Maladies animales
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Production de sérum et collecte de tissus chez le hamster pour développer des outils immuno-sérologiques’
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Le projet vise à produire du sérum et des tissus de référence à partir de hamsters immunisés. 112 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal reçoit trois immunisations puis une ponction de sang directement dans le cœur sous anesthésie profonde. Le porteur justifie l'espèce par sa bonne réponse immunitaire et présente les cultures cellulaires comme une piste future de réduction, la mise à mort servant à collecter sang et organes.
Objectifs
De plus en plus d’études montrent que des virus circulent ou apparaissent chez les chauves-souris européennes, dont certains sont particulièrement préoccupants en raison de leur capacité connue à se transmettre d'une espèce à l'autre et à provoquer des maladies graves chez l'Homme. Les méthodes de détection disponibles, développées pour des virus humains (ex. le virus de la rage), sont rarement validées pour les virus trouvés chez les espèces de la faune sauvage tel que les chauves-souris ou les musaraignes, ou ne sont pas adaptées aux échantillons collectés sur le terrain. Pour cela, il apparait nécessaire de développer de nouveaux outils de détection des virus circulant dans la faune sauvage permettant ainsi d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. De plus, l'absence de matériaux de référence ou de valeurs seuils communes complique l'interprétation des résultats et leur comparaison entre les groupes de recherche. Le modèle hamster est un modèle sensible à certains virus et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum et des tissus. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux immunisés ou non-immunisés permettront de développer un panel d’outils de détection de ces virus. La collecte des organes, permettra de développer de nouvelles méthodes de recherche d’anticorps intratissulaires pour chaque virus quand l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de cellules en 3 dimensions mimant les caractéristiques et fonctionnalités des organes en vue de constituer une banque biologique limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite. Ce projet ne nécessite pas d’analyse statistique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque virus et aux investigations chez les chauves-souris et musaraignes, réservoirs de ces virus (microprélèvements, organes/tissus d’intérêt…). La collecte des différents tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque virus et dans différents organes lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les cultures de cellules en 3 dimensions permettra l’étude des mécanismes d’infection d’un agent pathogène sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux chauves-souris afin de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis de nouveaux virus et de caractériser les relations hôtes-pathogènes. Dans cette optique, et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.
Procédures
Les hamsters seront immunisés trois fois par voie intra-péritonéale ou par voie sous-cutanée (animaux anesthésiés- durée =10 secondes environ). Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ analgésie) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont celles liées au stress de la contention de l'animal, et à l'anesthésie gazeuse et celles lisées à la douleur liées aux injections par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée (légères de courtes durées mais répétées).
Devenir
Mise à mort pour collecte de sang et tissus
Remplacement
Le modèle hamster nous permettra de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales. De plus, l’étude in vitro des mécanismes de franchissement de la barrière d’espèce de ces virus dans la faune sauvage nécessite la mise en place de cultures de cellules en 3 dimensions. Seuls des organes rapidement prélevés sur l’animal permettront la mise au point de ce type de modèle in vitro (poumon, cerveau, foie, rate…). Il n’y a donc pas d’alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine.
Réduction
Le nombre de hamsters a été confirmé par les premiers résultats obtenus d'un précedent projet pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’immunisation avec chaque espèce virale. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes sera effectuée sur l’ensemble de ces hamsters afin de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour la mise au point de méthodes de détection sérologiques sur des matrices alternatives au sérum mais également pour le développement de cultures de cellules en 3 dimensions, qui à moyen terme, permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Suite à l'obtention de premiers résultats, nous avons modifié le protocole d’immunisation des animaux afin d’avoir une meilleure réponse immunitaire sans qu’il soit nécessaire d’augmenter le nombre d’animaux par espèce virale.
Raffinement
Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Aucun signe clinique n'est attendu dans la mesure où les animaux seront immunisés par des suspensions non pathogènes ou faiblement réplicatives (virus inactivés, faiblement réplicatifs ou protéine virale vectorisée ou protéine adjuvée).
Choix des espèces
Plusieurs études scientifiques menées sur les lyssavirus et sur des protéines virales vectorisées ou adjuvées d’intérêt ont montré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une bonne réponse immunitaire humorale et permettait l’obtention de sérums spécifiques. Le hamster est donc un très bon modèle pour réaliser ces tests d’immunisation. D’après la littérature des hamsters âgés entre 7 et 10 semaines le jour de l’immunisation sont connus pour avoir une bonne réponse immunitaire humorale. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 7 semaines à réception.
Evaluation d’une méthode d’infestation expérimentale de souris par voie sous-cutanée permettant de valider l’infectiosité des œufs d’Echinococcus isolés à partir d’une matrice alimentaire
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
Pour valider une méthode mesurant si des œufs d'Echinococcus prélevés sur des aliments restent infectieux, 90 souris reçoivent ces œufs en injection sous la peau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une masse parasitaire se développe au point d'injection sur une période allant jusqu'à quatorze semaines, avec possibles lésions ou abcès. La mise à mort est requise pour observer le développement du parasite par identification moléculaire. Le porteur signale qu'une méthode in vitro est en cours de développement au laboratoire, mais qu'elle n'est pas encore comparable.
Objectifs
Contexte : Les échinococcoses sont des maladies parasitaires transmises par les aliments d’importance majeures au niveau européen et mondial. Deux formes de ce parasite sont décrites en France, l'échinococcose alvéolaire (EA) et l'échinococcose kystique (EK). Chez l’Homme, les deux maladies ont une localisation principalement au niveau du foie mais également des poumons pour l’EK. Elles se caractérisent toutes deux par une longue période asymptomatique pouvant atteindre 15 ans, rendant presque impossible l’identification précise des sources individuelles de contamination. L'Homme se contamine par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques du parasite disséminés dans l’environnement (aliments non cuits, sol, eau, etc…) via des selles de carnivores (essentiellement renards et chiens contaminés). En Europe, dans les salades et les baies, les taux de contamination de ces parasites sont estimés entre 0 et 7%, avec une moyenne de 1 à 5 œufs détectés. La viabilité d’œufs provenant d’aliments de consommation humaine n’a jamais pu être démontrée directement faute de méthode adaptée. Une seule étude, datant de 2015, a démontré un développement dans 100% des souris (4/4) après une inoculation en sous-cutanée de 20 œufs de parasites. Ainsi, aucune donnée n’est existante pour une quantité inférieure à 20 œufs, ni avec des œufs isolés à partir d’aliments de consommation humaine. L’objectif de l’étude : Valider la méthode de viabilité chez des souris, utilisée dans une publication de 2015, pour deux espèces principales d’échinocoques. Les œufs seront inoculés en sous-cutanée avec et sans débris d’aliments afin de reproduire les conditions de la publication et d’adapter la méthode pour répondre aux enjeux. Perspectives et enjeux globaux : L’étape suivante sera donc d’évaluer la sensibilité de cette même méthode pour de faibles quantités de parasites (5 à 1 œuf), représentatives des taux moyens retrouvés sur des aliments contaminés (salades, baies, etc…). Ainsi, cette méthode de viabilité pourrait être utilisée à partir d’aliments collectées sur le terrain pour contribuer à l’évaluation du risque de contamination alimentaire pour l’Homme.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote permettra d’évaluer pour la première fois la sensibilité de l’approche in vivo en sous-cutanée sur deux espèces d’échinocoque en présence et absence de matrice alimentaire. Les données produites serviront ensuite à mettre en place des études visant à évaluer la pertinence de l’approche in vivo pour prouver la contamination de matrices alimentaires par des œufs viables d’échinocoques pour la première fois et d’en estimer la proportion. En effet, la viabilité d’œufs d’échinocoques sur des matrices alimentaires n’a encore jamais été démontrée alors que pourtant admise d’où la classification comme parasites transmis par les aliments. Disposer de données sur la proportion d’échantillons de type salades, fraises ou myrtilles contaminés par des œufs infectieux d’échinocoques permettrait de préciser la contribution relative des aliments parmi les sources de contamination humaine et de fournir des valeurs chiffrées pour l’évaluation du risque pour l’échinococcose alvéolaire (EA) et kystique (EK).
Procédures
Identification par puce électronique et injection d'œufs de parasites pour voie sous-cutanée - anesthésie générale légère - 1 seule fois - durée =1 minute. Prise de sang totale intracardiaque par voie intercostale - anesthésie générale par voie intrapéritonéale - 1 seule fois - 5 minutes
Impact sur les animaux
Le développement d’une petite masse parasitaire sous-cutanée (au site d’injection) est attendu avec une possible faible prise de poids sur une période maximale de 14 semaines. Des lésions ou abcès transitoires peuvent être observés au site d’injection durant les semaines suivant l’injection.
Devenir
L’objectivation du développement du parasite nécessite une observation macroscopique combinée à une identification moléculaire nécessitant la mise à mort de l’animal au préalable. De plus, les animaux témoins, bien que non infectés, seront trop âgés pour être réutilisés dans d’autres procédures.
Remplacement
Une méthode alternative via la culture de cellules (in vitro) est en cours de développement au sein de notre laboratoire afin d’essayer de pallier à l’utilisation d’animaux (in vivo). Toutefois, comme il n’existe pas de bibliographie permettant de comparer les deux méthodes de viabilité (in vitro et in vivo) pour de faible quantité d’œufs d’échinocoques sur matrice alimentaire, il est nécessaire de tester parallèlement la sensibilité de la méthode de viabilité in vivo. Ainsi, nous pourrons statuer sur la méthode la plus adaptée pour répondre à nos problématiques afin d’améliorer les connaissances et la prévention.
Réduction
Le projet utilisera 90 souris sur 3 ans. En raison du manque de données dans la littérature et en se basant sur un test statistique, des hypothèses formulées et des efficacités fixées, 8 souris seront utilisées par groupe pour les modalités tests et 5 souris pour les modalités témoins. Ces effectifs ont été réfléchis pour que les résultats obtenus soient recevables statistiquement tout en utilisant un minimum de souris.
Raffinement
Afin de limiter les anesthésies, les souris subiront le même jour l’injection sous cutanée décrite dans les procédures, ainsi que la pose du transpondeur. Le transpondeur permet d’identifier l’animal mais également la prise de température simplifiée en limitant le stress. Selon les résultats de la première étape, un antibiotique dans l’eau de boisson sera utilisé dans la procédure suivante afin d’éviter une infection de type abcès suite à l’injection de matrice alimentaire. En plus de limiter la gêne de l’animal cela améliorerait les chances de développement parasitaire puisqu’un abcès pourrait nuire ou éliminer les parasites injectés. Afin d’améliorer leur bien-être, les souris seront hébergées par groupe (8 pour les tests et 5 pour les témoins) et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris, cellulose et bâton de bois) dans les cages. L’utilisation d’anesthésique et d’un antidouleur seront employés afin de limiter la douleur et le stress des souris lors des actes opératoires. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraînera la mise à mort compassionnelle de l'animal.
