Toxicologie (hors obligations réglementaires)

2 280 rats vont être utilisés, chacun porteur d'un cathéter implanté dans la veine fémorale ou jugulaire, avec jusqu'à trois administrations par jour pendant quatre semaines, six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et jusqu'à seize heures en cage à métabolisme, privés d'eau. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, pour rechercher dans leurs organes les cibles de la toxicité des molécules testées. Une partie d'entre eux est hébergée seule, de l'implantation à la fin du traitement, quand le cathéter oblige à poser un harnais qu'un congénère abîmerait. Ces essais interviennent en amont des études réglementaires, pour trier les candidats médicaments d'une recherche pharmaceutique privée avant les tests obligatoires, plus consommateurs d'animaux.

Objectifs

L’objectif de la Recherche et Développement (R&D) Pharmaceutique est de développer de nouvelles molécules qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. Pour un candidat médicament, la R&D pharmaceutique vivo se doit de déterminer la fenêtre thérapeutique pour l’administration chez l’Homme, c’est-à-dire l’intervalle de doses entre lequel le candidat est à la fois actif et efficace et engendre le moins de toxicité possible. Pour cela, des études de toxicologie (incluses dans ce projet) ainsi que des études de pharmacologie (efficacité, mode d’action du candidat médicament) doivent être mises en place conformément à la réglementation. Les études préliminaires in vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet permettent de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître ainsi la fenêtre thérapeutique (marge de dose permettant une efficacité et absence de toxicité). Les données d’efficacité et de sécurité permettent ainsi conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament. Les études de ce projet concernent des candidats médicaments dont l’administration sera réalisée par administration intraveineuse chez le Rat via un cathéter implanté dans un vaisseau de large diamètre tel que la veine fémorale ou jugulaire (mimant l’administration chez l’Homme, ce qui diminue les risques d’intolérance locale par rapport à une administration périphérique dans un vaisseau de plus petit calibre et permettant des administrations répétées et/ou sur une longue durée sans aucune contention de l’animal). Elles interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo réglementaires) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après une première étape de caractérisation et de sélection des molécules in vitro (modèles cellulaires de neurotoxicité, d’hépatotoxicité, de cardiotoxicité...) et in silico (analyse informatique de la génotoxicité). Ces études sont réalisées chez le Rat (présentant une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et étant considéré comme le plus prédictif en toxicologie) en utilisant les candidats médicaments les plus prometteurs mais également les composés autres que le principe actif du candidat médicament qui seront utilisés pour la suite du développement afin de déterminer en parallèle leurs profils de sécurité s’ils n’étaient pas encore établis.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et du développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisés pour un projet de recherche) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires et d’évaluation pharmacologique qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet ainsi d’optimiser les études et de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament dans le cadre d’administrations via un cathéter. Les deux procédures de ce projet (et associées aux informations fournies par les études de pharmacologie) permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés pour un projet thérapeutique donné.

