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Génération et maintien de souches génétiquement modifiées de parasites Cryptosporidium parvum dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
Infectées par gavage avec un parasite intestinal, 980 souris immunodéficientes passent jusqu'à douze jours hébergées sur grille en cage métabolique pour que leurs fèces soient récoltées. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue, l'agent en cause étant transmissible à l'humain. Le porteur décrit un ramollissement des fèces pendant plusieurs jours, une prostration possible et une légère perte de poids à partir du douzième jour après l'infection. La finalité est l'entretien d'un stock : Cryptosporidium parvum ne se congèle pas et perd son infectiosité au bout de quatre mois environ, ce qui impose plusieurs passages par animal chaque année, 900 souris étant prévues pour la seule multiplication des souches.
Objectifs
Cryptosporidium parvum est un parasite unicellulaire qui se multiplie dans l’intestin avant d’être excrété dans le milieu extérieur avec les selles. Il est responsable de la cryptosporidiose, une maladie conduisant à des diarrhées sévères chez les individus jeunes ou immunodéprimés, que ce soit chez les ruminants ou chez l’humain. Les moyens de contrôle vis-à-vis de la cryptosporidiose sont limités et de nouvelles cibles thérapeutiques doivent donc être identifiées. La possibilité de modifier génétiquement le parasite est un outil précieux pour nos recherches portant sur la réponse immunitaire de l’hôte face à l’infection et la mise en place de nouvelles stratégies de contrôle : suivi d’infection in vitro et in vivo, identification de facteurs de virulence, génération de mutants ou de vaccins, test d’efficacité de nouveaux traitements. De plus, nos projets de recherche requièrent des quantités importantes de parasites. Comme il n’existe pas de système in vitro permettant de générer ou de multiplier efficacement une souche transgénique, nous utilisons pour cela un modèle murin sensible à la cryptosporidiose. Par ailleurs, le parasite ne peut être congelé, il peut être conservé à 4 °C, mais au-delà de plusieurs mois (environ 4 mois) une diminution progressive de sa capacité à infecter les cellules est observée. Nos études exigent des parasites fraichement multipliés, aussi plusieurs multiplications par an sont nécessaires pour conserver chaque souche générée. Ce projet a pour but de générer puis de maintenir des souches transgéniques de Cryptosporidium parvum in vivo, puisque celles-ci ne peuvent être congelées ou stockées au réfrigérateur plus de 4 mois (perte de leur infectiosité).
Bénéfices attendus
De nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiées pour lutter plus efficacement contre la cryptosporidiose, que ce soit en santé humaine ou animale. Le développement et l’utilisation de souches parasitaires transgéniques permettra d’accélérer les recherches conduisant à l’identification de nouvelles molécules. En effet, ces souches permettent de rendre diverses applications possibles (ex : génération de mutants ou de vaccins, identification et caractérisation de facteurs de virulence parasitaires par génétique inverse) et/ou plus aisées, robustes et rapides au laboratoire (ex : criblage et test d’efficacité de nouveaux traitements, suivi d’infection in vitro et in vivo). Des multiplications régulières sur animaux sont nécessaires pour conserver et maintenir l’infectiosité de chaque nouvelle souche transgénique générée, et ainsi permettre la continuité des études au laboratoire.
Procédures
Les souris adultes vigiles seront toutes soumises à une ou deux administration(s) orale(s) par gavage, sous contention. Ce geste dure quelques dizaines de secondes. Les animaux reçoivent deux administrations de ce type dans la transfection (au maximum 80 souris sur 5 ans) et une seule dans la multiplication (au maximum 900 souris sur 5 ans).
Impact sur les animaux
Les animaux vigiles seront soumis sous contention à une (inoculation de parasites) ou deux (inoculation de sodium bicarbonate puis parasites) administration(s) orale(s) selon la procédure considérée. Le gavage réalisé sur animal vigile génère un stress du fait de la contention et une gêne par l’introduction de la sonde par voie buccale. Il n’y a pas de souffrance liée au gavage oral. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée si le gavage est effectué en douceur par du personnel expérimenté, ce qui est toujours le cas. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Chez les rongeurs, on n’observe pas de diarrhée mais un ramollissement des fèces durant plusieurs jours et éventuellement une prostration des animaux et une légère perte de poids à partir d’une douzaine de jours après infection par le parasite. L’hébergement des animaux sur grille en cage métabolique durant une partie du protocole (12 jours maximum) est nécessaire pour la récolte des parasites qui constitue l’objectif du projet. Les déplacements ou postures statiques sur la grille peuvent engendrer de l’inconfort pour les animaux.
Devenir
Les animaux entrent dans un protocole expérimental en zone confinée et sont tous infectés avec un agent pathogène zoonotique de classe II (risque pour l'humain et pour l’environnement). Ils sont donc mis à mort en fin d’expérimentation selon les normes réglementaires et de sécurité biologique.
Remplacement
Pour l’obtention de nouveaux parasites infectieux, la complétion du cycle parasitaire incluant une phase de reproduction sexuée est requise (durée de 3-4 jours). Les cultures cellulaires conventionnelles, utilisées par le laboratoire, permettent de reproduire le début du cycle mais pas la fécondation ni la production de nouveaux parasites infectieux. La complétion du cycle parasitaire a été récemment obtenue par quelques laboratoires dans le monde, mais uniquement à l’aide d’approches impliquant un système de bio-ingénierie ou basées sur des structures cellulaires tridimensionnelles dérivées de cellules souches. Surtout, ces quelques approches in vitro non conventionnelles permettent l’obtention d’oocystes en très faible quantité. Ce faible rendement est très éloigné des quantités dont le laboratoire a besoin pour ses recherches, et qui ne peuvent être obtenues à l’heure actuelle qu’à partir d’un modèle in vivo.
Réduction
Les effectifs d’animaux utilisés pour ce projet ont été définis d’après la littérature et notre expérience sur les 8 dernières années. Ils permettent d’assurer l’obtention du nombre de parasites requis pour nos études, tout en utilisant le moins d’animaux possible.
Raffinement
Avant la phase de récolte des matières fécales, les animaux sont hébergés au maximum par 4 dans des cages sur litière et un enrichissement comprenant des feuilles de papier cellulose, bâtonnets de bois et abri en polycarbonate est ajouté. Durant la phase de récolte des matières fécales, les souris sont toujours hébergées au maximum par 4 sur grille dans des cages de récolte et durant 12 jours maximum. Ces cages de récolte sont enrichies de bâtonnet de bois, d’un abri en polycarbonate et d’une plateforme de repos ajoutée au centre de la cage, afin que les animaux puissent monter dessus pour se reposer et ne pas être continuellement sur cette grille. Les animaux reçoivent une récompense alimentaire (ex : graines de tournesol, popcorn…) après l’administration orale des parasites. Pour limiter l’impact de l’infection sur le poids des animaux et éviter une éventuelle déshydratation, un complément alimentaire riche en calories (DietGel® Boost, Clear H20) sera ajouté sur une plateforme dans chaque cage de récolte dès le début de l’excrétion parasitaire et cette supplémentation sera maintenue jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis seront définis dans une grille de suivi clinique (perte de poids, apparence, comportement de l’animal) et tout animal atteignant l’un de ces points limites sera pris en charge sans délai.
Choix des espèces
Les espèces pouvant être infectées par Cryptosporidium parvum sont nombreuses. En élevage, les ruminants sont les plus touchés par la cryptosporidiose. Les souris adultes immunodéficientes utilisées pour la totalité de ce projet représentent un bon modèle d’étude de cette maladie car il reproduit bien la sensibilité des patients immunodéprimés. Ce modèle permet également une multiplication du parasite sur animaux exempt d'agents pathogènes spécifiques et opportunistes, ce qui évite les contaminations par d’autres espèces ou souches de Cryptosporidium, ou par d’autres parasites ou agents pathogènes. Cette lignée murine est plus sensible aux infections (notamment par des parasites).
Tester des pratiques efficaces contre les strongles gastro-intestinaux et la petite douve
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
Sensibiliser les éleveurs à un usage raisonné des vermifuges de synthèse et "communiquer largement les résultats" : 1 260 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent seulement des prélèvements de matières fécales, deux ou trois selon la procédure, espacés de quinze jours et durant quelques secondes, et toutes retournent ensuite dans leur troupeau. Le porteur mobilise des brebis adultes déjà infestées de strongles gastro-intestinaux ou de petite douve, à l'entretien ou en début de gestation, et justifie l'espèce par le fait qu'elle est la cible du projet. La démonstration cherche à valider une piste alternative à l'albendazole, la consommation de radis noir, et à en "promouvoir" l'usage, une finalité de conseil technique aux éleveurs davantage que de production de connaissances.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de sensibiliser les éleveurs sur l'utilisation raisonnée des anthelmintiques de synthèse pour luttter contre les parasites internes en particulier les strongles gastro-intestinaux et la petite douve. Pour cela deux pratiques vont être mis en oeuvre pour démontrer leur efficacité et communiquer largement les résultats. Le test de réduction de l'excrétion fécal évalue la présence et la proportion de population résistante de styrongles. Il permet d'identifier les molécules éfficaces contre les strongles dans l'élevage et d'adapter les pratiques pour maintenir leur efficacité. La seconde procédure a pour objectif de trouver une méthode alternative à l'albendazole pour lutter contre la petite douve qui aujourd'hui la seule molécule efficace et homologué en France. Des travaux menés en élevage sur la consommation de radis noir ont montré des résultats intérréssants sur la réduction de l'eccrétion d'oeuf de petite douve. Ce projet vise à les valider et promouvoir leur utilisation.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de sensibiliser les éleveurs et techniques sur l'intérêt de mettre en oeuvre certaines pratiques pour limiter la résistance aux anthelminthiques de synthèse de certains parasites internes (strongles gastro-intestinaux et la petite douve). Ainsi à l'issu de cette procédure, les éleveurs pourront faire évoluer leur pratiques en utilisant de façon raisonnée et en alternance les différents antiparasitaires afin qu'ils maintiennent leur efficacité.