Choix des espèces
Les hôtes intermédiaires du parasite responsable de l’échinococcoses alvéolaire (EA) sont les rongeurs sauvages mais plusieurs études ont déjà utilisé des souris comme modèle de viabilité. S’agissant du parasite responsable de l’échinococcose kystique (EK), le mouton est l’hôte intermédiaire principal. Toutefois des rongeurs, dont les souris, ont déjà été utilisés pour étudier la viabilité des œufs de ce parasite. Ainsi, pour ces deux espèces parasitaires, la souris est sensible au développement parasitaire et constitue donc le modèle de choix. De plus, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication ayant injecté un faible nombre d’œufs d’échinocoques, les souris utilisées seront des femelles et auront entre 6 à 8 semaines. Le stade de développement des animaux n'aurait pas d'influence sur la sensibilité au parasite et le développement de la forme larvaire. Toutefois, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication avec un faible nombre d’œufs, les souris utilisées auront 6 à 8 semaines.
Multifonctionnalité de la surface de la tête prothétique – une innovation dans l’implantologie dentaire : Etude pilot de raffinement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Extraction des molaires puis pose immédiate d'implants dentaires, suivie pour 15 rats d'injections destinées à provoquer une infection autour de l'implant : 27 rats vont être utilisés, tous tués, dont 15 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ces gestes servent à valider des conditions d'imagerie et un modèle d'infection avant une étude plus large sur des surfaces d'implants nanotexturées. Le porteur reconnaît que "la douleur est inévitable" après la chirurgie buccale. Présentée comme une "étude pilote de raffinement", cette phase inflige à plus de la moitié des rats le niveau de souffrance le plus élevé, et justifie l'effectif par la seule puissance statistique.
Objectifs
Nous souhaitons dans le cadre d'un projet de developpement de nouveaux implants nous voulons vérifier les propriétés adhésives et anti bactériennes de surfaces nanotexturées de mini-implants adaptés pour les rats. Pour réaliser cet objectif, nous devons dans un premier temps valider les poses d’implants chez le rat par des imageries au scanner rayons X et nous souhaitons mimer les conditions infectieuses en injectant de faibles doses de molécules infectantes proche de la zone implantée. C’est pour vérifier les conditions optimales d’imagerie et d’infections que nous sollicitons cette étude pilote de raffinement avant la procédure complète de tests de diverses combinaisons de surface nano texturées. Les objectifs sont : 1. Réaliser l’implantation dentaire immédiatement après l’extraction d’une molaire chez le rat selon le concept "One abutment-one time", Les mini-implants (la dimension est réduite afin adapter à l'anatomie de rat) consistent en une tête prothétique intégrée avec la tige de l'implant, qui se met en place lors de la première intervention chirurgical et à ne plus changer par la suite. 2. Etablir le modèle infectieux péri-implantaire (mucositite péri-implantaire et péri-implantitite) chez le rat en injectant des solutions infectantes. 3. Valider des techniques d'imagerie in vivo et ex vivo pour la détection des tissus mous et durs à l’aide du microscanner à rayons X et l’imagerie photonique (microscopie confocale et light sheet).
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pilote établissent les conditions d’imageries pour une vérification optimale de la position des implants ; les conditions doses et durée du modèle infectieux péri-implantaire chez le rat, et les modalités pour les imageries longitudinales et ex vivo innovantes. Toutes ces conditions seront reprises pour l'étude finale de performance osseuses et gingivales des nanotextures.
Procédures
1. Extraction bilatérale des premières molaires dans le maxillaire et implanter les implants dentaires immédiatement dans les avéoles, qui reproduit l'osséointégration et la cicatrisation des tissus mous autour de l'implant: 30 min/ rat sous l’anesthésie chimique, appliquer sur 27 rats divisent en 2 procédures. 2. Etude longitudinale appliquée à 27 rats par microscanner à rayon X sur l'osséointégration suite à l'implantation dentaire (12 rats – procédure 1) et le déclenchement de maladies péri-implantaires suite à l'infection (15 rats – procédure 2) sous l’anesthésie gazeuse. Durée 20 min/ fois, à J0, 14, 28 jours pour les 12 rats dans procédure 1. Durée 20 min/ fois, à J28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 pour les 15 rats dans procédure 2 sous anesthésie gazeuse. 3. Etablissement des maladies/inflammation péri-implantaire : injection sur 15 rats de procédure 2 sous l’anesthésie gazeuse rapide. 4. Evaluation des attaches et des étanchéités fonctionnelles de l'épithélium jonctionnel et du tissu connectif péri-implantaires, appliquer sur 27 rats à la fin de procédure (avant la mise à mort).
Impact sur les animaux
1. Les rats subiront la chirurgie d'extraction dentaire bilatérale et la pose d'implant immédiate. La douleur est inévitable, mais nous veillerons à combiner tous les mesures médicamenteuses (analgésie, anesthésie, myorelaxant), physiques (environnement d'hébergement confortable adapté pour les animaux post-opératoire et nourriture molle), et humaines (soins et surveillance rigoureusement par les personnels habilités) pendant l'étude afin de détecter toutes anomalies à résoudre de suite. La consommation de nourriture et d'eau seront mesurées régulièrement. 2. En plus, les rats passeront par des anesthésies gazeuses répétées lors des sessions d'imagerie qui ne donne pas de douleur particulière et non invasive. Nous utiliserons la couette de survie pour assurer la température corporelle. Après les manipulations, les rats seront posés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. 3. L'administration de molécule infectante sous l'anesthésie rapide donne de douleur très peu, nous ferons très attention à l'hypothermie des animaux en utilisant le tapis chauffant pendant la manipulation. Après les manipulations, les rats seront posés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil.
Devenir
Les mises à mort seront réalisées sur tous les rats (27) par une personne habilitée à la fin de chaque procédure. Nous devons mettre à mort tous les animaux afin de collecter les hemi-maxillaires avec implants pour les expérimences ex vivo d'imageries multimodales et innovantes incluant le microscannaire à haute résolution avec produits contrastants, l'imagerie photonique et l'immunohistochimie. Ces techniques permettent de visualiser et quantifier l'attache péri-implantaire et parodontale et l'étanchéité que les examens cliniques n'arrivent pas à évaluer.
Remplacement
Nos questions scientifiques sont centrées sur l'effet de la nano-texturation de la surface des têtes prothétiques sur l'attache des tissus péri-implantaires dans les conditions physiologiques incluant métabolisme osseux, vascularisation, système immunitaire que les modèles in vitro ne peuvent pas mimer. Les expérimentations animales avec une physiologie intégrée sont donc primordiaux. De nombreuses combinaisons de topographie de surface peuvent être efficaces in vitro sur l'adhérence de l'épithélium jonctionnel, par contre il est impossible de toutes les tester dans des modèles « de plus gros animaux tels que beagles ou mini-pigs » qui sont les gold-standard en préclinique implantaire à cause de leur cout. Il nous semble donc essentiel de proposer un modèle chez le rongeur pour tester 2 ou 3 nano-texturations et choisir la plus performante à valider en phase en phase clinique.
Réduction
Nous avons estimé la taille des échantillons afin d'assurer la puissance statistique lors du traitement des données.
Raffinement
Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérés grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes harmonieux (minimum de 2); dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin d’éviter de fragiliser les implants au cours de la cicatrisation à cause de batônnet à ronger, mais afin de respecter les activités chez le ronger, nous utiliserons en alternative des batônnets très fins et les rouler en coton pendant 4 semaines post-op. Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum". Lors des procédures, nous devons utiliser l'anesthésie car ce sont des manipulations qui doivent être faites in vivo afin de surveiller la cinétique de cicatrisation dans les conditions physiologiques.
Choix des espèces
Les rats constituent un bon point de départ pour tester la faisabilité des nouveaux implants dentaires dans la recherche préclinique en raison de sa similarité avec l'homme en termes de structure osseuse, d'anatomie buccale. En plus, les rats sont privilégiés pour le coût, la facilité de logement et la manipulation. Les rats Wistar sont encore considérés comme l'un des meilleurs modèles. A l'âge adulte (16 semaines), les rats arrivent à la maturité squelettique et dentaire et atteignent environ 400 g, ce qui rend la facilité des manipulations chirurgicales (extraction dentaire et implantation immédiate). La taille de fabrication des implants est adapté pour l’os maxillaire du rat. Ce sont des mini-implants qui ne transpercent pas les sinus lors de la pose, principale cause de rejet ou de problèmes sanitaires pour les animaux.
Exposition du tube digestif à la tilmicosine après administration orale de tilmicosine associée ou non à un peptidomimétique chez le porc
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
Soumis à une administration orale d'antibiotique puis à une prise de sang et une mise à mort sous anesthésie, 20 porcelets vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet vise à mettre au point un traitement des diarrhées du porcelet en post-sevrage en associant la tilmicosine à une nouvelle molécule. Chaque animal est tué pour prélever les contenus intestinaux et mesurer les concentrations atteintes, ses autres organes étant récupérés pour d'autres équipes. Le porteur décrit une démarche "une seule santé" visant à moins recourir aux antibiotiques, tout en reconnaissant qu'il n'est "pas encore possible de se passer des antibiotiques" en élevage.
Objectifs
Le projet a pour objectif de développer un traitement des diarrhées colibacillaires du porcelet. Ces diarrhées peuvent en effet être à l'origine d'une importante mortalité chez les porcelets et le traitement actuel est peu efficace. Le nouveau traitement que nous souhaitons tester combine l'utilisation d'un antibiotique déjà utilisé chez le porc avec une nouvelle molécule facilitant la mise en contact des bactéries avec l'antibiotique tout en ayant également un effet antibactérien en propre.
Bénéfices attendus
A court terme, le bénéfice attendu du projet en termes de santé animale est de développer un traitement efficace contre les diarrhées colibacillaires chez le porcelet en post-sevrage afin de limiter la mortalité chez ces animaux jeunes ne répondant pas à la vaccination. A plus long terme, ce projet s'inscrit dans le cadre d'une révision de l'utilisation des antibiotiques en élevage et d'une approche "une seule santé". En effet, il n'est pas encore possible de se passer des antibiotiques pour soigner les animaux en élevage, mais une utilisation plus raisonnée et efficace des antibiotiques existants permettra d'en utiliser moins (d'où également une moins large dissémination dans l'environnement) et de préserver certaines molécules pour l'utilisation exclusivement en santé humaine.
Procédures
Pour les porcs recevant une solution d’antibiotique combinée ou non à la molécule candidate, l’administration orale n’excèdera pas 1 min. Pour tous les porcs, une prise de sang (moins de 30 sec) sera réalisée après anesthésie (moins de 30 sec également) et avant mise à mort pour prélèvement des contenus intestinaux.
