculaire (groupe A). L'administration par voie intramusculaire se fera sous sédation gazeuse (durée : 1 minute) pour soulager l'inconfort et la douleur occasionnée par l'injection (durée : 30 secondes). Le gavage (durée : 1 minute) ne nécessite pas de sédation, puisque la pratique repose sur un geste techniqué et maîtrisé. Afin de réaliser les prélèvements de matières fécales, les rats seront disposés dans des boites préalablement désinfectées et l'abdomen de chaque animal sera massé pour favoriser la défécation spontanée. Cette manipulation sera effectuée neuf fois sur 24 rats et 8 fois sur 36 rats. Le gros intestin de tous les rats sera prélevé après sédation gazeuse et mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont la douleur et le stress dus à l'administration de l'antibiotique ainsi que des réactions d'hypersensibilités locales après l'administration intramusculaire de la solution d'AMC. Potentiellement des diarrhées peuvent émerger.

Devenir

J11 et J100, les rats seront mis à morts afin de prélever le gros intestin.

Remplacement

Le modèle animal choisi pour cette étude ne peut pas être remplacé. Seulement les études in vivo permettent de reproduire l'exposition di MI dans le cadre d'une thérapie antibiotique. La quantification directe de l'AMC dans l'intestin permettra d'objectiver directement la quantité d'AMC présente au contact du microbiote.

Réduction

Il est prévu d'utiliser le minimum de sujets nécessaires dans chaque groupe pour pouvoir rendre les résultats interprétables. Selon une approche statistique, il a été estimé qu'un total de 36 rats seraient nécessaires pour la totalité du projet. L'étude nécessite 4 groupes de 9 rats, en tenant compte d'un tiers sera utilisé pour une analyse du microbiote intestinal après la fin de l'administration de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique, et les deux tiers restants pour l'analyse à trois mois après la fin de l'administration de l'antibiotique.

Raffinement

Les rats auront une période d'acclimatation de 3 semaines avant d'effectuer le protocole. Les rats seront hébergés dans des cages spéciales rats qui leurs permettront la stature bipède. Un tunnel, des Sizzle-Nest et des os à ronger sont disponibles dans les cages. La socialité des animaux sera garantie en hébergeant 3 rats par cage. Pour réduire le stress dû à l'administration de l'AMC, les rats auront une sédation. Pour soulager la douleur due à l'injection d'AMC ou à une éventuelle hypersensibilité locale, de la pommade contenant de la lidocaïne sera placée sur la cuisse concernée. Pendant l'administration d'AMC, le poids des animaux sera monitoré. Si une perte de poids importante (-15 à -20% dans les 3 jours et comparée au poids pré-administration ou aux groupes contrôles) est observée, l'animal sera mis à mort. Si l'animal montre des signes de douleur( le poil hérissé, le dos arrondi, le faciès contracté et/ou l'isolement), du paracétamol (200 mg/kg) sera administré par voie orale (biberon), 3 fois maximum pendant 24h. Si les signes de douleur persistent au-delà de 3 jours, l'animal sera mis à mort. La diarrhée est un effet secondaire possible. L'incidence de la diarrhée associée à l'administration d'AMC chez le rat n'est pas connue. En se basant sur les observations conduites chez l'Homme, si une diarrhée de courte durée sans signes de douleurs et sans déshydratation (pli de peau persistant) émerge, aucune modification ne sera apportée au protocole. Cependant, en cas de signes de douleur, du paracétamol sera administré à tous les animaux pour éviter un biais lié à cette administration. Si la diarrhée se prolonge sur plus de 3 jours, associée à des signes de déshydratation et une perte de poids, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L'utilisation des rats comme modèle d'étude nous permet de contrôles les facteurs, comme l'âge, l'alimentation ou encore l'état de santé , qui peuvent jouer un rôle dans la composition du MI et donc être confondant pour l'évaluation de l'impact de l'AMC. Les rats sont le modèle le plus utilisé dans les études du microbiote intestinal. De plus, le rat est souvent utilisé pour les études sur le MI humain, car son MI conserve des caractéristiques communes à tous les mammifères, permettant la généralisation des résultats. Dans le cadre de l'étude de l'impact de l'AMC sur le MI, les rats seront adultes (8 semaines). En effet, à ce stade, la composition du MI est stabilisée. Ainsi, les perturbations observées après l'administration d'AMC peuvent être attribuées à l'antibiotique et non au sevrage des rats.

6 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés. Ils reçoivent, vigiles, trois injections sous-cutanées d'un vaccin expérimental et neuf prélèvements sanguins de 20 mL sur six mois, pour évaluer la production d'anticorps contre une molécule de l'inflammation en vue d'un traitement de l'arthrose canine. Le porteur indique n'attendre aucune séquelle et un stress léger, ce qui justifie selon lui la réutilisation des animaux. Il précise que la réponse immunitaire ne peut être évaluée in vitro et que le chien est l'espèce cible du vaccin.

