Maladies animales

La sauvegarde annoncée des races locales menacées s'accompagne d'un autre objectif, monter une plateforme de service pour les entreprises de sélection et leurs lignées parentales. 315 poules et coqs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Chaque animal est gardé jusqu'à la maturité sexuelle pour des tests de fertilité, de ponte et de production de semence, les mâles passant jusqu'à six semaines en cage individuelle. Le porteur indique qu'il faut partir de 1 080 animaux pour obtenir ces 315 individus finaux, et que ceux-ci seront tués parce que la protéine fluorescente verte qui les marque interdit de les replacer.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’établir le protocole optimal pour restaurer une race de poules à partir de cellules germinales primordiales. Plus spécifiquement, il s’agit d’évaluer si les trois génotypes considérés — lignée pondeuse, lignée chair et race locale — peuvent être restaurés avec le même hôte, ou si des contraintes physiologiques limitent cette compatibilité. Jusqu’à présent, les restaurations réussies de Gallus ont été réalisées au sein de races similaires, par exemple en injectant des cellules germinales primordiales issues d’une souche pondeuse dans un embryon hôte également de souche pondeuse. Parallèlement, nous perfectionnerons la technique d’injection des cellules germinales primordiales dans l’embryon hôte afin d’augmenter à la fois les taux de succès de colonisation gonadique et la survie embryonnaire. L’aboutissement de ce projet offrira une réponse innovante aux menaces que représentent l’influenza aviaire et d’autres épizooties pour les cheptels de lignées pures issus de la sélection génétique, ainsi que pour les races locales à faibles effectifs. Il contribuera à sécuriser durablement ce patrimoine génétique en proposant un protocole standardisé, plus rapide et moins coûteux. En effet, les biotechnologies de la reproduction utilisant des cellules germinales primordiales cryoconservées permettront une restauration en une seule génération, contre environ cinq générations lorsqu’on utilise uniquement de la semence congelée, tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer un protocole optimisé, fiable et économiquement accessible pour la sauvegarde et la restauration de lignées pures — qu’il s’agisse de lignées grand-parentales ou parentales utilisées par les entreprises de sélection, des races locales majoritairement menacées d’extinction, ou encore des lignées expérimentales. Au-delà de l’innovation technique, notre objectif est de préserver et transmettre un savoir-faire stratégique : prélèvement, culture, congélation-décongélation et injection des cellules germinales primordiales. À l’issue du projet, ce protocole et ces compétences seront partagés et pérennisés au sein d’un réseau d'établissements. Cette collaboration structurante ouvrira la voie à la création d’une plateforme de service unique, au bénéfice des industriels, des gestionnaires de races locales souhaitant garantir la conservation à long terme de leurs souches.

Procédures

Les coqs et les poules conservés (315 animaux en tout) jusqu'à la maturité sexuelle pour les tests de fertilité, de ponte et de production de semence auront chacun une prise de sang d'une durée inférieure à 10 secondes.

Impact sur les animaux

Un stress lié au passage en cage peut être observé chez nos animaux, entraînant notamment des troubles du comportement alimentaire qui durent généralement de 48 à 72 heures. Au cours des élevages de longue durée comme ici, il est aussi possible d’observer une dégradation de l’état général d’un individu aux causes parfois non définies avant une autopsie. La capture, la contention et la prise de sang sont des stress pour l’animal, qui n’auront lieu qu’une seule fois dans cette procédure. L’isolement en cage individuelle constitue un autre stress. Il ne sera imposé qu’une seule fois aux mâles pour une durée maximale d'isolement de 6 semaines incluant 2 semaines habituation,. Les coqset les poules bénéficieront de la proximité de leurs congénères dans une même salle et de la mise à disposition d’un objet à picorer dans leur cage. Les prélèvements de semences peuvent éventuellement engendrer du stress.

Devenir

Les 315 animaux finaux seront euthanasiés à la fin du projet car étant marqué par une protéine fluorescente verte ils ne pourront pas être replacés.

Remplacement

L’objectif de notre projet est de comprendre, avec un haut niveau de précision, le mécanisme de transmission germinale des cellules germinales primordiales . Cela implique d’étudier, in vivo, la manière dont des cellules germinales exogènes injectées interagissent et entrent en compétition avec les cellules germinales endogènes de l’hôte, tout au long du développement embryonnaire et jusqu’à la formation des gonades fonctionnelles. Ce type d’étude ne peut pas être remplacé par des modèles in vitro ou par de la modélisation informatique pour plusieurs raisons fondamentales : 1.Complexité des interactions biologiques La colonisation des gonades par les cellules germinales primordiales résulte d’une succession d’événements biologiques finement régulés : migration cellulaire à travers des tissus en développement, signaux moléculaires spécifiques à chaque étape, interaction avec les cellules somatiques gonadiques, et intégration dans un environnement immunologique particulier. À ce jour, aucune plateforme in vitro ne permet de reproduire simultanément l’ensemble de ces signaux et contraintes mécaniques dans leur contexte physiologique réel.