Procédures
Les brebis seront soumis uniquement à des prélèvements fécaux au nombre de 2 pour la première procédure et à 3 pour la seconde pour suivre leur état parasitaire. Ces prélèvements seront tous espacés de 15 jours pour ne pas impacter la santé et le bien être des animaux. Cette procédure est très courte, de quelques secondes car les quantités nécessaires sont faibles environ 10g.
Impact sur les animaux
Un stress léger peut être ressenti par les brebis lors de la contention pour les prélèvements de fécaux. Lors des prélèvements de fécaux, les brebis peuvent ressentir une gêne légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe d'intensité modérée ou élevée. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général.
Devenir
Les procédures mises en oeuvre sont très légères et elles n'occasionne qu'une légère gêne aux animaux. Les prélèvements fécaux sont des procédures régulièrement réalisées en élevage pour suivre l'état de santé des animaux sans impact sur celui-ci. Dans ces conditions, l'ensemble des animaux retourneront au sein de leur troupeau à l'issu de la procédure.
Remplacement
Les ovins sont les animaux cibles de ce projet et il n'existe pas de méthode alternative.
Réduction
Les effectifs ont été réduits au maximum pour les deux procédures expérimentales afin de limiter le nombre d'animaux mobilisés tout en permettant de répondre aux objectifs du projet.
Raffinement
Les brebis seront dans leurs conditions d’élevage habituelles (en groupes) dans un bâtiment d’élevage conventionnel sur litière paillée et feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée du protocole. Pour les prélèvements de fèces, la contention sera faite par des animaliers expérimentés, dont la présence journalière répétée en interaction positive (alimentation, soins) est associée à une diminution du comportement de fuite des brebis et donc de leur stress face à la contention. En cas de signes de maladie (par exemple fièvre > 40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids >15 %...) ou d’impact sur l’état général des animaux (prostration, cachexie, alopécie…), une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). Le cas écheant (non réponse aux traitements ou blessure de l'animal non soignable), l’animal sera euthanasié par surdosage de barbiturique par voie intraveineuse, selon la posologie appropriée et le poids de l'animal.
Choix des espèces
Les ovins sont l'une espèce les plus sensibles aux strongles gastro-intestinaux et la petite douve et sont donc l'espèce cible pour cette étude. Nous mobiliserons des brebis adultes à l'entretien ou en début de gestation ayant pâturées de l'herbe depuis plusieurs mois et étant infestées de strongles et/ou de petites douves selon leur implication dans la 1ière ou la 2nd procédure. Ce sont ces catégories animales qui sont concernées par ces infestations et aux stades physiologiques étudiés les risques sanitaires sont faibles.
Uvéite induite par injection de mycobacterium tuberculosis (H37Ra) chez le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Deux injections espacées de quinze jours déclenchent une uvéite, inflammation de l'intérieur de l'œil, chez chaque lapin inclus. 1 800 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués à la fin pour des analyses histologiques et des dosages, 180 d'entre eux étant réutilisés dans d'autres protocoles parce qu'ils n'auront reçu que les examens préalables. Selon le traitement testé, ils reçoivent des collyres jusqu'à six à huit fois par jour, ou des injections dans l'œil sous microscope chirurgical une à deux fois par semaine, certains restant seuls en cage jusqu'à dix semaines. Le porteur décrit ce que l'uvéite provoque chez l'humain, rougeurs, larmoiements, démangeaisons et douleurs, et annonce des points limites "suffisamment prédictifs et précoces" sans dire lesquels ni ce que ressentent les lapins.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle in vivo d’uvéite chronique induite par l’antigène Mycobacterium Tuberculosis inactivé (H37RA) chez le lapin afin d’évaluer de nouveaux traitements dans la prévention de récidive de l’uvéite. Les uvéites sont des inflammations intraoculaires, souvent d’origine auto-immune, pouvant représenter une réelle menace pour la vision des patients. Dans les pays occidentaux, l’incidence des uvéites serait de 17 à 52 cas pour 100 000 habitants par an. Chaque année, environ 17% des patients atteints d’uvéites actives présente une diminution ou une perte de l’acuité visuelle. Les formes sévères d’uvéite antérieure et postérieure nécessitent souvent des doses élevées de corticoïdes pouvant entraîner des effets secondaires. Lorsque ces traitements sont inefficaces ou mal tolérés ils peuvent être remplacés par des immunosuppresseurs. Cependant, les uvéites ne guérissent pas définitivement et les symptômes reviennent périodiquement après arrêt des traitements. Le praticien se retrouve donc très limité en ce qui concerne le traitement et la prévention de récidive.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus seront de participer à l'élaboration de traitement luttant contre les uvéites et leur récidive, pour améliorer la vue de patients.
Procédures
Au début de l’étude, tous les animaux reçoivent deux injections espacées de 15 jours afin d’induire une uvéite, une inflammation touchant plusieurs zones de l’œil. L’évaluation de cette pathologie se fait par des examens ophtalmologiques rapides, durant seulement quelques minutes. Une anesthésie peut être pratiquée si une immobilisation complète de l’animal est nécessaire. Le traitement à tester est administré par un seul mode choisi pour chaque animal : soit par injection intraoculaire, soit par collyre, soit par voie orale. Ces procédures sont très brèves, ne dépassant généralement pas 1 à 2 minutes. Les collyres peuvent être appliqués plusieurs fois par jour, avec une moyenne de trois administrations et un maximum de six à huit. Les injections intraoculaires sont réalisées sous anesthésie locale, voire générale si nécessaire. Leur fréquence est plus limitée, à raison d’une à deux fois par semaine. Ces interventions, un peu plus longues, nécessitent l’utilisation d’un microscope chirurgical et prennent environ cinq minutes par animal. Les prélèvements sont effectués sur des animaux vigiles, sans anesthésie, et ne durent pas plus de cinq minutes, à raison d’une fois par semaine maximum. Enfin, certains lapins seront hébergés individuellement dans leur cage pendant la durée de l'étude maximum 10 semaines.
Impact sur les animaux
Le modèle entraine une uvéite, une inflammation des structures oculaires chez le lapin, chez l'homme les uvéites provoquent des rougeur, troubles, larmoiements, démangeaisons et douleurs au niveau de l’œil. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de saignements au site d'injection ainsi qu'une grosseur due à l'injection sous cutanée au moment de l'induction de la pathologie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale : examens, induction de la pathologie et traitements, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais nous estimons qu’une proportion de 10% animaux ne suivra pas la totalité de la procédure. Ces animaux auront suivi la procédure jusqu’aux examens « baseline » qui servent à révéler un défaut ou une particularité anatomique ou physiologique susceptible de biaiser les résultats. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie. Ils pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire.
Remplacement
Malgré les recherches pour développer des modèles alternatifs, les systèmes in vitro comme les organoïdes ou les organes sur puces, ne représentent pas complètement la complexité d’une maladie comme l’uvéite qui implique l’interaction entre les différents tissus de l’œil et aussi le système immunitaire. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples. Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en binôme, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce, enrichissement collectif (ambiance sonore, hébergement à plusieurs, interaction visuelle, sonore et olfactive) et enrichissement individuel nutritif (rondin végétal par exemple) et non nutritif comme des buchettes de bois ou balle de cellulose. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (tapis chauffants, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Le lapin a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le système immunitaire possède des similitudes avec celui de l’homme dans le cas des uvéites. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur cette espèce, les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Les animaux seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans l'études auront 2 à 3 mois conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.
