Maladies animales

2 400 animaux non-humains vont être utilisés, 960 souris et 1 440 rats, en majorité tués et pour partie réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés sont placés en atmosphère enrichie en oxygène pour provoquer une atteinte des vaisseaux de la rétine, puis reçoivent des gouttes ou des injections répétées, avec anesthésies et examens d'imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur teste des traitements contre les rétinopathies vasculaires et indique réutiliser les mères gestantes dans d'autres procédures après avis vétérinaire. Sur le remplacement, il affirme avoir besoin d'un œil perfusé en développement, que seul l'animal vivant fournirait.

Objectifs

Les pathologies de la rétine ou rétinopathies sont liées en grande partie à des anomalies de la vascularisation rétinienne. Parmi elles, on retrouve la rétinopathie du prématuré. Cette maladie liée à un mauvais développement du système vasculaire qui touche 30% des prématurés de moins de 31 semaines est la principale cause de cécité infantile dans le monde avec 30000 cas de malvoyance. Le but de ce projet est de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques et de trouver de nouveaux traitements en utilisant un modèle qui va mimer cette atteinte vasculaire chez le rongeur après une exposition à une atmosphère enrichie en oxygène. Plus généralement, lorsque le flux sanguin est altéré et que les vaisseaux perdent leur intégrité fonctionnelle, un mécanisme compensateur de réparation se met en place, avec la formation de nouveaux capillaires à partir des vaisseaux préexistants. Ce phénomène est appelé néovascularisation. Ces nouveaux capillaires sont souvent perméables et se développent de façon anarchique. Ils ne peuvent alors plus assurer correctement le transport du sang et aggravent de ce fait les dommages causés à la rétine. C’est le cas de nombreuses maladies comme la forme humide de dégénérescence maculaire liée à l’âge, première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans et la rétinopathie diabétique, première cause de cécité acquise dans les pays occidentaux chez l’adulte entre l’âge de 25 et 74 ans. Ce projet s’inscrit donc avec ce modèle de rétinopathie, développé dans les années 1950, dans un cadre plus large que la seule rétinopathie du prématuré. Il est largement utilisé depuis pour l’étude de l’angiogenèse et de la néovascularisation pathologique au niveau de la rétine. Il permet de ce fait de tester l’efficacité de thérapies luttant contre la grande famille des rétinopathies vasculaires. Sur la durée du projet, 10 études par espèce sont prévues en plus des études de formation du personnel aux bons gestes techniques, avec à chaque fois au moins un nouveau traitement ou une nouvelle formulation à tester. Chaque étude nécessite un nombre d’animaux minimum afin de pouvoir comparer les différentes conditions expérimentales et évaluer de l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de nouveaux traitements pouvant améliorer la prise en charge de la rétinopathie du prématuré bien sûr mais aussi toutes les maladies incluant une composante vasculaire telles que dégénérescence maculaire liée à l’âge ou rétinopathie diabétique par exemple.

Procédures

Dès la naissance (rats) ou 7 jours après (souris), les animaux seront placés dans des chambres permettant le contrôle du taux d’oxygène durant une durée définie (14 jours pour les rats, 5 jours pour les souris). La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 17 ou 20 jours de l’étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation à la lampe à fente, angiographie, tomographie…) seront généralement hebdomadaires et de dureront pas plus de 5 minutes. Des anesthésies seront pratiquées autant que nécessaire afin de permettre si besoin l’administration ou l’examen des animaux. Tous les examens réalisés ces procédures sont des examens pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Chez l’homme, toutes les procédures qui ont nécessité une anesthésie générale, se font la plupart du temps sous anesthésie locale. Les autres examens (lampe à fente…) sont totalement indolores ou sous anesthésie locale et ne durent que cinq minutes tout au plus. Chez l’animal, l’anesthésie générale est réalisée afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés aux conditions expérimentales d’hébergement, à leur manipulation et à l’administration des produits. La pathologie recherchée - néovascularisation et perméabilité vasculaire rétinienne - n'induit pas de douleur chez l'animal. La croissance des nouveau-nés et des mères exposés à l'hyperoxie (ou alternance de cycles hypoxie/normoxie) n’est que faiblement impactée. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet de la modification du taux d'oxygène sur le comportement des animaux. La manipulation des nourrissons peut introduire du stress chez les petits comme chez la mère. Les risques sont qu'un animal soit rejeté de la portée par la mère, ne soit plus alimenté ou mangé par la mère. Pour ne pas induire de stress chez les mères déclenchant ces comportements, les manipulations des animaux seront donc limitées au maximum et seront réalisées par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.