Réduction

Le plan expérimental comprend neuf combinaisons hôte–donneur (3×3). Nous visons 35 animaux par lot en fin d’étude pour disposer d’une puissance correcte sur les critères principaux. Ces ordres de grandeur convergent vers un objectif de 35 sujets par lot comme compromis robuste couvrant l’ensemble des critères. Le démarrage à 120 animaux par lot est dimensionné pour atteindre ces 35 finaux sans répéter d’essais : — deux échantillonnages intermédiaires planifiés (≈ 40 animaux à J7 pour la colonisation post-éclosion ; ≈ 40 animaux à 12–14 semaines pour la compétition exo/endogène) laissent ~40 animaux ; — une attrition attendue de 10–15 % (pertes sanitaires, exclusions techniques) conduit à ~35 animaux disponibles par lot pour la phase adulte (fertilité, ponte, production de semence). Ainsi, le total 1 080 animaux au départ (9×120) est le minimum permettant d’obtenir 315 animaux finaux (9×35), d’assurer la puissance statistique sur tous les critères avec un seul plan intégré, et d’éviter des réitérations expérimentales supplémentaires.

Raffinement

Raffinement de l’hébergement : Les animaux seront maintenus en groupes sociaux tout au cours de l’élevage. Les animaux au sol auront à leur disposition diverses combinaisons d’enrichissement : perchoir, bloc à piquer, des chaînettes métalliques, des bandelettes de tissus pour stimuler le jeu. Les poules et coqs hébergées en cages individuelles pendant 6 semaines au maximum bénéficient d'un milieu enrichi par un jouet à picorer et de la proximité avec leurs congénères permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs. Pour limiter les phénomènes de picage, des répulsifs dit anti picage pourront être appliqués sur les animaux victimes de picage. Les animaux seront soumis à une observation soutenue, plusieurs fois par jour, afin de détecter le plus précocement possible toute dégradation du bien-être. Un arbre de décision visant à faciliter la gestion quotidienne des animaux (atteinte ou non du point limite) et une grille d'évaluation ont été développés et seront fournis aux zootechniciens chargés du suivi des animaux.

Choix des espèces

Pour étudier le meilleur génotype pour restaurer les souches de poules à partir de cellules germinales primordiales du poulet l’espèce receveuse la plus adaptée est le poulet. Une partie des animaux sera utilisé après 7 jours de vie, afin d’étudier la colonisation des gonades par les cellules germinales primordiales injectées durant le développement embryonnaire. Une partie des animaux sera utilisée à 12 semaine de vie afin d’analyser et de comprendre la compétition entre les cellules germinales primordiales exogènes (injectées) et endogènes. Une partie des animaux sera utilisée à l’âge adulte pour la reproduction et pour étudier le pourcentage des cellules germinales primordiales injectées devenues des gamètes fonctionnels.

Pour savoir où le SARS-CoV-2 se cache dans l'organisme après la guérison apparente, 12 macaques à longue queue vont être infectés puis tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit environ quarante-cinq anesthésies générales, quarante-cinq prélèvements de sang, trente écouvillonnages du nez et de la trachée, vingt lavages broncho-alvéolaires, dix ponctions de moelle osseuse et huit retraits de ganglions lymphatiques. Le porteur annonce aussi deux injections de molécules qui imitent une infection bactérienne, destinées à réveiller le virus "endormi", et décrit fièvre, douleurs musculaires, anémie et saignements de nez parmi les suites attendues. La surveillance repose sur une grille de score déjà employée dans le service, les animaux étant tués en fin de projet pour analyser moelle osseuse, ganglions, rate et intestin.