Modèles expérimentaux de dégénérescence rétinienne induite par une ischémie reperfusion transitoire
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Évaluer l'efficacité et la tolérance de traitements de la rétine, et former du personnel à des gestes professionnels, ces deux finalités se superposent ici. 1 100 rats vont être utilisés, dont 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et sont tués à l'issue pour analyse des yeux. Un œil par animal subit soit le pincement des vaisseaux et des nerfs qui l'irriguent, soit une élévation de sa pression interne, pendant trente à soixante minutes sous anesthésie, puis des injections dans ou autour de l'œil une à deux fois par semaine et des collyres jusqu'à huit fois par jour. Une centaine d'animaux écartés de l'étude pour un défaut de l'œil repéré avant le début des procédures sont réorientés vers d'autres expériences.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de mettre en place et d’utiliser des modèles expérimentaux afin de mieux comprendre les dommages que peut subir la rétine (la partie de l’œil qui capte la lumière) lorsqu’elle manque temporairement de sang, comme cela peut arriver dans certaines maladies de l’œil. Ce type de problème, appelé ischémie rétinienne, est lié à plusieurs maladies comme le glaucome, la rétinopathie diabétique ou l’occlusion d’une artère de la rétine. Ces maladies peuvent entraîner une perte de vision. Ces modèles, utilisant des rats, permettent de bloquer temporairement le flux sanguin vers la rétine, puis le rétablir. Ces techniques permettent d’observer les réactions de l’œil, comme le stress, l’inflammation et la mort de certaines cellules. Les premières cellules touchées sont celles qui envoient les signaux visuels au cerveau. Ensuite, d’autres types de cellules de la rétine sont affectées selon la durée du manque de sang. Des cellules de soutien dans l’œil réagissent aussi, ce qui aggrave l’inflammation et les dégâts. Ces modèles aident à comprendre les mécanismes en jeu dans les lésions de la rétine. Ils servent aussi à tester des traitements potentiels pour protéger les cellules de l’œil, réduire l’inflammation ou le stress, avant de passer à des essais chez l’humain. En résumé, ce projet fournit des outils précieux pour mieux comprendre comment la rétine est endommagée lors d’un manque de sang, et pour développer de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est de développer des modèles expérimentaux fiables permettant d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements destinés à protéger ou réparer la rétine après une lésion. La recherche médicale évolue rapidement, et il est essentiel de pouvoir tester ces traitements dans des conditions rigoureuses, tout en respectant les principes du bien-être animal. Grâce à ces modèles, il sera possible de simuler des atteintes rétiniennes similaires à celles observées chez l’humain, comme dans le glaucome ou certaines maladies vasculaires de l’œil. Cela permettra d’observer précisément l’effet des traitements sur les cellules de la rétine et de mesurer leur impact à l’aide d’outils non invasifs d’imagerie et d’électrophysiologie par la mesure de l’activité électrique de la rétine. Ces études contribueront à identifier les molécules les plus prometteuses, à ajuster les doses et à mieux comprendre les mécanismes d’action, tout en garantissant une approche éthique et encadrée.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions expérimentales, réparties sur une période de 1 à 4 semaines selon les résultats obtenus avec les traitements testés. Concernant les procédures chirurgicales d’induction de la pathologie, deux méthodes seront utilisées, chacune pratiquée une seule fois sur un œil par animal. La première consiste à pincer les vaisseaux et les nerfs qui vascularisent et innervent l’œil. La seconde consiste à augmenter la pression dans l’œil. Ces procédures, réalisées sous anesthésie générale et locale, durent entre 30 et 60 minutes. Concernant les évaluations, différents examens seront réalisés une fois par semaine comme la mesure de l’activité neuronale de l’œil, l’évaluation anatomique par imagerie optique et biomicroscopie. Les deux premiers examens nécessitant une immobilisation complète de l’animal seront réalisés sous anesthésie générale, et regroupés dans une même session pour limiter le nombre d’anesthésies. Chaque examen dure quelques minutes. L’administrations des traitements se feront par : 1. L’applications de gouttes. Cette procédure nécessite une contention légère, d’une durée d’1 à 2 minutes et réalisée 3 fois par jour avec un maximum de 6 à 8 fois par jour. 2. Les injections sous-cutanées, intramusculaires ou intrapéritonéales. Ces procédures, également très rapides (1 à 2 minutes) sont réalisées sur animal vigile. 3. Injections intra- ou péri-oculaires sont réalisées sous anesthésie locale et générale si nécessaire, à une fréquence de 1 à 2 fois par semaine. Ces procédures durent environ 5 minutes par animal et nécessitent l’utilisation d’un microscope chirurgical. Des prélèvements biologiques seront peut-être nécessaires afin de doser le principe actif ou des marqueurs de la maladie. Pour cela, des prélèvements sanguins ponctuels pourront être réalisés et ne dépassent pas 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables anticipés dans le cadre de ce projet sont considérés comme modérés. L’expérience acquise lors d’études antérieures, ainsi que les données issues de la littérature scientifique, indiquent que les manifestations les plus fréquentes incluent : 1. une rougeur conjonctivale liée à une inflammation locale modérée lors d’injections ou d’administrations, 2. un léger saignement réversible au site d’injection, ou d’incision, 3. un trouble transitoire ou une opacification de la cornée. L’élévation de la pression intraoculaire induite dans ces modèles sera transitoire et réversible, et ne devrait pas générer de douleur manifeste après le réveil de l’animal. Les examens et les administrations nécessitent une contention brève des animaux, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter cet impact (habituation, manipulation douce, environnement calme). Certaines procédures, telles que les injections intra ou péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère, afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire ou un léger saignement, mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
L’œil est un organe très complexe, composé de nombreuses parties (cornée, cristallin, rétine…) qui interagissent entre elles et avec le reste du corps. Il subit en permanence des variations mécaniques, chimiques et biologiques qui influencent son fonctionnement et sa réaction aux traitements. Des techniques comme les cultures cellulaires, les organoïdes ou les simulations informatiques existent, mais elles ne peuvent pas reproduire toutes les interactions présentes dans un œil vivant. Par exemple, elles ne simulent pas correctement les effets sur l’ensemble du corps, les variations de pression dans l’œil ou bien les réactions complexes liées à des maladies comme le glaucome. C’est pourquoi les modèles animaux sont ici encore indispensables car ils permettent premièrement de reproduire plus fidèlement les conditions du glaucome. Deuxièmement, de tester l’efficacité et la tolérance de nouveaux traitements dans un organisme vivant. Troisièmement d’étudier les effets à long terme sur la rétine et le nerf optique dans un environnement complet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques, tout en garantissant une analyse statique fiable des résultats. En fonction des résultats, les outils statistiques à notre disposition permettront, le cas échéant, d’ajuster encore à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre : Utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie (imagerie rétinienne, etc.), permettant de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, sans nécessité de mise à mort à chaque point d’analyse. Chaque fois que cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Afin l'optimisation des protocoles expérimentaux permettra de limiter la variabilité interindividuelle et maximiser la robustesse des résultats.
Raffinement
Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera mis en place tout au long des études, afin de détecter précocement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Ce suivi permettra d’intervenir rapidement si nécessaire, dans le respect des points limites prédéfinis, conçus pour être précoces, prédictifs et adaptés à la pathologie étudiée. Ces points limites visent à minimiser toute douleur potentielle et à garantir une prise en charge rapide et éthique. Les animaux seront hébergés en groupe, dans des cages enrichies contenant nourriture et eau en libre accès et à volonté, ainsi que des éléments d’enrichissement environnemental (abris, matériaux à ronger) favorisant leur bien-être psychologique et comportemental. Les examens réalisés pour évaluer la pathologie sont non invasifs et comparables à ceux pratiqués en ophtalmologie humaine ou vétérinaire. Lorsque l’immobilité de l’animal est requise pour garantir la qualité des mesures, une anesthésie légère pourra être administrée, dans le seul but d’assurer le confort de l’animal et de limiter le stress. Ce projet a été soumis à l’évaluation d’un comité d’éthique compétent, et sera étroitement suivi par la structure en charge du bien-être animal au sein de l’établissement. Toutes les procédures seront réalisées par un personnel formé et expérimenté, dans le strict respect des réglementations en vigueur et des principes éthiques de l’expérimentation animale.
Choix des espèces
L'espèce sélectionnée pour ce projet présente des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques largement documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, en particulier dans le contexte des pathologies oculaires telles que le glaucome. Ces espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de glaucome et d’hypertonie oculaire notamment. Leur emploi repose sur une expérience accumulée dans la communauté scientifique, garantissant la reproductibilité des résultats et la comparabilité avec d’autres études précliniques. Les animaux seront des jeunes adultes âgés au minimum de 6 semaines pour les rats correspondant à la maturité de la rétine.
Développement d’anticorps de type VHH dirigés contre la protéine prion chez le rongeur, à visée diagnostique et/ou thérapeutique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris reçoit six injections d'immunogènes espacées de trois semaines, six prélèvements sanguins, puis trois injections supplémentaires dans les cinq jours précédant sa mise à mort. 100 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des nanocorps dirigés contre la protéine prion. Le porteur décrit ces quinze interventions comme de "légères gênes temporaires" qui ne devraient entraîner "ni douleur importante ni effet durable", quand la gravité déclarée du projet est modérée. Toutes sont tuées dès que la réponse en anticorps est jugée correcte, pour prélever la rate.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire un type particulier d’anticorps appelés VHH ou nanocorps. Ces anticorps sont beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur petite taille est intéressante car elle leur permettrait, en théorie, de franchir plus facilement la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre la possibilité d’imaginer un jour des traitements pour des maladies qui touchent directement le système nerveux. Nous voulons produire ces anticorps contre la protéine prion (PrP). Cette protéine est responsable des maladies à prion, qui touchent l’animal et l’Homme, et qui sont toujours fatales car il n’existe actuellement aucun traitement. Les nanocorps obtenus pourraient servir à mieux comprendre comment ces maladies se développent, à améliorer leur diagnostic et à explorer de nouvelles pistes de traitement. Nous cherchons aussi à produire des nanocorps capables de reconnaître non seulement la forme « normale » de la protéine prion, mais aussi certaines formes anormales associées aux maladies. Cela permettrait d’obtenir des anticorps plus spécifiques et plus utiles que ceux dont nous disposons aujourd’hui. Enfin, la protéine prion est également impliquée dans d’autres maladies, comme certains cancers ou encore la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. La production de nanocorps dirigés contre la protéine prion pourrait donc avoir un intérêt bien au-delà des seules maladies à prion, et bénéficier à un domaine plus large de la recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Les anticorps de type VHH, aussi appelés nanocorps, sont des outils innovants qui possèdent plusieurs avantages par rapport aux anticorps classiques. Leur petite taille leur permet de se fixer sur des cibles difficiles d’accès et, en théorie, de franchir la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre des perspectives uniques pour envisager un jour des traitements de maladies qui touchent directement le système nerveux. Ils sont aussi très stables, faciles à produire en laboratoire et peuvent être utilisés sous différentes formes pour la recherche, le diagnostic ou le traitement. Ces nanocorps sont déjà étudiés dans d’autres maladies humaines, par exemple certains cancers, des maladies infectieuses, ou encore des maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Leur potentiel d’application est donc très large. À ce jour, il n’existe aucun nanocorps dirigé contre les maladies à prion. Ce projet vise à combler ce manque en développant une nouvelle génération d’anticorps contre la protéine prion. L’intérêt dépasse les maladies à prion elles-mêmes, car la protéine prion est aussi impliquée dans d’autres pathologies. Les bénéfices de ce projet seront donc multiples : - fournir de nouveaux outils de recherche pour mieux comprendre le rôle de la protéine prion, - permettre un diagnostic plus précoce et plus précis des maladies à prions, - et à plus long terme, ouvrir des pistes thérapeutiques innovantes grâce à la petite taille des nanocorps, qui pourrait leur permettre d’atteindre le cerveau et de cibler spécifiquement les formes anormales de la protéine prion.