Objectifs

L’arthrose est une maladie courante chez le chien, touchant différentes articulations et ayant un impact significatif. Près de 20% des chiens souffrent d’arthrose. Les traitements actuels se concentrent sur le soulagement des symptômes à l’aide d’analgésiques et d’infiltrations. Malheureusement, comme chez l’Homme, la maladie tend à s’aggraver avec le temps. L’immunothérapie active propose une approche alternative en induisant la production d’anticorps contre des protéines du « Soi ». Pour ce faire, des peptides (petites protéines), qui font partie du « Soi » et donc n’induisent pas de réponse immunitaire initialement, sont couplés à une protéine porteuse étrangère. En vaccinant ainsi contre les molécules responsables de l’inflammation, on peut espérer soulager l’animal durablement. L’objectif de cette étude est de confirmer la bonne tolérance et d’évaluer la réponse immunitaire suite à l’utilisation de cette stratégie de vaccination chez le chien, déjà testée avec succès chez la souris et le lapin, en amont d'un essai clinique vétérinaire. Deux groupes de trois chiens seront l’objet d’immunisations avec le vaccin par voie sous-cutanée et la production d’anticorps sera évaluée au fil du temps. Des tests in vitro seront également réalisés pour confirmer la capacité des anticorps à neutraliser leur cible.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir des données de tolérance et d'immunogénicité sur deux doses différentes, indispensables à la préparation d'un essai clinique vétérinaire sur des chiens de compagnie atteints d'arthrose. En effet, l’arthrose est une affection prévalente chez les chiens, touchant différentes articulations et ayant une incidence significative. Selon plusieurs études, l’arthrose concerne 20% des chiens et est la cause la plus fréquente de douleur chronique chez le chien. De plus, des chiens plus jeunes peuvent également développer de l’arthrose en raison de contraintes articulaires intenses, comme c’est le cas chez les chiens de course. Les articulations les plus couramment touchées chez les chiens sont celles des membres, du rachis ou encore du bassin. Comme chez l’Homme, les traitements reposent sur le traitement des symptômes avec l’utilisation d’analgésiques et des infiltrations. Malheureusement, bien que les traitements visent à atténuer la douleur et à ralentir la progression de la maladie, il est important de noter que l’arthrose chez le chien tend à s’aggraver au fil du temps. De plus, l’administration d’anti-inflammatoires aux chiens est liée à de nombreux effets indésirables tels que des hémorragies gastro-intestinales et des lésions rénales et la gestion de ces effets indésirables demeure difficile. L’approche thérapeutique testée ici consiste à inciter l’organisme hôte à produire son propre traitement en stimulant une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre la cible impliquée dans l’arthrose et la douleur associée.

Procédures

Trois injections sous-cutanées seront effectuées sur chacun des chiens vigiles, espacées d’un mois puis de 3 mois. La durée de la manipulation des animaux est estimée à 5 minutes environ. Neuf prélèvements sanguins de 20 mL seront également réalisés sur chacun des chiens vigiles et étalés sur 6 mois, avec un intervalle entre chaque prélèvement d’au moins 14 jours. La durée de la manipulation des animaux est estimée à 5 minutes environ.

Impact sur les animaux

Lors d’essais réalisés sur les souris, les lapins, les singes et l’Homme, aucun effet indésirable grave n’a été observé. Cependant, une induration au point d’injection du conjugué a été observée chez certains patients ainsi que chez les singes, de façon transitoire (Desallais et al. 2016). Un tel phénomène pourrait être observé chez les chiens de cette étude. Les chiens seront également soumis à 9 prélèvements sanguins ce qui peut constituer une source de stress.

Devenir

Nous ne nous attendons pas à ce que ce projet induise de séquelles sur les animaux et le stress lié à la procédure est léger. Il n’y a donc pas de contre-indication a priori à la réutilisation de ces animaux.

Remplacement

Nous souhaitons développer un vaccin qui, à terme, pourrait traiter l’arthrose inflammatoire chez le chien. Après avoir testé l’immunogénicité du conjugué et la capacité neutralisante des anticorps chez la souris et le lapin, il est nécessaire de déterminer la dose optimale de conjugué à utiliser chez le chien ainsi que de valider le schéma vaccinal avant de réaliser un essai clinique plus large sur des chiens souffrant d’arthrose. La réponse immunitaire induite par le vaccin chez le chien, cible du vaccin, ne peut pas être évaluée in vitro.