Procédures

L’ensemble des animaux inclus dans ce projet pourront être soumis : - A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) de composés via le cathéter (de quelques minutes jusqu’ à perfusion de 4 heures maximum) - A l’administration d’analgésique avant l’euthanasie (administration unique de quelques secondes) - A des prélèvements de sang en prélevant une faible quantité de sang prélevée à la veine marginale externe de la patte ou veine caudale sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude (30 secondes par prélèvement environ) - A des prélèvements via le cathéter dédié de courte durée et maximum 6 fois par jour à ces prélèvements si besoin de quantités répétées plus importantes - A des recueils urinaires d’une durée comprise entre 6h (cas standard) et 16 heures (cas exceptionnel) en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) avec diète hydrique d’une durée correspondant à celle du recueil (6h en standard et 16h maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère (en dessous du seuil réglementaire) au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • L’administration via le cathéter nécessite une contention douce quel que soit le système utilisé (VAB ou VAH) et le placement de l’animal dans une cage dédiée au traitement – Traitement hebdomadaire à une fois par jour pendant 4 semaines maximum – Durée de quelques minutes à plusieurs heures – Degré de sévérité modéré • Hébergement individuel : le cathéter implanté peut nécessiter la mise en place d’un harnais de protection sur l’animal. L’utilisation de ce système appelé VAH (Vascular Access Harness), qui sera limitée à son maximum, et mise en place seulement si le système VAB (Vascular Access Button) ne peut pas être utilisé, nécessite une stabulation individuelle des animaux de l’implantation jusqu’à la fin de la période de traitement puis du maintien des animaux (afin d’éviter la dégradation du dispositif par un congénère) ce qui peut générer un stress pour l’animal – Degré de sévérité modéré • Prélèvements de sang à la veine marginale externe de la patte ou à la veine de la queue : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (Degré de sévérité modéré). Placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux dans le cas d’un prélèvement à la veine de la queue (5 minutes – degré de sévérité modéré) • Recueil urinaire (cage à métabolisme) : Le changement d’environnement et l’hébergement individuel de courte durée (6h en prélèvement diurne en standard, exceptionnellement prélèvement nocturne inférieur à 16h, cas qui devra être justifié par le demandeur) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal – 1 seule fois par étude (Degré de sévérité léger) • Administrations sous-cutanées (analgésique) : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur (Degré de sévérité léger) - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance pour l’animal (impacts sur l’activité, état général, le poids corporel par exemple).

Devenir

Tous les animaux de la procédure ayant reçu une administration de candidat médicament (ou de formulation/véhicule) seront euthanasiés pour prélèvements et examens divers (histologie, toxicogénomique, etc…) puisqu’un des objectifs est de rechercher les organes cibles potentiels. Si les animaux cathétérisés venaient à ne pas être utilisés dans le cadre de ce projet ils seront euthanasiés pour prélèvement d’organes ou de fluides et mise au point (histologie, biologie clinique, études vitro par exemple).

Remplacement

Ce projet couvre la réalisation d’études très précoces réalisées sur l’ensemble des candidats médicaments de notre recherche (intervenant en complément d’autres études de sécurité non clinique décrites dans d’autres projets, et mises en place seulement si nécessité d’utilisation de cathéters pré-implantés des administrations centrales longues ou des composés non tolérés quand administrés par voie périphérique telle que la veine de la queue), études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. En effet, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo.

Réduction

Une sélection des molécules les plus prometteuses est réalisée à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel de rats (2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace pour atteindre les objectifs des procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus réduit possible (nombre éprouvé basé sur une solide expérience en interne et sur les recommandations de la littérature). Il permet d’intégrer de la mixité (nécessaire pour évaluer principalement la toxicité d’un composé sur l’appareil reproducteur mâle et femelle) dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Ces études permettent de confirmer ou d’infirmer les données obtenues grâce aux méthodes alternatives. Elles sont mises en place précocement et profitent des informations des études de pharmacologie réalisées en parallèle (développement de modèle et recherche du mode d’action du candidat médicament). Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études de pharmacologie, le développement de la molécule peut être arrêté évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un nombre d’animaux plus important. Elles permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque et l’impact en termes de bien-être pour les animaux. Un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporels, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour cinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, et à son issue prélèvements d’organes …) réduisant aussi le nombre de rats nécessaire dans chaque procédure. En cas de protocole particulier (ex besoin de suivre plus précisément un paramètre particulier) le service de biostatistiques sera sollicité pour définir le design expérimental le plus optimal. Enfin, l’utilisation du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale externe de la patte ou à la veine caudale) peu invasive, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre de rats (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant la volémie physiologique.