Procédures
100 souris sont prévues pour le projet. Pour chaque animal, les gestes techniques seront les suivants : - injection d’analgésique avant injection des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigile. Il faut compter 30 secondes par intervention. - Injections des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigiles. Il faut compter 1 minute maximum par intervention (contention et injection) - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles 1 prélèvement avant la première injection puis toutes les 2 semaines après chaque immunisation, soit 6 prélèvements. Il faut compter 2 minutes par intervention (contention, prélèvement puis massage de la joue) - Cinq jours avant la mise à mort, 3 injections toutes les 24h d’immunogènes sur animaux vigiles. Il faut compter environ 1 minute par intervention (contention et injection).
Impact sur les animaux
Les interventions prévues (injections et prises de sang) peuvent provoquer de légères gênes temporaires chez les souris, mais elles ne devraient pas entraîner de douleur importante ni d'effet durable. Les effets observés peuvent être une petite rougeur ou un léger gonflement à l'endroit de l'injection ou de la prise de sang ; une sensibilité locale passagère ; un léger inconfort dans les heures suivant la manipulation. Il peut arriver que certains animaux soient un peu moins actifs ou mangent un peu moins pendant un jour ou deux, ou qu'ils perdent légèrement du poids. Ces effets disparaissent généralement rapidement, sans conséquence sur leur état général.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la campagne d’immunisation quand les réponses en anticorps seront correctes afin de prélever la rate.
Remplacement
Il existe aujourd’hui des méthodes permettant de produire des anticorps sans utiliser d’animaux, par exemple des techniques de sélection réalisées uniquement en laboratoire., Cependant, ces approches n’aboutissent pas encore à des anticorps de même qualité que ceux produits par le système immunitaire d’un animal. En effet, l’organisme possède un mécanisme naturel qui « améliore » progressivement les anticorps pour qu’ils se fixent très efficacement à leur cible, un processus qui ne peut pas être reproduit artificiellement avec les techniques actuelles. Dans ce projet, les souris sont utilisées pour générer des cellules capables de produire durablement des anticorps. Ces cellules seront ensuite immortalisées en laboratoire et permettront de produire les anticorps sur le long terme, sans avoir à réutiliser de nouveaux animaux pour chaque antigène ou chaque série d’expériences.
Réduction
Le nombre de 5 souris par antigène a été déterminé à partir d’un calcul statistique. L’objectif est de garantir, avec une forte probabilité, que au moins deux souris par lot développent une bonne réponse immunitaire. Cela est nécessaire pour pouvoir utiliser leurs cellules et produire les anticorps sans avoir à recommencer tout le protocole depuis le début. En pratique, il est bien connu qu’une ou deux souris sur cinq peuvent ne pas répondre correctement aux immunisations. Le choix de 5 animaux tient donc compte de cette variabilité naturelle tout en évitant d’utiliser plus de souris que nécessaire. De plus, si la première tentative de production d’anticorps en laboratoire échoue (ce qui est rare), les trois souris restantes du lot servent de filet de sécurité. Cela permet de refaire un essai sans devoir réimmuniser un nouveau groupe d’animaux, ce qui contribue directement à réduire leur nombre sur l’ensemble du projet.
Raffinement
Trente minutes avant l’intervention les animaux recevront une injection d’analgésique. Après les interventions, les animaux seront surveillés et placés sur un tapis chauffant à 37°C pendant 2 heures pour favoriser leur récupération. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Les lignées de souris de laboratoires sont classiquement utilisées pour l’immunisation et la production d’anticorps. Les souris transgéniques exprimant des anticorps de camélidés évitent le recours à ces espèces, protocole beaucoup plus difficile à mettre en œuvre. De jeunes adultes (6 à 8 semaines) seront utilisés au démarrage des immunisations ; ils ont en effet la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires lors des immunisations successives.
PRELEVEMENT DE PRODUITS BIOLOGIQUES D’ORIGINE ANIMALE SUR RONGEURS
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 575
Fournir aux laboratoires du sang, de la bile, du liquide cérébral, de l'urine et des fèces de rongeurs sains : 3 700 souris et rats vont être utilisés, dont 825 anesthésiés puis prélevés sans jamais être réveillés. Les autres passent jusqu'à seize heures en cage à métabolisme, quatre nuits par semaine pendant deux semaines, à jeun et parfois isolés. Tous sont ensuite tués. Le porteur présente ces animaux comme des "surplus de stock" d'élevage et décrit un service de fourniture interne, les scientifiques demandeurs devant justifier que les matrices in vitro ne permettent pas "d'atteindre les résultats attendus".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de collecter sur des rongeurs (rats et souris) sains sans maladie des produits du corps : sang, liquide cérébral, bile, urine, fécès. Ces fluides servent par la suite à développer ou vérifier l’efficacité de tests de diagnostiques (tests permettant de vérifier l’absence ou la présence d’une maladie par exemple) ou servent dans des études regardant le devenir du médicament et sa toxicité dans le corps. Il n’est parfois pas possible de prélever ces produits sur animal non vivant car sinon la qualité ou la quantité n’est pas conforme aux besoins de la communauté scientifique pour des résultats fiables et pertinents (après la mort, le produit se détériore trop vite ; trop de produit est nécessaire ce qui demanderait de prélever beaucoup d’animaux après leur mort). Les produits sont donc collectés sur des rongeurs vivants si cela n’est pas douloureux (urine et fécès collectés grâce à un système collecteur le permettant dans la cage) ou sur rongeurs endormis et dont la douleur a été contrôlée et qui ne seront pas réveillés.
Bénéfices attendus
Les produits collectés servent dans la santé humaine et vétérinaire. Ils servent par exemple à développer ou vérifier l’efficacité de tests de diagnostiques (tests permettant de vérifier l’absence ou la présence d’une maladie par exemple) ou servent dans des études regardant le devenir du médicament et sa toxicité dans le corps.
Procédures
Prélèvement d’urines et de fécès pendant maximum 16 heures maximum 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines dans des cages permettant la collecte d’urines et fécès (présence de grilles pour collecte) pour les animaux entrant dans la procédure de collecte d’urines et fécès Une à deux injections (d’une durée de 10 secondes maximum par injection) d’analgésiques pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale Anesthésie générale d’une heure maximum pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale Collecte de produits biologiques (d’une heure maximum) sans réveil pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale
Impact sur les animaux
Dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès, les animaux sont soumis à un hébergement en cage à métabolisme pendant une durée maximale de 16 heures maximum 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines. Hébergement isolé possible dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès pour une durée maximale de 16 heures Mise à jeûn alimentaire dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès pour une durée maximale de 16 heures 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines Stress dû à la contention et à l’induction d’une analgésie / anesthésie générale dans le cadre de prélèvements de produits biologiques d’origine animale sur animaux anesthésiés et analgésiés mais non réveillés
Devenir
Dans le but de réduire l’utilisation d’animaux (règles des 3R), les animaux ayant subi uniquement un prélèvement d’urine ou de fécès proviendront de nos surplus de stock puis mis à mort. Dans le cadre des animaux prélevés sous anesthésie / analgésie générale, tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
De nombreuses supports in vitro existent afin de mimer les produits biologiques d’origine animale et ont permis de réduire l’utilisation des animaux pour les études en question. Cependant, dans certains cas, ces matrices ne permettent pas d’atteindre les résultats attendus et une fiabilité forte des résultats (échec du diagnostic recherché par le test diagnostique, pas de possibilité de valider la matrice comme témoin pour des études de pharmacocinétique ou toxicologie). L’objectif du projet est donc de fournir aux scientifiques des produits biologiques d’origine animale de rongeurs (sang, sérum, plasma, organe, fluides) lorsque l’utilisation de matrices in vitro n’est pas possible. Une justification de l’obligation de l’utilisation de ces produits d’origine animale est demandée aux scientifiques avec support de la SBEA.
Réduction
Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont des animaux de surplus de stock. Grâce à l’application de ces procédures au sein de nos zones d’élevage plutôt que chez les scientifiques (pas de remise en stock possible), aucun animal n’est produit volontairement pour l’application de ces procédures, contribuant donc à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet. Sur la base de notre expérience passée dans ce type de prélèvements, des tableaux sont à notre disposition afin de calculer au plus près le nombre d’animaux nécessaires en fonction du poids, du sexe et de la souche de l’animal. Les méthodes de calcul sont régulièrement revues pour utiliser le moins d’animaux possible pour le besoin attendu. La meilleure balance nuisances / nombre d’animaux utilisés sur une durée maximale de 10 jours (temps de conservation de l’urine au réfrigérateur) sera effectuée avec support de la SBEA.
Raffinement
Les produits biologiques d’origine animale peuvent également être collectés sur animaux après la mort, en post mortem. La pertinence de prélèvements de ces fluides sur animal vigile peut donc être demandée en amont au scientifique (en cas volume concordant avec un prélèvement post mortem pour les urines et les fécès et en cas de faisabilité en postmortem pour les prélèvements sous anesthésie/analgésie) avec si besoin support de la SBEA. Lors des collectes sur animal anesthésié, une anesthésie adéquate ainsi qu’une analgésie couvrant la totalité de la procédure sera effectuée. Des points limites spécifiques et suffisamment prédicitfs ont été définis et seront appliqués pour chaque procédure. Les animaux sont manipulés selon de bonnes pratiques de manipulation (main en coupe, tunnel, …). Une récompense alimentaire type graines de tournesol sera proposée lors de la remise en cage d’hébergement des animaux dans le cadre des prélèvements d’urines et de fécès.
Choix des espèces
Les produits biologiques d’origine animale sont utilisés d’une part dans le cadre de réalisation de tests diagnostiques qui ont été créés à partir des espèces souris et rat d’où l’utilisation de ces espèces ; d’autre part dans le cadre d’études de toxicologie dans lesquelles sont inclus principalement les espèces souris et rat. Le prélèvement de sang, d’organe ou de fluide pourra être réalisé sur des rongeurs de la naissance jusqu’au stade âgé, en fonction du besoin du scientifique. En cas de demande de prélèvement sur animaux non sevrés ou gestantes, un accord préalable de la SBEA sera demandé.
