Toxicologie (hors obligations réglementaires)

10 macaques à longue queue, des primates âgés de 2 à 5 ans, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyser la distribution des vecteurs viraux dans leur organisme. Au cours d'une même chirurgie d'environ quatre heures, chacun reçoit une injection dans l'œil, une dans l'oreille interne et une dans une veine, puis subit éveillé, dans un système de contention, jusqu'à une prise de sang par jour pendant sept jours. Il s'agit de choisir, avant des études de toxicologie réglementaire, les vecteurs AAV qui portent le mieux une protéine sensible à la lumière jusqu'à la rétine, l'oreille interne, le cerveau ou l'estomac, en vue de thérapies optogénétiques. Le porteur cite parmi les risques rares de l'injection dans l'œil une hémorragie du vitré, des déchirures et un décollement de la rétine, et pour l'injection dans la cochlée des troubles de l'audition et de l'équilibre. Il écrit que réunir les trois voies sur les mêmes macaques divise leur nombre par 3 à 4 "sans introduire de charge supplémentaire pour l'animal individuel".

Objectifs

Le projet est une étude préliminaire visant sélectionner des vecteurs viraux AAV permettant d’apporter à un type de cellule une molécule thérapeutique sensible à la lumière. Cette sélection sera faite d’après l’affinité de ces vecteurs pour les organes cibles (oreille interne, rétine, estomac, cerveau), ainsi que leur distribution dans l’organisme. L’étude sera effectuée comme une étude de toxicologie pour évaluer tout effet potentiellement toxique. La sélection sera faite après leur administration intraoculaire, dans l'oreille interne et intraveineuse au cours d’une même anesthésie chez le macaque fascicularis. Les vecteurs viraux AAV sont dérivés d'un virus non pathogène et sont couramment utilisés dans la recherche biomédicale afin de développer des thérapies chez l’humain. Ils permettent une transduction efficace de nombreux types de cellules de mammifères et une expression génétique stable après un seul traitement d’un ou plusieurs gènes, ce qui permet de compenser un déficit génétique. Les protéines sensibles à la lumière sont utilisées pour développer la thérapie optogénétique, une méthode prometteuse pour compenser la perte des cellules de la rétine ou de restaurer l’audition via des implants intra-auriculaire chez des patients atteints de surdité. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les vecteurs viraux les plus prometteurs dans le développement de thérapies optogénétiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

Il permet de sélectionner les vecteurs viraux capbles de transduire efficacement dans les différents cellules et tissus cibles pour la réalisation d’études de toxicologie règlementaire prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III chez l’humain

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'environ 4h et pendant laquelle une injection dans l'oeil, une injection dans l'oreille interne et une injection intraveineuse du produit testé seront effectués successivements. Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang effectués vigiles, dans un système de contention adapté, à raison d'un par jour au maximum sur 7 jours. Le prélèvement de sang dure quelques minutes. Un prétraitement sous forme d'une perfusion pourra être effectué selon des résutlats préliminaires, d'une durée maximal de 2h.

Impact sur les animaux

Quatre catégories de nuisances peuvent être provoquées chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises en compte de manière préventives pour réduire leur impact. 1)Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des primates. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaire mais cela peut néanmoins engendrer un stress chez ces espèces non domestiques 2) Liées à la chirurgie : un risque de nuisance modérée pour les animaux (inflammations, douleurs opératoires et post opératoire, etc) est possible 3) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang, peut provoquer des lésions locales (hématomes) et un stress modéré des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque d’infection lors d’administration dans la cochlée ou l’œil. Enfin, dans de rares cas, l’injection intravitréenne peut entrainer une augmentation de la pression intraoculaire, hémorragie du vitré, déchirures et décollement de la rétine, inflammation intraoculaire et endophtalmie et l’administration intra cochléaire peut provoquer des troubles auditifs et de l’équilibre se traduisant par exemple par des maux de tête ou des nausées. 4) Liées à une toxicité du mélange de vecteurs testés : ce type de nuisances est difficilement estimable, mais semblent faibles selon les données scientifiques des études chez d’autres espèces. Si des effets toxiques apparaissent, ils seront liés à la biodistribution des vecteurs dont l’évaluation est le but de cette étude.

Devenir

Les animaux utilisés seront euthansiés pour procéder à une analyse de la distribution des vecteurs dans l'organisme.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ce type étude, qui visent à sélectionner des variants de vecteurs viraux les plus efficaces pour poursuivre le développement de thérapies optogénétiques. Il faudra pour cela pouvoir modéliser un organisme entier, ce qui n'est pas réalisable pour le moment avec les méthodes alternatives existantes.

Réduction

L’utilisation d’un male et d’une femelle par lot est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données. L’administration successive des variants AAV chez les mêmes animaux a pour but de réduire le nombre d’animaux d’un facteur 3 à 4 (par rapport à un criblage séparé pour chaque voie d’administration), sans introduire de charge supplémentaire pour l’animal individuel. Les 3 voies d'administrations n'interfèrent pas ensemble car chaque vecteur est identifié par un code spécifique. Les principaux organes cibles sont les cellules cilliées auditives, la rétine, le cerveau et l'estomac, d’où les 3 vois d'administration.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 15-21 jours est respectée à réception des animaux, suivie de 1- 2 semaines de training. Les animaux bénéficient d’un programme de training par renforcement positif pour réduire le stress/favoriser la coopération (habituation aux systèmes de contention -boîtes taxi, chaises, gilets- et manipulations progressives reproduisant les gestes techniques de l’étude). Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animal est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase de suivi après l’administration. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des primates vigiles (boîte taxi, chaise à contention). Les volumes prélevés/administrés respectent les guidelines vétérinaires. Concernant les administrations : ce sont des voies standard en médecine humaine. Elles seront effectuées sous anesthésie et analgésie par des chirurgiens expérimentés ayant pratiqués ces chirurgies chez l’humain et différents modèles animaux. La réalisation de l’ensemble des administration en une seule anesthésie limite l’accumulation des anesthésies et permet d’évaluer à modérée le degré de sévérité.