Raffinement

L’utilisation du cathéter pour l’administration Intraveineuse permet de réaliser les administrations uniques ou réitérées des substances étudiées sans contention de l’animal contrairement à une administration intraveineuse périphérique. De plus l’administration via un cathéter dans un vaisseau de gros calibre diminue les risques d’intolérance locale par rapport à une administration périphérique dans un vaisseau de plus petit calibre. L’une des voies d’accès au cathéter à l’extérieur de l’animal consiste en un harnais de protection du cathéter, réglé tous les jours pour s’adapter à la croissance du rat (impliquant une manipulation régulière du rat). La présence de ce harnais nécessite néanmoins l’hébergement individuel et nous privilégierons donc, une nouvelle voie d’accès au cathéter consistant en un bouton transcutané (permet l’hébergement collectif et donc un raffinement important). Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable d’étude, la Structure en charge du Bien-être animal (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase de traitement ou non, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique au rat qui est mise en place rapidement. Le personnel technique formé interagit tous les jours avec les animaux (manipulation) pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Pour les prélèvements de sang, la technique de prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale externe de la patte est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique, de respecter la volémie physiologique du rat et d’améliorer ses conditions de manipulation. La durée du recueil urinaire est limitée, réalisée en standard en journée sur une durée de 6h ou exceptionnellement sur une période nocturne

Choix des espèces

Les 2 procédures de ce projet sont réalisées sur l’espèce rat car elles interviennent en amont des études réglementaires réalisées sur ce modèle. Comme ces études permettent, en particulier, de choisir les doses et le schéma d’administration des études réglementaires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires obligatoires, elles doivent être réalisées sur le même modèle expérimental que celui des études réglementaires. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. Lorsque cela est possible, l’espèce rat doit répondre aux effets pharmacodynamiques du candidat médicament. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en parallèle chez la souris. Les animaux sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Placés jusqu'à trois fois par jour pendant six semaines dans un tube de contention, un manchon serré autour de la queue, 192 rats reçoivent aussi des composés hypertenseurs ou hypotenseurs par gavage deux fois par jour ou par injection trois fois par semaine. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente pourtant le dispositif de mesure comme "un raffinement en lui-même" parce qu'il est non invasif et indolore, tout en décrivant des hypotensions et des hypertensions provoquées pendant six heures d'affilée, une à deux fois par semaine. Aucun rat n'est déclaré tué dans ce projet, tous étant annoncés comme réutilisables dans d'autres protocoles après avis vétérinaire, ce qui prolonge leur exploitation au-delà de ces six semaines.

Objectifs

L’une des causes principales du retrait anticipé du marché ou de l’arrêt dans le développement d’un candidat médicament est la toxicité cardiovasculaire, quelle que soit sa classe thérapeutique. Pour répondre aux besoins des patients le plus rapidement possible en leur proposant des traitements les plus sécurisés, il convient de mettre en place des techniques d’évaluation de l’impact de ces candidats sur la fonction cardiaque. Dans les études nécessaires au développement d’un candidat médicament, le rat est un bon modèle pour l’évaluation précoce in-vivo de la fonction cardiaque car il présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme Des systèmes ont été perfectionnés pour pouvoir mesurer la pression sanguine de manière non invasive et avec une précision importante chez le Rat. Parmi les différentes approches, la méthode d’oscillométrie consiste en un manchon placé sur la queue de l’animal et relié à un logiciel d’acquisition qui permet d’analyser la pression sanguine (similaire à la méthode utilisée classiquement en médecine humaine). La pression sanguine par oscillométrie n’est pas encore mesurée dans notre laboratoire chez le rat. Afin d’évaluer si un nouveau système d’oscillométrie (choisi car non invasif, indolore et ayant démontré de bons résultats dans la bibliographie) peut être utilisé dans nos études de sécurité non clinique pour déceler précocement in-vivo d’éventuels impacts de nos candidats médicaments sur la fonction cardiovasculaire, il faut le tester et le valider. Après une première étape de mise au point consistant à de la recherche bibliographique (synthèse des données de la littérature) et comparaison avec les données obtenues avec le système en faisant varier certains paramètres influençant la pression (non détaillé ici car en dessous du seuil réglementaire), ce projet aura donc pour objectif : - d’évaluer l’impact d’une administration (eau ou sérum physiologique) sur la pression sanguine : nécessaire pour différencier l’impact éventuel de l’administration en elle-même de celui des composés administrés dans la deuxième étape - puis de valider le système en comparant les données de pression sanguine obtenues sur des rats traités avec des composés de référence ayant un effet direct hypertenseur ou hypotenseur connu ou indirect par modification de l’hémodynamique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et du développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. En mettant au point et en validant une méthode d’investigation précoce de la pression sanguine chez le rongeur, le bénéfice escompté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments. En incluant cette méthode d’investigation, qui plus est non invasive et non douloureuse, dans les études de sécurité non clinique, un profil de sécurité plus complet du candidat médicament pourra être déterminé. En effet, l’investigation de toxicité cardiovasculaire est déjà réalisée mais seulement à des étapes ultérieures du développement. Grâce à ce projet, si le candidat médicament devait avoir un effet sur la fonction cardiovasculaire, celui-ci pourra être décelé très précocement. Cette approche permettra ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans les études de sécurité non clinique ultérieures en s’assurant de la bonne tolérance des candidats médicaments. Cette technique contribuera à sélectionner les meilleurs candidats ou arrêter les candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés pour un projet, en utilisant qui plus est une méthode non invasive d’investigation. De plus le dispositif nous permettra d’accéder à des données de contractilité (paramètre qui définit la performance de contraction du muscle cardiaque) sans avoir à réitérer de mesure dédiée : ces données seront comparées à des données in vitro obtenues après test des mêmes composés hypotenseurs ou hypertenseurs sur des cellules cardiaques. Ainsi, l’un des autres bénéfices du projet est d’apporter des données pour développer un modèle de corrélation vitro-vivo de la contractilité, pour à terme mettre au point des méthodes alternatives vitro plus précoces pour évaluer l’impact des candidats médicaments sur la contractilité cardiaque.