Objectifs

Le Covid long touche environ une personne sur dix après une infection par le virus responsable du Covid-19, le SARS-CoV-2. Il entraîne des symptômes qui persistent plusieurs mois après la guérison initiale, comme une grande fatigue, des troubles de la mémoire ou encore des douleurs multiples (thoraciques, musculaire ou articulaire, céphalées…etc). Les causes précises de ce syndrome restent encore mal comprises. Plusieurs pistes sont étudiées : une inflammation prolongée, un dérèglement du système immunitaire, des déséquilibres hormonaux ou encore la présence persistante du virus dans l’organisme. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous utilisons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus, dont les réponses à l’infection à SARS-Cov-2 sont proches de celles de l’humain. Ce modèle permet d’étudier en détail l’évolution de l’infection sur le long terme. Grâce à lui, il a été découvert que le virus, même s’il n’est plus détecté par les tests tels que les écouvillons nasaux, peut rester caché pendant 6 à 18 mois dans les poumons dans certaines cellules immunitaires, les macrophages. Nous avons aussi observé que certaines cellules du système immunitaire, les cellules NK (pour “natural killer”), peuvent s’adapter pour mieux combattre ce virus caché. Une sous-population particulière de ces cellules, les “NK adaptatives”, semble jouer un rôle clé dans le contrôle de l’infection persistante. Ce projet de recherche se poursuit aujourd’hui autour de trois grandes questions : 1/ Où le virus se cache-t-il à long terme ? Nous voulons savoir si les macrophages des poumons sont les seuls refuges du virus, ou si d’autres cellules, dans d’autres organes comme l’intestin, peuvent aussi l’héberger durablement. 2/ Quel est le rôle du système immunitaire ? Nous étudierons si l’état du système immunitaire au moment de l’infection influence la capacité à éliminer le virus. Nous chercherons aussi à comprendre comment les cellules NK adaptatives se développent et agissent. 3/Le virus peut-il se réveiller ? Enfin, nous testerons si ce virus "endormi" peut se réactiver plus tard, par exemple en cas d’infection bactérienne, et provoquer de nouveaux symptômes. Ces recherches visent à mieux diagnostiquer le Covid long et à poser les bases pour développer, à terme, un traitement curatif.

Bénéfices attendus

Une des hypothèses avancées pour le Covid long est que le virus pourrait persister discrètement dans l’organisme, sans être complètement éliminé par le système immunitaire. Dans ce projet de recherche, l’objectif est de mieux comprendre où et comment le virus peut rester caché dans le corps. Les cellules et tissus jouant un rôle de “réservoirs” viraux – comme les poumons, l’intestin, les ganglions lymphatiques ou la moelle osseuse – seront identifiés et étudiés. Leur nombre, leur activité anti-virale et leur évolution dans le temps seront analysées. Une attention particulière sera portée aux macrophages des poumons et aux cellules NK, capables d’éliminer les cellules infectées. On s’intéressera aussi aux facteurs immunitaires (c’est-à-dire l’ensemble des réactions et des cellules de nos défenses naturelles qui permettent de combattre une infection) et aux facteurs épigénétiques (c’est-à-dire les mécanismes qui modifient l’activité de nos gènes sans changer l’ADN) qui peuvent influencer la capacité du corps à éliminer durablement le virus. Pour cela, nous utiliserons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus. Grâce à lui, après une infection par le SARS, la dynamique du virus peut être observée dans plusieurs organes et sur une longue période, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. Nous testerons une approche innovante qui consiste à injecter une molécule modulatrice de la réponse immunitaire qui imite une infection bactérienne. L’objectif est de vérifier si, dans ces conditions, le virus encore présent dans l’organisme mais « endormi » peut se réactiver, sans qu’il y ait réellement de nouvelle infection. Plusieurs avancées sont attendues grâce à ce projet : • Une meilleure compréhension de la persistance virale, des mécanismes d’échappement au système immunitaire, et des conditions de réactivation du virus. • La mise en évidence du rôle des cellules NK dites "adaptatives" dans le contrôle de l’infection à long terme. • L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des antiviraux ou des immunothérapies. • La détection de marqueurs sanguins utiles au diagnostic du Covid long et à la sélection des patients pour de futurs essais cliniques. Ce projet permettra une avancée majeure dans la compréhension et la prise en charge du Covid long, tout en enrichissant les connaissances scientifiques sur les infections chroniques et l’immunité.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (45 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus SARS-CoV-2 (une fois, 15 min, tous les animaux, - Injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire (deux fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (45 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (10 fois environ, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait de ganglions lymphatiques périphériques (8 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (30 fois environ, 2 minutes, tous les animaux) - Lavage broncho-alvéolaire (20 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection : Symptômes respiratoires (pneumonie légère à modérée, difficultés respiratoires transitoires, toux légère), fièvre et comportement de fatigue, anorexie transitoire ou diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, déshydratation. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Nuisances suite à l’injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire : Fièvre et comportement de fatigue, douleurs musculaires (tremblements, difficultés locomotrices), anorexie transitoire ou diminution de l’appétit, déshydratation, activation de la réponse immunitaire. Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse, et anesthésies répétées : Diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite aux lavages bronchoalvéoaires: Toux, difficultés respiratoires légère juste après le geste. Nuisances suite aux écouvillons nasotracheaux: Saignement nasal (léger à modéré). Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Après infection et pendant environ 4 semaines, ils seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales pour limiter la surinfection virale. Nuisances possibles suite à l’exérèse de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin de pouvoir analyser tous les organes où sont activées les NK et macrophages (moelle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, intestin…)