Réduction

Deux études préliminaires ont été réalisées chez la souris et le lapin afin d’encadrer la dose optimale à injecter pour induire une production d’anticorps chez les animaux. Cet encadrement nous a permis de sélectionner deux doses à tester chez le chien. Il s’agit d’un protocole de preuve de concept, le nombre de chiens par lot est volontairement réduit au minimum de 3 chiens/lot afin d’évaluer si le protocole est sujet à la variabilité inter-individus. Aucun test statistique ici n’est nécéssaire, pour établir un nombre minimum de chien par lot. Ces données préliminaires serviront aux futurs tests cliniques qui seront réalisés ultérieurement. Suite à l’accord du vétérinaire référent, chaque chien provient d’un projet précédent, cette réutilisation participe ainsi à la réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux, réutilisés, sont déjà habitués à l’environnement des locaux ainsi qu’aux personnes qui les manipuleront : le stress global sera ainsi réduit. Une attention particulière sera portée à la minimisation du stress au moment des manipulations : injections et prélèvements. Les chiens seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage habituel. Le temps sera pris avant le prélèvement pour rassurer le chien. À la fin du prélèvement, une friandise sera donnée au chien, qui sera également félicité par la voix et des caresses, afin d’induire un renforcement positif. Sur le plan de l’hébergement, les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, avec leurs congénères habituels (animaux déjà présents dans l’EU, les groupes d’animaux ayant été constitués selon les affinités de caractères), dans des boxes extérieurs. Leur alimentation reste inchangée et de l’eau est proposée ad libitum. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (niche, chauffée de novembre à avril), une plateforme et des jouets. Ils bénéficieront d’interactions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux) et d’une sortie quotidienne (hors week-end et jours fériés) dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.

Choix des espèces

Le vaccin que nous souhaiterions tester est un conjugué peptidique composé d’un peptide issu de l’interleukine-6 de chien et d’une protéine porteuse. Il a été développé à des fins de traitement chez des chiens arthrosiques. Après deux études pilotes réalisées chez la souris et le lapin, nous souhaiterions tester l’immunogénicité de notre conjugué chez le chien, espèce cible. Le système immunitaire des animaux doit être compétent, ainsi les chiens utilisés seront des chiens adultes, mâle ou femelle.

48 truies gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour reprendre leur cycle de production dans l'élevage. Elles reçoivent une ou deux prises de sang et une injection de vaccin ou de placebo, avec des effets indésirables possibles au point d'injection et de la fièvre. Le porteur teste l'innocuité chez la truie gestante d'un vaccin déjà autorisé chez le porc en engraissement, en préalable à une étude d'efficacité. Il justifie le recours à l'espèce porcine par le fait que le vaccin lui est destiné.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester l’innocuité de l’administration d'un vaccin inactivé par voie intramusculaire contre Actinobacillus pleuropneumoniae, chez la truie gestante. C'est un vaccin à destination des porcins visant une immunisation active des porcs à partir de 6 semaines d'âge, afin de réduire les lésions pulmonaires et la colonisation des voies respiratoires par Actinobacillus pleuropneumoniae (App) exprimant des toxines. Ce vaccin est administré chez le porcelet en croissance pour protéger les animaux en engraissement contre la toux, la pleurésie et la mortalité liées à cette bactérie. L'innocuité a donc été évaluée pour ce stade physiologique. En effet, ce vaccin dispose d'une autorisation de mise sur le marché (AMM) pour les porcins et est indiqué pour les porcs en engraissement. La truie infecte les porcelets à partir de l'âge de 2 semaines et ces porcelets infectés propagent l'infection dans le groupe lors de la disparition de l'immunité maternelle, après le sevrage. La transmission se fait par l'intermédiaire des gouttelettes de salive projetées par les animaux porteurs. La sensibilité immunitaire de l'élevage dépend du niveau d'anticorps d'origine maternelle (AOM) pouvant perdurer de 5 à 12 semaines, et de la présence de souches d'App non virulentes à l'origine d'une protection immunitaire croisée. La vaccination des truies, en réduisant la colonisation des voies respiratoires, permettrait de diminuer l'exposition et la contamination des porcelets sous la mère durant la phase d'allaitement. Elle permettrait également de fournir une immunité passive aux porcelets, via des anticorps dans le colostrum, afin de les protéger dans leurs premières semaines de vie, avant l'immunisation active par la vaccination. L'innocuité chez la truie en cas de gestation n'a pas été établie pour ce vaccin. Cette étude sur l'innocuité est préliminaire à une étude d'efficacité, et va permettre de réaliser des tests sérologiques : en effet il n'existe aucune donnée chez la truie concernant la réponse immunitaire en anticorps vis à vis de ce vaccin, et donc le possible transfert d'immunité aux porcelets, via le colostrum.

Bénéfices attendus

Dans le dossier d'AMM, l’innocuité du médicament vétérinaire n’a pas été établie en cas de gestation. En vue d'une utilisation du vaccin sur les truies en cours de gestation, il est nécessaire, avant d'en étudier l'efficacité, d'établir des connaissances sur l'innocuité. C'est l'objet de cette étude.