Choix des espèces

Le macaque fascicularis est une espèce reconnue pour son aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de produits à visée thérapeutiques humains pour des produits thérapeutiques dont la cible est la plus proche de l’humain, ce qui est le cas pour les structures oculaires et auditives. De plus, les variants AAV sélectionnés sur des modèles murins pour ce type de thérapies se révèlent souvent peu efficace chez le primate humain et non humain, ce qui explique la nécessité de passer par un primate non humain pour les sélectionner plus finement. Il convient d’utiliser de jeunes animaux sains ; les macaques sont utilisés à partir de 2 ans, et jusqu'à 5 ans.

Une partie des souris utilisées est immunodéprimée par construction, pour accepter la greffe de tumeurs humaines. 2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, portant chacune une tumeur greffée sur animal vigile. Elles reçoivent jusqu'à trois injections du composé à tester, des mesures de tumeur au moins deux fois par semaine, plusieurs prélèvements sanguins sur animal vigile, puis un prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil que le porteur décrit comme pouvant provoquer un arrêt cardiaque. 540 d'entre elles pourront être réutilisées, et les souris jamais entrées en protocole sont utilisées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de caractériser ensemble ou indépendamment les paramètres de candidats médicaments de type thérapie ciblée anticancéreuse chez la souris porteuse de tumeur au niveau pharmacocinétique (PK) c’est à dire le devenir du candidat médicament dans le sang au cours du temps, pharmacodynamique (PD), son effet sur l’organisme, et de biodistribution (BioD), sa distribution dans l’organisme. Ces composés, développés dans le cadre de thérapies ciblées anticancéreuses pour l’Homme, nécessitent une évaluation complète de leur comportement in vivo afin d’optimiser les futures études d’efficacité et de tolérance. L’étude PK sera réalisée selon une méthode d’échantillonnage conventionnel ou la méthode de micro-échantillonnage, avec des volumes de sang total prélevés concordants avec une limite réglementaire de 7.5 % du volume sanguin total par semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes. Des prélèvements d’organes et de tumeurs pourront également être effectués à différents temps post-administration afin d’étudier la biodistribution du composé et leur impact sur les tissus (PD). Ces données permettront de déterminer la répartition tissulaire du composé, d’identifier les éventuels organes cibles ou de stockage, et de corréler ces observations avec les effets pharmacodynamiques observés. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), la stratégie d’échantillonnage (PK) ainsi que les groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) (PD/BioD) seront optimisés. Cela permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe cinétique et des données de biodistribution et de pharmacodynamie à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer ensemble ou indépendamment des données précliniques de pharmacocinétiques, de biodistribution tissulaire et d’activité pharmacodynamiques de candidats médicaments de type thérapie ciblée anticancéreuse. Les résultats attendus permettront d’identifier les profils d’exposition systémique, la répartition dans les tissus cibles, ainsi que les effets biologiques induits par ces composés dans les organes sains et les tumeurs. L’intégration potentielle de ces trois paramètres dans une même étude permettrait une compréhension globale et rigoureuse du comportement in vivo de ces candidats, permettant (1) de continuer d’en optimiser les propriétés (2) d’orienter la sélection de composés ayant la meilleure fenêtre thérapeutique et (3) d’anticiper/optimiser les schémas posologiques (dose, fréquence, voie d’administration). En intégrant des approches de réduction du nombre d’animaux (via le suivi longitudinal sur un même individu et l’utilisation ciblée de groupes satellites), ce projet s’inscrit pleinement dans une démarche éthique et scientifique rigoureuse. À terme, les données générées contribueront à accélérer le développement de thérapies ciblées innovantes contre le cancer, avec un fort potentiel de transposition vers l’Homme grâce à la pertinence translationnelle du modèle utilisé.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Prise de mesure des tumeurs sur souris vigiles minimum deux fois par semaine et quotidiennement en cas d’approche des points limites (2-3 minutes), # Injection des composés sur souris vigile (1-3 minutes_maximum 3 fois) # Un prélèvement sanguin intermédiaire sur souris vigile (2-3 minutes_plusieurs fois), # Un prélèvement de sang terminal sur souris sous anesthésie et analgésie générale sans réveil (2-5 minutes_ 1 fois).

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie fixe ou gazeuse. # Les animaux vigiles subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale, (2) de l’injection des composés et (3) de prélèvements sanguins intermédiaires. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs minutes lors d’un prélèvement de sang terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, sous anesthésie et analgésie générale sans réveil. »

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation#50826 avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et de distribution, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle de souris.

Réduction

Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3Rs. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux par groupe (4 à 5) a été défini sur la base d’une analyse de puissance statistique, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. Dans les cas où des prélèvements tissulaires seront nécessaires pour les analyses de biodistribution et de pharmacodynamie, des groupes satellites pourront être utilisés de manière ciblée, uniquement aux temps les plus pertinents, et en nombre restreint. Cette approche permettra de limiter les duplications inutiles tout en assurant la qualité des données biologiques collectées. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, bâtons à ronger…). Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscrits afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de celluloses et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’environ une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure seront effectuées au moins deux fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel, du volume tumoral et de la qualité de la tumeur. Cette surveillance sera renforcée à l’approche des points limites. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogènes, mieux vascularisées et de limiter les nécroses tumorales. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Ainsi les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Il est à noter que le phénotype «immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Choix des espèces

#Les études pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et de distribution nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). De plus, les souris immunocompétentes ou immunodéprimées sont des espèces pertinentes pour la greffe de tumeurs murines ou humaines. Enfin, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. #Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’Etablissement Utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte.

Un prélèvement sanguin terminal qui peut provoquer un arrêt cardiaque, pratiqué sous anesthésie sans réveil, c'est la fin prévue pour la plupart des 3 870 souris de ce projet, utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. 774 d'entre elles sont réutilisées ailleurs, celles qui n'entrent pas dans le protocole étant reversées à l'entraînement du personnel aux gestes techniques. Greffées de tumeurs, injectées dans la veine de la queue, elles subissent des prélèvements répétés destinés à mesurer combien de temps un candidat médicament anticancéreux reste dans le sang et à quelle dose il devient toxique. Le porteur revendique là une "avancée majeure dans le respect des 3R", ces souris humanisées remplaçant selon lui les primates non humains habituellement utilisés pour ce type de composés.