Devenir

A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Dans le cadre de notre projet, nous avons besoin d’un œil perfusé en cours de développement. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus dans un environnement enrichi, (bouts de bois, coton pour le nid sur toute la période de l’étude) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Les examens qui nécessitent un immobilisme complet de l'animal pour la prise de photo, sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et après l’intervention. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques, depuis les années cinquantes pour étudier le développement de la vascularisation de la rétine et ses pathologies. Les espèces choisies sont le rat et la souris. Ce sont les espèces références pour ce modèle. Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le principe du modèle est d'agir sur le développement vasculaire de la rétine de nouveau-nés. Les animaux seront donc inclus dans l'étude quelques jours après leur naissance, avec leur mère pour subvenir à leurs besoins.

270 souris, 270 rats et 270 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestations teste pour ses clients des molécules dont elle indique ignorer la nature et les effets, administrées par des voies multiples, avec des prélèvements sanguins par ponction rétro-orbitale, sublinguale ou intracardiaque et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme qui isolent chaque animal. Le porteur reconnaît qu'il lui est difficile d'anticiper les nuisances puisqu'il ne connaît pas les composés testés. Il conclut que l'absence de modèle in vitro rend le recours à l'animal "incontournable" et fixe six animaux par groupe d'après quinze ans d'expérience, sans test statistique.

Objectifs

Ce projet approuvé par la direction de la société permettra d’évaluer l’absorption, la distribution et le métabolisme de candidats médicaments dans l’organisme après administration afin d’obtenir des données de pharmacocinétiques et pharmacodynamie. Etant une société de prestations de service, nous testons les molécules de nos clients dont nous n’avons aucune connaissance sur le type/famille de molécule. Cependant, ces molécules seront testées dans le cadre de la recherche de pathologies rénales, urologiques, oncologiques, gastro-entérologiques…nos principales thématiques de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de récolter du matériel biologique (sang, organes, urines, fecès, salive….) afin d’avoir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de candidats médicaments. Ces différentes données, obtenues au tout début des études pré-cliniques, permettront par la suite d’adapter les doses et la fréquence d’administration des composés dans des études plus complexes (pouvant mimer une pathologie).