Remplacement

Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester présent dans l’organisme sur le long terme, il est essentiel d’étudier ce phénomène dans un organisme vivant. Les expériences faites uniquement sur des cellules isolées, ne permettent pas de reproduire la complexité d’un corps entier. Elles ne reflètent pas non plus le comportement réel des cellules dans leur environnement naturel. C’est pourquoi des études sont menées sur des modèles animaux. Le macaque est l’un des plus adaptés pour ce type de recherche, car il est très proche de l’humain sur le plan biologique. Il possède les mêmes récepteurs cellulaires d’entrée pour le virus), ce qui permet au SARS-CoV-2 d’infecter ses organes de manière similaire à ce qui est observé chez l’humain, qu’il s’agissent des poumons, des intestins, des ganglions lymphatiques ou encore de la moelle osseuse. Grâce à ce modèle, la persistance du virus, l’emplacement de ses réservoirs dans l’organisme et l’évolution des réponses immunitaires peuvent être étudiés dans la durée. De plus, des prélèvements peuvent être réalisés dans différents organes, ce qui n’est pas possible chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude est réalisée en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Anesthésies/ Toutes les interventions et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule et même anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée. Prélèvements / Ils consistent en des prélèvements de sang, de moelle osseuse et des exérèses de ganglions périphériques. Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si des réactions locales apparaissent, un traitement symptomatique pourra être instauré. Exposition au virus / Après exposition aux virus SARS-CoV2, une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Elles ont déjà été établies et utilisées au sein de notre département et assure un bon suivi de l’état de santé des animaux après infection et permet d’alerter les vétérinaires en cas de besoin. Administration des molécules modulatrices de la réponse immunitaire / Si des réactions locales apparaissent suite à l’administration des modulateur, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Hébergement individuel / Les animaux sains seront hébergés en groupe sauf avis contraire des vétérinaires ; les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour limiter la surexposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée (4 semaines maximum), ils seront remis en groupe sociaux. Observations Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester dans le corps après une infection, nous utilisons un modèle animal proche de l’humain : le macaque cynomolgus. Ce primate partage de nombreuses caractéristiques biologiques avec l’être humain, notamment les récepteurs que le virus utilise pour entrer dans les cellules. Cela signifie que l’infection se développe chez ce modèle animal de manière très similaire à ce qui est observé chez l’humain, en touchant notamment les poumons, les intestins, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse. Ce modèle permet de suivre l’infection sur le long terme, dans des conditions très contrôlées : nous pouvons choisir précisément la dose de virus administrée et simuler certaines maladies associées (comorbidités), par l’injection de molécules modulatrices de la reponse immunitaire, comme cela se produit chez certains patients humains. Des prélèvements réguliers dans différents organes (sang, ganglions, moelle osseuse) sont possibles sur plusieurs mois, ce qui permet d’observer l’évolution du virus, d’identifier ses "cachettes" dans le corps (appelées réservoirs) et de mieux comprendre les réactions du système immunitaire dans le temps. Ce modèle permet aussi d’étudier le sang pour y repérer des signes spécifiques (biomarqueurs) de la présence du virus dans les différents organes. Ces informations pourraient ensuite être utilisées pour améliorer le diagnostic du Covid long chez l’humain, sans devoir effectuer de prélèvements invasifs. Les recherches se concentrent uniquement sur des modèles animaux adultes. En effet, leur système immunitaire est déjà totalement développé, ce qui permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables à ceux d’adultes humains. Cela aide à mieux comprendre les mécanismes de défense qui fonctionnent — ou échouent — face au virus, et pourquoi il peut parfois persister longtemps dans l’organisme. En résumé, le modèle macaque cynomolgus adulte est aujourd’hui l’un des plus pertinents pour faire progresser la recherche sur la persistance du SARS-CoV-2 et mieux prendre en charge les personnes souffrant de Covid long.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est infecté par le virus de l'immunodéficience simienne, puis subit une quinzaine d'anesthésies générales, une quinzaine de prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse et environ sept ablations chirurgicales de ganglions lymphatiques, avec un hébergement individuel une fois infecté. Le porteur attend de l'infection une perte de poids, des diarrhées, une chute des lymphocytes, des nodules palpables et des lésions cutanées, et prévoit de compléter l'alimentation si les anesthésies répétées coupent l'appétit. Il affirme que le macaque est le seul modèle animal reproduisant la maladie humaine et qu'il n'existe "pas d'autre modèle animal" pour le sida, l'objectif restant de comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires échouent à contrôler le virus.