Cryoconservation de sperme et fécondation in vitro chez le poisson zèbre
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
Isolement d'une nuit, anesthésie générale de deux à trois minutes, une minute hors de l'eau, prélèvement de un à deux microlitres de sperme jusqu'à trois fois par individu à une semaine d'intervalle : 7 650 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le champ structuré les déclare tous réutilisés, et le porteur ajoute que les animaux dont les lignées ne seront pas maintenues en élevage sont tués par surdose d'anesthésique. L'objectif est de constituer une banque de sperme pour sécuriser des lignées génétiques uniques créées par les équipes et indisponibles dans le commerce, ce que le porteur présente aussi comme un moyen de réduire le nombre de poissons surnuméraires. L'isolement d'une nuit est reconnu comme anxiogène chez une espèce qui vit en groupe, et rien n'est précisé sur la répartition entre mâles et femelles parmi les 7 650 individus, ni sur le nombre de lignées abandonnées.
Objectifs
Les équipes de recherche des instituts utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez le poisson zèbre, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations de cryoconservation et de fécondation in vitro des lignées génétiques impliquées vise à préserver des modèles uniques créés par les équipes de recherches et indisponibles dans le commerce.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à constituer une banque de sperme de poisson zèbre permettant de sécuriser les lignées uniques développées par les chercheurs utilisant l'animalerie. Cela permettra à la fois de diminuer le nombre d'animaux surnuméraires générés en maintenant des lignées non utilisées en procédures expérimentales mais aussi de limiter les dérives génétiques résultant de croisement à répétition en repartant sur un stock de sperme congélé en utilisant la technique de fécondation in vitro.
Procédures
Un prélèvement de sperme (1-2 µl) sera réalisé une fois par individu. Dans le cas où le nombre soit insuffisant, jusqu'à 3 prélèvements de sperme pourront être réalisés par individu en respectant un délais d'une semaine entre chaque prélèvement. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. La récolte des oeufs sera réalisé une fois par individu.
Impact sur les animaux
Les mâles sont hébergés en situation d'isolement pendant une nuit avant le prélèvement de sperme pour éviter les stimulations avec les autres congénères. L'isolement peut générer de l'anxiété, le poisson étant un animal vivant en groupes sociaux. L'anesthésie générale (environ 2-3minutes) et le temps passé en dehors de l'eau (environ 1minute), nécessaires pour réaliser le prélèvement peut également induire un stress pour l'animal.
Devenir
Les animaux pour lesquels les lignées ne seront pas maintenues en elevage seront mis à mort par surdosage anesthésique.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible, la cryoconservation est la seule méthode possible pour garantir le stockage à long terme de lignées uniques. Elle sera limitée aux lignées originales pour lesquels ces lignées ne sont pas disponibles auprés d'un centre de ressouces
Réduction
Le nombre d'animaux a été évalué pour garantir la bonne réalisation de la cryoconservation. La procédure permettra de réduire le nombre d'animaux en élevage.
Raffinement
Les poissons sont élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7,5 avec des cycles jour/nuit de 14h/10h. Nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante (artémias) et à maintenir un enrichissement social. Lors des prélèvements, les bacs d'anesthésie et de reveil seront maintenus à 28°C par l'utilisation de tapis chauffant. Une anesthésie générale sera réalisée. Des points limites strictes et spécifiques seront appliqués.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude des maladies génétiques. Le poisson zèbre présente de nombreuses similitudes avec l’Homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires. Les poissons seront utilisés à partir de 3 mois. Il est necessaire que les poissons aient atteint la maturité sexuelle et qu'ils soient en capacité de se reproduire.
Etude de la protection des canes reproductrices contre les virus influenza aviaires hautement pathogènes (VIAHP)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Prise de sang et écouvillons dans la gorge et le cloaque avant l'étude, infection par aérosol ou dépôt du virus dans le passage reliant le nez et la gorge, puis prélèvements répétés à huit reprises sur quatorze jours, tous sur animaux vigiles : 192 canes reproductrices Pékin sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié d'entre elles et sévère pour l'autre moitié. L'infection peut provoquer abattement, torticolis, tremblements, paralysie, détresse respiratoire et hémorragies dès 24 à 48 heures, jusqu'à la mort spontanée. Il s'agit de comparer trois protocoles de vaccination à deux âges de ponte, chez des canes que le porteur qualifie de "particulièrement précieuses" parce qu'elles fournissent les 34 millions de canetons d'élevage produits chaque année. Toutes seront tuées à l'issue, l'arrêté du 25 septembre 2023 imposant l'abattage des animaux exposés au virus.
Objectifs
Les virus de l’influenza aviaire hautement pathogènes (VIAHP) de la lignée H5 ont provoqué ces dernières années des pertes majeures chez les volailles d’élevage. Leur impact se manifeste par l’abattage massif de troupeaux infectés, la mortalité d’espèces sauvages parfois menacées, et un risque croissant de transmission inter-espèces, notamment vers les mammifères et potentiellement l’Homme. La vaccination des canards d’élevage contre ces VIAHP H5 est effective en France depuis 2023. Elle a permis de considérablement réduire les dégâts dus aux VIAHP, mais l’optimisation des protocoles de vaccination est encore en cours, en particulier pour certains « types » de canards comme les canes reproductrices. Ces canes reproductrices d’élevage, de l’espèce « canard Pékin » produisent en effet les œufs qui donneront les futurs canetons d’élevage (34 millions de canetons par an), et ont donc un rôle crucial parmi les canards d’élevage. Ces canes sont particulièrement précieuses parce qu’elles sont issues d’une sélection génétique longue et coûteuse et sont peu nombreuses. Leur espérance de vie est de l’ordre de 70 semaines : il est donc important de s’assurer que leur protection vaccinale contre les VIAHP H5 est efficace tout au long de leur vie, en particulier durant la ponte. Les vétérinaires responsables d’élevages de canes reproductrices ont mis en place, dans le contexte des soins vétérinaires, des protocoles de vaccination renforcés pour optimiser la protection vaccinale chez ces animaux. Le présent projet vise à évaluer l’efficacité de ces protocoles sur le développement de la maladie et l’excrétion de virus en réalisant des épreuves virulentes, c’est-à-dire en infectant dans des installations confinées des animaux vaccinés ou pas. Ces épreuves sont l’approche la plus rigoureuse permettant de vérifier si la vaccination protège les animaux.
Bénéfices attendus
Le projet induira des bénéfices à court et moyen terme. A court terme, il permettra de déterminer quels sont les protocoles de vaccination optimaux protégeant de façon efficace et durable les canes reproductrices contre les VIAHP H5. Ces protocoles pourront donc être communiqués auprès des vétérinaires et professionnels de l’élevage pour être mis en œuvre sur le terrain. Des animaux avec une protection vaccinale optimale ne développent pas de maladie s’ils sont exposés au virus et produisent très peu voire pas de virus par rapport à des animaux non vaccinés. Cette production réduite ou disparue évite donc de contaminer d’autres animaux. A moyen terme, cette protection des canes reproductrices contribuera à réduire au minimum les dégâts engendrés par les VIAHP chez les volailles, oiseaux sauvages et potentiellement mammifères dont l’homme en protégeant les animaux et en « cassant » la chaîne de transmission de ces virus.
Procédures
Avant de commencer l'étude, une prise de sang et des écouvillons dans la gorge et le cloaque seront effectués. Au début de la procédure, les animaux vaccinés ou non seront infectés soit par inhalation d'un aérosol contenant le virus, soit en déposant une solution contenant le virus dans le passage reliant le nez et la gorge (voie intra-choanale). Après infection, des prélèvements seront réalisés à plusieurs moments (0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 jours après l'infection) : prises de sang (volume réduit à chaque prélèvement), écouvillons dans la gorge et le cloaque. Tous les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement durera moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Chez la volaille, la contention nécessaire aux prélèvements (écouvillons, prises de sang) peut induire un stress des animaux. Les prises de sang peuvent induire la formation d’hématomes sous-cutanés, notamment en cas de mauvaise manipulation. Un saignement prolongé au point de ponction est également possible, surtout si la coagulation est altérée ou si le site n’est pas correctement comprimé après le prélèvement. Les VIAHP peuvent entraîner un tableau clinique sévère pouvant aller jusqu’à la mort chez les espèces-cibles. Les signes cliniques observés sont susceptibles de varier en fonction des souches virales, de l’espèce cible et du statut vaccinal. Ainsi, certaines souches virales n’entraînent pas de signes cliniques notable chez les canards (mais demeurent hautement pathogènes pour les poulets). Au contraire, d’autres souches peuvent induire une symptomatologie sévère chez le canard. Les effets indésirables incluent : signes généraux d’abattement, des signes nerveux (torticolis, tremblement, paralysie), une détresse respiratoire, des hémorragies, une mortalité spontanée. Ces signes, lorsqu’ils surviennent, peuvent être observés dès 24 à 48 heures post-inoculation et s’intensifier jusqu’à la mort des animaux. Le score clinique en annexe 2 prend en compte ces données. Ces signes devraient être réduits voire absent chez les animaux vaccinés.
Devenir
À la fin de l’étude toutes les canes seront euthanasiées. Cette décision est conforme à l’arrêté du 25 septembre 2023 relatif aux mesures de surveillance, de prévention, de lutte et de vaccination contre l’influenza aviaire hautement pathogène qui impose l’abattage des animaux exposés à ce virus. En effet, ces animaux ne peuvent pas être réintroduits dans un élevage ou utilisés pour d’autres projets car ils représentent un risque sanitaire.