Procédures

A l’administration de composés par voie orale (2 fois par jour max pendant 6 semaines) ou par injection (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée 3 fois/semaine max pendant 6 semaines) sur animal vigile. - A des mesures de pression artérielle non invasive nécessitant une contention légère de quelques minutes dans un tube à contention au maximum 3 fois par jour pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir : • Administration orale : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 1 fois par jour pendant 6 semaines) (Degré de sévérité modéré). • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (38 degrés maximum) (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée au rat (2min maximum) peuvent générer du stress ; l’injection peut générer de la douleur due à la piqure (maximum 3 fois par semaine pendant 3 semaines) (Degré de sévérité modéré). • Autres administrations par injection : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur due à la piqure (maximum 3 fois par semaine pendant 6 semaines). Degré de sévérité léger pour une administration unique ou modéré si l’administration est réitérée. • Les composés administrés pourront induire des effets hypotenseurs ou hypertenseurs transitoires modérés (6 heures maximum 1 à 2 fois par semaine, pendant 6 semaines) et donc une nuisance pour l’animal

Devenir

Les animaux de l’étape de mise au point pourront être inclus dans les études de la deuxième étape utilisant des composés hyper ou hypotenseurs. Tous les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet si la gravité réelle des procédures expérimentales sont au maximum de classe modérée, et après récupération complète de l’animal et avis favorable du vétérinaire

Remplacement

Ce projet va permettre de mettre au point une technique non invasive de mesure de la pression artérielle et nécessite l’utilisation d’animaux pour mimer au mieux les processus physiologiques retrouvés chez l’Homme. En effet, il n’existe pour le moment pas de méthode alternative suffisamment complexe pour mimer de manière optimale les paramètres de pression sanguine. Ce projet permettra aussi d’apporter des données pour développer un modèle de corrélation entre les données mesurées chez l’animal in vivo et des données in vitro de contractilité des cellules cardiaques, pour à terme mettre au point des méthodes alternatives plus précoces pour évaluer l’impact des candidats médicaments sur la contractilité, et remplacer l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les études incluses dans ce projet visent à développer un système de mesure précoce de la pression sanguine chez le rat. Elles aideront à l’inclusion d’un examen paraclinique supplémentaire dans les études de sécurité non clinique, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : si un effet d’un candidat médicament sur la pression sanguine est décelé à l’aide du système d’acquisition mis au point dans ce projet, cela pourra contribuer à l’arrêt anticipé du candidat médicament évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Un nombre important de mesures de la pression sanguine pourra être réalisé sur un même animal, le système étant non invasif, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire dans chaque procédure de ce projet pour générer des données consolidées. Dans les procédures, chaque animal sera son propre contrôle. Les composés de référence utilisés sont connus pour avoir une élimination rapide de l’organisme (quelques heures). De cette manière et après avoir respecté une période de récupération entre chaque administration, un animal donné pourra recevoir plusieurs composés différents ou des doses différentes d’un même composé, ce qui évite de multiplier le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les rats pourront ainsi être utilisés dans plusieurs études ou procédures successives. De plus, de la mixité male/femelle sera intégrée dans chaque groupe sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Une fois l’étude réalisée, nous utilisons uniquement des statistiques descriptives (calcul de médiane, variance, écart-type, comparaison aux valeurs basales et aux données de la littérature) et au cas par cas de tests statistiques avec le support du service de biostatistiques.