Impact sur les animaux
Les porcs vigiles seront tout d’abord soumis à une administration par voie orale de l’antibiotique seul ou conjointement à la nouvelle molécule. Cette intervention est une intervention engendrant du stress pour l’animal, mais non douloureuse et durant moins d’une minute. Le risque de fausse route, déjà limité chez le porc du fait de caractéristiques morphologiques particulières, sera évité par deux tests effectués juste avant administration de la solution. Aucun effet indésirable n’est attendu lors de l’administration de l’antibiotique. Cependant, nous ne pouvons pas exclure un effet de la nouvelle molécule, même si d'autres molécules proches sont déjà utilisées en médecine humaine ou vétérinaire. Il est probable que si des effets secondaires apparaissent lors de l’administration orale des deux substances, il s’agira d’une réaction de type allergique transitoire ou de trouble digestif mineur. Les animaux seront également exposés à un stress de courte durée lors de l’anesthésie précédant le prélèvement sanguin et la mise à mort.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélèvement des contenus intestinaux afin de déterminer les concentrations en antibiotique et nouvelle molécule qui atteignent effectivement le tube digestif.
Remplacement
Il est nécessaire d'utiliser des animaux pour déterminer le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) car les études in vitro ne permettent pas de prendre en compte la complexité des mécanismes mis en jeux (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...). Cependant, les études d’efficacité du traitement sur les colibacilloses seront réalisées in vitro (remplacement de l'utilisation d'animaux infectés) et les ajustements de schéma posologique qui seront réalisés par la suite ne seront pas réalisés sur animaux mais in silico par modélisation.
Réduction
Une étude pilote sur un nombre réduit d'animaux nous a permis de déterminer une cinétique complète de l'antibiotique dans les contenus intestinaux afin de sélectionner seulement les trois temps de prélèvement les plus pertinents (au lieu d'au moins 7 pour une étude complète) pour décrire la distribution de l'antibiotique et de la molécule candidate lors d'une administration conjointe ou non et ainsi utiliser moins d'animaux dans ce projet. De plus, les porcs utilisés ici seront utilisés également pour d'autres projets, d'autres organes étant prélevés conjointement aux contenus intestinaux pour une utilisation par d'autres équipes de recherche de l'unité ou externes à l'unité.
Raffinement
Les porcs seront hébergés en groupe et nourris à volonté. Ils auront accès à des balles à mâcher, des mordillots, des ballons, des cartons. Des blocs de copeaux seront également laissés au sol pour que les animaux puissent les détruire et fouir dedans. Pour limiter le stress des manipulations (administration par voie orale et prélèvement sanguin), ils seront entrainés à être touchés, contenus de plus en plus longtemps au sol puis pris dans les bras et récompensés avec du sirop de cassis et des chamallows. L'administration de la nouvelle molécule ne sera pas faite sur tous les porcs en même temps. Nous n'administrerons tout d'abord que les 2 porcs qui doivent être prélevés 24h après administration. Ce n'est que si le suivi des ces animaux, de l'administration à l'euthanasie, ne nous indique pas d'effet indésirable majeur que nous administrerons la nouvelle molécule aux 6 autres porcs.
Choix des espèces
Le projet sera réalisé sur l'espèce cible. Le projet sera réalisé sur des porcelets en post-sevrage (arrivée au moment du sevrage, soit à 28 jours), les porcelets à ce stade de développement étant sensibles aux colibacilloses avec une mauvaise réponse à la vaccination.
Modèle expérimental de perméabilité vasculaire chez le lapin et le rongeur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 1250
Lapins : 2560
Des injections dans l'œil et jusqu'à huit instillations oculaires par jour: 5060 souris, rats et lapins sont utilisés dans des procédures censées reproduire une perméabilité des vaisseaux de la rétine. Une injection intravitréenne déclenche le modèle, suivie d'examens ophtalmologiques répétés, dont certains sous anesthésie. Le porteur classe pourtant l'ensemble en souffrance "légère" et affirme que les procédures "ne devraient pas entraîner de douleur". La plupart des animaux sont tués pour analyse, environ 10 %, exclus avant toute induction, étant réutilisés dans d'autres protocoles.
Objectifs
Les atteintes vasculaires de la rétine sont communes à plusieurs maladies telles que le diabète, les uvéites, les occlusions veineuses ou l’hypertension, et sont responsables de la majorité des pertes de vision dans les pays industrialisés. Ces pathologies entrainent une détérioration des capillaires sanguins de la rétine qui perdent leur étanchéité. L’augmentation de la perméabilité vasculaire et la rupture de la barrière hémato-rétinienne est une étape clé dans l’installation de la maladie qui peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. L'étude des pathologies a permis de mettre en évidence des composés clés impliqués dans le mécanisme conduisant à la perméabilité vasculaire, comme notamment le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Ces composés sont les cibles privilégiées des traitements pour bloquer l'évolution de la maladie, mais sont également utilisés pour mimer la pathologie dans des modèles expérimentaux. L'objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de perméabilité vasculaire afin de tester des traitements potentiels chez le lapin et le rongeur. Le modèle est développé chez plusieurs espèces pour offrir un choix plus étendu de possibilités de traitements, la taille réduite des yeux des rongeurs permet l'utilisation de quantités moindres de traitement, au contraire la taille plus importante de l'œil de lapin permet de tester des traitements plus proches de ceux appliqués à l'homme comme la pose d'implant.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements luttant contre la perméabilité vasculaire au niveau de la rétine. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et préserver au mieux la vision des patients.
Procédures
Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection intravitréenne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil (injection intravitréenne, sous conjonctivale), soit par administration orale, par injection sous cutanée, intraveineuse, ou intramusculaire (pour les anesthésiants). Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical, et durent en général 5 minutes par animal. Si le traitement est administré par voie orale il peut être au maximum quotidien, par voie intraveineuse il sera au maximum 3 fois par semaine, si la voie d’administration est l’injections sous-cutanée, la fréquence sera au maximum de 2 fois par jours, sur la durée de l’étude soit maximum 2 mois. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal. Les prélèvements de sang se feront par ponction et seront basés sur les recommandations du Gircor.
Impact sur les animaux
Ces modèles expérimentaux induisent une augmentation de perméabilité vasculaire transitoire, le retour à la normale se fait en quelques jours. Les nuisances pour l’animal sont celles dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. En dehors de ces périodes d’examen ou d’administration de traitement, l’animal est libre de ces mouvements, avec un accès à l’eau et à la nourriture.
Devenir
Les animaux qui auront suivi la totalité de chaque procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs et à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en binôme avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (tapis chauffant, ou lampe). Les procédures impliquées ne devraient pas entrainer de douleur. La sévérité de la demande est classée légère. L’application d’anesthésiant locaux est prévue avant les injections. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum, cependant si une complication apparait au cours du temps, l’emploi d’un analgésique de type buprénorphine sera envisagé.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront minimum 8 semaines et les rongeurs minimum 6 au début de l’étude, âge minimum pour la maturation de la rétine, conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles.
Production d’échantillons et de matériaux biologiques de référence, issus de volailles, pour la caractérisation et le contrôle de méthodes de diagnostic en santé animale
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Dindes : 80
Autres oiseaux : 160
Pour constituer une collection d'échantillons de référence, 320 volailles, des poules, des dindes et des canards, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque oiseau est infecté par de l'influenza aviaire ou un paramyxovirus déposé dans les yeux et les narines, puis subit jusqu'à dix-huit écouvillons et trois prises de sang sur vingt jours. Le porteur indique que l'effectif suit la norme réglementaire, sans analyse statistique. Les animaux sont mis à mort pour récolter un volume maximal de sérum, l'un des objectifs du projet, et pour éviter la dissémination des virus.
Objectifs
L'influenza aviaire et la maladie de Newcastle sont des maladies à virus des oiseaux dont l'impact sanitaire et économique est majeur dans les élevages de volailles. La surveillance et la lutte contre ces maladies reposent sur l'utilisation de méthodes de diagnostic de laboratoire, dont les performances doivent être préalablement déterminées et contrôlées. L'objectif de ce projet est de constituer une collection d'échantillons biologiques, d'origine et de caractéristiques connues, qui serviront à ces contrôles. Le recours aux animaux est la seule façon d'obtenir des échantillons représentatifs des prélèvements qui sont faits en pratique quand la présence de la maladie est suspectée en élevage. Les échantillons collectés pendant le projet sont des écouvillons et des sérums prélevés chez quatre espèces de volailles (poule, dinde, canard de Barbarie et canard mulard) après inoculation contrôlée avec un virus de l'influenza aviaire ou un paramyxovirus aviaire.
Bénéfices attendus
L’utilisation de méthodes d’analyses de laboratoire est obligatoire pour confirmer officiellement un cas d’influenza aviaire ou de maladie de Newcastle. Les échantillons (écouvillons et sérums) récoltés à différents stades de l'infection chez les volailles seront utilisés pour les contrôles préalables de conformité des méthodes de diagnostic de l'influenza aviaire et de la maladie de Newcastle. Ils pourront également être utilisés en routine afin d'harmoniser, au niveau national, la mise en oeuvre de ces mêmes méthodes.
Procédures
Les animaux sont soumis aux prélèvements suivants sur animaux vigiles. Au maximum, 9 écouvillons oropharyngés, 9 écouvillons cloacaux et 3 prises de sang seront réalisés par animal, sur un pas de temps de 20 jours au maximum. L'infection des animaux est effectuée par application d'une goutte de suspension de virus dans chaque oeil et chaque narine, en début de procédure. Au cours de chaque intervention, les prélèvements (3 types au maximum pour une date donnée) sont réalisés séquentiellement sur l'animal : la durée de chacun des actes ne dépasse pas une minute pour une durée totale d'immobilisation et de contention d'environ 3 à 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Suite à l’inoculation des virus, les signes cliniques suivants pourront être observés le plus souvent isolés (et éventuellement associés dans les cas les plus prononcés) : symptômes respiratoires, digestifs et symptômes généraux pouvant exceptionnellement amener l’animal à arrêter de s’alimenter ou à rester prostré. Toutefois, les virus sélectionnés ne provoquent généralement que des signes de gêne respiratoire modérée. Par ailleurs, chez les canards, l’infection est fréquemment inapparente. Les manipulations et la contention des animaux nécessaires à la réalisation des prélèvements, ainsi que ces derniers, peuvent également avoir un impact négatif sur le bien-être des animaux. Toutefois, ces nuisances sont de faible intensité et très limitées dans le temps. Le risque d’hématome suite aux prises de sang est réduit : le personnel est formé à cet acte et applique systématiquement un point de compression pour éviter la formation de l’hématome.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des oiseaux utilisés au cours d'une procédure, qui ont donc été infectés et auront produit des anticorps, est nécessaire pour procéder (au moment de cette mise à mort) à la récolte d'un volume maximal de sang permettant d'obtenir un volume final de sérum, dont la collecte est l'un des objectifs du projet, lui aussi maximal. Par ailleurs, cette mise à mort est également nécessaire pour prévenir tout risque de dissémination des virus inoculés.