Remplacement
Le projet a pour but d’évaluer les paramètres cliniques, les paramètres d’excrétion, de transmission et de diffusion des VIAHP ainsi que l’impact de la vaccination sur ces derniers. Des épreuves virulentes sur animal (motif de la présente saisine) sont donc nécessaires et non remplaçables par un modèle ne reproduisant pas le sujet entier.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre de canards minimal nécessaire à l’obtention de résultats scientifiquement robustes. Une analyse statistique préalable a été réalisée afin de garantir une sensibilité suffisante pour détecter des différences biologiquement pertinentes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Un maximum de 192 oiseaux sera dont utilisé en tenant en compte deux facteurs majeurs : l’âge des animaux et le protocole vaccinal. Soit 32 animaux par procédure (8 individus par isolateur x 4 isolateurs) ; procédure répétée 6 fois pour tenir compte du facteur « âge » et du facteur « protocole vaccinal » (2 âges et 3 protocoles).
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes seront appliquées : 1. Période d’acclimatation de 72h en isolateur dès leur arrivée. 2. Enrichissement du milieu incluant cordelettes avec jouet de type bouchon suspendu, miroir avec clochette, possibilité pour les canards d’exprimer un comportement de toilettage à l’aide des dispositifs d’abreuvement. 3. Mise en place d’un suivi clinique quotidien, et biquotidien de 9h00 à 11h le matin ainsi qu’un second passage à 18h en phase d’infection précoce (5 premiers jours) avec grille de suivi et de notation clinique par le vétérinaire responsable de l’essai (annexe). Une caméra sera installée dans l’animalerie et à l’extérieur des isolateurs afin de surveiller les animaux plus régulièrement, notamment en phase d’infection précoce. 4. Utilisation d’une garde lors des prises de sang au sinus occipital ainsi qu’une compression au niveau du site d’introduction de l’aiguille après la prise de sang.
Choix des espèces
Les canards et notamment les canes reproductrices Pékin sont une espèce soumise à la vaccination déployée depuis septembre 2023 et jouent un rôle clef dans la filière avicole française en y constituant l’un des maillons primaires et dans l’écologie des VIAHP en excrétant le virus tout en présentant des degrés variables d’expression clinique (allant d’une absence de signes cliniques jusqu’à la mort selon les souches virales). À ce titre, il n’existe pas de meilleur modèle expérimental que l’espèce cible elle-même pour étudier l’impact des VIAHP et l’efficacité des mesures de prévention. Les canes Pekin domestiques (Anas platyrhynchos domesticus) utilisées seront des animaux adultes de 50 à 70 semaines d’âge et au maximum 3,5 kg. Ces animaux adultes étant sélectionnés selon des critères de production de viande et d’œufs ne volent pas en raison de leur poids corporel important en rapport au développement de leurs muscles pectoraux. L’objectif du projet étant d’évaluer la protection vaccinale chez des animaux de cet âge. Les oiseaux seront pesés avant le transfert de l’élevage vers l’animalerie. Les âges choisis correspondent respectivement au milieu et à la fin de la période de ponte. Cette dernière est une période à risque pour laquelle la protection vaccinale pourrait être moindre, du fait de la durée depuis la dernière injection vaccinale (datant d’avant l’entrée en ponte, soit à environ 25 semaines d’âge) et de l’impact cumulé de la période de ponte, cette dernière sollicitant la physiologie des animaux.
Création de modèles pathologiques ou physiologiquement modifiés par chirurgie d’exérèse
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système urogénital
Rats : 2500
Ôter un rein, une thyroïde ou un autre organe pour fabriquer un animal malade, puis l'expédier au laboratoire qui l'a commandé : 4 000 souris et 2 500 rats vont être utilisés dans ce catalogue de modèles chirurgicaux. 200 d'entre eux seront opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les 6 300 autres subiront une opération de dix minutes à une heure suivie d'un réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à six injections par jour et un isolement en cage pouvant durer douze jours. Une partie des animaux sert à former et à requalifier les chirurgiens, de trois à vingt-cinq individus par technicien pour une acquisition, jusqu'à dix pour un maintien de compétence. Les autres sont, selon les mots du porteur, "à la demande, expédiés chez les scientifiques", donc versés à des projets dont le RNT ne dit rien.
Objectifs
L’objectif du projet est d’opérer des animaux afin de leur enlever un organe. Cela permet de mimer des maladies humaines ou animales (par exemple, enlever le rein et mimer une défaillance du rein, enlever la thyroïde et mimer une absence de thyroïde,...) afin de pouvoir mieux comprendre comment elles évoluent. Ces modèles animaux opérés sont aussi très importants pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Des modèles de maladies sont créés chez le rat ou la souris pour aider la recherche à mieux comprendre certaines pathologies humaines et à tester de nouveaux médicaments. Ces modèles permettent d’observer comment un traitement agit dans le corps et d’étudier le rôle des organes ciblés. Les chirurgiens qui réalisent ces modèles suivent des protocoles précis et doivent être bien formés, afin de garantir des résultats fiables, de limiter la souffrance animale et de proposer des modèles standards, prêts à l’emploi pour les chercheurs.
Procédures
Tous les animaux analgésiés, anesthésiés et non réveillés ou analgésiés, anesthésiés puis réveillés, dans le cadre de ce projet, seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée de dix minutes à une heure, sous anesthésie générale. Selon le modèle et en cas de besoin (besoin scientifique, douleur, récupération post opératoire difficile), les animaux pourront être soumis à des injections (maximum 6 injections par jour, comprenant les injections suite à la mise en place du protocole d’analgésie et de raffinements). Selon les besoins des scientifiques, un prélèvement sanguin maximum (durée de l’acte de maximum une minute) est possible. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 12 jours.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dus aux contentions, aux procédures chirurgicales et à la récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel sur une partie ou sur toute la durée de la procédure si l'intégrité du modèle le nécessite.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite, acquisition ou maintien des compétences ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
Les modèles chirurgicaux créés dans le cadre de ce projet permettent de mimer des maladies humains ou animales par l’absence d’un organe dans leurs corps. Cela permet de comprendre les liens qu’il y a entre cet organe et le reste de l’organisme. Cela permet également de comprendre comment de nouveaux médicaments peuvent aider à soigner cette maladie. Ces interactions ne sont pas des phénomènes isolés et par conséquent ne peuvent pas être étudiées in vitro sur un seul type de cellule. Pour l’acquisition et le maintien des compétences techniques, avant tout entraînement sur un modèle animal, une formation théorique basée sur l’utilisation de supports papiers et vidéos est effectuée. Lorsque cela est possible, l’entrainement pour certains gestes techniques pourront être réalisés sur des supports inertes (mannequin de formation). Pour les différents modèles, la validation du chirurgien sera évaluée sur la technique dans un temps imparti, sur la viabilité et la fonctionnalité du modèle dans le temps : cette partie ne peut être réalisé in vitro.
Réduction
Basé sur les expériences précédentes, le nombre d’animaux a été calculé le plus juste possible en fonction des chirurgies et permettant d’atteindre les objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux surnuméraires opérés est suivi, calculé et ajusté à la baisse autant que possible en fonction des lots précédents. Pour l’acquisition et le maintien des compétences, le nombre d’animaux défini dans notre procédure est basé sur la criticité et la technicité du modèle (faible / moyen / forte) ainsi que les expériences précédentes. Ce nombre est composé d’un minimum (3 pour l’acquisition, 1 pour le maintien) et d’un maximum (de 25 pour l’acquisition, 10 pour le maintien) afin de pouvoir qualifier le chirurgien lorsque la technique est maîtrisée, dès lors que le nombre minimum est atteint. Cela nous permet également d’avoir un nombre maximum au-delà duquel le technicien n’est pas considéré comme formé. L’acquisition ou le maintien des compétences s’arrête dès lors qu’un taux de réussite de 100% est atteint pour un lot de 3 ou 1 animaux respectivement, même si le nombre maximum d’animaux n’a pas été effectué. Lors d’une acquisition ou maintien des compétences sur cadavre ou sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé, nous pouvons utiliser un animal pour l’entraînement de plusieurs gestes techniques de plusieurs modèles, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces animaux peuvent être les surnuméraires non opérés de commandes ou surplus de stock, ce qui contribue aussi à la réduction. Pour l’acquisition des compétences des modèles, les premiers entrainements se feront sur cadavre puis sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé. Dès lors que les gestes sont maîtrisés, la chirurgie est réalisée sur animal analgésié, anesthésié et réveillé. Pour le maintien des compétences, l’utilisation d’animaux supplémentaire n’est pas systématique. Les différents modèles ont été classé selon leur difficulté et leur criticité. Pour ceux dont la difficulté et la criticité est considéré comme faible, le maintien des compétences se fera sur animaux de lots demandés par les scientifiques, sous supervision du formateur et/ou du responsable du service, avec au préalable, une relecture de la procédure et/ou le visionnage d’une vidéo de la technique.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, et dans un milieu enrichi et les interactions se font selon les bonnes pratiques de manipulation. Des points limites spécifiques au modèle seront appliqués. Toutes les interventions sont réalisées sur animaux anesthésiés, qui sont préalablement préparés de manière aseptique. Les chirurgies sont réalisées selon des procédures standardisées et adaptées aux spécificités de souche, sexe, âge et poids. Après évaluation de la douleur possible induite par le modèle (paliers de douleur définis pour chaque modèle en collaboration avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin (signes de douleur individuelle, d’inconfort ou absence de fèces). L’utilisation complémentaire d’anesthésique local (Lidocaine 2%, 1 ml/kg, dilution par 4, posologie de 16.22 mg/kg) peut être réalisée selon le palier de douleur de la chirurgie (procédure interne de classification validée par l’équipe vétérinaire et la SBEA). Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux avant réveil. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience (si le taux de succès ou de survie est très bas par exemple sur le choix fait par le scientifique). Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec le modèle d’intérêt, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Etude de la transmission de la coccidiose chez deux races de poulets de chair
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Infestés par des coccidies à six jours d'âge, 252 des 288 poulets de ce projet subissent ensuite vingt-quatre pesées individuelles, vingt-deux écouvillonnages cloacaux et une à deux prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués en fin d'expérimentation pour que leur tube digestif soit prélevé et les lésions comptées. L'objectif est de comparer une race décrite comme résistante et une lignée commerciale, afin d'estimer ce que la sélection génétique pourrait apporter contre une maladie dont le porteur souligne d'abord le "fort impact économique". Il annonce des "signes subcliniques transitoires" sur vingt-quatre à quarante-huit heures, sans mortalité ni signe clinique sévère, sans préciser ce que ce terme recouvre.