Objectifs

Malgré des décennies de recherche, il n'existe toujours pas de vaccin ni de traitement curatif contre le VIH/SIDA. Pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans le contrôle de l'infection, nous utilisons deux modèles animaux primates non humains (il s’agit d’animaux d’élevage) infectés par le virus d’immunodéficience simienne (VIS) : • Le singe vert d’Afrique, naturellement infecté par le VIS sans développer la maladie, • Et le macaque cynomolgus, chez qui l’infection par le VIS est pathogène, comme chez l’humain. Un intérêt particulier est porté à un type de cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles (NK, natural killers), qui jouent un rôle crucial dans la réponse antivirale, notamment au sein des tissus lymphoïdes secondaires . Ces tissus, comme les ganglions ou la rate, sont les lieux stratégiques où les cellules immunitaires se rencontrent et s’activent pour organiser la défense de l’organisme. Parmi ces cellules, on retrouve les cellules T, des globules blancs spécialisés qui reconnaissent spécifiquement un agent infectieux et coordonnent la réponse immunitaire. Tout comme elles,ces cellules NK peuvent acquérir des caractéristiques de mémoire et s'adapter fonctionnellement. Il a été d’ores et déjà montré chez le singe vert d’Afrique que les cellules NK adaptatives fortement différenciées se développent dans les tissus lymphoïdes secondaires et contribuent à un contrôle efficace du virus. Il n’y a pas de contrôle chez le macaque cynomolgus. Pour comprendre l'absence de contrôle du virus chez ce dernier, cette étude sera menée sur six macaques infectés par le VIS. Cette étude se concentre sur l’analyse de la charge virale ainsi que l’évaluation de l’ensemble des caractéristiques phénotypiques, tel que leur apparence ou les molécules présentes à leur surface et fonctions des cellules NK dans divers tissus. L’objectif global est de comprendre les conditions qui favorisent ou empêchent la génération de cellules NK efficaces, et d’identifier des éléments précis du système immunitaire sur lesquels on peut agir afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur le modèle macaque vise à mieux comprendre pourquoi certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, sont dysfonctionnelles et incapables de contrôler l'infection par le virus VIS, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur ce modèle, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles sont régulées. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules dans l’infection. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui pourraient rendre ces cellules NK particulièrement efficaces pour éliminer les cellules infectées. Nos résultats pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus VIS (une fois, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection: Perte de poids, diarrhée, baisse importante des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’ablation de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où sont activées les cellules NK.

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le modèle primateest, pour toutes ses similarités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que celui-ci. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est pathogène, comme chez l’humain, nous permet d'analyser et de comparer, en absence de traitement, les réponses cellulaires dans différents tissus en plus du sang, notamment la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, l’intestin, le foie et la rate qui jouent un rôle dans la pathogenèse. Le modèle du macaque cynomolgus permet donc d’analyser les interactions hôte/virus dans des contextes contrôlés (virus, timing) facilitant ainsi l’identification des caractéristiques propres à l’organisme qui influencent sa réponse face au virus. Par ailleurs, seul le modèle animal permet d’analyser les interactions virus/hôte dès les premiers jours post-infection (période qui généralement est impossible à étudier chez l’humain infecté par le VIH), or il est connu que les temps précoces suites à l’infection sont fortement impliqués dans la régulation des réponses immunes et l’établissement des réservoirs viraux. Il est donc très important d’étudier cette période précoce pour mieux comprendre les facteurs responsables de l’induction d’un contrôle viral efficace.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale avec un soutien thermique pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (patés pour singe, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. En cas d’apparition de réaction locale, un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe. Les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Le macaque est le seul modèle animal, qui, lorsqu’il est infecté par le SIV présente une physiopathologie comparable à celle observée chez l’humain infecté par le VIH. C’est le modèle animal le plus pertinent pour étudier et comprendre les mécanismes de transmission du virus et de développement du SIDA chez l’Humain. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier pourquoi le système immunitaire est dysfonctionnel pour lutter contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

Infectées par des salmonelles au cours d'une contention d'une trentaine de secondes, 2 400 poules vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes et noter les lésions. Le protocole ajoute une vaccination, des pesées, un prélèvement de sang à l'aile, et l'analyse des fèces et des œufs pour mesurer l'excrétion de la bactérie. Le porteur indique qu'aucun signe clinique ni mortalité ne sont attendus puisque les oiseaux restent porteurs sains, et attribue le niveau modéré au stress des manipulations plutôt qu'à l'infection elle-même. Ces essais d'efficacité sont exigés pour les dossiers d'autorisation de mise sur le marché des médicaments vétérinaires, et le schéma de vaccination suit le résumé des caractéristiques du produit ou la demande du donneur d'ordre.