Objectifs

Ce projet consiste à mettre au point des modèles d'étude de toxicocinétiques non réglementairement pour des candidats médicaments de thérapies anticancéreuses ciblées par des antiticorps. Ces modèles de souris permettront ainsi de remplcer d'autres éspèces plus grandes (commes les primates non humains généralement utilisé pour les études de toxicocinétiques de ce type de composés), tout en étant plus pertinents que ces derniers. # Les études de toxicocinétiques sont les études précliniques les plus importantes pour pouvoir accéder à une première étude clinique sur l’homme pour de nouveaux candidats médicaments. Elles consistent à interpréter en parallèle les effets toxiques et l’exposition sanguine de candidats médicaments et ainsi à définir les paramètres de dose, de distribution et d’élimination qui peuvent être utilisés dans l’évaluation des risques pour l’homme. # Ce projet ce divise en trois parties distinctes: (1) Une mise au point et preuve de concept du modèle constituée d’une étude de toxicocinétique sur un médicament de référence connu, testé à une dose forte, en comparaison direct sur les différents modèles testés. Cette étape permettra de comparer les données sur l'ensemble des modèles avec leurs contrôles. (2) Des études de toxicocinétique de candidat médicament en injection unique à trois doses (faible, moyenne et haute) sur les modèles retenus lors de la preuve de concept. Cette étude sera répétable pour 3 candidats médicaments. (3) Des études de toxicocinétique de candidat médicament en injections répétées et à trois doses (faible, moyenne et haute), sur les modèles retenus lors de la preuve de concept. # L'ensemble de ces études réalisées précocement sur des modèles simples et pertinents permettront d’éviter des essais réglementaires lourds si des toxicités majeures sont identifiées précocement. Elles sont cruciales pour les médicaments comme les anticancéreux.

Bénéfices attendus

​Il s'agit ici d'un protocole de mise au point et d'utilisation de modèles de substitution à l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées aux composés anticancéreux dérivés d'anticorps. Les études toxicocinétiques de composés thérapeutiques sont essentielles pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine (temps de demi-vie, biodisponibilité, clairance, exposition plasmatique…), et à relier ce comportement à des effets toxiques pour établir des relations dose-effet pour prédire la toxicité chez l’humain de définir des marges de sécurité et déterminer un choix de dose dans les premiers essais cliniques chez l’homme. La mise au point de nouveaux modèles à la fois plus éthique, plus fiables et plus pertinents pour préparer au mieux une phase clinique chez l’homme est une priorité mondiale, récemment annoncées par les autorités de controle des médicaments. Les modèles murins testés ici permettront, non seulement de substituer l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées à ce type de composés, mais également de leur être supérieur en matière de pertinence (modèles porteurs de tumeur) et de calcul des doses cliniques (modèle humanisé pour le récepteur aux anticorps), constituant ainsi une avancée majeure dans le respect des 3R dédiés aux thérapies anticancéreuses dérivées d’anticorps.

Procédures

Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésies fixes ou gazeuses. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors: (a) de la greffe tumorale, (b) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue des candidats médicament, et (c) de chacun des prélèvements sanguins. # Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. # Un prélèvement de sang terminal, sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil pouvant durer plusieurs minutes.

Impact sur les animaux

​​# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésies fixes ou gazeuses. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors: (a) de la greffe tumorale, (b) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue des candidats médicament, et (c) de chacun des prélèvements sanguins. # Les souris ayant des tumeurs atteignant les points limites seront mises à mort. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les candidats médicaments peuvent induire des évènements indésirables en cas de surdosage (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, neutropénie, diarrhées, perte de poils…). Ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal, la dose maximale de cette étude étant plafonnée à une dose considérée comme la mieux tolérée en clinique pour cette classe thérapeutique. # Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. # Un prélèvement de sang terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil pouvant durer plusieurs minutes.

Devenir

# La majorité des animaux entrés en experience, seront euthanasiés après un prélèvement sanguin terminal (sous anesthésie/analgésie générale, profonde et sans réveil), pour permettre une étude toxicocinétique du composé dans le sang, une numération, formulation sanguine, une chimie du sang, une étude de biomarqueurs plasmatiques et des prélèvements d'organes. # Les animaux non entrés en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à celui désiré, tumeur inadéquate...), seront reformées pour entraînement aux gestes techniques permettant la formation du personnel ou pouront etre réutilisés dans d'autres experiences sur décision vétérinaire.

Remplacement

Les analyses hors organisme vivant de ces candidats médicaments ont déjà été effectuées avec succès avant de passer à une étude toxicocinétique. A cette étape, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. Ainsi, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle vivant. En revanche, ce projet consiste à mettre au point un modèle de substitution de l’espèce utilisée (essentiellement primate non humain pour ces types de composés), par une espèce rongeur humanisée ou non, et/ou porteuse de tumeur, afin d’être le plus transposable et pertinent possible par rapport aux futures études clinique sur l’humain . Les études toxicocinétiques de composés thérapeutiques sont essentielles pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine et à relier ce comportement à des effets toxiques pour établir des relations dose-effet pour prédire la toxicité chez l’humain, de définir des marges de sécurité et de déterminer un choix de dose dans les premiers essais cliniques chez l’homme. La mise au point de nouveaux modèles à la fois plus éthique, plus fiables et plus pertinents pour préparer au mieux une phase clinique chez l’homme est une priorité mondiale. Les modèles murins testés ici permettront, non seulement de substituer l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées à ce type de composés, mais également de leur être supérieur en matière de pertinence et de calcul des doses cliniques, constituant ainsi une avancée majeure dans le respect des 3R dédiés aux thérapies anticancéreuses dérivées d’anticorps.