Remplacement
Le modèle d’infection des oiseaux par voie naturelle permet l’obtention d’échantillons dans lesquels le virus recherché ou les anticorps produits par l'animal infecté sont naturellement associés de manière représentative à la matrice du prélèvement lui-même. Ces prélèvements, d’origine contrôlée et de caractéristiques a priori connues, sont ceux qui se rapprochent le mieux des prélèvements collectés en élevage pour le diagnostic ou la surveillance des maladies des volailles, ce qui les rend pertinents pour le contrôle des méthodes d'analyse.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés correspond à l’effectif standard (fixé par la réglementation) prélevé sur le terrain, pour le diagnostic de l‘influenza aviaire ou de la maladie de Newcastle, et il est adapté pour optimiser le volume total de sérum collecté en fin de procédure. Par ailleurs, ce projet ne nécessite pas d'analyse statistique.
Raffinement
Les souches de virus utilisés seront de préférence sélectionnées parmi des souches qui n’étaient pas associées, lors de leur détection, à des formes sévères de maladie : ceci permet de limiter l’intensité prévisible des signes cliniques que pourraient manifester les animaux inoculés lors de la procédure. De plus, un examen clinique au moins quotidien permet de suivre l’évolution des signes cliniques éventuels : il est prévu, dès la première détection éventuelle de signes cliniques prononcés, d’augmenter la fréquence des observations à deux fois par jour afin de détecter précocemment toute aggravation. Des points limites stricts et spécifiques de la procédure expérimentale associée à ce projet seront également appliqués. Les animaux sont logés dans des parcs ou des volières, en respectant les normes d'élevage adaptées (superficie et densité d'animaux, points d'alimentation et d'abreuvement), par groupes d'animaux de même espèce, bénéficiant ainsi d'un enrichissement social. Ils sont nourris et abreuvés à volonté.
Choix des espèces
Les espèces d'oiseaux choisies (poule, dinde, canard de Barbarie et canard mulard) correspondent à quatre espèces de volailles parmi les plus couramment élevées en France, et à ce titre les plus fréquemment prélevées dans le cadre des plans de lutte et de surveillance pour l'influenza aviaire et la maladie de Newcastle. Les animaux seront inoculés entre 4,5 et 6,5 semaines d'âge. Cette classe d'âge correspond à la période médiane ou finale de l'élevage de production pour les différentes filières concernées. Par ailleurs, le choix de cette tranche d'âge représente un compromis entre une bonne réceptivité à l'infection (celle-ci étant généralement plus importante, plus l'animal est jeune) et une moindre sensibilité à la maladie.
Protocole d’infection expérimentale de poissons par bain et/ou injection pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales et antivirales
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour protéger la filière piscicole de virus réglementés, 10 000 truites arc-en-ciel vont être infectées par voie de bain ou d'injection, dans des procédures dont la moitié, soit 5 000 poissons, relève d'un niveau de souffrance sévère. Les souches virulentes utilisées sont mortelles, avec des taux de mortalité de 30 à 100 % chez les jeunes alevins, longs de un à dix centimètres. Les poissons sont manipulés sous anesthésie, mis à jeun, puis tués par prélèvement sanguin terminal. Le porteur situe l'enjeu du côté des pertes économiques des élevages français et européens.
Objectifs
Ce projet permet l’étude des agents pathogènes et du dialogue hôte/pathogène et le développement de nouveaux vaccins chez la truite. Il vise à : - mieux comprendre ces virus d’importance majeure pour la filière piscicole nationale et réglementés au niveau européen. - mieux appréhender les marqueurs génétiques (variations dans les gènes) à l’origine de la virulence et du franchissement de la barrière d’espèce (ici adaptation à la truite de nouvelles souches virales présentes chez d’autres espèces de poisson) afin de développer des outils de diagnostic discriminant permettant à terme une meilleure gestion sanitaire. - développer des candidats vaccins efficaces et sûrs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - une meilleure connaissance des déterminants moléculaires (variations dans les protéines virales) responsable de la virulence et du franchissement de la barrière d’espèce (ici adaptation à la truite de nouvelles souches virales présentes chez d’autres espèces de poisson) de ces virus d’importance majeure pour la filière piscicole. Ce projet permettra à terme de développer des outils de diagnostic discriminant pour une meilleure gestion sanitaire et des candidats vaccins efficaces et sûrs utilisables par bain pour l’immunisation des alevins dont la vaccination à grande échelle par injection est impossible sur le terrain et par injectionchez les adultes et les reproducteurs pour lesquels cette méthode est utilisée en élevage. Nous espérons que ce projet permettra d’améliorer la santé des poissons face à ces infections virales et de limiter les pertes économiques dans les élevages français et européens.
Procédures
Les interventions réalisées sur les truites seront les suivantes : -Deux manipulations des alevins lors des tris, des transferts et des pesées réalisées sous anesthésie en début et parfois en fin de procédure (durée de l’ordre de la minute). -Mise à jeun de 24h -Injections réalisées sous anesthésie : 2 maximum par expérimentation espacées de 21 jours (durée d’environ 30 secondes par poisson). -L’infection par bain d’une durée de deux heures sera réalisée deux fois maximum -Une prise de sang terminale sur animal anesthésié (environ 1 min).
Impact sur les animaux
Les manipulations (tri, pesée, transfert) ainsi que la mise à jeun 24 heures avant les infections engendrent un stress chez les animaux. L’infection des truites arc-en-ciel par les souches virales virulentes de ces virus est fatale avec des taux de mortalité très élevés chez les jeunes alevins comme observé dans les piscicultures (de 30 à 100 %). Les souches virulentes sont utilisées pour mesurer la sensibilité des truites. Il faut noter qu’une grande majorité des souches virales que nous testons in vivo chez la truite sont des souches virales atténuées (taux de mortalités très variables mais inférieurs à ceux induit par la souche virulente) ou à vocation vaccinale (absence de mortalité résiduelle recherchée) et que dans nos expérimentations la moitié des poissons utilisés sont reclassés en gravité « légère » ou « modérée ».
Devenir
Tous les animaux de ce projet qui rentreront dans un protocole d'infectiologie ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Les procédures décrites dans ce projet sont complémentaires aux expériences sur des lignées cellulaires de poissons (in vitro) car elles visent à comprendre les interactions virus-hôte dans leur intégralité (virulence, réponse immunitaire, résistance à l’infection…). L’étude de la réponse immunitaire et de la protection induites par un vaccin ne peut être réalisée autrement que sur animal vivant. De plus, l’apparition ou non de symptômes chez les poissons après infection expérimentale est le seul critère sur lequel il est possible de se baser pour définir les notions de virulence et d’atténuation des souches virales. A ce jour, aucun système in vitro ne permet de prédire le niveau de virulence ou d’atténuation d’une souche virale chez l’animal infecté et encore moins son immunogénicité (son efficacité à induire une réponse immunitaire protectrice) chez l’animal vacciné.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus est justifié par le besoin de s’affranchir de la variabilité inter-animale au sein d’un même groupe et permet une analyse statistique rigoureuse des résultats obtenus. Ce nombre d’animaux est également dicté par la très petite taille des alevins (1 à 5 cm) et la nécessité d’effectuer des prélèvements en quantité suffisante pour valoriser scientifiquement les résultats. Ces dernières années, nos modèles d’infection ont été rigoureusement standardisés et nous veillons à réduire les effectifs de poissons autant que possible pour obtenir des résultats significatifs..
Raffinement
Nous effectuons les expériences dans un environnement optimal pour les animaux. La manipulation des animaux se fait sous anesthésie afin de limiter leur stress. Les animaux sont gardés en lots, aucun animal n’est isolé ce qui est très important pour le bien-être des poissons. La présence de congénères constitue un élément important d'enrichissement du milieu, car c’est la seule possibilité dont nous disposons, puisque l’ajout d’objet dans les aquariums peut provoquer des blessures et rendre les observations des animaux très difficiles. Toutefois, chaque aquarium est équipé d’un bulleur (Colson et al. Sci Rep. 2022) et le sol des aquariums est de couleur foncée. Le bien-être et l’état de santé des animaux est suivi 2 fois par jour minimum pendant toute la durée des expérimentations. Des critères d’arrêt ont été définis rigoureusement : nage erratique et non réponse à des stimuli externes ; les animaux les ayant atteints sont euthanasiés pour limiter toute souffrance.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est l’hôte naturel des virus étudiés dans ce projet. Cette espèce est également, au niveau économique, la principale espèce aquacole produite sur le territoire. Les épidémies virales au niveau des piscicultures françaises peuvent engendrer la destruction totale de l’élevage. Le développement de vaccins efficaces est donc dédié à cette espèce d’intérêt. Stade juvénile pour la truite entre 0,3 et 10 g, ce qui correspond à des tailles allant de 1 à 10 cm. Les poissons juvéniles de poids inférieur à 3 g (taille inférieure à 3 cm) sont généralement plus sensibles à l’infection virale que les adultes.
Prélèvements sanguins dans le cadre du développement et de la mise en place de méthodes analytiques chez les carnivores.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Chiens : 300
Pour caler des appareils de mesure et renouveler un stock de sang destiné au contrôle qualité de médicaments, 300 chiens et 200 chats sont soumis à des prises de sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Les prélèvements non terminaux renvoient l'animal au cheptel, où il sera prélevé de nouveau selon une rotation, tandis que quarante animaux subissent une prise de sang terminale sous anesthésie profonde et sont tués. Le porteur présente ces gestes comme déclenchés par des "demandes internes" des directions techniques. La réutilisation, mise en avant au titre de la réduction, prolonge de fait l'exploitation des mêmes individus sur plusieurs mois.
Objectifs
Paramétrer et qualifier des équipements de mesure analytique appartenant à des laboratoires rattachés au Département Recherche et développement, soit au Département Controle Qualité de l'établissement ; Développer et valider de nouvelles méthodes analytiques telles que le dosage de principes actifs ou de biomarqueurs (biochimie, hématologie, anticorps) ; Renouveler le stock de sang ou dérivés du sang nécessaire aux contrôles des lots de vaccins (Contrôle Qualité). La procédure est déclenchée suite à des demandes internes validés par les directions techniques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer d'échantillons sanguins pour paramétrer et qualifier les équipements de mesure analytique, ainsi que pour valider de nouvelles méthodes de dosage de principes actifs ou de biomarqueurs. Ces échantillons alimentent également le stock de sang ou de dérivés du sang (hématies) nécessaire aux contrôles qualité de routine des médicaments. Les prélèvements par animal sont optimisés et la réutilisation des carnivores est privilégiée dans les limites éthiques. Ceci contribue à réduire le nombre total d'animaux utilisés tout en garantissant la fiabilité des études précliniques indispensables à l'élaboration de nouveaux médicaments.