Objectifs
L’amélioration de la résistance des élevages aux maladies infectieuses est nécessaire pour promouvoir le bien-être des animaux, de même que pour contribuer à la réduction de l’utilisation d’antimicrobiens. Parmi les maladies fréquemment rencontrées en élevage, la coccidiose du poulet est particulièrement intéressante en raison de son fort impact économique. L’objectif de ce projet est d’explorer et de comparer la sensibilité, l’infectiosité, la durée d’infection, la tolérance et la croissance compensatrice chez deux races de poulets suite à une infection. L’une des races étant décrite comme résistante à la coccidiose et l’autre étant une lignée commerciale. Nous regarderons et analyserons les différences entre animaux et entre génétiques, de même que les mécanismes de transmission de la maladie.
Bénéfices attendus
La coccidiose est une des maladies les plus fréquentes chez les volailles. Pourtant, à ce jour, aucune donnée n’est disponible concernant la variabilité inter-individuelle au sein des poulets de chair concernant la sensibilité, l’infectiosité, la durée d’infection, la tolérance et la capacité de croissance compensatoire après une infestation. Notre projet est donc une première étape pour estimer le potentiel de la sélection génétique sur ces caractères. A plus long terme, ce projet permettra l’utilisation des courbes de poids individuelles pour retracer la dynamique d’une épidémie au sein d’une large population, étape nécessaire pour estimer des paramètres génétiques pour des caractères dits « sociaux » tels que la sensibilité et l’infectiosité. Il permettra également d’orienter la sélection génétique sur des caractères favorisant la santé animale face à une maladie infectieuse en prenant en compte les mécanismes de transmission d'un animal à un autre.
Procédures
Sur les 48 parquets de 6 poulets chacun, 42 poulets seront soumis à une infestation coccidienne expérimentale unique. L’inoculation se fera, sur animaux vigiles, à 6 jours d’âge et chaque inoculation durera moins de 20 secondes. Les 288 poulets du projet auront 24 pesées individuelles et 22 prélèvements par écouvillon cloacal. Les pesées sans prélèvement (au nombre de 2) seront faites sur animaux vigiles et la durée sera inférieure à 10 secondes par animal. Les pesées avec prélèvement (au nombre de 22) seront faites sur animaux vigiles et la durée sera de 30 secondes maximum. Les 288 poulets du projet auront une prise de sang à 5 jours et, parmi eux, 240 poulets en auront une seconde à 35 jours. Chaque prélèvement se fera sur animal vigile et durera moins de 15 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs sur les animaux sont liés à l’infestation coccidienne, aux prises de sang et aux prélèvements par écouvillons cloacaux. Infestation : présence de signes subcliniques transitoires, sur 24h (48h maximum), au moment du pic d’excrétion des coccidies, soit environ 4 à 7 jours d’après l’infestation. La contention lors des inoculations peut également engendrer un stress léger et passager pour l'animal. Prises de sang : douleur légère et transitoire (inférieure à 15 secondes) générée par la pénétration de l’aiguille et stress léger et passager lors de la contention. Prélèvements cloacaux : stress léger et passager lors de la contention.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à des fins de prélèvements du tube digestif pour la recherche et le dénombrement de lésions liées à la coccidiose.
Remplacement
Avant la mise en place de ce projet, nous avons développé un modèle in silico de simulation d’une épidémie de coccidiose en élevage. Ce modèle se base cependant sur de fortes hypothèses et ne prend pas en compte la variabilité inter individuelle. A ce jour, il n’existe pas de méthodes pour étudier les réponses physiologiques individuelles des individus face aux parasites (ici les coccidies) auxquels ils sont exposés. En effet, le développement d’une coccidiose et la réaction à la maladie (sensibilité, tolérance…) varient fortement d’un animal à l’autre. Enfin, l’analyse des contenus digestifs en fin de procédure, nécessite obligatoirement le recours à des animaux.
Réduction
Dans notre projet, les 288 poulets sont répartis en trois modalités dont 36 poulets dans la modalité témoin (6 répétitions de 6 animaux). Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum nécessaire, pour d’une part maintenir des relations sociales (6 animaux par répétitions) et d’autre part pour trouver des différences significatives sur la base de l’indice de consommation (6 répétitions). Dans les 2 autres modalités infestés par la coccidiose, les 21 répétitions par modalité sont nécessaires pour détecter des différences significatives de sensibilité et d’infectiosité entre les deux lignées génétiques. Aussi, avec 252 animaux au total dans ces deux modalités (126 par lignée génétique), nous aurons le nombre d’animaux nécessaires pour réaliser des statistiques fiables et trouver des différences significatives pour évaluer les caractères « individuels » comme la durée d’infection ou les caractères liés au poids (tolérance et rapidité de la croissance compensatrice)
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des parquets (petits enclos où se trouvent les poulets), au sol sur des copeaux et en groupe (6 par parquet) afin de créer des relations sociales. Des ficelles et des pierres à piquer seront installées dans chaque parquet en tant que matériel d’enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d’alimentation et de soins, selon des normes mieux-disantes que celles prévues par la règlementation. Dans ce projet, nous avons porté une vigilance particulière aux conséquences de l’infestation que nous avons choisi : il n’entrainera ni mortalité, ni signes cliniques sévères. Seuls des réductions de consommation alimentaire et des ralentissements de croissance sont attendus. Toutes les contentions seront réalisées dans le calme par des personnes expérimentées. Afin de limiter le nombre de contentions, les prélèvements cloacaux se feront juste après la pesée. Le matériel de pesée sera adapté à la taille et à la morphologie des animaux. Lors des prélèvements de sang nous utiliserons une garde d’aiguille pour sécuriser le prélèvement. Une grille d’évaluation du bienêtre des animaux, basée sur leur comportement et leur état de santé, est complétée quotidiennement par le personnel animalier afin de détecter toute altération de leur état de bien-être. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, nous avons défini plusieurs niveaux d’action.
Choix des espèces
S'agissant d'un objectif finalisé sur la santé des volailles, le choix du poulet (gallus gallus) a été fait car il s’agit l'espèce majeure sur le terrain et un modèle reconnu par la filière. Les poussins arriveront dans notre élevage à 1 jour d’âge mais l‘infestation coccidienne n’aura lieu qu’à 6 jours d’âge. Cela permettra d’avoir des premières excrétions d’oocystes entre 10 et 20 jours, âge auquel les infestations aux coccidies apparaissent en élevage. Nous étudierons ensuite les animaux infestés sur toute la durée d’élevage, c’est-à-dire jusqu’à 35 jours.
Etude des mécanismes des réponses immunitaires spécifiques du poisson-zèbre contre des agents infectieux viraux et bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont anesthésiés puis injectés, ou plongés deux à quatre heures dans un bain contenant l'agent infectieux, certains subissant ensuite une épreuve virulente destinée à mesurer si le vaccin protège. L'infection peut provoquer une nécrose au point d'injection, une perte d'appétit, une nage erratique et la mort, et les résultats intéressent autant la recherche sur les maladies humaines que les industriels de l'aquaculture, avec une mise sur le marché en perspective. Le porteur formule le tout ainsi : "pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre", il sera nul chez les témoins et sévère chez les infectés.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses repose sur la caractérisation de l’agent pathogène (nature, propriétés de virulence…) et de la réponse de l’animal infecté, par une combinaison d’approches expérimentales menées in vitro en culture cellulaire et in vivo chez l’animal. La complexité des mécanismes engagés nécessite la reproduction expérimentale des maladies étudiées. Cela nous permet d’aborder des études de virulence des agents pathogènes causant les infections. Ces études sont effectuées dans une perspective de comparaison entre les agents émergents qui affectent les élevages et ceux qui causent des maladies chez l’Homme. Nous disposons de multiples modèles d’infections du poisson zèbre par des agents pathogènes de poissons ou de mammifères. Les infections par injection permettent de contrôler finement la dose de pathogène administrée à chaque poisson et constituent donc un modèle d’infection reproductible. Les infections par balnéation restent une alternative importante pour reproduire la voie naturelle d’infection des poissons. Les protocoles engagés peuvent être associés à des vaccins et à des prélèvements de matériel biologique après euthanasie des animaux pour caractérisation de la réponse immunitaire induite par les infections. Les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes quand il n’existe pas de vaccin efficace. Pour limiter leur utilisation et les risques associés, la mise au point de stratégies alternatives de lutte faisant appel à des immunostimulants est une solution possible pour améliorer les performances de l’aquaculture. Les objectifs de ce projet sont donc, en utilisant le poisson zèbre (1) de caractériser les mécanismes des réponses immunitaires des poissons lors d’infections par des virus ou des bactéries, (2) d’évaluer les effets protecteurs des vaccins et de comprendre les réponses immunitaires qu’ils induisent chez ces espèces, et (3) d’évaluer la capacité de nouvelles stratégies d’immunostimulations à augmenter la résistance à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique (Flavobactérie, virus responsable de la septicémie hémorragique virale (SHV), virus de la Nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI), …).