Réduction

# Une première étude de mise au point et de preuve de concept permettra (1) de valider le nombre d'animaux nécessaire par modèle et (2) de déterminer quels sont les modèles les plus adéquats pour les études suivantes. # Le nombre d’animaux par groupe est en accord avec la guideline de l’agence européenne du médicament, et nos connaissances sur cette classe thérapeutique : - Pour l’étude de tolérance, 4 à 5 animaux par groupe et par sexe sont considérés comme le nombre minimum à la fois nécessaires et suffisants. - Pour l’étude de toxicocinétique, les prélèvements par micro-échantillonnage seront privilégiés. Ce procédé permettra d’avoir autant que possible l’ensemble des valeurs provenant d’un même animal, augmentant ainsi l’homogénéité et la fiabilité des résultats permettant la réduction du nombre d’animaux. # Des méthodes statistiques adaptées aux petits nombres seront utilisées augmentant ainsi considérablement la significativité et la pertinence de ces statistiques, permettant la réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux (jusqu’à 5 par cage et jamais isolés) dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté et un enrichissement de l’environnement. Les souris seront acclimatées pendant une période minimale de 5 jours. Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions asceptiques. Selon les modèles, une greffe tumorale dans le tissu mammaire sera préférée car plus homogène et moins sujette aux nécrose. Chaque nouvel essai de dose sera séparé du précédent de 1 à 2 semaines, ce qui permettra de ne pas passer à la dose supérieure si une dose toxique est trouvée précocement. Les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque geste expérimental. Les animaux seront pesés et leurs tumeurs mesurées (si nécessaire) minimum 2 fois par semaine. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, incluant une surveillance physiologique et comportementale, permettra d'éviter la souffrance des animaux. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux le week-end et les jours fériés. Les prélèvements sanguins seront effectués préférentiellement par micro-échantillonnage sans jamais dépasser les doses recommandées. # Un prélèvement de sang terminal sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil.

Choix des espèces

Les études de toxicocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. ​​Les animaux seront des souris femelles et/ou mâles en fonction des besoins de l’étude. Ils seront livrés à partir de 7 à 8 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une toxicocinétique physiologiquement pertinente.

Implantés d'électrodes crâniennes au cours d'une chirurgie d'environ une heure, isolés une semaine pour que leurs congénères ne touchent pas les sutures, puis enfermés huit heures par jour dans des cages sans accès à l'eau, des rats sont exposés six heures durant à des composés organiques volatils. La séquence se répète cinq à sept fois par animal, deux jours par semaine, pour chacun des treize composés testés, soit 416 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend de la somnolence, des troubles de l'équilibre et des problèmes de coordination, qu'il décrit comme réversibles. L'objet est de situer les seuils d'effet sur l'activité cérébrale par rapport aux limites réglementaires de l'air des ateliers. Tous sont tués par prélèvement final du sang et du cerveau.

Objectifs

Dans l’industrie, de nombreux Composés Organiques Volatils (COV) sont utilisés. Lorsqu’ils se dispersent dans l’air des ateliers, ils peuvent être inhalés par les travailleurs, passer dans le sang et s’accumuler dans certains organes, notamment le cerveau. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études précédentes et vise à mieux comprendre les effets immédiats de certains des COV sur le cerveau, encore mal connus. L’objectif est double : d’une part, comparer la toxicité de plusieurs substances appartenant à une même famille chimique, et d’autre part, confronter les seuils d’effet aux limites réglementaires existantes et aux mesures réalisées en milieu professionnel.

Bénéfices attendus

Les Composés Organiques Volatils (COV) sont des substances qui peuvent provoquer des effets immédiats sur l’activité du cerveau comme la somnolence, une sensation d'ébriété ou des troubles de la concentration. Cependant, pour de nombreuses substances, nous ne savons pas exactement à partir de quelle concentration ces effets apparaissent. C’est pourquoi des rats seront exposés à diverses concentrations de COV alors que leur activité cérébrale est enregistrée, afin de déterminer la concentration au-dessus de laquelle l’acitivté du cerveau est modifiée. Si certaines substances s’avèrent dangereuses à des niveaux proches de ceux retrouvés dans l’air des lieux de travail, ces résultats permettront d’alerter sur un risque potentiel pour la santé des travailleurs. En parallèle, des analyses sanguines et cérébrales seront menées après l’exposition. Cela nous aidera à faire le lien entre la quantité de COV dans l’organisme et les conséquences de cette imprégnation sur l’activité du système nerveux central. Ces données, aujourd’hui majoritairement absentes de la littérature scientifique, permettront d’apporter de nouvelles connaissances sur les risques liés à l’utilisation des COV dans l’industrie, ainsi que sur la toxicité aiguë de ces substances chez l’animal.

Procédures

Treize COV seront testés dans le cadre de ce projet. Les nombres d’animaux indiqués s’entendent pour chaque COV. Pour chaque COV testé, des animaux différents sont utilisés. Ils sont répartis en deux groupes suivant deux procédures différentes. Les animaux de la première procédure (10 mâles et 10 femelles) sont tout d’abord implantés avec des électrodes à demeure permettant de recueillir l’activité du cerveau pendant l’exposition au COV. Cette implantation requiert une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie qui dure environ 1 heure. Après une semaine de récupération, au cours de laquelle les animaux seront en hébergement individuel afin d’éviter que les congénères n’explorent les sites d’incision ou de suture, ils seront exposés deux jours par semaine à diverses concentrations de COV (à raison de 6h par jour). Pendant ces journées d’exposition, la durée totale dans les cages d’exposition est de 8 heures, car l’exposition au COV est précédée et suivie de deux périodes d’une heure lors desquelles l’air n’est pas chargé en COV. Au total, ces journées d’exposition se répètent entre 5 et 7 fois par animal. Enfin, les animaux sont mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Les animaux de la deuxième procédure (6 mâles et 6 femelles) suivent la même séquence d’interventions, à l’exception de la chirurgie crâniènne.

Impact sur les animaux

Les substances étudiées ici peuvent affecter l’activité du cerveau. Il est donc possible qu’on observe des effets comme de la somnolence, des troubles de l'équilibre ou des problèmes de coordination. Ces effets, bien que réversibles, seront attentivement surveillés. À la suite d’une intervention chirurgicale prévue pour une partie des animaux, un hébergement individuel sera temporairement mis en place pendant environ une semaine, afin d’éviter que les autres animaux ne touchent les zones opérées. Pendant cette période, les animaux seront logés dans des cages transparentes et grillagées leur permettant de rester en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Des éléments d’enrichissement (tunnels, matériaux à ronger et à manipuler) seront ajoutés dans les cages pour réduire le stress lié à l’isolement. Pendant les expositions, les animaux seront placés dans des cages qui ne permettent pas l’accès à l’eau. Il est possible que cette contrainte puisse provoquer du stress chez eux, raison pour laquelle ils seront habitués progressivement à cette situation.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever les tissus nécessaires pour les analyses.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable ici car on essaye de comprendre comment les COV altèrent la fonction cérébrale et comment ils s'accumulent et sont éliminés dans un organisme entier ; il faut ainsi un organisme avec un métabolisme fonctionnel. Les tests en laboratoire sur des cellules ou des tissus isolés, ou les modèles mathématiques, ne permettent donc pas de répondre à ces questions.