Procédures
La prise de sang non terminale est toujours un acte unique (non répété sur la journée) effectué chez le chien vigile, chez le chat vigile ou anesthésié. La contention de l’animal dure environ 1 minute pour la réalisation d’une prise de sang qui comprend la tonte de la zone de prélèvement, la désinfection de cette zone et la prise de sang elle-même. La prise de sang terminale est un acte unique effectué chez un animal (chien ou chat) profondément anesthésié. Ce type de prélèvement sanguin dure au maximum 10 minutes y compris la tonte et la désinfection de la zone de prélèvement.
Impact sur les animaux
Les animaux ont été habitués à la manipulation et à la contention afin de réduire au maximum le stress et permettre ainsi la réalisation du prélèvement sanguin chez des animaux vigiles. Cependant, certains chats sont stressés par la contention qui nécessite, dès lors, une anesthésie pour le bien-être de l’animal et la sécurité du manipulateur. Les prises de sang entraînent, au plus, une douleur légère au point de ponction mais cette dernière disparaît chez l’animal anesthésié. Aucun effet indésirable n’est attendu excepté un hématome dans de très rare cas. En cas de dégradation de l'état général, qui n’a jamais été observé pour ce genre de prélèvement, l'animal sera immédiatement pris en charge par un vétérinaire afin d’établir un diagnostic et d’instaurer un traitement symptomatique.
Devenir
Tous les animaux, utilisés pour une prise de sang non terminale, retournent dans le cheptel. Tous les animaux, utilisés pour une prise de sang terminale, sont euthanasiés.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode alternative à l’utilisation de sang (ou de ses dérivés plasma et sérum) pour la mise au point de méthodes d’analyse ou à la réalisation de test in vitro. De plus, ces dernières répondent à des exigences réglementaires BPL ou BPF ou à la Pharmacopée Européenne.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés : 1) Optimisation du nombre d'animaux : le nombre nécessaire d'animaux est systématiquement justifié avant chaque procédure pour répondre aux besoins scientifiques tout en évitant toute duplication inutile. 2) Réutilisation éthique : la réutilisation des carnivores est privilégiée dans le respect du bien-être animal et sous réserve d'une évaluation de la sévérité réelle encourue lors des études précédentes. 3) Évaluation vétérinaire : le choix des animaux inclut une évaluation par le vétérinaire de l'établissement basée sur le cumul des procédures, l'état général, le comportement en colonie et le temps d'élimination des principes actifs: : possiblement present pour des animaux entrant dans d'autres projets et recevant des produits à longue remanencepossiblement interferents avec l'utilisation programmée du sang ou de ses dérivés. 4) Rotation des animaux : Une rotation des animaux prélevés est effectuée, car les prélèvements sont effectués sur des animaux non inclus dans des études. Celles-ci pouvant être faites à tout moment, la règle générale observée est qu’il est rare qu’un même animal soit prélevé deux fois de suite sur une période de l’ordre du trimestre.
Raffinement
Afin de limiter l'impact physiologique des prélèvements et de réduire le stress et la douleur au strict minimum, les mesures suivantes sont mises en œuvre : 1) Optimisation des volumes : les prélèvements sont réalisés selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM afin de minimiser le volume et la fréquence. Innovation méthodologique : un volume minimal est déterminé pour chaque acte (ex : entre 3 et 10 mL pour le maintien du stock de sang dans une solution isotonique permettant la conservation des hématies, jusqu’à des quantités très faibles de « micro-échantillons de 0,5 ml pour les études de qualification pharmacocinétique selon les protocoles techniques. 2) Compétence du personnel : les prélèvements sont réalisés par du personnel formé et expérimenté, garantissant une procédure peu invasive et peu douloureuse selon les standards EFPIA / ECVAM. 3) Habituation et renforcement positif : les chiens et les chats sont habitués à la manipulation, à la contention et à l'acte de prélèvement pour prévenir le stress. 4) Récompense : une friandise est systématiquement administrée après l'intervention pour favoriser une association positive avec le personnel et la procédure. 5) Gestion du stress par la non-exposition : Le prélèvement est effectué dans une autre zone que celle de l’hébergement et un animal ne sera jamais prélevé en présence d’un autre animal afin de prévenir tout stress chez ce dernier. 6) Gestion du stress par l'anesthésie : bien que le prélèvement soit réalisé sur animal vigile, une sédation ou une anesthésie est pratiquée si la contention induit un stress ou pour prévenir des lésions vasculaires chez un animal agité (ex: jeune animal). 7) Prévention des hématomes : un point de compression manuelle est appliqué au niveau du point de ponction vasculaire immédiatement après le prélèvement. 8)Prévention des infections : la zone de prélèvement est tondue et désinfectée avant ponction veineuse. De plus, du matériel stérile à usage unique est utilisé. 9)Confort thermique : lors d'une sédation ou anesthésie, les animaux sont placés, pendant la phase de réveil, sur un matelas chauffant ou sous une lampe infrarouge afin de prévenir toute hypothermie. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet afin de s’assurer de leur bon état général. 10) Suivi clinique post-prélèvement : un suivi est instauré jusqu'au réveil complet avec une évaluation de l'état général et, en cas de doute, un examen spécifique des fonctions neurologiques par un vétérinaire
Choix des espèces
Les chiens et les chats sont les modèles expérimentaux choisis car l’établissement utilisateur développe spécifiquement des médicaments destinés aux carnivores domestiques. L'utilisation de ces espèces cibles est indispensable pour garantir la validation du matériel et des méthodes d’analyses employées lors des études d’innocuité et d’efficacité. Ces espèces sont recommandées par les instances réglementaires pour assurer la fiabilité des données pharmacocinétiques et bioanalytiques. L'utilisation des espèces cibles permet d'obtenir une qualité d'information optimale sur la réponse biologique réelle, facilitant ainsi la comparaison et la transférabilité des méthodes vers les études cliniques ultérieures. De plus, les techniques doivent être validées sur les espèces les plus couramment utilisées au sein de l'installation d'essai afin de maintenir un référentiel de données historiques robuste. Dans le cadre de ce projet, les animaux adultes sont privilégiés par rapport aux individus plus jeunes. Ce choix se justifie par le fait que le volume sanguin total d'un animal est directement proportionnel à son poids. Ainsi, l'impact d'un prélèvement sanguin sur l'état général est moindre chez un adulte plus lourd, ce qui constitue un raffinement physiologique important. Toutefois, en cas d'indisponibilité ponctuelle des animaux adultes (par exemple s'ils sont déjà inclus dans d'autres protocoles d'études), des jeunes adultes (à partir de 5 mois) pourront être utilisés de manière exceptionnelle pour répondre aux besoins analytiques du laboratoire. Seuls des animaux sevrés et cliniquement sains seront inclus dans les procédures. Un examen préalable par le personnel vétérinaire ou par le personnel technique qualifié sera systématiquement réalisé avant toute inclusion pour garantir le bien-être des sujets.
Evaluation des propriétés anticoccidiennes des extraits d’insectes, introduits dans l’alimentation des volailles
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
Pour évaluer un complément alimentaire à base d'extraits d'insectes destiné à la filière avicole, 120 poules vont être infectées par le parasite Eimeria, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les poussins sont infectés par voie orale dès leurs premiers jours, équipés de puces télémétriques sous anesthésie, puis tués à vingt et un jours pour prélever leurs tissus. Le porteur situe d'emblée l'enjeu du côté des pertes économiques de l'aviculture, chiffrées à plus de douze milliards d'euros par an dans le monde. Le bénéfice visé est de pouvoir recommander la supplémentation aux éleveurs.
Objectifs
Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques de plus de 12 milliards d’euros dans le monde et par an. Ces maladies infectieuses sont provoquées par la multiplication de parasites protozoaires. Une fois ingérés, ces parasites envahissent les cellules intestinales et se multiplient massivement avant d’être excrétés. Les pertes de production observées dans les élevages avicoles sont principalement dues à une morbidité chez le poulet de chair. En outre, l’infection par ce parasite prédispose les oiseaux à l'entérite nécrotique, ainsi qu'à la colonisation par d’autres bactéries pathogènes. La dégradation de la litière causée par cette infection peut également entraîner de la boiterie de la volaille. Le traitement repose principalement sur l’administration d’anticoccidiens dans l’aliment des oiseaux pendant toute la durée de l’élevage. Cependant, l’apparition de résistances souligne l’urgence de trouver des moyens de lutte alternatifs : nouvelles formulations vaccinales ou nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à évaluer les propriétés anticoccidiennes d’extraits naturels d’insectes, en conditions contrôlées. Un projet antérieur a permis de caractériser in vitro les propriétés anticoccidiennes d’extraits naturels d’insectes (extrait lipidique et extrait protéique). La poursuite du projet nécessite désormais d’objectiver l’effet des extraits d’insectes in vivo. L’objectif est de quantifier l’effet de la supplémentation sur des paramètres parasitaires, la physiologie et la réponse immunitaire des oiseaux, comme la poule.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme, dans le cadre de ce projet, seraient que les lots supplémentés présentent un meilleur contrôle de l’infection parasitaire (effet anticoccidien : moins de lésions, moins d’excrétion de parasite) et une amélioration de la physiologie (moins d’inflammation et tissu à l’homéostasie). Les oiseaux non infectés et supplémentés pourraient également bénéficier d’une meilleure croissance. Le bénéfice à moyen terme serait de pouvoir recommander la supplémentation en extrait d’insecte sur le terrain, auprès des éleveurs (des produits commerciaux existent mais n’ont pas encore été recommandés pour la volaille).
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration par voie orale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. L’objectif est de reproduire une infection expérimentale par voie orale (0.5 mL à l’aide d’une seringue munie d’un embout en silicone (4mm de diamètre ; 2cm de long) ou pipette avec cône de 0.5 mL) pour étudier l’effet de la supplémentation en extrait d’insecte chez des oiseaux infectés ou non par Eimeria. Les contrôles recevront 0.5 mL d’eau. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). Aucune douleur n'est attendue suite au gavage. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté. Tous les animaux seront régulièrement pesés au cours de l’expérimentation (1, 14, 21 jours d’âge) et les animaux seront soumis à un prélèvement de sang juste avant leur mise à mort. 3 mL de sang seront prélevés. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Après une anesthésie gazeuse flash (quelques minutes), les puces télémétriques sont injectés en intrmusculaire (moins de 1 minute) et la récupération très rapide des animaux (moins de 5 min sous lampe chauffante) et puis remis en lot dans la foulée.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. L’effet attendu de la supplémentation est d’améliorer l’état des animaux comme par exemple de limiter la perte de poids causée par l’infection et les conséquences négatives de l’infection (lésions, inflammation), diminuer l’excrétion parasitaire. Dans le cas peu probable que l’état des animaux supplémentés et infectés soit pire que les animaux contrôles, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation. Les puces télémétriques seront placées chez 10 animaux par lot, sous anesthésie générale, pouvent engendrer un stress et une douleur légère au point d'implantation.