Procédures

Les prises de sang se feront sur animal vigile. Cette opération sera réalisée une fois, 6 semaines avant mise bas pour le groupe placébo, et deux fois, 6 et 1 semaines avant la mise bas pour le groupe vacciné. La durée maximale d'une prise de sang est d'une vingtaine de seconde. Les injections de vaccin ou de placébo seront faites selon les bonnes pratiques d'injection et durent en moyenne 3 secondes. 48 animaux seront concernés.

Impact sur les animaux

Les prises de sang et la contention sont une source de stress ponctuel pour la truie. Les cas de saignement par le point de ponction sont rares mais pas inexistants. La vaccination qui peut également avoir des effets indésirables sur les truies : rongeur et gonflement au point d'injection, élévation de la température corporelle. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux conformément à la réglementation en vigueur. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.

Devenir

Les animaux sont tous gardés en vie en fin de procédure. Ils continueront leurs cycles de production classiques d'un élevage de porcs.

Remplacement

L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine.

Réduction

L'unité épidémiologique est l'animal. Les écarts attendus entre le groupe témoin et le groupe vacciné nécessitent de mener l'étude sur 48 animaux, soient 24 truies par groupe. Des données qualitatives (état de santé des animaux, évaluation du site d'injection) et quantitatives (température rectale, taux d'anticorps) seront comparées entre groupes par des tests statistiques. Le nombre d'animaux pour lequel une prise de sang sera réalisée a été fixé pour représenter l'unité épidémiologique, soient 48 truies.

Raffinement

Les prises de sang seront réalisées par une personne aguerie à ce geste afin que les périodes de contention soient réduites autant que faire se peut. Pour les vaccinations, il est recommandé d'utiliser une contention afin que les injections soient réalisées correctement. Cette contention consistera loger les truies temporairement dans des stalles individuelles, les unes à côté des autres, pour la durée des injections. Les truies seront ensuite libérées. C'est une procédure réalisée classiquement à chaque séance de vaccination dans l'élevage expérimental de Romillé. Parmi les effets indésirables du vaccin chez le porc en croissance sont rapportés une induration, une rougeur ou un gonflement au site d'injection qui se résorbent spontanément, ainsi qu'une augmentation de la température pendant 1 à 2 jours après l'injection. Ce sont des effets indésirables qui arrivent fréquemment lors de la vaccination des animaux et qui feront l'objet d'investigations lors de cette étude. Tout autre symptôme sera également noté. Des soins seront apportés aux animaux dès que nécessaire (antipyrétiques, anti inflammatoires, isolement en infirmerie). En cas d'effets indésirables cumulés ou impactant l'état général de l'animal, la/les truie(s) concernée(s) sera/ont isolée(s) en infirmerie, soignée(s) et sortie(s) de l'étude. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux d'enrichissement, conformément à la réglementation. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.

Choix des espèces

L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine. Les truies seront suivies de 6 semaines avant la mise bas jusqu'à la mise bas. Les vaccinations seront réalisées sur cette période (6 et 3 semaines avant mise bas). La comparaison des effets indésirables et de la réaction immunitaire liés à la vaccination se feront sur cette période. Leurs porcelets à la naissance seront également inclus dans l'étude.

2 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés à l'issue du projet. Déjà réutilisés d'un autre protocole autorisé, ils reçoivent une injection sous-cutanée par semaine pendant quatre semaines et cinq prises de sang, pour tester la tolérance de fragments d'ADN candidats au traitement des tumeurs cutanées équines. Le porteur affirme que le remplacement n'est pas possible, le cheval étant l'espèce cible et les molécules spécifiques. Il décrit une injection peu ou pas douloureuse et une surveillance rapprochée après chaque geste.

Objectifs

Les mélanomes représentent 3,8% des tumeurs chez le cheval et affectent plus de 80% des chevaux gris de plus de 15 ans. Le mélanome équin est un cancer d’évolution lente mais très métastatique et invasif. Il entraine progressivement des douleurs et troubles fonctionnels (en particulier digestifs), voire des hémorragies chez les chevaux de plus de 10 ans. Actuellement, il n’y a pas de traitement spécifique totalement efficace et les chevaux affectés ont une espérance de vie réduite. Par ailleurs, les jeunes chevaux de races diverses sont fréquemment atteints par des tumeurs cutanées de type sarcoïde, induites par un papillomavirus d’origine bovine ; ces tumeurs souvent placées dans les zones très mobiles (pli du coude, du grasset, passage de sangle) peuvent entraîner saignements et gêne à l’utilisation des animaux, voire leur réforme anticipée.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une étude préliminaire de tolérance de fragments d'ADN candidats au traitement des tumeurs cutanés chez le Cheval (mélanomes et sarcoïdes). Les doses testées vont de ½ à 4 fois la dose de traitement envisagée. Si les injections répétées à 4 fois la dose de traitement par voie sous-cutanée sont bien tolérées, cette étude permettra d’envisager l’utilisation de ces fragments d'ADN à la dose prévue par voie intratumorale (diffusion générale probablement moindre) chez des cas cliniques (chevaux porteurs de mélanomes ou de sarcoïdes).