Procédures

Les animaux seront traités par des molécules par différentes voies possible (per os, intrapéritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée, intradermique, intra-vésicale…). Ces gestes sont en général rapides et durent moins d’une minute/animal. Les animaux pourront être anesthésiés pour certains gestes ou prélèvements (gazeuse : isoflurane ou fixe : xylazine/kétamine). Ces anesthésies devraient être rapides et ne pas durer plus de 1 heure (pour les administrations intra-vésicales). Des prélèvements sanguins sur animal vigil ou anesthésié au niveau des veines caudales, saphènes, de la veine abdominale, en sublinguale, submandibulaire, rétro-orbital ou intracardiaque pourront être réalisés. Ces gestes sont rapides et durent moins de 5 min. Les animaux pourront être mis dans les cages à métabolisme et seront donc isolés de leurs congénères quelque temps (24H maximum).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés et vont recevoir des administrations de produits, pouvant engendrer un stress et une légère douleur. Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme, et donc être isolés temporairement de leurs congénères (24 heures maximum), avoir des prélèvements sanguins, être anesthésiés…tout cela peut provoquer une nuisance.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent fournir du matériel biologique afin de réaliser différents tests de pharmacocinétique ou pharmacodynamie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. En général, ces études préliminaires de pharmacocinétique et pharmacodynamie ne sont pas réalisées sur un grand nombre d’animaux car ce sont des études préliminaires aux tests pré-cliniques. Aucun test statistique n’est utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Cependant, de par notre expérience de plus de 15 ans, nous savons qu’un nombre de 6 animaux par groupe est suffisant pour avoir des données fiables et statistiquement significatives. Dans une même étude, il sera rare que différentes espèces soient utilisées. Nous prévoyons de réaliser 3 études par an par espèce avec 18 animaux par étude.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois), igloo en polycarbonate, tunnel, carré de coton…). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Les méthodes utilisées pour récolter tout ce matériel biologique (par exemple les cages métaboliques avec une phase d’acclimatation pour réduire le stress) sont peu invasives et ne devraient pas provoquer chez l’animal un grand stress, ni de souffrance particulière et ne nécessitent donc pas l’utilisation d’antalgique. Tous les gestes techniques seront réalisés par du personnel compétent et qualifié diminuant ainsi les temps de contention et la souffrance ou le stress possible. Le personnel, sensibilisé au raffinement et à l’éthique animal, pourra modifier quelques protocoles, enrichissement des cages…. en fonction des nouvelles techniques mises au point et nouvelles obligations dans le but d’améliorer les conditions des animaux de laboratoire. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids supérieure à 20%, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un signe de douleur, de mal-être, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Dans notre laboratoire, nous utilisons ces 3 espèces (rat, souris et cobaye) selon les modèles et aires thérapeutiques employés. Ces trois espèces seront donc utilisées pour réaliser des études de pharmacocinétique et pharmacodynamie. Les animaux utilisés seront très dépendants des demandes de nos clients et de la thématique étudiée. Nous essayerons le plus possible d’utiliser des animaux âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Cependant, l’utilisation d’animaux plus jeunes ou plus âgés sera possible.

89 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est infecté par un virus de la maladie de Marek, hébergé en isolateur, puis subit des prélèvements répétés de sang et de plumes, pour étudier la réplication du virus dans la peau et les plumes. Le porteur indique que la maladie est "hautement contagieuse et fatale" et que certains oiseaux peuvent développer paralysie, lymphomes ou détresse respiratoire avant l'échéance prévue. Il justifie le recours à l'animal entier par la spécificité du follicule plumeux, qu'aucune méthode ne reproduit à ce jour.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la biologie des virus virulents ou de virus vaccinaux de la maladie de Marek dans leurs tissus cibles, en particulier la peau et les plumes (associées ou non à leur follicule plumeux). Pour cela, nous utiliserons des virus mutants. Nous avons plusieurs objectifs scientifiques : (i) identifier les partenaires protéiques de protéines virales, (ii) identifier les cellules véhiculant le virus dans les follicules plumeux et décrire la formation des particules virales dans l’épithélium de ce tissu, (iii) identifier des cellules du follicule plumeux pouvant contribuer à la persistance du virus dans ce tissu, et (iv) développer d’une nouvelle méthode afin de vérifier la prise vaccinale à l’aide de prélèvements biologiques, comme les plumes. Ce projet a la particularité d’utiliser des méthodes innovantes de protéomique ou d’imagerie in situ.

Bénéfices attendus

Ce projet regroupe des approches innovantes afin de répondre à plusieurs questions de recherche relative à la biologie du virus de Marek et à ses vaccins, en particulier leur transmissibilité via les particules virales matures produites en quantité et excrétées, exclusivement au niveau des follicules plumeux. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : (i) Maladie de Marek : Meilleure compréhension de la physio-pathologie de la maladie ; (ii) Protéomique : Établissement d’un protocole pour utiliser la technique de biotinylation de protéines à proximité (bioID) in vivo chez la poule, une méthode dont la faisabilité n’a jamais été décrite chez les oiseaux ; (iii) Virologie : Étude des mécanismes d’entrée et de persistance des virus aviaires dans la peau et les plumes ; (iv) Vaccinologie : Intérêt d’un vaccin DIVA contre la maladie de Marek afin d’évaluer la prise vaccinale.

Procédures

Injection du virus sur animaux vigiles par voie intramusculaire dans le bréchet, 1 fois. Prélèvements sanguins sur animaux vigiles = 2 fois. Prélèvements de plumes sur animaux vigiles = entre 2 à 5 fois selon l'expérience. Injection de substrat par voie sous-cutanée : 7 fois. Chaque injection dure entre 2 et 5 sec. Chaque prélèvement sanguin dure au maximum 5 sec. Les prélèvements de plumes dure 1s par plume.