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension des mécanismes de réponses à l’immunisation - Compréhension des mécanismes de la pathogenèse associée aux infections - Validation expérimentale de nouveaux vaccins contre différents virus chez le poisson zèbre - Evaluation des effets immunostimulants et/ou protecteur des différentes conditions pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour valider les modèles d’étude des maladies infectieuses, des mécanismes de réponses associés, et des stratégies de prévention ou de lutte contre ces maladies. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères et qui peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une injection est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. L’immunisation des poissons par injection implique une ou deux injections (si rappel nécessaire) effectuées sous anesthésie. Le cas échéant, les prélèvements de mucus sous anesthésie seront effectués une ou deux fois, à un intervalle de temps d’au moins 3 jours. L’anesthésie associée est courte (de l’ordre de la minute) comme pour les injections. L’immunisation des poissons par balnéation implique une séance de 2 à 4 heures éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire, l’injection nécessite une anesthésie de 1-2 minutes. Les infections par injection ou par bain correspondent à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène. Dans le cas d’épreuve virulente post immunisation, pour tester l’efficacité d’un vaccin, l’infection correspond à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène.
Impact sur les animaux
Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) est compensé par anesthésie par bain. Pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre, il sera nul chez les contrôles non infectés, très modéré chez les animaux immunisés et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. Le niveau de douleur sera modéré chez les animaux vaccinés/immunostimulés et protégés, même après infection. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension de la pathogenèse liée à l’infection, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des lymphocytes B ou T responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par les lymphocytes B ou T, ou l’efficacité d’un vaccin/immunostimulant lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
Les infections par balnéation ou par injection, et les expériences de vaccination/immunostimulation permettent de comparer plusieurs conditions expérimentales (différents génotypes, différents agents infectieux, différents protocoles d’immunisation/immunostimulation, etc). Les effectifs requis pour la mise en évidence de différences significatives de survie et de réponses entre les conditions dépendent de l’homogénéité des réponses et de la mortalité, et sont calibrés sur la base de notre connaissance de la sensibilité du poisson zèbre à chaque virus, chaque fois que cela est possible. Les groupes peuvent être de 10 à 15 individus, selon les informations disponibles. Les effectifs sont fixés pour l’obtention de résultats statistiquement représentatifs permettant d’apporter des résultats interprétables dans nos études. Des tests statistiques sont utilisés La taille des groupes (10-15 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus. Un effectif minimal de 15 poissons permet de mettre en évidence une protection qui doit assurer 90 à 100% de survie pour une vaccination efficace. Par ailleurs, les groupes de 15 poissons permettent d’évaluer la mortalité induite par un agent pathogène chez des poissons non vaccinés ou stimulés, en utilisant un minimum d’animaux et en gardant des conditions d’effectif standardisées. Cet effectif permet de réaliser des prélèvements en nombre suffisants pour étudier la réponse immunitaire induite par une immunisation, une infection, ou une vaccination/stimulation chez les survivants. Un effectif de 10 à 15 permet en effet, pour un même groupe de poissons, de consacrer 3 à 5 poissons entiers à des expériences d’histologie et 7 à 10 à des prélèvements de tissus pour des études d’expression ; il doit être noté que la taille du poisson zèbre peut imposer pour certains tissus, de réaliser des pools de prélèvements de 2 individus. Des groupes de 10-15 individus permettent donc de travailler dans des conditions reproductibles (même taille de groupe, mêmes conditions expérimentales par exemple, même taille d’aquarium), et correspondent à des effectifs minimums, des groupes plus petits ne permettraient pas de fournir, de manière systématique et standardisée, les échantillons et informations requises pour nos projets de recherche. Ainsi ces effectifs permettent une utilisation optimale des animaux.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. L’enrichissement mécanique dans ce type d’expérimentation n'est sera pas sans impact sur les résultats (blessure avec voie d’entrée du pathogène, difficulté d’observation des poissons situés dans les caches, développement de biofilm, …). Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La transparence des premiers stades de développement de cette espèce facilite la mise en œuvre des techniques d’imagerie in vivo. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires contre des agents infectieux, dans ce modèle. Pour l’étude des réponses immunitaires spécifiques et de la protection vaccinale/immunostimulant, le système immunitaire des poissons doit être mature, et ils sont donc utilisés au stade adulte, à 4-6 mois. L’étude des réponses immunitaires innées et de la pathogenèse sera effectuée à différents stades, chez les juvéniles (3 à 8 semaines) et chez l’adulte (4-6 mois)
Étude pilote de la tolérance locale et systémique (hors BPL) de l’albumine sérique humaine chez le chat et le chien
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
Chiens : 12
Gardés en vie à l'issue, 12 chiens et 12 chats pourront être versés à d'autres projets sur décision du vétérinaire désigné. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 18 d'entre eux et modéré pour les 6 autres. Six animaux, trois par espèce, reçoivent sous anesthésie un implant d'albumine humaine sous la peau pendant vingt et un jours, avec une seconde plaie servant de témoin de cicatrisation, tous subissant en parallèle sept prises de sang à la jugulaire et les chiens quatre sondages urinaires sur animal éveillé. Le porteur écarte toute approche statistique et présente l'effectif comme le minimum d'une étude pilote.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer la tolérance immunologique, systémique et locale après l'implantation sous-cutanée d'un biomatériel à base de d'albumine sérique humaine et pendant 21 jours chez le chien et le chat. Ce projet a pour but de valider la tolérance locale de ces dispositifs utilisés dans le cadre de la reconstruction maxillo-faciale lors de cancers oraux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sur ce projet sont de démontrer la bonne tolérance locale, immunologique et systémique de ce nouveau dispositif et d'identifier si des signes cliniques ou biologiques apparaissent dans le temps. Si les implants sont bien tolérés par les chiens et les chats cela permet une nouvelle perspective de reconstruction maxillo-faciale lors de cancers oraux chez ces espèces et chez l'humain. Ces implants ont été préalablement implantés sur les espèces suivantes: souris, rats et lapins dans le cadre du même projet.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées: - Test de tolérance au sérum d'albumine humaine sur animaux vigiles d'une durée inférieure à la minute. - Intervention chirurgicale pour la pose d'implant sur 3 animaux de chaque espèce sous anesthésie générale. Durée de l'intervention environ 30 minutes. L'une comprendra l'implant et l'autre fera office de contrôle de cicatrisation sans l'effet potentiel de l'implant. - Des prélèvements sanguins seront réalisés aux temps suivants: T0h, T8h, T24h puis au J3, J7, J14 et J21. La durée des prélèvements est inférieure à la minute. Les prélèvements seront au nombre de 5 sur 7 jours. Un temps de repos de 7 jours sera alors réalisé avant de renouveler un prélèvement sanguin. - Des prélèvements urinaires seront réalisés sur les chiens à l'aide une sonde urinaire sur animaux vigiles aux temps suivants: T0h, T24h, J7 et J21. Une gêne lors du passage de la sonde peut être occasionné. Durée inférieure à 2 minutes par sondage. Pour les chats, les prélèvements urinaires seront réalisés par miction spontanée en hébergement individuel à T0h, T24h, J7 et J21 (gardant le contact visuel, olfactif et tactile entre les animaux des hébergements adjacents) à l'aide bac de litière spécifique pour le recueil d'urine. Les animaux sont préalablement entrainés à ces litières.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à la contention lors des prélèvements sanguins et vésicaux des animaux, le risque d'hématome lors des prélèvements au niveau des veines jugulaires, un risque de microtraumatismes lors des sondages urinaires chez le chien, à la douleur potentielle post-opératoire, au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale au risque post opératoire d'hématome, d'oedème ou de déhiscence des plaies au niveau de la zone implantée et à une réaction allergique (grattage, oedème, gonflement de la face, etc...), notamment pour les chiens, pendant la période d'implantation des 21 jours.
Devenir
Les animaux sont tous gardés en vie. Suite à ce projet, les animaux pourront participer à de futurs projets sous décision du vétérinaire désigné.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet actuellement de vérifier la bonne tolérance locale et systémique pour ce dispositif. Ici les espèces séléctionnées représentent les espèces cibles pour ce projet et le chien est l'espèce recommandée pour ce projet chez l'Homme.
Réduction
Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour réaliser une étude pilote et obtenir des résultats interprétables.
Raffinement
Les chiens seront hébergés par groupe entre 2 à 4 animaux par affinité pour l'étape une et par 3 pour l'étape deux. De l'enrichissement (exemple: tablettes, jouets divers et balles) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...). Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress. Les chats seront hébergés par groupe entre 2 à 4 animaux par affinité. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, griffoirs, plateformes et coussins). Les animaux sont observés toutes les semaines par le vétérinaire afin d'évaluer les conditions d'hébergement et les enrichissements présents ainsi que d'évaluer l'absence ou présence de stress dans les groupes d'animaux liés aux intéractions sociales (règlementaire pour les chats et appliqué, ici, aux autres espèces). Les volumes de prélèvements sanguins et urinaires seront réduits au minimum nécessaire à la réaliser des analyses. Les sites de prélèvements sanguins seront alternés (jugulaire droite, jugulaire gauche) afin de laisser un temps de récupération maximal des vaisseaux sanguins. L'étape de sélection des animaux non réaction à l'albumine humaine permet d'inclure des animaux présentant le moins de risques de développer une réaction allergique forte lors de l'implantation. Une anesthésie générale complète et une analgésie per-opératoire seront réalisés pour une meilleur gestion de la douleur et du réveil post-opératoire. Un suivi antibiotique et analgésique sera réalisé en post-opératoire pour limiter les risques d'infection et de douleur après la chirurgie de pose d'implant.
Choix des espèces
Espèce cible pour les médicaments vétérinaires. Pour les produits humains, l'utilisation des chiens est bien décrite et caractérisée dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques. Jeunes adultes stérilisés et non stérilisés ayant atteint leur taille adulte et un système immunitaire et métabolique mature.