Procédures

Vigiles, les chevaux sont soumis à une injection sous cutanée une fois par semaine pendant 4 semaines (soit 4 injections au total, 30 s par injection) et à une prise de sang avant le début du protocole puis une fois par semaine pendant 4 semaines (soit 5 prises de sang au total, durée 30 s chacune).

Impact sur les animaux

L’injection est normalement peu à pas douloureuse. Le fragment d'ADN testé est une poudre diluée dans du sérum physiologique, donc facile à injecter avec une aiguille de petit diamètre et ne causant pas d’irritation locale. D’une manière générale ces fragments sont bien tolérés que ce soit par voie générale (injection sous-cutanée ou intra-musculaire) ou locale (intrathécale ou intraoculaire) aussi bien chez l’animal de laboratoire que chez l’homme (nombreux essais cliniques faits et en cours). Il s'agit dans cette demande d'un ADN modifié nu sans emballage lipidique, ni adjuvant ; il est de qualité très purifiée et normalement non réactive. Après purification, un contrôle d’absence d’endotoxine est réalisé par le fabriquant. La dose injectée est faible au regard de la masse totale de l’animal. Nous n’attendons donc normalement pas de réaction particulière après les injections. Néanmoins, cette étude est menée pour le vérifier.

Devenir

La procédure ne devrait pas causer de dommage aux animaux ; ils seront replacés à l’issue du projet.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible, le cheval étant l’espèce cible du traitement évalué, et les fragments d'ADN utilisés des molécules spécifiques. La molécule testée a été retenue parmi d’autres molécules candidates à l’issue d’études in vitro et s’est montrée la plus efficace sur cultures cellulaires issues de tumeurs de cheval.

Réduction

Le nombre de 2 chevaux est le nombre minimal pour cette étude préliminaire observationnelle. Il permettra de vérifier sur deux individus différents que la molécule testée est bien tolérée localement et sans effets généraux. Aucun test statistique n'est donc envisagé. Les 2 chevaux sont réutilisés d'un autre projet autorisé.

Raffinement

Les chevaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée après chaque injection avec des examens toutes les 2 heures dans les 8 heures suivant l’injection, puis deux à trois fois par jour. Les chevaux seront dans un environnement hospitalier permettant une surveillance quasi continue et une intervention rapide au moindre signe d’inconfort ou de douleur. Pendant l’essai, les chevaux seront hébergés en box individuel sur paille, avec contact visuel avec des congénères. Ils seront nourris avec du foin à volonté et des granulés complémentaires de fourrage distribués en trois repas par jour. Ils seront pansés et sortis marchés en main 15 minutes deux fois par jour. Les boxes sont également enrichis (foin dans un filet pour allonger le temps d’alimentation, pipolino-balle distributrice de granulés/friandises, etc).

Choix des espèces

Le cheval est l’espèce cible du traitement testé. Par ailleurs, les fragments d'ADN sont spécifiques. Animaux jeunes adultes (en général entre 3 et 5 ans).