Raffinement

Le système de mesure de la pression sanguine est un raffinement en lui-même car non invasif et pouvant être appliqué plusieurs fois sur un même animal vigile ce qui limite les contraintes pour l’animal par rapport à d’autres techniques plus invasives (cathétérisation artérielle par exemple). Les animaux sont manipulés et seront habitués à la mesure de pression sanguine (augmentation progressive du temps passé dans le tube de contention). L’ensemble du personnel technique sera formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Les recommandations de la SBEA sur les voies volumes et fréquences des administrations chez le rat seront appliquées. Les rats seront surveillés tous les jours et de manière très approfondie durant les phases d’activité des agents hypertenseurs ou hypotenseurs nécessaires aux mesures. Seules des doses provoquant des hypertensions ou hypotensions modérées et transitoires (quelques heures maximum) seront administrées. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision rapide est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure de bien-être animal et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Une liste de points limites standards est mise à disposition. Tous les animaux sont stabulés en groupes avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Pendant l’habituation et après chaque mesure, une récompense (type graine de tournesol) sera distribuée à chaque animal.

Choix des espèces

Le rat est l’un des modèles les plus représentés car il présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et est ainsi considéré comme un modèle prédictif en toxicologie (modèle rongeur utilisé dans les études règlementaires). De plus, le rat est un excellent modèle pour l’évaluation de la fonction cardiovasculaire car il mime les processus physiologiques de la pression sanguine retrouvés chez l’Homme. C’est ainsi le modèle le plus adapté pour mesurer la pression sanguine de manière non invasive et générer des données consolidées et reproductibles. Les rats utilisés seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures dans lesquelles seront mise en place le suivi de la pression sanguine.

Contenus jusqu'à quatre heures pour des perfusions intraveineuses, parfois hébergés seuls pour éviter les contaminations, 302 macaques subissent des administrations quotidiennes ou hebdomadaires et des biopsies sous sédation. 256 macaques crabiers et 46 macaques rhésus sont concernés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente ces études exploratoires comme se faisant "avec peu d'animaux", au motif qu'elles sécurisent des études réglementaires plus lourdes. 70 d'entre eux pourront être gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, les 232 autres sont tués, en partie pour l'analyse histopathologique de leurs organes.

Objectifs

Ces études permettent d’établir ou de confirmer les homologies biologiques entre le primate non humain et l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce), en préparation ou en complément des études réglementaires. Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé pharmaceutique avec pour but d'assurer la santé des patients. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans l'espèce primate non humain. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le primate non humain. Lorsqu'elles sont réalisées avant le démarrage d'études réglementaires avec des conditions particulières (voie d'administration ou investigations particulières), ces études préliminaires avec peu d'animaux permettent d'assurer le succès des études règlementaires qui nécessitent des nombres plus importants d'animaux, en évitant ainsi le risque de devoir les répéter.