Réduction

Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animauxrequis soit réduit à son minimum, tout en incluant à la fois des mâles et des femelles afin d’avoir des résultats représentatifs des deux sexes. Au lieu d’utiliser un groupe d’animaux pour chaque condition expérimentale, nous avons mis en place un système où chaque rat est soumis séquentiellement à toutes les conditions expérimentales. Il est donc son propre témoin. Cela permet de s’affranchir des différences de sensibilité entre les animaux, d’augmenter la puissance statistique et d’utiliser beaucoup moins d’animaux.

Raffinement

Tout au long du projet : Les animaux seront manipulés avec soin par du personnel qualifié et surveillés chaque jour pour évaluer leur état de santé et leur comportement. Ils seront hébergés par deux dans des cages enrichies (tunnels en carton, blocs à ronger, matériaux de nidification), avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, sauf durant les phases d’habituation et d’exposition (maximum 8 h). Autour des chirurgies : Un analgésique sera administré avant l’intervention, et un anti-inflammatoire deux fois à 24 h d’intervalle après. L’induction de l’anesthésie sera réalisée à l’isoflurane à 5 % dans un mélange air/oxygène, puis maintenue à une concentration de 2 à 3 % pendant toute la durée de l’intervention. Un gel ophtalmique évitera le dessèchement des yeux, une pommade cicatrisante sera appliquée sur les plaies, et une injection de sérum physiologique assurera la réhydratation. Le réveil aura lieu en armoire chauffée à 28 °C sous surveillance, avant le retour en hébergement. Une alimentation en bouchons et sous forme gélifiée facilitera l’accès à la nourriture. Pendant les 5 jours suivant la chirurgie, les animaux seront observés (douleur, comportement) et pesés quotidiennement. Ils seront logés seuls pour éviter que leurs congénères ne touchent les zones opérées ou n’abîment le dispositif implanté, mais dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel. Si possible, ils seront ensuite remis par deux, avec un environnement enrichi. Pendant l’exposition aux COV : Une habituation progressive aux cages compartimentées et aux enceintes d’inhalation réduira le stress. Les animaux seront aussi entraînés à la manipulation pour la pose/retrait de l’appareil d’enregistrement de l’activité cérébrale. Lors des expositions, ils seront placés individuellement dans des compartiments grillagés, permettant un contact visuel et olfactif entre eux. Ils seront observés toutes les 2 heures, et une fiche consignera tout signe clinique. Si un score d’arrêt est atteint, l’exposition s’arrêtera et les animaux seront surveillés pendant 2 heures pour vérifier leur bien-être. Les données des appareils d’enregistrement seront transmises en direct aux ordinateurs des expérimentateurs, afin de détecter rapidement un signal plat ou des interférences liées à des mouvements anormaux.

Choix des espèces

Le rat a été sélectionné parce que son métabolisme traite les COV de façon similaire à celui de l’humain. Cela permet d’obtenir des résultats plus pertinents pour comprendre leurs effets sur l’Homme. Nous avons choisi une souche de rats pigmentés, qui possèdent de la mélanine, un pigment également présent chez l’Homme. La mélanine joue un rôle protecteur contre certaines substances toxiques. À l’inverse, les rats albinos, qui n’en ont pas, sont plus sensibles à certaines substances. De plus, cette souche a déjà été utilisée dans nos études précédentes, et nous allons continuer à l’utiliser pour assurer la cohérence des résultats entre les différentes expériences. Des animaux des deux sexes sont étudiés ici car il pourrait exister des différences entre mâles et femelles sur l’effet des COV sur l’activité du cerveau, ainsi que sur la distribution et l’élimination de ces polluants par l’organisme. Les rats seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 3 mois), période à laquelle le système enzymatique hépatique, impliqué dans le métabolisme des substances testées ici, est considéré comme pleinement fonctionnel. Ces choix nous permettront d’obtenir des données plus précises et applicables à l’Homme.

Issues de pontes relevées en mer dans des casiers ou pondues par des génitrices captives, 555 seiches vont être exposées à des résidus de médicaments, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'exposition dure trois semaines sur la fin du développement embryonnaire, ou tout le premier mois de vie. Les jeunes seiches passent ensuite un quart d'heure en arène libre, un quart d'heure sur chacun de trois fonds pour mesurer leur camouflage et une demi-heure face à un leurre imitant un prédateur. Le porteur qualifie ce protocole de conforme aux 3R parce qu'il cherche des effets en deçà de la mort et travaille sur un invertébré, alors que les 555 seiches sont tuées à l'issue des tests pour qu'on dose les polluants dans leur cerveau.

Objectifs

La présence de polluants dans les écosystèmes aquatiques est une préoccupation grandissante du fait des effets néfastes qu'ils peuvent avoir sur la faune sauvage. Il est ainsi fondamental d’évaluer les risques environnementaux qui y sont associés. Parmi ces polluants, les résidus de médicaments à usage humain et vétérinaire attirent de plus en plus l'attention du fait de leur fréquente détection dans l'environnement, sans qu'il n'y ait de normes réglementant les concentrations maximales acceptables n'engendrant pas d'impact négatif sur les organismes, principalement dû au manque de connaissance de leurs effets potentiels. Un effort de recherche est donc requis pour évaluer correctement les dangers environnementaux liés à leur présence dans les milieux naturels, ceux-ci s'ajoutant à la pression qu'exercent déjà les changements climatiques sur les organismes. Ces substances peuvent de plus engendrer des effets sublétaux, en dessous des seuils de toxicité classiques, incluant par exemple une perturbation du système nerveux, pouvant entrainer une modification de comportements essentiels à la survie et nécessitant le développement de tests innovants pour les détecter. Ainsi, au moyen d'approches complémentaires in vitro, ex vivo et in vivo, des effets des 10 résidus médicamenteux les plus fréquemment quantifiés dans les eaux de surface seront recherchés chez la seiche, espèce modèle d’intérêt économique et scientifique. Ce projet vise également à répondre au besoin de pertinence écologique en prenant en compte l'évaluation nécessaire des effets des polluants en mélange et associés au changement climatique. Il s’agit plus précisément (1) de déterminer in vitro et ex vivo des critères de neurotoxicité et de neuroperturbation, permettant de tester les 10 substances et offrant une base pour permettre la sélection des 2 substances les plus préoccupantes, de (2) tester ces 2 substances in vivo pour évaluation de leurs effets sur les comportements essentiels à la survie (locomotion, camouflage, réponses au stress), de (3) fournir des données de bioaccumulation dans les tissus biologiques et (4) d'évaluer la neurotoxicité (in vitro) et la neuroperturbation (ex vivo et in vivo) dans un contexte de contamination environnemental et de changement climatique.