Devenir
Pour l’unique procédure de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever différents tissus (caeca) et de pouvoir analyser la charge parasitaire contenue, le scoring des lésions et la réponse immunitaire induite.
Remplacement
L’objectif est d’évaluer les propriétés anticoccidiennes in vivo or, l’agent pathogène Eimeria tenella responsable de la coccidiose a un spectre d’hôte restreint : il infecte exclusivement le poulet Gallus gallus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est choisi en fonction de la dispersion des paramètres mesurés. Nos effectifs sont basés sur les études du laboratoire portant sur les scores lésionnels lors de supplémentation et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe entre deux groupes pour avoir une différence significative avec une puissance de 93% avec un seuil alpha de 0.05 pour un test non paramétrique défini par le plan expérimental.
Raffinement
Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées, ils disposeront d’un enrichissement social et comportemental. Ils seront hébergés en groupe de 20 poussins, au sol, dont la température est régulée (ajout le lampe chauffante) avec aliment et eau ad libitum ainsi qu’un éclairage 12h/24h. Ils bénéficieront également d’un enrichissement environnemental et matériel : l'espace de vie sera enrichi par la suspension de rubans, de perchoirs et de la litière favorisant le grattage (litière de miscanthus pour éviter les poussières). La prise de sang est réalisée avant l’euthanasie par du personnel formé et qualifié, ce qui permet d’effectuer une prise de sang en douceur et rapidement pour éviter toute souffrance. Dans ces conditions, l’animal est détendu et ne présente pas de signes d’angoisse et de stress. L'anesthésie gazeuse flash dure quelques minutes et récupération très rapide des animaux (moins de 5 min sous lampe chauffante), qui sont remis en lot dans la foulée. Pas de gène visible, ni de modification d’interactions entre les poussins. .
Choix des espèces
Le poulet Gallus gallus est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de statut sanitaire protégé sont utilisés. L’étroitesse du spectre d’hôtes des parasites du genre Eimeria empêche toute tentative de manipulation d’une espèce parasitaire aviaire sur un modèle animal autre que la poule. Des poussins de 1 jour sont utilisés afin d’apporter la supplémentation alimentaire contenant les extraits lipidique ou protéique de larves d’insecte le plus tôt possible dans la vie des oiseaux, cela pouvant agir sur la composition du microbiote digestif, et contribuer la lutter contre l’infection parasitaire. Les oiseaux seront utilisés dès l’éclosion et seront ou non supplémentés dès leur début de vie pour évaluer l’effet de la supplémentation alimentaire en extraits d’insecte sur le contrôle de l’infection parasitaire, la croissance ds oiseaux et l’inflammation. Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à 14 jours d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire. Les animaux sont mis à mort à 21 jours d’âge.
Infestation orale de renards captifs par T. crassiceps afin d’optimiser les méthodes de détection fécale des Taenias chez les carnivores et étudier les réponses immunitaires sanguines associées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Pour mettre au point une méthode de détection de l'ADN parasitaire dans les fèces, 25 renards roux au maximum vont être infestés par voie orale par le ténia Taenia crassiceps, dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger. Chaque animal reçoit jusqu'à vingt vers et subit jusqu'à dix prises de sang sous anesthésie gazeuse, réparties sur la durée de l'infection. Le porteur indique qu'aucune nuisance n'est attendue, tout en prévoyant un vermifuge et un traitement vétérinaire en cas de diarrhée profuse ou de perte de poids. Il affirme que le recours aux renards reste "indispensable", faute de pouvoir reproduire in vitro la maturation des vers, et prévoit de réutiliser les animaux d'une étude à l'autre.
Objectifs
Taenia crassiceps est un parasite intestinal contaminant des rongeurs (au stade larvaire) et des carnivores comme les renards (Vulpes Vulpes) (au stade adulte sous forme de vers produisant des œufs). Ce projet vise à induire pour la première fois une infection expérimentale par Taenia crassiceps chez des renards captifs et de déterminer combien de jours après l’inoculation les œufs parasitaires et l’ADN parasitaire sont détectables. Le développement des méthodes moléculaires a permis de grandement améliorer la capacité de détection de l’infestation via l’ADN parasitaire fécal (copro-ADN) y compris en l’absence d’œufs car l’ADN parasitaire peut également provenir de la desquamation ou de la lyse de vers dans l’intestin. L’utilisation en routine d’une approche moléculaire à partir de copro-ADN permettrait d’augmenter grandement la sensibilité du diagnostic d’infection par des Taenia chez les carnivores sauvages et domestiques, de réaliser des études épidémiologiques plus robustes et d’évaluer le risque d’infection pour les populations humaines et domestiques exposées. De plus, l’analyse des réponses sanguines (cellulaire et serologique) au cours de l’infection permettra de mieux comprendre les paramètres immunitaires clefs pour l’implantation des vers de Taenia et leur maturation dans l’intestin des renards. A terme, ces connaissances permettront d’appréhender des méthodes de lutte éventuelles et de standardiser le modèle infectieux chez les renards captifs.
Bénéfices attendus
Ce projet validera la possibilité d’infestation expérimentale de renards roux par Taenia sp. et permettra de mesurer la durée de période prépatente pour T. crassiceps chez le renard. Les échantillons obtenus de fèces de renards contenant des œufs du parasite ainsi que de copro-ADN parasitaire permettront de valider la meilleure sensibilité de l’approche par détection de copro-ADN en comparaison avec les techniques coprologiques classiques d’observation des œufs.
Procédures
Les prélèvements de fèces seront réalisés par collecte sous les cages sans manipulation d’animaux. La distribution des larves et des comprimés d’antiparasitaires sera réalisée dans une gamelle contenant aussi des aliments aimés par les animaux. Les animaux seront anesthésiés par inhalation d’un gaz anesthésique pour les prélèvements de sang (un maximum de 10 fois sur la durée de chaque étude à intervalle de 3-4 jours minimum et chaque procédure dure environ 10min ; 5 min de mise en place du masque délivrant le gaz et 5 min de prise de sang).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n’est attendue dans ce projet. Les renards seront dans des cages habituelles. L’infestation intestinale par un taenia ne cause normalement pas de symptômes chez les carnivores, hormis lors de très fortes infestations (correspondant à plus d’une cinquantaine de vers) pouvant induire une diahrrée. Dans cette étude, il est prévu d’administrer un maximum de 20 vers/renard comme lors d’une infestation classique. Toutefois, en cas de troubles digestifs trop importants (diarrhée profuse sur au moins 3 jours, ou sanguinolente, perte de poids inhabituelle ou signes de douleur abdominale), l’animal sera vermifugé pour mettre fin à l’infestation et traité par un vétérinaire pour soulager les symptômes.
Devenir
Chaque renard traité à l’antiparasitaire pourra être réutilisé pour d’autre procédures légères si aucun effet d’accumulation n’est détecté.
Remplacement
Il n’est pas possible de reproduire in-vitro la maturation et la production d’œufs par des vers de Taenia dans des conditions identiques à celles de l’intestin de renard, et d’induire des réponses immunitaires. L’utilisation de renards reste donc indispensable pour ce projet.
Réduction
Aucune comparaison statistique n’est attendue et les résultats seront purement descriptifs. Etant donnée la longue durée d’infection et la disponibilité d’hébergement permettant de récolter les fèces dans un plateau sous les cages, un maximum de 5 inoculations (5 renards) sera réalisé par an.Dans ce projet préliminaire, aucune comparaison statistique n’est attendue et les résultats seront purement descriptifs. A ce stade, la variabilité du niveau d’infection expérimentale par Taenia crassiceps chez des renards n’est pas connue. Par extrapolation aux réponses à un autre cestode dont le renard est hôte définitif, Echinococcus multilocularis, il est possible que seules environ 2/5 inoculations résulteront en la maturation au stade adulte des vers de Taenia. Sur cette base, un maximum de 5 inoculations seront réalisées par an sur 5 ans, afin d’obtenir au moins 2 renards infectés par an et un maximum de 25 renards naïfs sera donc utilisé. L’impact de la réutilisation des renards entre les études sera également testée la 2eme année sur 2 renards déjà utilisés la première année, et si elle ne fait pas baisser le taux d’infection par Taenia crassiceps, certains renards seront réutilisés entre études. Le nombre total de renards utilisés pourra donc être inférieur à 25.
Raffinement
Les protocoles d’inoculation seront les mêmes que ceux déjà régulièrement mise en œuvre pour un modèle expérimental similaire avec Echinococcus multilocularis autorisé chez les renards. L’inoculation et le recueil des échantillons fécaux ne nécessiteront aucune manipulation stressante pour les animaux. Des prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse un maximum de 2 fois par semaine et un maximum de 10 fois au total. Les cages d’hébergement des renards seront identiques à celles hors protocoles (4m2), et à proximité de congénères auxquels ils sont habitués. Le régime alimentaire et l’abreuvement seront fournis de façon habituelle et le projet ne nécessitera aucune période d’habituation. Le suivi quotidien des animaux sera renforcé avec des vidéos pour suivre le cas échéant des signes d’inconfort digestif, et des pesées sans manipulation dans des cages de pesées pour détecter une perte de poids inhabituelle (>25% en 1 mois). L’hébergement des renards d’élevage en cages est raffinée par les enrichissements suivants: - Zones d’observations : plateformes d’observation 1/ fixe au fond de la cage, et 2/ mobile sous laquelle les animaux peuvent aussi se cacher s’ils le souhaitent - Zones de séparation : petit tunnel par lequel l’animal doit sauter pour passer d’un côté de la cage à un autre, et se mettre à distance des observateurs - Zones de repos : cartons ouverts sur le sol des cages, boites en bois dont le fond est garni d’une litière (sous forme de matelas apprécié par les animaux) - Zones d’exploration : cartons « construits » avec des aliments cachés à l’intérieur, jeux résistants (balles en plastique, os à ronger, cordes tressées, morceaux de bois) - Zones de marquage par l’urine et les fèces de chaque animal dans sa cage : carreaux, morceaux de cartons changés moins fréquemment que d’autres.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans ce projet sont des renard roux (Vulpes vulpes) comme hôte définitif majeur de T. crassiceps. Les animaux seront adultes ou jeunes d’au moins 6 mois.