Impact sur les animaux

1/Hébergement : L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également considérablement la liberté de mouvement des animaux. 2/ Le développement de tumeurs induites par le virus de la Maladie de Marek (MDV) : La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est possible même si rare, que des animaux développent les 1ers signes de la maladie de Marek un peu avant 28 jours. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les injections intramusculaires et sous-cutanées peuvent entrainer une douleur au niveau du site d’injection. 4/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles. Les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Enfin, un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser.

Devenir

les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de rélaiser des prélèvements sanguins et de tissus.

Remplacement

Le projet vise à étudier la biologie de Maladie de Marek avec des virus virulents ou de virus vaccinaux à partir de virus mutants dans les tissus animaux (sang, organes et plumes associées ou non aux follicules plumeux). Ce projet nécessite donc l'animal dans son entier aussi bien pour étudier des partenaires protéiques de protéines virales, que pour celle de la morphogenèse virale dans le follicule plumeux ou encore pour le développement d’une nouvelle méthode afin de vérifier la prise vaccinale à l’aide de prélèvements biologiques. Du fait notamment de l’unique spécificité du follicule plumeux pour la morphogenèse du virus, il n'existe aucune alternative de remplacement pour répondre à ce type de question scientifique à ce jour. De plus, les résultats de ces expériences serviront de référentiel en vue de développer des méthodes alternatives d’infection de follicules plumeux en culture ex vivo qui permettront de grandement limiter le nombre d’animaux requis pour les expériences concernant la morphogenèse virale dans la peau.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants et/ou pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données. Pour l’expérience 1: Au minimum 2 animaux seront inoculés, même quand 1 seul animal aurait suffi ; étant interdit d’héberger 1 animal seul. Pour l’expérience 2 : Quand une cinétique sera effectuée, 1 animal sera requis par point, sauf pour le dernier point où 2 animaux seront requis pour respecter l’interdiction d’avoir un animal seul. Pour les expériences 4 et 5 : 3 animaux seront infectés par virus, ce qui est le minimum requis pour avoir des expériences interprétables, compte tenu des analyses de protéomique effectuées avec les échantillons collectés. Pour les expériences 6 et 7 : 10 animaux par lot est le minimum requis pour voir des différences statistiques entre virus WT et mutant.

Raffinement

Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de signes anormaux liés à la santé et au bien-être des animaux, voire de maladie de Marek entre 21 et 28 jours, même si le développement de la maladie est rare avant 28 jours post-infection. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. Des points limites adaptés ont été définis pour la maladie de Marek. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements sur animaux vigiles a été réduit au minimum pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes en croissance seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux.

Choix des espèces

La maladie de Marek est une maladie des Phasianidés, d'importance principalement dans l'espèce Gallus gallus (poule). Chaque année, des millions de doses de vaccins sont administrées aux poules dans le monde pour les protéger de la maladie, mais également contre d’autres maladies, car les souches de mardivirus (et notamment HVT) sont des vecteurs vaccinaux. Pour chaque expérience, les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à un âge maximum de 5 semaines.

300 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés après une période de repos. Ils subissent 10 à 20 prélèvements de sang, des administrations d'un médicament vétérinaire en développement et des examens cliniques, des effets comme des vomissements ou des troubles respiratoires pouvant apparaître. Le projet évalue la toxicocinétique de produits destinés aux chiens, le chien étant l'espèce visée. Le porteur affirme que le test sur l'espèce visée est une étape "obligatoire" pour la mise sur le marché.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier la toxicocinétique de différentes concentrations de formulations systémiques de produits vétérinaires canins chez le chien adulte mâle ou femelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux médicaments canins permettant de mieux soigner les chiens face à différentes maladies canines.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : - prélèvements sur animaux vigiles : 10 à 20 prélèvements sanguins pour la réalisation de l’analyse toxicocinétique sur la durée de l'étude et 1 à 4 prélèvements sanguins pour l’analyse hémato-biochimique. - administrations de traitement sur animaux vigiles selon la posologie et la voie d’administration recommandée par le fabricant - Examens cliniques sur animaux vigiles : diverses mesures non invasives tels que pression artérielle, électrocardiogramme, prise de température rectale, pesée.