Bénéfices attendus

Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de choisir les doses dans les premières études règlementaires. Elles permettent également, lors de criblages, de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans l'espèce primate non humain. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée. Les études exploratoires peuvent également être conçues pour montrer l’efficacité d’un produit, s’il est possible de l’étudier dans un modèle animal sain. En amont des études règlementaires, ces études préliminaires, avec peu d'animaux, permettent souvent d'assurer le succès des études règlementaires qui nécessitent des nombres plus importants d'animaux, en évitant ainsi le risque de devoir les répéter.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (ex : orale, injection intramusculaire) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 4h maximum dans le cas de perfusion intraveineuse. Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile sont peu invasifs (ex : sang, par les voies veineuses périphériques) et nécessitent une contention de courte durée (jusque 4h maximum pour des perfusions intraveineuses). Pour les prélèvements nécessitant une sédation et/ou une anesthésie (ex. biopsie), l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Pour certaines études (rares), un hébergement individuel peut être requis pour collecter des données individuelles ou éviter les contaminations d'un animal à l'autre.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement : -aux effets du produit administré -à l’inconfort généré par les procédures -aux prélèvements sur animaux vigiles : stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant -à la sédation/anesthésie générale -aux prélèvements comme les biopsies - Stress lors de contraintes occasionnelles liées à la procédure d’administration (ex : administration répétée) et à l’hébergement, notamment lors d’hébergement individuel, et de contentions le cas échéant, pour la réalisation de certains examens (ex : ECG).

Devenir

Les études de toxicologie peuvent inclure une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Les animaux pour lesquels aucune analyse histopathologique n'est nécessaire, et pour lequels des effets limités du traitement ont été observés peuvent être gardés en vie, et possiblement être réutilisés dans un autre projet après une période de récupération et sous réserve d'accord du vétérinaire.

Remplacement

L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament et/ou d’un dispositif médical ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Dans certains cas, l'espèce primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques (similarités physiologiques ou métaboliques Homme-primate non humain), par exemple dans le cas de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les prélèvements et la sensibilité des méthodes analytiques sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux. En se basant sur des tests statistiques, comprenant à minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (ex : graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté dans le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix du primate non humain est justifié par : - les homologies avec l'homme - la disponibilité d'études préliminaires sur cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie… Certains composés biologiques ciblant le système immunitaire [anticorps monoclonaux, protéines et vaccins thérapeutiques (anti-cancer, anti-Alzheimer…)] doivent être testés chez le primate non humain (espèce non-rongeur avec le système immunitaire le plus proche de l'Homme). Le choix de l’espèce de primate (Macaca fascicularis, Macaca mulatta) est le plus souvent déterminé par des études in-vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’homme. La pharmacocinétique du candidat médicament est également prise en compte, ainsi que les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique. Les macaques (crabiers ou rhésus) sont les seules espèces de primates utilisées dans les études de toxicologie réglementaire. Les animaux sont généralement âgés de 2 à 4 ans. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (par exemple nouveau produit contraceptif, des anticancéreux, des immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal un peu plus jeune (20 mois minimums).

Jusqu'à 40 ml de sang prélevés chaque mois sur animal conscient, ou une heure de contention sous des cages de moustiques qui se gorgent directement sur leurs oreilles, jusqu'à trois fois par semaine : 44 lapins vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur sang entretient des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques, et alimente les tests d'insecticides et de répulsifs menés en santé publique. Le porteur indique que la contention peut mettre les lapins en état de stress, avec yeux exorbités, râle et souffle court, et que des lésions aux oreilles apparaissent quand les tentatives de prélèvement échouent. Ceux qui atteignent quatre ans sont proposés à l'adoption, soit la moitié de l'effectif, les autres restant en vie pour la reconduction du même projet. L'espèce a été retenue notamment parce que les lapins cessent vite de réagir aux piqûres de moustiques, à la différence de l'être humain.

Objectifs

Nos travaux portent sur les insectes et arachnides responsables de la transmission de maladies infectieuses. De ce fait, nous avons des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques. Nous avons besoin d'avoir accès à une source de sang pour maintenir ces élevages car cela permet à ces animaux de produire leurs œufs ou de croître. De plus, les moustiques, phlébotomes et tiques sont également utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines. Ainsi, les prélèvements sanguins peuvent également servir pour infecter ces insectes et archnides avec des virus ou des parasites et ainsi simuler la transmission de maladies. Egalement, dans le cadre des évaluations d’insecticides et/ou répulsifs utilisés en santé publique, l'efficacité de ces produits peut être démontré parce qu’ils empêchent la piqûre ou permettent de contrôler la population de vecteurs. L’objectif global de ce projet est le gorgement des moustiques, pblébotomes, tiques : - à des fins de production - à des fins d’expérimentations