Evaluation de la virulence de 2 souches récentes de virus de la septicémie hémorragique virale sur alevins de truites arc en ciel
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Plongés trois heures dans une eau chargée de virus, 600 alevins de truite arc-en-ciel subissent une infection expérimentale, dont 480 dans des procédures classées au niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. L'épreuve reproduit deux souches récentes du virus de la septicémie hémorragique virale et provoque une mortalité pouvant être importante. Sur les survivants, une prise de sang sous anesthésie précède la mise à mort. Le porteur justifie l'infection par un objectif de surveillance sanitaire, ces souches ayant été détectées en France en 2024 et 2025.
Objectifs
Cette étude a pour objectif d’investiguer l’impact épidémique potentiel de 2 souches du virus de la Septicémie Hémorragique Virale (vSHV) récemment détectées en France (2024 et 2025). Malgré des conditions environnementales propices à l’expression et l’amplification virale, une de ces 2 souches a été détectée sans observation de signes cliniques évocateurs de la maladie dans un élevage infecté. Les difficultés à amplifier ces souches au laboratoire sur des lignées cellulaires habituellement sensibles au vSHV, couplées à l’observation de mutations inhabituelles dans les séquences génétiques soulèvent des interrogations quant à leur niveau de virulence . L’infection expérimentale contrôlée d’alevins de truites arc-en-ciel issus d’une lignée hypersensible par ces 2 souches de terrain comparée à un témoin positif hautement pathogène permettra de caractériser le potentiel de virulence de ces souches dans un environnement aquatique en forte évolution (réchauffement des eaux). La mise en oeuvre de 2 voies d'infection (balnéation ou injection intrapéritonéale) permettra de mieux caractériser le potentiel de pathogénicité des 2 souches et leur capacité à infecter l'hôte par voie naturelle (passage de la barrière naturelle via peau / branchies).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre la circulation du virus sur le terrain et son évolution. En caractérisant le pouvoir pathogène de 2 souches atypiques récemment détectées en France en élevage, elle apportera des clés pour les études épidémiologiques menées lors de la découverte de foyers de SHV.
Procédures
Les animaux seront infectés avec les souches virales par immersion dans un volume d’eau réduit hyperoxygéné pendant environ 3 heures. En fin de procédure, des prises de sang seront réalisées sur les survivants (moins d'1 minute par animal) avant mise à mort afin d'étudier la réponse immunitaire spécifique de l'hôte (analyse des plasmas par séroneutralisation ciblant les anticorps anti-SHV).
Impact sur les animaux
La phase de balnéation dans un volume d’eau réduit hyperoxygéné (3 heures) génère un stress pour les animaux, limité du fait que le volume disponible est largement suffisant pour permettre leur mobilité. L’épreuve infectieuse virale constitue un stress sévère puisqu’elle induit l’apparition de signes cliniques et d’une mortalité pouvant être significative. La prise de sang, sous anesthésie, génère une légère douleur. L'injection par voie intrapéritonéale génère également une légère douleur, sous anesthésie.
Devenir
Mise à mort pour raison sanitaire.
Remplacement
Cette étude vise à étudier le caractère pathogène de 2 souches atypiques de vSHV récemment isolées sur le territoire français. Le virus de la SHV est un virus réglementé, faisant l’objet d’un plan National d’Eradication et de Surveillance mis en place par les autorités Françaises depuis 2017. Malgré des conditions environnementales propices à l’expression du virus, une des 2 souches étudiée ici a été détectée dans un élevage en l’absence de signes cliniques évocateurs de la maladie. Le diagnostic in vitro engagé en premier lieu ne se substitue pas à des essais in vivo qui eux seuls pourront permettre d’évaluer la virulence d’un agent pathogène suspecté.
Réduction
Le nombre de poissons et de bassins par condition a été réduit à son minimum en intégrant la variabilité inter-bassin fréquemment observée, les mortalités pouvant survenir sur les stades alevins et de façon à assurer une fiabilité statistique des résultats. Pour l’infection à virus vSHV, 90 animaux seront utilisés pour les 2 souches testées, 60 pour les contrôles, pour chacune des voies d'infection évaluées (balnéation ou injection intra-péritonéale), soit un total de 600 animaux.
Raffinement
Différents types d’enrichissement sont proposés aux animaux (couvercles sur les bassins et bullage leur permettant d'avoir des zones d'ombre et de turbulence). L'état de santé général des poissons sera évalué quotidiennement en utilisant une grille de points limites adaptée intégrant plusieurs paramètres (nage, comportement, état physique). En fonction des scores obtenus avec cette grille, des actions pourront être mises en place comme des mesures de surveillance accrue et/ou une mise à mort compassionnelle.
Choix des espèces
La truite arc en ciel est l'espèce d'eau douce la plus produite en France. Les stades alevins sont les plus sensibles au vSHV.
D?veloppement d?un mod?le exp?rimental de myopie chez le rongeur pour l??valuation de strat?gies th?rapeutiques
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 1620
Jusqu'à six à huit instillations oculaires par jour pendant six semaines: 3 120 souris et rats vont être utilisés, dans des procédures classées de souffrance légère. Une myopie est induite sur un œil par un dispositif optique ou par des injections, avec des examens répétés sous anesthésie légère. Le projet développe un modèle de myopie chez le rongeur pour tester des traitements de la progression du défaut visuel. Environ 2 421 animaux sont mis à mort pour l'analyse des tissus oculaires, près de 699 souris et rats, surtout des mères, étant réutilisés dans d'autres protocoles.
Objectifs
L?objectif principal de ce projet est de d?velopper un mod?le exp?rimental de myopie chez le rongeur afin d??tudier les m?canismes cellulaires et mol?culaires impliqu?s dans la progression du d?faut r?fractif et de l?allongement axial. La myopie est une pathologie fr?quente et en forte augmentation mondiale, pouvant conduire ? des complications s?v?res lorsqu?elle devient ?volutive ou forte, notamment des alt?rations r?tiniennes, scl?rales ou choro?diennes. Les mod?les exp?rimentaux d?velopp?s permettent d?induire de mani?re contr?l?e une myopisation, reproduisant les modifications structurelles de l??il observ?es chez l?humain, telles que le remodelage scl?ral, les perturbations de la choro?de, les modifications de l??pith?lium r?tinien ou l?activation de voies m?canosensibles. Ces mod?les facilitent l?analyse des r?ponses cellulaires et mol?culaires associ?es, incluant les variations d?expression de g?nes impliqu?s dans la croissance oculaire, les voies de signalisation r?gulant la scl?re, ainsi que les processus inflammatoires et de stress oxydatif pouvant contribuer ? la progression de la myopie. Ils constituent ?galement une plateforme pertinente pour ?valuer l?efficacit? de strat?gies th?rapeutiques visant ? limiter l?allongement axial, moduler la signalisation scl?rale ou pr?venir les complications li?es ? la myopie forte, avant leur ?valuation clinique. En r?sum?, ces mod?les repr?sentent un outil essentiel pour approfondir la compr?hension de la physiopathologie de la myopie et identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques.
Bénéfices attendus
Le principal b?n?fice attendu de ce projet est la mise au point de mod?les exp?rimentaux robustes permettant d??valuer l?efficacit? de nouvelles approches th?rapeutiques visant ? limiter la progression de la myopie ou ? pr?venir ses complications structurelles. La myopie, en particulier dans ses formes ?volutives ou fortes, constitue une pathologie ? fort impact clinique, associ?e ? un risque accru de r?tinopathies, de d?collement r?tinien et de d?g?n?rescence maculaire. Les options th?rapeutiques permettant d?en contr?ler l??volution restent encore limit?es, d?o? la n?cessit? de disposer de mod?les fiables reproduisant les m?canismes physiopathologiques observ?s chez l?humain. Ces mod?les permettront de simuler les modifications caract?ristiques de l??il myopique, telles que l?allongement axial, le remodelage scl?ral, les perturbations choro?diennes et les alt?rations de la signalisation r?tinienne. Ils offriront la possibilit? d??valuer avec pr?cision l?effet des traitements sur la modulation de la croissance oculaire, la r?gulation des voies m?canosensibles, l?int?grit? scl?rale ou la fonction r?tinienne. Ces ?tudes contribueront ? identifier les mol?cules ou strat?gies les plus prometteuses, ? optimiser les sch?mas th?rapeutiques et ? approfondir la compr?hension de leurs m?canismes d?action, tout en garantissant une approche ?thique conforme aux exigences r?glementaires.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis ? diff?rentes interventions r?parties sur une p?riode allant de 1 ? 6 semaines, en fonction des objectifs et des r?sultats obtenus avec les traitements ?valu?s. Ces interventions comprennent : 1. Induction par dispositif optique : Cette proc?dure, r?alis?e une seule fois en d?but d??tude sous anesth?sie g?n?rale, consiste ? appliquer un dispositif optique sur un seul ?il. Elle dure au maximum cinq minutes. Un ajustement ou un repositionnement pourra ?tre n?cessaire si le dispositif se d?place. 2. Induction par administration d?un principe actif : Cette m?thode repose soit sur : ? des instillations quotidiennes (3 ? 4 fois par jour) pendant toute la dur?e de l??tude, ? soit des injections effectu?es 1 ? 2 fois par semaine. Les instillations sont tr?s rapides (quelques secondes) et ne n?cessitent qu?une simple contention. Les injections, en revanche, exigent une anesth?sie et durent environ 2 ? 3 minutes. 3. Examens ophtalmologiques ? Observation ? la lampe ? fente : r?alis?e en baseline, puis tous les jours apr?s induction. Chaque examen dure moins de cinq minutes. ? L?imagerie in vivo : effectu?e avant induction puis une fois par semaine. Ces examens n?cessitent une anesth?sie l?g?re pour immobiliser l?animal et garantir des images interpr?tables. Elle ne dure pas plus de 5 ? 10 minutes. 4. Administrations de traitements ? Instillations topiques (collyres) : d?une dur?e de 1 ? 2 minutes par application, sur animal vigile, ? raison de trois fois par jour en moyenne (jusqu?? 6?8 fois/jour maximum) pendant 1 ? 6 semaines. ? Injections intra- ou p?ri-oculaires : r?alis?es sous anesth?sie locale ou g?n?rale, durant quelques minutes. Elles peuvent ?tre quotidiennes mais sont le plus souvent hebdomadaires. ? Injections syst?miques : administr?es sur animal vigile, r?parties sur 1 ? 6 semaines. Elles peuvent ?tre quotidiennes et ne durent pas plus de 2 minutes. 5. Pr?l?vements sanguins effectu?s en g?n?ral une fois par semaine sur animal vigile, leur fr?quence d?pend du volume pr?lev? et du temps de r?cup?ration requis. Chaque pr?l?vement veineux est rapide, durant 1 ? 2 minutes
Impact sur les animaux
Dans le cadre des mod?les d?induction de la myopie et des proc?dures associ?es (pose des dispositifs, anesth?sies r?p?t?es, examens in vivo), plusieurs nuisances ou effets ind?sirables peuvent ?tre observ?s. Bien que ces mod?les soient globalement peu invasifs et bien tol?r?s, il est n?cessaire d?anticiper les points suivants : 1. Les anesth?sies g?n?rales l?g?res, utilis?es pour la pose des dispositifs et les examens OCT hebdomadaires ou l?administration de produits, peuvent entra?ner des effets transitoires fr?quents comme une hypothermie durant et apr?s l?anesth?sie (risque compens? par tapis chauffant), une s?cheresse corn?enne. 2. La pose ou le port des dispositifs (lentilles) peuvent entrainer une irritation cutan?e locale autour du dispositif (colle, sutures, bandeau), une conjonctivite m?canique, des s?cr?tions oculaires augment?es, sans infection associ?e, un d?placement ou perte du dispositif, n?cessitant une remise en place, et bien s?r un flou visuel permanent plus important sur l??il induit, pouvant modifier le comportement exploratoire de l?animal (transitoire et attendu dans le mod?le), un comportement de frottement, surtout les premiers jours, li? ? la g?ne du dispositif. Dans les deux mod?les, il s?agit de nuisances attendues, habituellement mod?r?es et r?versibles, qui diminuent apr?s les premiers jours d?adaptation. 3. Les effets ind?sirables li?s aux manipulations, administrations et examens r?p?t?s pouvant conduire ? un stress l?ger et transitoire, un risque mineur de perte de poids et des irritations locales.