Bénéfices attendus

Les substances pharmaceutiques sont de plus en plus souvent détectées dans les eaux côtières, dernier réceptacle de la pollution chimique continentale, mais l'évaluation de leur impact reste rare et se concentre sur des espèces d'eau douce. Les polluants sont de plus fréquemment testés individuellement alors qu’ils sont retrouvés ensemble dans l’environnement, et leur présence est concomitante avec les changements climatiques non pris en compte dans les tests réglementaires (augmentation de la température et acidification de l’eau), s’éloignant ainsi de la réalité écologique. L'apport de données écotoxicologiques sur les résidus médicamenteux effectivement présents dans les eaux de surface, obtenues dans ce projet sur une espèce marine, et prenant en compte l’effet du changement climatique et l’effet cocktail (mélange), permettra ainsi une évaluation pertinente des dangers environnementaux et sanitaires associés. Ce projet permettra également la valorisation des données de quantification obtenues dans le cadre du suivi des eaux de surface, apportant une image de la contamination par les médicaments, mais ne permettant pas leur intégration dans l'évaluation de la qualité des eaux par manque de connaissance de leurs effets. La mise à disposition des biotests développés dans ce projet permettra d’évaluer le potentiel neurotoxique de substances d’intérêt émergent pour lesquelles il n’existe donc pas encore de Normes de Qualité Environnementales réglementaires (NQE), pouvant ainsi aider à leur préconisation dans l’évaluation du bon état chimique des masses d’eau de surface de la Directive Cadre sur l'Eau (DCE). De plus, à ce jour, le biotest le plus largement appliqué en environnement aquatique est un test de toxicité aigüe mené sur 42 à 60 poissons exposés à la substance d’essai avec la mort comme critère d’effet toxicologique (ligne directrice 203 de l’OCDE). Ce projet priorise quant à lui la recherche de critères toxicologiques sublétaux chez un invertébré marin et le développement d’approches ex vivo/in vitro, une stratégie conforme au principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les bénéfices attendus de ce projet sont donc la mise à disposition de tests écotoxicologiques sublétaux innovants, s'inscrivant dans la stratégie des 3R, permettant l'évaluation de l'impact écotoxicologique de résidus médicamenteux fréquemment retrouvés dans les masses d'eau locales, pouvant mener à une réévaluation de leur bon état chimique.

Procédures

Les interventions de ce projet sont des expositions à des résidus de médicaments et leurs conséquences. Ces expositions se feront d'une part durant le dernier tiers du développement embryonnaire des seiches (1 exposition chronique de 3 semaines) qui seront soumises à divers tests non invasifs pendant le développement et à son terme, puis des prélèvements post-mortem seront réalisés. D'autres animaux seront exposés de manière chronique dès la naissance pendant le premier mois de vie de l'animal, au cours duquel des tests comportementaux non-invasifs seront appliqués 3 fois maximum. Ces tests consistent en la mesure des déplacments de l'animal dans une arène libre (1 test de 15 min), en la mesure de l'efficacité du camouflage par changement de couleurs sur 3 types de fonds différents (15 min par fond) et en la mesure des réponses comportementales et physiologiques face à un stimulus artificiel mimant un prédateur (30 min).

Impact sur les animaux

Les expositions chroniques aux résidus médicamenteux sont susceptibles d’entraîner des altérations légères à modérées des capacités de locomotion (stabilité de l'animal dans la colonne d'eau), du camouflage, du comportement prédateur et de la réponse aux stimuli sensoriels. En cas d’exposition aiguë, les effets attendus sont des altérations modérées à sévères du métabolisme. Aucune nuisance n’est attendue dans le cadre des manipulations et des tests comportementaux.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans les procédures seront mis à mort à la fin des tests, sans délai. Cela permettra de prélever leurs organes (notamment le cerveau) afin de quantifier le taux de contamination des animaux par les différents polluants ou d'analyser l'impact sur le développement du système nerveux et son fonctionnement.

Remplacement

Les substances pharmaceutiques, de par leurs modes d’action divers et diffus, ont le potentiel d’impacter les grandes fonctions physiologiques d’un organisme dans son ensemble. Il est donc fondamental de travailler sur des animaux vivants. Toutefois, dans le cadre du développement de biotests ciblant des critères toxicologiques précis, les approches ex vivo/in vitro peuvent être pertinentes et doivent être encouragées. Dans le cas présent, l’analyse de l’activité des chromatophores sur échantillons de peau est une approche qui permettra de tester plusieurs traitements (substances ou concentrations) sur des échantillons issus d’un même individu, de même que l'utilisation de cellules nerveuses maintenues en culture primaire. S'agissant de prélèvements post-mortem, les individus ne seront ainsi pas exposés à des substances néfastes pouvant engendrer une souffrance.