Objectifs

Les salmonelles ubiquistes sont un grave problème et pour la santé humaine et pour la filière avicole. La salmonellose est une zoonose majeure, en raison surtout de sa fréquence et de sa gravité médicale pour l’Homme. La contamination à différents niveaux de la filière avicole par la bactérie du genre Salmonella est à l'origine de toxiinfections alimentaires chez l'Homme via la consommation d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair. La maladie humaine se contracte par l’ingestion d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair crue contaminés, et constitue la première cause de toxi-infections alimentaires collectives en France. La prophylaxie repose essentiellement sur une hygiène stricte et de bonnes pratiques d’élevage. Mais les salmonelles sont des germes très difficiles à éradiquer du fait de leur ubiquité et de leur grande résistance dans le milieu extérieur, tant aux agents physiques que chimiques. Il est donc important de trouver de nouvelles stratégies pour renforcer la résistance des poules domestiques à l’infection, de diminuer l’excrétion des germes dans le milieu extérieur et le portage asymptomatique. La vaccination des poules pondeuses et des reproducteurs au couvoir avec des vaccins vivants permet une réduction nette du portage et de l'excrétion, mais cette prévention n'est ni suffisante ni durable. L'objectif de ce projet est de tester différents schémas vaccinaux permettant de réduire significativement et durablement le portage et l'excrétion. Sur les 5 années du projet, nous estimons à 2 le nombre d'études de développement de modèle et à 2 le nombre d'essais d'efficacité, ce qui correspond à un nombre maximal de 2400 oiseaux.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux vaccins contre les Salmonelles, et plus particulièrement de vaccins destinés aux lignées reproductrices ou aux poules pondeuses permettrait de réduire la contamination de la filière, et ainsi de limiter les risques de toxi-infection chez l'Homme. Une meilleure maîtrise des Salmonelles en élevage aviaire permettrait d'éviter l'abattage d'animaux ou la destruction des œufs ou des carcasses en cas de contamination avérée. Le but recherché est d'induire une immunité forte chez les animaux vaccinés et de protéger la descendance pendant les premières semaines de vie via les anticorps maternels (anticorps maternelles transmis de la mère à la descendance par le jaune d'oeuf). Les stratégies vaccinales permettent également d'éviter l'utilisation des antibiotiques dans les élevages avicoles. En effet, l'utilisation massive d'antibiotiques jusqu'aux années 2000 a engendré l'apparition de souches multiresistantes très préoccupantes pour la santé humaine.

Procédures

L'infection sera induite par administration d'un inoculum contenant une ou plusieurs souches de Salmonelles par la voie décrite dans le protocole. Un seul challenge avec l'inoculum sera effectué par essai. L'inoculation est effectuée sur animaux vigiles et la durée de la contention est d'environ 30 secondes. Dans le cas de l’évaluation de vaccins vétérinaires, ces derniers seront administrés selon les modalités prévues dans le RCP (Résumé des Caractéristiques du Produit) ou demandées par le donneur d’ordre. Une seule administration de vaccin est généralement nécessaire, mais certains protocoles vaccinaux peuvent nécessiter un ou deux rappels. L'administration se fait sur animaux vigiles et la durée de la contention est inférieure à 20 secondes. Au cours du projet, des données seront générées dans le cadre du suivi de l’évolution de la maladie chez les animaux: examens cliniques quotidiens (examen visuel depuis l'exterieur de la case), poids (maximum une fois par semaine; sur animaux vigiles; durée entre 30 et 60 secondes), ingérés alimentaires ou hydriques quotidiens (mesure de la quantité d'aliment/d'eau distribués par case et mesure des refus après 24h). Chez la poule pondeuse, les oeufs seront collectés pour analyses bactériologiques. Des prélèvements de fèces (effectués dans la litière) peuvent également être réalisés pour évaluer l'excrétion de la bactérie dans l’environnement. Un prélèvement sanguin pourra être effectué en fin d'étude dans le cadre du suivi de la bactériémie ou de la réponse humorale après vaccination. L'animal vigile sera tenu en contention pendant environ 1 minute pour effectuer le prélèvement à l'aile. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin d'évaluer les lésions des organes, et pour prélèvement d'organes pour identification et numération bactérienne.

Impact sur les animaux

Aucun signe clinique ni mortalité ne sont attendus chez les animaux inoculés puisque les animaux sont porteurs sains. Bien que l'infection n'induise pas de signes cliniques ni de mortalité, le niveau de gravité des modèles d'infections par Salmonelle est classé "modéré" à cause du stress induit par les manipulations d'animaux au cours des pesées, de l'administration du produit d'étude, du challenge, des prises de sang et des euthanasies. La seule douleur sera celle liée à l'insertion de l'aiguille lors de la prise de sang ou pour euthanasie (en cas d'euthanasie chimique).