200 chiens vont être utilisés, dont 150 tués à l'issue et 50 réutilisés ou proposés à l'adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infestés à plusieurs reprises par des tiques porteuses de la bactérie de la borréliose sous tranquillisation, isolés cinq jours à chaque fois, et subissent prélèvements de sang, biopsies de peau et comptages de tiques, pour évaluer un antiparasitaire vétérinaire. Le porteur indique que les chiens témoins sont volontairement exposés à l'infection et que les animaux restés porteurs seront tués faute de pouvoir être traités ou adoptés. Il affirme que le recours à l'espèce cible est "indispensable" et "recommandé d'un point de vue réglementaire" pour démontrer l'efficacité préventive.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un produits pharmaceutiques parasiticides vétérinaires, ayant démontrés une efficacité parasiticide, à empêcher la transmission de la borreliose par des tiques infectées par Borrelia burgdorferi sensus lato chez le chien.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la prévention de la transmission de la borreliose (ou maladie de Lyme chez l’homme) chez le chien, et par conséquent la prévention de la transimission de la maladie de Lyme à l’homme en réduisant le nombre d’hôtes infectés pouvant transmettre la bactérie aux tiques.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à une administration en vigile. Cet acte dure environ 3 minutes. Tous les animaux sont soumis à une infestation sous tranquilisation ou anesthésie, en cage d’infestation. Les tiques sont déposées directement sur l’animal ou à côté. Cet acte est répété 3 fois minimum 3 fois ou plus si le produit est à action longue. L'acte dure environ 30 minutes. Tous les animaux sont hébergés en cage individuelle durant 5 jours. Cet isolement est répété à chaque infestation soit 3 fois minimum ou plus si le produit est à action longue. Tous les animaux sont soumis à des prélèvements sanguins en vigile au minimum 3 fois pendant toute la durée du protocole ou plus selon la durée du produit. Cet acte dure environ 3 minutes. Tous les animaux sont soumis a des biopsies cutanées sous anesthésie locale ou tranquillisation en fonction de l'animal. 2 biopsies punch minimum sont effectuées pendant toute la durée du protocole ou plus selon la durée du produit. Cet acte dure environ 5 minutes. Tous les animaux sont soumis à des comptages des tiques avec recherche et retrait dans le pelage en vigile. Cet acte est répété 3 fois minimum pendant toute la durée du protocole ou plus selon la durée d'action du produit. Cet acte dure environ 15 minutes. Enfin, tous les animaux sont soumis à des observations cliniques complètes en vigile selon le protocole et la durée d'action du produit. Cet acte dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : Risques liés à l’anesthésie (hypotension, hypothermie). Cependant, les animaux ne seront pas anesthésiés profondément, l’effet recherché étant une tranquilisation, et seront observés tout le long. Isolement des animaux sur une durée maximale d’environ 5 jours après l’infestation pour éviter le toilettage mutuel des animaux. Contention des animaux en cages d’infestations, placées dans la zone d’hébergement lors de l’infestation. Les animaux seront placés anesthésiés dans les cages d’infestation (de la taille équivalente à une cage de transport) avec les tiques, afin de faciliter leurs attachements sur l’animal et d’éviter la propagation dans l’environnement. Après la fin de l’anesthésie les cages seront ouvertes pour permettre aux animaux de sortir d’eux même lorsqu’ils le voudront. Réalisation de biopsies cutanées. Les sites de biopsies seront nettoyés et suivis. Risques liés à l’infection par la borreliose chez les chiens des groupes contrôles. Cependant, 95% des chiens exposés à Borellia burgdorferi sensus lato sont asymptomatiques. Les atteintes les plus rapportées sont les atteintes rénales (glomérulonéphrite) chez moins de 2% des séropositifs et articulaire chez 5% des séropositifs (polyarthrite). Ces atteintes n’étant pas aigues et les animaux contrôles étant euthanasiés deux mois après l’infestation, il est peu probable d’observer ces signes.

Devenir

Les animaux positifs à Borrelia burgdorferi sensus lato (groupes contrôles et traités) seront euthanasiés en fin d’étude, car même si asymptomatique, il ne sera pas possible de les traiter (le traitement de la borreliose est long et contraignant pour les animaux). Ils ne pourront donc pas être réutilisés dans d’autres projets et ne pourront pas être proposés à l’adoption (il n’est pas possible de laisser des animaux porteurs de Borrelia burgdorferi sensus lato en extérieur, car ils pourraient infecter des tiques). Les animaux dont la négativité à Borrelia burgdorferi sensus lato sera avérée pourront être réutilisés dans ce même projet ou dans d’autres projets léger ou modéré après validation par un vétérinaire, ou proposés à l’adoption.

Remplacement

Pour pouvoir transmettre la maladie, la tique doit commencer un repas sanguin sur son hôte. De plus, pour pouvoir démontrer qu’un produit pharmaceutique parasiticide prévient de la transmission de la maladie par le vecteur, il faut que le produit pharmaceutique parasiticide soit appliqué sur l’espèce hôte au moment de l’infestation par les tiques. Le recours a l’animal est donc indispensable pour démontrer l’efficacité préventive contre la transmission de la maladie et recommandé d’un point de vue réglementaire.

Réduction

Aucun test n'a été utilisé. Le nombre d’animaux utilisés est évalué en prenant en compte tous les critères (exigences réglementaires, études précédentes, susceptibilité des animaux, données bibliographiques) pour réduire le risque d’étude non conclusive. Lorsque le statut des animaux le permet, les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress et de stabiliser l'état physiologique. La durée optimale est de 7 jours. Des points limites spécifiques ont été définis afin de limiter le plus précocement possible la douleur des animaux. Ces critères sont en constante évolution pour les améliorer afin de réfleter au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est compétent pour identifier des signes d’inconfort ou de douleur. Une anesthésie et une analgésie peuvent être réalisées lors de certains actes si nécessaire. Pour réduire l’inconfort provoqué par l’administration et/ou les prélèvements : - Des opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée. - En cas d’administration et/ou de prélèvements douloureux ou répétées, ou pouvant entrainer un stress important, une anesthésie et/ou une analgésie peuvent être réalisées - La zone de prélèvements peut évoluer - Pour les opérations d’infestations / comptage, une sédation et/ou une anesthésie peuvent être réalisées - Les animaux sont entrainés à la contention et aux méthodes de prélèvement afin de réduire le stress et l’inconfort lors de la réalisation des actes techniques. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Lors de la période d’hébergement individuel, les animaux conservent un contact visuel et olfactif entre eux et des enrichissements supplémentaires sont ajoutés. Les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement adaptées afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. La réalisation de la procédure de validation du modèle permet de s’assurer que les tiques peuvent transmettre la maladie avant de commencer les études d’efficacité, et d’éviter ainsi des études non conclusives ayant pu utiliser un grand nombre d’animaux. De plus avant chaque début d’étude d’efficacité, la compatibilité des chiens au modèle est testée afin d’inclure uniquement des animaux compatibles avec l’attachement des tiques et éviter des études non conclusives. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible. Les signes cliniques liés à la borreliose étants plus importants chez les chiens de moins de 3 mois. Des chiens adultes seront utilisés afin de limiter le risque de développer des signes cliniques.