Réduction

Le choix des substances à tester représente un compromis entre la possibilité de mener une évaluation comparative et un criblage relativement large des effets toxicologiques, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. (1) Les 10 substances seront d'abord évaluées in vitro et ex vivo afin de n'exposer les animaux qu'à 2 substances, limitant le nombre de lots et donc d’animaux. (2) Trois concentrations seulement de chaque substance seront utilisées lors des expositions par balnéation afin de limiter le nombre de lots et donc d’animaux. . Ces trois concentrations ont été choisies à la suite d’une campagne d’échantillonnage où les concentrations moyennes en résidus ont été calculés, cette moyenne constitue donc la concentration environnementale. Quant aux deux autres concentrations elles représentent des scénarios pessimistes, parfois vérifiés dans le cadre de contaminations environnementales exceptionnelles observées. (3) Chaque animal sera sollicité pour un maximum d'analsyes compatibles entre elles, c'est à dire ne présentant pas d'interférence méthodologique ou biologique. Garantissant ainsi une optimisation des données obtenues par animal tout en garantissant la validité scientifique des résultats. (4) Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques conçus pour des échantillons de faible effectif ou de modèles mixtes permettant l’utilisation de mêmes animaux pour des tests successifs. Un programme d'analyse de la puissance statistique des tests utilisés a été utilisé pour ajuster les effectifs.

Raffinement

Ce type de projet incluant une exposition par balnéation à des molécules limite les conditions de stabulation. Toutefois, plusieurs dispositions seront prises : (1) le maximum sera fait pour s’approcher le plus possible des conditions naturelles, notamment via l’utilisation de proies naturelles et locales (crevettes ou crabes) de taille adaptée aux animaux, via la régulation de la température de l’eau et de l’éclairage proche des variations naturelles ainsi qu'en limitant au minimum la manipulation des animaux . (2) Les tests comportementaux sont non invasifs (basées sur la prise d’images et de vidéos) (3) Les animaux seront obtenus par prélèvement de pontes de génitrices en captivité ou par prélèvement de pontes par des techniques non invasives (relevé de casiers ou d'orins). L’impact de ce prélèvement sur les populations de seiches est minime puisqu’en milieu naturel, une faible fraction des jeunes arrive à maturité. (4) Les animaux seront suivis quotidiennement afin de prévenir un état de douleur, de souffrance ou d’angoisse avec comme points limites : une réduction ou un arrêt de la prise alimentaire, une altération du contrôle de la flottaison, l’apparition de lésions cutanées liées ou non à des réactions de stress (mouvements désordonnés de rétropropulsion, jet d’encre excessif). Le cas échant, l'animal sera placé en quarantaine et, s'il n'y a pas d'amélioration (guérison des lésions cutanées et diminution du stress) ou de rétablissement complet après 48h (prise alimentaire et flottaison), mis à mort.

Choix des espèces

Les mollusques sont reconnus comme des espèces modèles de choix en écotoxicologie car ils sont particulièrement sensibles aux polluants organiques. Dans le cadre de la recherche de critères d’effets toxicologiques sublétaux, les céphalopodes offrent l’avantage de manifester des signes facilement analysables de leur état physiologique et de leurs chances de survie à long terme tels que leurs comportements de survie (locomotion, prédation, efficacité de leur camouflage). La seiche est une espèce modèle bien étudiée d’un point de vue neuroéthologique et physiologique. Nous disposons par conséquent d’une large gamme d’outils analytiques de son comportement et de son camouflage. Pour couvrir les étapes clés du développement cérébral, comportemental et cognitif de la seiche, se déroulant près des côtes et correspondants de plus aux stades de vie les plus exposés à la pollution chimique et aux changements climatiques dans la nature, les animaux seront utilisés durant les 24 premières heures post-éclosion ou pendant le premier mois post-éclosion.

Anesthésiés jusqu'à cinq fois pour être mesurés et pesés, 4 320 médakas marins passent l'intégralité de leur cycle de vie, six mois, dans une eau contaminée. Douze combinaisons de polluants, de température et d'acidification sont testées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous les poissons sont tués pour doser la contamination et analyser leurs organes. Le porteur reconnaît ne pas savoir si six mois d'exposition produiront des effets modérés ou graves, aucune étude n'ayant encore couvert l'ensemble du cycle de vie. Cinq tests comportementaux de cinq à neuf minutes sont annoncés comme non invasifs, sans qu'aucun soit nommé, et la rubrique consacrée à la réduction du nombre d'animaux tient en deux phrases.

Objectifs

La production et l'utilisation de divers produits chimiques ont considérablement augmenté depuis le milieu du XXe siècle, conduisant à l'émergence de nouveaux contaminants appelés contaminants émergents. Ces substances, qui incluent des produits pharmaceutiques, des pesticides, des produits de soins personnels et des plastifiants, sont souvent retrouvées dans l'environnement aquatique en raison de leur usage intensif et d'une gestion inadéquate des déchets. En raison de leur nature diverse, ces contaminants peuvent persister, s'accumuler et interagir avec des organismes aquatiques de manière complexe. Pourtant, les effets chroniques de ces substances sur les écosystèmes marins restent encore largement méconnus. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer la toxicité chronique de différents contaminants émergents chez un poisson marin, tout en explorant comment les conditions de changement climatique, telles que l'augmentation de la température et l'acidification des océans, peuvent modifier leur impact environnemental.

Bénéfices attendus

Les recherches présentées dans cette demande s'attacheront à identifier les effets des contaminants émergents sur les populations de poisson. Cela devrait à terme fournir des données scientifiques nouvelles sur les risques liés à ces contaminants émergents pour les écosystèmes aquatiques et ainsi permettre de mieux réglementer leur rejet et informer le public sur les risques environnementaux associés à ce type de produits, sous la contrainte du changement climatique.

Procédures

Durant le projet, chaque individu pourra subir jusqu'à cinq anesthésies pour des mesures biométriques (taille et poids), chaque intervention durant moins de 5 minutes, incluant le transfert en bac de réveil. Un sous-échantillon d'individus sera soumis à cinq tests comportementaux non-invasifs d'une durée entre 5–9 minutes répartis sur 4 jours. Une période de repos de 24 h suit chaque test, avec alimentation et maintien en bac individuel en contact visuel avec les congénères.