Devenir
? l?issue de la proc?dure exp?rimentale d?induction de la myopie et des examens associ?s, l?ensemble des animaux ayant suivi la totalit? du protocole seront euthanasi?s de mani?re ?thique et conforme ? la r?glementation, afin de permettre les analyses ex vivo n?cessaires. Ces analyses comprendront notamment : des ?tudes histologiques des structures oculaires (r?tine, choro?de, scl?re), des dosages biochimiques ou mol?culaires, ainsi que des ?valuations morphologiques compl?mentaires indispensables ? la validation scientifique des r?sultats. En revanche, les m?res et les animaux non inclus dans l?int?gralit? de la proc?dure, estim?s ? environ 10 % (hors exclusions pour atteinte d?un point limite), pourront ?tre r?utilis?s dans d?autres protocoles compatibles, sous r?serve de l?avis favorable du v?t?rinaire responsable. Ces animaux sont g?n?ralement retir?s avant l?induction car les examens de baseline peuvent r?v?ler : une anomalie anatomique ou physiologique, un d?faut oculaire pr?existant, ou un crit?re rendant l?induction de la myopie non pertinente ou non fiable. Ces individus n?auront subi ni induction, ni administration de traitement exp?rimental. Ils n?auront ?t? expos?s qu?? des examens non invalidants, parfois r?alis?s sous anesth?sie l?g?re (lampe ? fente, OCT, biom?trie), sans cons?quences durables. Dans ces conditions, leur r?utilisation ?ventuelle s?inscrit pleinement dans les principes des 3R, en permettant une r?duction du nombre total d?animaux utilis?s tout en garantissant la protection du bien??tre animal et le respect des exigences scientifiques du projet.
Remplacement
L??il est un organe sensoriel d?une grande complexit?, constitu? de structures anatomiques et physiologiques vari?es (corn?e, cristallin, r?tine, choro?de, scl?re, nerf optique?) interagissant de mani?re dynamique avec leur environnement local et syst?mique. Son fonctionnement est influenc? en permanence par des variations m?caniques, physicochimiques et biologiques, essentielles ? la r?gulation de la croissance oculaire et de la r?fraction. Bien que des m?thodes alternatives telles que les cultures cellulaires, les organo?des ou les mod?lisations in silico aient connu des avanc?es importantes ces derni?res ann?es, ces approches restent limit?es pour reproduire l?ensemble des interactions fonctionnelles, m?caniques et pharmacocin?tiques observ?es dans un ?il vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de mani?re fiable la progression de la myopie, l?allongement axial, les modifications tridimensionnelles de la scl?re, ni les r?ponses r?tiniennes et choro?diennes complexes impliqu?es dans la r?gulation de la croissance oculaire. Dans ce contexte, le recours ? un mod?le animal demeure actuellement indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour : 1. Reproduire fid?lement les conditions pathologiques associ?es au d?veloppement et ? la progression de la myopie, incluant l?allongement axial, le remodelage scl?ral et les perturbations choro?diennes. 2. ?valuer l?efficacit? et la tol?rance de nouvelles strat?gies th?rapeutiques visant ? ralentir la croissance oculaire ou ? pr?venir les complications de la myopie forte, au sein d?un organisme vivant int?grant vascularisation, innervation et r?gulations m?canosensorielles. 3. ?tudier les effets ? long terme sur les tissus oculaires, en particulier la scl?re, la r?tine et la choro?de, dans un environnement physiologique complet impossible ? reproduire in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d?animaux par groupe a ?t? volontairement limit? afin de respecter les principes ?thiques encadrant l?exp?rimentation animale, tout en maintenant une puissance statistique suffisante pour garantir la fiabilit? et la reproductibilit? des r?sultats. Une analyse de puissance sera r?alis?e syst?matiquement avant chaque s?rie exp?rimentale afin de d?terminer l?effectif optimal permettant de d?tecter un effet significatif. Ce calcul permettra, lorsque possible, de r?duire l?effectif n?cessaire sans compromettre la validit? scientifique du projet. Dans une d?marche active de r?duction du nombre d?animaux utilis?s, plusieurs approches compl?mentaires seront mises en ?uvre. L?utilisation de m?thodes non invasives pour le suivi de la myopie ? notamment l?imagerie oculaire (OCT pour la choro?de et la r?tine, biom?trie optique pour la mesure de la longueur axiale...) ? permettra d?effectuer des suivis longitudinaux chez les m?mes individus, ?vitant ainsi les sacrifices ? diff?rents points temporels. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d?un m?me animal pourront ?tre analys?s. On aura ainsi pour un m?me animal un oeil induit et un oeil contr?le, ce qui permettra d'avoir des yeux contr?les sans augmenter l?effectif. De plus, l?optimisation des protocoles exp?rimentaux (standardisation des conditions d?induction de la myopie, contr?le pr?cis des param?tres d??clairement, de l?environnement visuel et des variables biologiques) contribuera ? limiter la variabilit? interindividuelle et ? renforcer la robustesse des r?sultats. Enfin, une attention particuli?re sera port?e ? la formation des exp?rimentateurs et ? la qualit? des soins apport?s aux animaux afin de garantir leur bien??tre tout au long de l??tude.
Raffinement
Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera assur? afin de d?tecter rapidement tout signe de stress, d?inconfort ou d?effet ind?sirable li? aux proc?dures exp?rimentales. Cette surveillance permettra une intervention rapide selon des points limites pr?d?finis, adapt?s au mod?le de myopie et visant ? r?duire toute souffrance potentielle. Les animaux seront h?berg?s en groupe dans des cages enrichies, avec acc?s ad libitum ? la nourriture et ? l?eau. L?environnement sera optimis? par des abris, des mat?riaux ? ronger et des ?l?ments favorisant l?exploration, afin d?assurer leur bien??tre psychologique et comportemental. Dans le cadre du projet, une anesth?sie g?n?rale sera n?cessaire pour les proc?dures d?induction de la myopie (ex. mise en place de dispositifs optiques). Elle pourra ?tre compl?t?e par une anesth?sie locale. Une analg?sie pr??op?ratoire sera administr?e, et une antibioprophylaxie locale pourra ?tre appliqu?e en cas de risque infectieux. Les examens de suivi seront principalement non invasifs, tels que la biom?trie optique pour la longueur axiale et l?imagerie comme l'OCT par exemple pour l?analyse r?tino?choro?dienne. Ces techniques permettront des suivis longitudinaux chez les m?mes individus, r?duisant ainsi le nombre d?animaux n?cessaires. Lorsque l?immobilit? est requise, une anesth?sie l?g?re et courte pourra ?tre administr?e. Apr?s chaque anesth?sie, les animaux seront plac?s sur un support chauffant pour pr?venir l?hypothermie, et une hydratation oculaire sera maintenue jusqu?au r?veil. Ils seront ensuite replac?s dans leur environnement habituel pour limiter le stress post?manipulation. Le projet a ?t? valid? par un comit? d??thique et sera suivi par la structure en charge du bien??tre animal.
Choix des espèces
Les esp?ces retenues pour ce projet, le rat et la souris, pr?sentent des caract?ristiques anatomiques, physiologiques et m?taboliques bien d?crites dans la litt?rature, facilitant l?extrapolation des r?sultats vers l?humain, notamment dans l??tude de la croissance oculaire et des m?canismes impliqu?s dans la myopie. Ces deux esp?ces sont couramment utilis?es dans des mod?les valid?s de myopie exp?rimentale, en particulier pour l??tude de l?allongement axial, du remodelage scl?ral et des r?ponses r?tiniennes. Leur utilisation offre une grande flexibilit? exp?rimentale, notamment pour les suivis longitudinaux, la biom?trie optique, l?imagerie et l?analyse de marqueurs mol?culaires. L?exp?rience accumul?e avec ces mod?les garantit la reproductibilit? des r?sultats, leur comparabilit? avec d?autres ?tudes pr?cliniques et leur pertinence pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques. Le choix de ces esp?ces s?inscrit dans une d?marche scientifique rigoureuse, ?thique et translatoire, visant ? maximiser la qualit? des donn?es tout en respectant les principes de l?exp?rimentation animale. Les animaux seront inclus ? un stade juv?nile, correspondant ? la phase de croissance oculaire active, condition indispensable pour induire de mani?re fiable la myopie et mesurer l?allongement axial. Pour les souris, induction g?n?ralement entre P14 et P28, avec un suivi sur 2 ? 6 semaines selon le protocole et pour les rats, induction g?n?ralement entre P21 et P35, avec un suivi de dur?e comparable, adapt? au cin?tique de croissance propre ? l?esp?ce. ? ces ?ges, la r?tine, la choro?de et la scl?re sont suffisamment matures pour r?pondre aux manipulations optiques, tout en conservant une plasticit? ?lev?e de la croissance oculaire. Ce choix garantit une r?ponse coh?rente et reproductible aux protocoles d?induction (lentilles n?gatives ou d?privation de forme), tout en limitant les biais li?s ? la s?nescence ou, ? l?inverse, ? la croissance trop rapide des toutes premi?res semaines de vie. ? cet ?ge, la pr?sence de la m?re est indispensable. Il sera donc n?cessaire soit de recevoir des femelles gestantes, avec une mise bas pr?vue directement dans notre ?tablissement, soit de commander ? l??leveur des port?es reconstitu?es incluant la m?re et ses petits. Une fois que l??ge des souriceaux ou des ratons le permettra, les m?res seront s?par?es de leur port?e et pourront ?tre r?utilis?es dans un autre projet.