Bénéfices attendus

La reproduction des insectes et archnides effectuée en laboratoire permet de maintenir les souches et ainsi de les utiliser dans les différents projets. Les élevages sont utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines : 1. évaluation des insecticides utilisés en santé publique dans le cadre d’expertise ou de recherche. 2. évaluation de nouvelles formules d’insecticides pouvant donner lieu à des dépôts de brevets 3. recherche sur les maladies infectieuses transmises par ces insectes et arachnides 4. études sur le comportement de ces insectes et arachnides 5. autre objectif : fournir d'autres laboratoires et instituts pour des expérimentations et/ou des modules d'enseignement. Ces axes de recherche sont des voies importantes pour mettre en œuvre des moyens de protection efficaces contre les maladies transmissibles via ces insectes et archnides, tel le paludisme, transmis par les moustiques, qui fait chaque année de 1 à 3 millions de morts.

Procédures

Un prélèvement sanguin régulier sur animal conscient sera effectué sur une partie des lapins. Ils seront prélevés entre 1 à 2 fois par mois selon les demandes. Généralement, les lapins seront prélèvés mensuellement de maximum 40 ml de sang puis mis en repos pour 4 semaines. La durée du prélèvement en lui-même est d’une dizaine de minutes. L’autre partie des lapins sera mis régulièrement en contention pendant 60 min maximum afin que les moustiques (disposés en cages) puissent se gorger directement sur les oreilles des lapins. La fréquence sera entre 0 et 1 fois/semaine pour les gorgements simples (annuel) et entre 1 à 3 fois/semaine pour les gorgements liés aux évaluations insecticides utilisés en santé publique (entre 3 à 6 mois d’évaluation/an maximum). Il n’y a pas de gorgement direct pour les phlébotomes et tiques.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de gorgement direct sur lapin, celui-ci peut être en situation de stress (yeux exorbités, râle, souffle court…). De plus, la piqûre par des moustiques en direct représente également une nuisance, même sans effet visible d’inflammation ou de grattage. Les lapins prélevés, quant à eux, peuvent présenter des lésions au niveau des oreilles si les tentatives de prélèvements sont infructueuses.

Devenir

les animaux ayant atteint environ 4 ans seront mis à la retraite et proposés à l’adoption soit la moitié de l'effectif prévu. Les animaux ayant moins de 4 ans seront maintenue en vie en vue d'un nouveau dépôt du même projet scientifique (utilisation continue).

Remplacement

Les élevages de moustiques, phlébotomes et tiques nécessitent du sang pour produire des œufs ou leur croissance. À ce jour, il n’existe pas d’alternative totalement sans sang ou utilisant un sang artificiel, bien que des projets soient en cours pour explorer d’autres options, notamment pour les moustiques. Gorgement sur lapin : Les signaux émis par un animal permettent de reproduire les conditions naturelles et d’assurer un gorgement efficace. Les systèmes de gorgement artificiel (sang prélevé) ne conviennent pas toujours, notamment pour des études comportementales ou des tests de répulsifs/insecticides, car ils ne reproduisent pas tous les facteurs naturels nécessaires (comme le CO₂ ou l’acide lactique). Gorgement artificiel : Le sang acheté auprès de fournisseurs externes comporte un faible risque de contamination par des pathogènes ou des molécules (médicaments, vermifuges), ce qui peut nuire aux élevages. En revanche, le sang prélevé sur des lapins dans l’animalerie est contrôlé, exempt de pathogènes et sécurisé. Lors de traitements, les lapins concernés sont temporairement exclus. De plus, le sang prélevé destiné aux infections expérimentales doit être prélevé dans les 24 heures avant l’expérimentation.