Devenir

Les animaux entrant dans ce projet seront euthanasiés en fin de procédure pour scoring des lésions et prélèvements de tissus/organes afin de vérifier la charge bactérienne (portage) et/ou d'effectuer des analyses histopathologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants n’est susceptible de répondre aux objectifs du projet. L'utilisation de modèles in-vitro, ex-vivo ou de simulations informatiques ne permet pas de répondre aux objectifs du projet. En effet, l'efficacité d'un médicament, d'un vaccin ou d'un additif ne peut être évaluée qu'après administration du produit à des animaux infectés par la bactérie afin d'évaluer son efficacité (réduction des signes cliniques, de la mortalité, la réponse immunitaire, le portage et l'excrétion) chez l'espèce cible. Les essais d'efficacité sont obligatoires au dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché de médicaments vétérinaires et doivent être réalisées chez l'espèce cible correspondant aux indications thérapeutiques du produit à tester. Il n'y a donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux implique au préalable une bonne caractérisation du modèle expérimental afin de réaliser ensuite des calculs d'effectifs fiables et d’éviter l'échec d'étude d'efficacité parce que la variabilité n'est pas maîtrisée (modèles pas assez ou trop sévères) ou parce que le nombre d'animaux est insuffisant. Le calcul d'effectif est basé sur le paramètre d'intérêt spécifique au produit dont l'efficacité est évalué et peut se faire sur un score clinique et/ou sur un paramètre zootechnique (poids ou indice de consommation). Selon le paramètre retenu, le calcul d'effectif doit se baser sur le test statistique qui sera conduit. Pour les études de développement de modèles, le nombre d'animaux utilisé sera déterminé de telle sorte que l'expérimentation soit interprétable, en tenant compte de la variabilité biologique individuelle.

Raffinement

Les conditions d'hébergement seront adaptées aux besoins physiologiques des animaux et leur permettront d'exprimer le plus possible leur gamme normale de comportements. Pour les volailles, l'hébergement sera en bâtiment fermé sur paille ou sciure au sol ou sur caillebottis en cages. Les cloisons seront grillagées afin de permettre des contacts physiques, olfactifs, visuels et auditifs entre animaux. Les animaux seront systématiquement hébergés en groupe d'au moins 2 individus. La température, l’hygrométrie et la luminosité de la pièce seront adaptés à l'espèce et au stade physiologique. Des enrichissements (perchoirs, ficelles, blocs à piquer, balles, grelots) seront proposés et renouvelés régulièrement. La contention visera à minimiser le stress. Le bien-être des animaux sera évalué par le personnel en charge des animaux au moins une fois par jour.

Choix des espèces

La contamination à différents niveaux de la filière avicole par la bactérie du genre Salmonella est à l'origine de toxiinfections alimentaires chez l'Homme via la consommation d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair. Afin de réduire le risque de zoonose, il est important de développer de nouveaux vaccins, médicaments ou additifs vétérinaires chez l'espèce cible. La lignée et le stade de développement des animaux utilisés dépendra de la cible du produit testé. En effet, selon les objectifs de l'étude, des poussins d'un jour, des poulets de chair en croissance, des poules pondeuses ou des reproducteurs pourront être utilisés car ils correspondent aux différentes populations ciblées par les vaccins en développement. La première étude visant à renforcer l'immunité vaccinale de poules reproductrices, l'essai sera conduit sur les animaux adultes (12 semaines au moment de la vaccination).

Tous gardés en vie à l'issue et réutilisés, 34 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une boiterie leur est provoquée par huit points d'injection de kaolin sous la peau de la face plantaire d'un membre postérieur, sous une heure d'anesthésie générale, et dure environ cinq jours pendant lesquels ils sont hébergés seuls. Ils reçoivent jusqu'à trois administrations du produit testé espacées de trois semaines, des prélèvements sanguins à la jugulaire, et marchent en laisse sur une plateforme de mesure de force pour évaluer l'appui du membre rendu douloureux. Deux animaux ont été ajoutés au projet pour valider l'induction de la boiterie elle-même, et le porteur affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'évaluer un anti-inflammatoire vétérinaire sur ce modèle.