140 chiens vont être utilisés, gardés en vie et réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines, les chiots subissent des prises de sang répétées, des biopsies de peau et jusqu'à trois biopsies intestinales par ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale, ainsi qu'une sensibilisation à la cacahuète poursuivie jusqu'à l'apparition d'un eczéma. Le porteur décrit l'induction volontaire d'une allergie alimentaire et d'une réaction cutanée comme la "preuve" recherchée, et indique un suivi sur deux ans. Il affirme que le chien est le "modèle idéal", seule espèce développant une dermatite atopique spontanée comparable à celle de l'humain.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples : 1) Déterminer le rôle et les mécanismes de sensibilisation à travers la peau d’allergènes alimentaires chez le chien. 2) Evaluer la possibilité de rétablissement de la tolérance aux allergènes alimentaires chez les chiens allergiques. 3) Explorer les risques de rupture de la tolérance, induite par contact précoce digestif, par pénétration des allergènes par voie cutanée chez les chiens tolérants. 4) Déterminer si des modifications des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané, sont associées à la sensibilisation à des allergènes alimentaires et à l’allergie alimentaire. 5) Evaluer si la composition des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané est modifiée par la sensibilisation à des allergènes alimentaires ou l’allergie alimentaire, et déterminer si ces modifications sont réversibles. 6) Identifier des biomarqueurs de la sensibilisation à des allergènes, présents dans la couche cornée. 7) Comparer ces résultats avec les mêmes paramètres évalués à partir des modèles expérimentaux de dermatite atopique canine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront, en plus de la connaissance scientifique sur les mécanimes pathogéniques de ces allergies (dermatite atopique et allergie alimentaire), d’en améliorer la prise en charge. En effet, aujourd’hui, l’éviction alimentaire (croquettes hypo / anallergéniques strictes) semble la seule méthode de diagnostic fiable d’allergie alimentaire, qu’elle soit associée à une dermatite atopique ou pas. Nous souhaitons mettre en évidence des biomarqueurs diagnostiques dans le sang et dans la peau (désensibilisation par immunothérapie) qui évitera la lourdeur d’un régime d’éviction alimentaire et de nombreux dosages d’IgE sériques inutiles car non validés et permettront : 1) d’accélerer la démarche diagnostique et donc la prise en charge de cette dermatose, 2) de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses. Ces biomarqueurs pourront églement servir lors du suivi thérapeutique. De plus, le modèle actuel d’allergie alimentaire étudié est un modèle murin, très éloigné de l’Homme. Il serait intéressant de montrer une similarité avec notre modèle d’allergie alimentaire canin car le chien est un modèle plus pertinent, de part la proximité qu’il partage avec l’Homme : environnement, alimentation, pression allergénique.

Procédures

Chez chiots (actes étalés sur une période d’environ 33 semaines) : écouvillons cutanés et prélèvements de selles (à 5 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prises de sang (à 8 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 4 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois), biopsies intestinales (à 3 reprises, avec 2 biopsies à chaque fois, sous anesthésie générale par ouverture de l’abdomen par une incision large, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 heure à chaque fois entre l’induction de l’anesthésie, l’acte chirurgical et le réveil des animaux). Un test cutané explorant la sensibilisation à divers allergènes sera également réalisé (sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 15 minutes). Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines, avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois). Chez chiens (actes étalés sur une période d’environ 7 semaines) : prises de sang (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prélèvements partie superficielle de la peau (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 2 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois). Application cutanée de l’allergène après rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois). Injections sous-cutanées d’allergène 2 fois par mois (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 30 seconde par animal à chaque fois).

Impact sur les animaux

Prises de sang au début de la sensibilisation, puis en fin de sensibilisation 42 jours plus tard, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain. Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes). Puis, environ 6 mois plus tard, sensibilisation à travers la peau 2 fois par semaine jusqu’à obtention d’un eczéma lors de la phase de rupture de la tolérance. Biopsies cutanées réalisées par voie sous-cutanée en début de sensibilisation, puis 42 jours plus tard en fin de sensibilisation, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Biopsies intestinales réalisées lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Ces biopsies impliqueront donc une ouverture de l’abdomen par une incision large sous anesthésie générale. La possibilité d’une éruption se manifestant par des plaques rouges au niveau des lèvres, d’un gonflement de zones de tissu sous la peau, voire d’une réaction allergique importante est attendue lors de la phase de déclenchement (administration par voie orale de la cacahuète) et cette réaction sera la preuve de l’allergie alimentaire induite par sensibilisation transcutanée. Pour les témoins positifs : réaction inflammatoire de la peau modérée possible au site d’injection se résolvant de façon spontanée.