Réduction

Pour les gorgements direct de moustiques avec lapin en contention, nous avons optimisé l'utilisation des lapins en limitant à deux lots de trois lapins, chaque lot utilisé une seule fois par semaine (lundi et vendredi). Nous n'utilisons qu'un lapin par insectarium (souches sensibles et résistantes), soit deux lapins, avec un troisième en réserve en cas d'agitation. Cela minimise le nombre de lapins. Nous avons également adopté des pratiques pour réduire le nombre de prélèvements. Pour les moustiques sains, le sang est réutilisé une seconde fois, diminuant les prélèvements. Bien que cela ne soit pas applicable aux repas infectieux, cela réduit la fréquence d’utilisation des lapins. Nous privilégions le gorgement artificiel sur membrane lorsque possible, réduisant ainsi le besoin de lapins en contention chaque semaine. Nous jugeons que le stress hebdomadaire de la contention est plus important que celui d’un prélèvement mensuel, d’où notre effort de réduction. Trois lapins par semaine suffisent pour obtenir 120 ml de sang, avec un roulement de 12 lapins pour leur repos et un lapin en cas de prélèvement infructueux, soit un lot total de 13 lapins. Pour l’évaluation des insecticides sur moustiques, trois lapins sont utilisés par lot : un pour les moustiques témoins, un pour les moustiques traités, et un troisième en réserve. Chaque lapin peut être utilisé une à trois fois par semaine, réduisant ainsi la nécessité d'en introduire de nouveaux. De plus, après deux jours, la majorité des résidus absorbés est excrétée, permettant de réutiliser les mêmes lapins sans risque de contamination. Enfin, l'expérience montre que les lapins peuvent être utilisés pour les prélèvements et les piqûres de moustiques jusqu'à un âge avancé (mais nous procéderons à une mise à la retraite aux alentours des 4 ans). Cela prolonge leur utilisation et évite le renouvellement fréquent des lots, participant ainsi à la réduction globale du nombre de lapins utilisés pour nos élevages et études.

Raffinement

Cliquez ou appuyez ici pour entrer du texte. Bien-être des lapines en animalerie : Des enrichissements comme des rondins de bois et blocs de sel (moins appréciés) ont été introduits pour permettre aux lapines de jouer ou ronger. Deux parcs ont été installés, offrant à chaque lapine une sortie hebdomadaire d'une demi-journée en rotation. Les lapines, hébergées par deux, sont regroupées dès leur arrivée, mais en cas d’agressivité, elles sont logées individuellement tout en pouvant se voir et se sentir à travers des parois en plexiglas. Dans ce cas, des enrichissements variés et des sorties fréquentes au parc favorisent leur sociabilisation. Gorgement direct : Les lapines destinées au gorgement direct sont installées dans une pièce calme, éloignée des bruits et du passage du personnel. Des panneaux signalent leur présence pour limiter les perturbations. Les gorgements se déroulent dans une pièce sombre afin de maintenir leur calme, et des friandises leur sont offertes après la contention. Prélèvements sanguins : Les prélèvements se font sur des animaux conscients, évitant l'anesthésie générale. Un délai de récupération de 2 à 4 semaines est respecté entre chaque prélèvement, selon la quantité de sang prélevée. Une crème anesthésiante (lidocaïne) est appliquée sur leurs oreilles 15 à 30 minutes avant le prélèvement. Après l’intervention, les oreilles sont nettoyées avec un antiseptique, puis une crème cicatrisante est appliquée avant de replacer les lapins dans leur hébergement. Retraite et adoption : Une mesure de raffinement envisagée est de fixer une mise à la retraite des lapines à l’âge de 4 ans, avec une proposition pour leur adoption

Choix des espèces

Cette espèce a été choisie pour sa taille et facilité de manipulation. Les lapins sont suffisamment gros pour supporter la prise de sang par les femelles moustiques contrairement aux petits rongeurs et sont plus faciles à manipuler et élever que des gros mammifères. De plus, ils permettent des prélèvements sanguins d'un volume plus important par rapport aux rongeurs. Leur facilité de mise en contention évite également le recours à l'anesthésie. Il est également à noter que les lapins ne présentent rapidement plus de réaction inflammatoire suite aux piqûres de moustiques (désensibilisation rapide), contrairement à l'Homme. Les lapins arrivent généralement à l'animalerie lorsqu’ils sont agés de 19 semaines. Ils ne sont utilisés que lorsqu'ils atteignent le poids de 3,5kg.