Impact sur les animaux

Des études précédentes ont montré l’absence de toxicité lors d’expositions aiguës ou chroniques de courte durée aux contaminants de différentes natures chez le médaka marin et d'autres espèces, bien que certains effets négatifs mais non létaux aient été observés, comme un ralentissement de la croissance (moindre gain de poids par rapport aux contrôles) et une diminution de la fécondité (réduction du nombre d’œufs produits par femelle). Cependant, aucune étude n’a encore évalué les effets des contaminants émergents en milieu marin sur l’ensemble du cycle de vie des poissons, en interaction avec des changements de température et d’acidification. Il reste donc incertain que ces expositions, sur une durée de six mois, entraînent des effets modérés ou graves. Néanmoins, certains signes précurseurs peuvent apparaître dès le début de l’exposition, permettant une réaction rapide et la mise en place de mesures correctives.

Devenir

En cours ou en fin de projet, tous les animaux seront prélevés après euthanasie pour des analyses moléculaires, des dosages de la contamination et des analyses histologiques des organes.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer les animaux dans cette étude, car nous analysons l’impact des polluants et du climat sur les poissons à un niveau individuel, ce qui nécessite des organismes vivants pour pouvoir comprendre comment fonctionne l’ensemble du système.

Réduction

Le nombre de poissons utilisés a été calculé pour être le plus bas possible tout en garantissant des résultats fiables. Nous utilisons des méthodes statistiques pour analyser les résultats et comparer les effets en fonction du sexe et de la condition des poissons.

Raffinement

Les poissons sont élevés en groupe dans un environnement adapté et observés régulièrement pour détecter tout signe de malaise (changement de couleur, difficulté à nager, etc.). Pendant certaines expériences, ils sont placés seuls pendant quatre jours, mais ils peuvent toujours voir d’autres poissons pour éviter le stress. Lors des mesures de taille et de poids, ils sont manipulés uniquement sous anesthésie pour leur bien-être.

Choix des espèces

Le médaka marin est un modèle animal qui permettra d’aborder les effets physiologiques des contaminants émergents sur les poissons osseux en milieu marin. L'espèce est caractérisée par une reproduction non-saisonnière en laboratoire, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts qui permettent d’aborder aisément les questions des effets à long-terme impliquant des expositions de l’ensemble des stades de vie. L'exposition aux 12 conditions climatiques et chimiques commencera lors de l'installation des animaux dans leur bac de 10L (15 jours post éclosion) et se poursuivra durant l’ensemble de leur cycle de vie afin d’étudier la toxicité des différentes conditions sur les différents stades aux sensibilités différentes (croissance juvénile, maturation sexuelle). Ils seront manipulés au stade juvénile (1, 2 mois) et adulte (jusqu'à 6 mois) pour des mesures de croissance, d'évaluation de la reproduction et de comportement (maturité du système nerveux optimale) respectivement.

14 080 rongeurs, 7 040 souris et 7 040 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés leur sont administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intranasale, jusqu'à 120 administrations par animal, avec des prélèvements sanguins pouvant retirer 15 % de leur volume sanguin. Le porteur prévoit que certains animaux atteignent les points limites du fait des substances elles-mêmes, ce qui déclenchera leur mise à mort anticipée. Deux phrases suffisent au RNT pour exposer objectifs et bénéfices de cette évaluation toxicologique de candidats médicaments, sans nommer aucun composé ni justifier l'effectif de 14 080 animaux.

Objectifs

L’évaluation toxicologique de nouveaux candidats médicaments est une étape clé dans leur processus de développement. Ce projet vise donc à évaluer le profil toxicologique de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’avancer dans la caractérisation de nouveaux candidats médicaments en s’assurant de leur innocuité chez l’animal avant toute administration chez l’Homme.

Procédures

1) L’administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d’une minute par animal pendant la durée de l’étude pourra être réalisée via différentes voies d’administrations : - par voie orale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) - par voie intraveineuse (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 14 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intrapéritonéale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intramusculaire (une administration pour la procédure 1) – par voie sous cutanée (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) – par voie intranasale sous anesthésie gazeuse a l’isoflurane (1 administration pour la procédure 1) 2) De 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés jusqu’à 2 fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal avec un temps de récupération de 2 semaines minimum. Le prélèvement pourra être fait à la veine submentale, saphène (sans anesthésie). Les prélèvements se feront sur une durée de deux minutes par animal.

Impact sur les animaux

On pourrait observer des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés à la voie d’administration des composés ou aux composés testés en eux même avec pour certains animaux l’atteinte potentielle des points limites. Des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés aux prélèvements sanguins pourraient également être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour évaluer l’innocuité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne permet de rendre compte des potentiels effets indésirables in vivo des nouveaux candidats médicaments. De plus l’évaluation de la toxicité potentielle des candidats médicaments est une étape clé de leur développement.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’études, et donc le nombre d’animaux utilisés, les différents candidats médicaments seront préalablement testés in vitro. Ne rentreront dans les études in vivo que ceux ayant montré le plus d’efficacité ainsi qu’une absence de toxicité dans ces tests in vitro. Le nombre d’animaux utilisés par étude sera réduit au maximum de manière à pouvoir observer de potentiels effets indésirables et est adapté des recommandations de l’OCDE associées à la réalisation d’étude toxicologique chez le rongeur. Pour la détermination des doses maximales tolérées un groupe vehicule unique sera utilisé tout au long du processus afin de réduire le nombre d’animaux. De plus, l’administration des composés se fera séquentiellement ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum d’animaux possible en n'incluant pas les reste des animaux prévu si le composé est toxique. Enfin, les études de toxicité chronique avec récupération ne se feront que sur les dose maximales testées la encore afin de réduire le nombre d’animaux. De ce fait, ce projet permet de réduire le nombre de composés qui seront testés dans les études d'éfficacité nécessaires aux études précliniques.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort éthiquement et de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance animale, de la nourriture pourra être ajoutée dans les cages sous forme de nourriture humidifiée. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton, feuilles de cellulose, …).

Choix des espèces

L’évaluation toxicologique des candidats médicaments est une étape clé de leur développement qu’il est nécessaire de réaliser dans au moins une espèce de rongeurs. Pour cela ce projet sera réalisé chez la souris et/ou chez le rat qui sont les deux espèces de rongeurs les plus utilisées pour des études de toxicologie. Cela permettra également de définir les doses maximales pouvant être utilisées dans les futures études d’efficacité qui seront réalisées dans ces deux espèces. L’âge des animaux utilisé dans ce projet sera choisi en fonction de l’indication du nouveau candidat médicament.