Objectifs

MODIFICATION : AJOUT D'UNE PROCEDURE DE VALIDATION DE METHODE DU CHALLENGE KAOLIN SUR DEUX NOUVEAUX ANIMAUX. L'objectif de ce projet est d'évaluer puis de comparer l'efficacité d'un élément d'essai administré à deux doses différentes. L'objectif est de pouvoir démontrer les propriétés anti-inflammatoire et analgésique du produit testé sur un modèle inflammatoire chez le chat. Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif (la référence) et un contrôle négatif (le véhicule du produit test à administrer ou du sérum physiologique). Modification au projet: Ajout de deux animaux pour valider l'injection de kaolin et valider l'inflammation. Ce modèle permet de créer une boiterie en induisant réponse inflammatoire au niveau du membre induit. Grâce au modèle boiterie, les propriétées anti-inflammatoire et analgésique des produits testés pourront être évalués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit testé en le comparant aux contrôles positif et négatif. De démontrer les propriétés anti inflammatoires et analgésiques du produit test . Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations sous-cutanées quelques soit le groupe, pour le produit test, le contrôle négatif et le contrôle positif. Durée, par administration, inférieure à la minute. Au total un maximum de 3 administrations par produit espacées de 3 semaines de récupération entre les administrations pourront être réalisées. La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible. Les prélèvements sanguins seront réalisés avant chaque administration du produit test, contrôle négatif ou positif puis toutes les 3 semaines jusqu'à la fin de l'étude. Tout prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. Enfin les animaux seront tenus en laisse et harnais et passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Les animaux auront eu un entrainement au préalable de l'étude. Cela a pour but d'évaluer la force du membre présentant la boiterie pour pouvoir évaluer l'efficacité du médicament testé. Durée d'un passage : inférieur à 1 minute. Plusieurs passages ( maximum 5) sont réalisés par temps afin d'obtenir une moyenne fiable d'interprétation. MODIFICATION: INDUCTION D'UNE BOITERIE SUR DEUX ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES POUR LA MISE AU POINT TECHNIQUE.La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à l'induction d'une boiterie et d'une inflammation du membre postérieur administré avec la solution de kaolin, à la contention lors des prélèvements sanguins, le risque d'hématome lors des prélèvements au niveau des veines jugulaires et au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale. Des réactions inflammatoires (gonflement, rougeurs par exemple) peuvent également être observées au niveau des sites d'injections des éléments tests.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, il est indispensable de recourir à l’animal. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle boiterie chez le chat. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés.

Réduction

32 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 4 groupes de 8 animaux. 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis deux groupes auront l' élément test à deux doses différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables et en tenant compte de la variabilité inter individuelle. Une justification du nombre d'animaux est demandée au donneur d'ordre. Des phases préliminaires, comme des études pilotes, ont été réalisées dans le but de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour cette étude. Ces études ont mis en avant qu'il était necessaire d'avoir des groupes de 6 à 8 animaux. Des groupes de 6 à 8 animaux ont été également indiqué dans des textes de références (J. vet. Pharmacol. Therap., 2005, 28, 275-285, J Vet Pharmacol Ther. 2009 Feb; 32(1):18-30 par exemple) . Pas de test statistique réalisé en amont. Pas d'approche statistique prévue pour ce projet. MODIFICATION : AJOUT D'UNE PROCEDURE DE VALIDATION DE METHODE DU CHALLENGE KAOLIN SUR DEUX NOUVEAUX ANIMAUX SOIT UN TOTAL DE 34 ANIMAUX INCLUS DANS CE PROJET. DEUX ANIMAUX DE PLUS RAJOUTES POUR VALIDER LA METHODE EST LE NOMBRE MINIMAL POUR EFFECTUER CE PROJET.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux continueront une phase d'entraînement à la marche en ligne dans le corridor de Force Plate. Cette phase sert à familiariser les animaux avec le dispositif experimental. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 4. Puis ils seront hébergés en condition individuelle tout au long de la présence de la boiterie. Cet hébergement en individuel est nécessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux ainsi que de garantir leur tranquilité tout au long de la phase active du modèle boiterie. En effet, pour les chats, le calme et le repos est plus apprécié lors d'évènements pouvant occasionner une gêne ou une diminution de la capacité motrice que les nombreuses intéractions sociales avec des congénères. Ils garderont un contact visuel, auditif et olfactif pendant la période d'hébergement individuel. De l'enrichissement (exemple: plateformes à différentes hauteurs, tunnels, balle, corde et griffoirs) sera présent autant que possible dans les boxes. Les tablettes dans les hébergements seront remontées aussi longtemps que la présence de boiterie pour l'animal au niveau du membre induit. En cas de détection d'une souffrance ou de douleur , le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre. Des anesthésiques ou analgésiques pourront être utilisés si necessaire. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour ce projet. Chats adultes entre 1 à 9 ans. Ce stade de développement permettra de viser la majorité du stade cible de ce médicament.