Impact sur les animaux

Le but de ce projet est d’évaluer les effets toxiques après administration systémique d’un nouveau médicament vétérinaire chez le chien. Des premiers tests réalisés sur d'autres espèces comme les rongeurs ont déjà permis de sélectionner les formulations les moins toxiques sur ces espèces. Cependant, s’agissant des premiers tests sur l’espèce canine, différents effets indésirables peuvent apparaître et ne peuvent pas être définis à l’avance. Il pourrait par exemple s’agir de vomissement, de trouble de l’alimentation ou de perturbation respiratoire entraînant un mal être/inconfort de l’animal. Les nuisances attendues liées aux prélèvements sanguins des animaux sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. L’étude toxicologique du produit d’essai a déjà été conduite sur d'autres espèces comme des rongeurs, et n’a pas révélé d’effets toxiques majeurs. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables. Selon les guidelines européennes, ce nombre est de 6 animaux par groupe pour une étude réglementaire. Pour une étude exploratoire, ce nombre pourra être ajusté en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux pourra être réduit avec des études en cross-over, une optimisation des groupes selon le sexe (ratio 50/50), ou avec des études pilotes pour évaluer les doses ou concentrations maximales.

Raffinement

Les concentrations des formulations seront augmentées progressivement afin de pouvoir arrêter les tests en cas de réactions sévères observées pour l’une des concentrations testées. Les conditions d'hébergement sont adaptées à l'âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivants l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et à une nourriture adaptée à leur âge et répondant à leur besoin énergétique. Les interventions effectuées dans ce projet sont réalisées par des personnes compétentes et les techniques utilisées visent à limiter au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. . Les animaux auront été habitués aux équipements de monitoring permettant les mesures de paramètres cliniques tels que la pression artérielle ou l’électrocardiogramme afin d’obtenir des résultats fiables durant le projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes compétentes avec du matériel adapté. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour soulager ses maux.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. De précédents tests ont été conduits sur d'autres espèces comme des rongeurs, l’étape suivante pour la validation des dossiers de mise sur le marché est le test sur l’espèce cible. Chiens adultes d'âge et de poids correspondant à celui indiqué pour le traitement.

20 chiens vont être utilisé·es, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces chiens, déjà inclus dans des recherches sur la myopathie de Duchenne, subissent trois prélèvements sanguins lors d'épisodes de bronchopneumonie survenant au cours de leur vie, pour évaluer un marqueur sanguin, la procalcitonine. Le porteur décrit un stress modéré lié aux prises de sang et ne rapporte pas de mise à mort au titre de ce projet. Il affirme qu'il "n'est pas envisageable" d'étudier ce marqueur autrement que dans un "organisme entier" et que l'espèce canine s'impose puisque l'application vise le chien.

Objectifs

Chez le chien, le diagnostic d’une bronchopneumonie par fausse déglutition (BPFD) repose sur le contexte, les signes cliniques, des images radiographiques évocatrices et une augmentation marquée de la protéine C réactive (CRP), un marqueur d'inflammation, dans le sang. Néanmoins, les lésions radiographiques peuvent être discrètes et masquées par des lésions pulmonaires pré-existantes, notamment lors d’épisodes récidivants. De même, la CRP reste peu spécifique : la sévérité de son augmentation lors de BPFD est très variable selon les cas et les valeurs de CRP peuvent se chevaucher entre plusieurs affections respiratoires. Ces limites soulignent la nécessité d’évaluer d’autres biomarqueurs. Ces problématiques sont particulièrement vraies chez les chiens atteints de myopathie de Duchenne et utilisés pour la recherche sur cette maladie, qui conduit à des difficultés de déglutition, prédispose à des épisodes récurrents de BPFD et où la chronicité des signes conduit le plus souvent à des augmentations plus modérées de la CRP. Par ailleurs, l’état inflammatoire inhérent à la myopathie peut être à l’origine d’une augmentation de la CRP sans lien avec une bronchopneumonie. La procalcitonine est un marqueur utilisé chez l’Homme et qui semble plus spécifique des infections bactériennes. Récemment, sa mesure par un kit ELISA a été validée chez le chien L’objectif de ce projet est de déterminer si la procalcitonine pourrait constituer un marqueur de BPFD qui répondrait aux problématiques soulevées par l’état actuel de l’arsenal diagnostique chez le chien. Ce projet exploitera les épisodes de BPFD survenant spontanément chez les chiens myopathes au cours de leur vie, sans interférence avec les projets dans lesquels ils seront inclus ni changement dans la gestion médicale habituelle de ces épisodes. A terme, si ce nouveau biomarqueur s'avère pertinent, il pourra constituer un outil pour mieux gérer ces affections non seulement chez les chiens atteints de myopathie de Duchenne, mais aussi chez tous les chiens de compagnie qui présentent des BPFD.