Devenir

Après chaque procédure, les animaux seront gardés en vie, car les procédures ne devraient pas impacter l'état de santé des animaux sur le long terme. Le vétérinaire et le directeur d'étude valideront systématiquement le devenir des animaux, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, et des possibilités éventuelles de réutilisation. Certains animaux pourront entrer dans un programme d'adoption, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, des possibilités éventuelles de réutilisation, et de leur comportement. Il n'est pour le moment pas possible d'anticiper le nombre d'animaux qui seront adoptés.

Remplacement

Une première étude in vitro sur peau reconstruite permet de caractériser l’inflammation induite par le contact avec la cacahuète, mais il n’est pas possible de réaliser la phase de déclenchement (qui consiste à administer l’allergène par voie digestive), d’où la nécessité d’utiliser des animaux vivants. Ce projet repose sur l’étude de la voie d’administration de l’allergène et de la comparaison entre l’induction de tolérance digestive versus la sensibilisation par voie transcutanée, qui n’est possible que sur animaux vivants. Enfin, le projet utilise des animaux vivants car il fait intervenir des réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Pour atteindre les objectifs du projet, les résultats seront analysés statistiquement.

Réduction

L’étude repose sur la formation de 10 groupes de chiots. Le nombre de chiots nécessaires pour une puissance statistique satisfaisante est de 90. La comparaison avec des modèles expérimentaux de dermatite atopique se fera sur 50 chiens pour avoir un nombre assez proche de chiots et des résultats interprétables.

Raffinement

Période d’acclimatation systématique de 2 à 3 semaines avant le premier acte technique. Animaux hébergés en groupe et avec des jouets. Des points limites adaptés permettront de sortir un animal de l’étude afin de limiter la douleur à son minimum. Actes techniques réalisés par du personnel formé et habitué à travailler avec les chiens, toujours accompagnés de renforcement positif (calins, croquettes). Présence de vétérinaires et surveillance accrue des animaux lors du déclenchement de l’allergie alimentaire. Pour les chiots, des lampes chauffantes seront installées. Paramètres d’ambiance des salles surveillés avec possibilité de modifier la température, afin d’optimiser le bien-être des chiots. Les chiots seront en présence de leur mère jusqu’au sevrage complet. Biopsies cutanées réalisées sous anesthésie locale et biopsies intestinales réalisées sous anesthésie générale, avec observation quotidienne des sites après interventions et prise en charge de la douleur.

Choix des espèces

Chez le chien, l’allergie alimentaire est souvent évoquée, exceptionnellement confirmée, car surtout mal comprise, en particulier chez les chiens souffrant de dermatite atopique. C’est la seule espèce qui présente une dermatite atopique comparable (sur plans cliniques et pathogéniques) à celle de l’Homme. Ce modèle permettra de vérifier les données obtenues uniquement dans le modèle murin expérimental et permettra d’approfondir les connaissances de la dermatite atopique du chien et d’explorer le rôle des allergènes alimentaires, en particulier la voie de pénétration de l’allergène. Utilisation d’animaux vivants car intervention de réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Le chien est l’espèce cible mais le projet peut, par la suite, servir à l’étude de l’allergie alimentaire chez l’Homme. Le chien est l’espèce idéale pour réaliser un modèle d’allergie alimentaire et de dermatite atopique (de plus, c’est la seule espèce pouvant développer une dermatite atopique de manière spontanée). L’étude s’interesse à une sensibilisation de chiots dès l’âge de 6 semaines pour la comparaison avec l’Homme (les bébés se sensibilisant par voie transcutanée dès la naissance et ayant une diversification alimentaire le plus tôt possible pour induire une tolérance, c’est-à-dire dès 2 mois). Il est donc choisi de commencer à sensibiliser les chiots dès qu’ils commencent une diversification alimentaire et ne se nourrissent plus exclusivement de lait maternel. Ce phénomène se produit à l’âge de 6 semaines chez le chien. Ils seront suivis pendant 2 ans pour la sensibilisation, l’induction de tolérance, la rupture de la tolérance acquise et l’immunothérapie (ce qui renforce le besoin d’animal jeune). Les chiens permettant l’établissement d’un modèle de dermatite atopique seront des jeunes adultes qui seront ainsi comparés aux chiots ayant grandi et pour lesquels l’étape de déclenchement aura eu lieu. Ils présentent, à cet âge, un juste équilibre entre réponse physiologique et acclimatation en étude.