Bénéfices attendus

Nous éméttons l’hypothèse que la procalcitonine sera un meilleur marqueur de BPFD que la CRP et donc que son augmentation sera plus marquée que celle de la CRP lors du diagnostic. Le bénéfice serait la validation d’un biomarqueur plus spécifique d’une infection bactérienne aiguë et/ou plus sensible dans les cas de bronchite bactérienne (sans pneumonie) afin de mieux diagnostiquer les BPFD, de mieux cibler les patients nécessitant une antibiothérapie, de mieux adapter la durée de l’antibiothérapie et ainsi de limiter l’antibiorésistance.

Procédures

Trois prélèvements sanguins de 3 mL sur chiens vigiles. Durée estimée : 1 minute pour le prélèvement, 5 minutes de manipulation incluant le temps de rassurer le chien, de prélever, d'effectuer un point de compression et de récompenser le chien.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables et nuisances sont modérés et essentiellement liés au stress lié à la réalisation de 3 prises de sang durant le suivi d’étude.

Devenir

Ce projet sera mené sur des animaux déjà inclus en procédures expérimentales et qui présenteraient des complications médicales de BPFD. Les BPFD, si elles n'induisent pas de difficulté respiratoire significative sur les chiens ne constituent pas en elles-mêmes un point limite et la procédure expérimentale initiale pourra donc être poursuivie normalement.

Remplacement

Cette étude visant à déterminer l'intérêt du dosage d'un biomarqueur d'inflammation systémique, il n'est pas envisageable de la réaliser autrement que dans un organisme entier. Par ailleurs, l'application de cette étude étant le diagnostic des bronchopneumonies par fausse déglutition chez le chien, il apparaît nécessaire de réaliser cette étude dans cette espèce. Enfin, les chiens atteints de myopathie de Duchenne développant spontanément ce type d'affection respiratoire et bénéficiant d'un suivi très rapproché dans des conditions standardisées, ils présentent un intérêt évident pour valider ou non ce biomarqueur qui pourra ensuite être appliqué aux chiens de compagnie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé sur la base d'études antérieures sur ce biomarqueur ayant montré des résultats significatifs avec un tel effectif.

Raffinement

Une attention sera portée à la minimisation du stress lié à la procédure de prélèvement. Les chiens seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage habituel. Le temps sera pris avant le prélèvement pour rassurer le chien. A la fin du prélèvement, une friandise sera donnée au chien, qui sera également félicité par la voix et des caresses. Habituellement les chiens GRMD présentent assez peu de signes d'inconfort respiratoire durant un épisode de bronchopneumonie, mais si tel éait le cas et que le prélèvement n'était pas indispensable au suivi clinique de l'animal, celui-ci ne serait pas effectué. Sur le plan de l'hébergement, les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'intéractions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.

Choix des espèces

Ce projet ayant pour objectif de valider un biomarqueur chez le chien, il sera mené dans l'espèce canine. Les chiens GRMD recrutés pourront l'être à tout moment de leur vie. Les BPFD peuvent survenir à partir de l'âge de 4-5 mois (à ce stade les chiens GRMD pèsent entre 10 et 15 kg).