Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Développement de nouveaux capteurs (d’oxygène, monoxyde d’azote et glutamate) pour le monitorage du cerveau chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés du crâne pendant quatre à six heures sous anesthésie, 96 rats sont tués avant tout réveil. Le porteur écrit que le réveil après la préparation d'un volet osseux serait "probablement douloureux" et que replacer l'animal paraît générateur de souffrances inutiles. L'objet est de mettre au point des capteurs d'oxygène, de monoxyde d'azote et de glutamate de moins de 100 micromètres, destinés au monitorage de patients cérébrolésés en soins intensifs puis au diagnostic de la dépression. L'effectif de douze rats par groupe intègre un taux d'échec prévu de 30 %, lié au comportement mal défini de ces nouveaux capteurs in vivo, pour huit animaux exploitables.
Objectifs
Ce projet vise à développer de nouveaux capteurs d’oxygène, de monoxyde d’azote et de glutamate dotés plus petits (
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal du projet est de permettre la mise au point de capteurs miniaturisés capables de monitorer l’oxygène, le monoxyde d’azote et le glutamate cérébral avec une plus grande sensibilité et moins de lésions tissualires. Ces capteurs fourniront des outils pour la recherche en Neurosciences et pourront à l’avenir être utilisés en clinique pour le monitorage des patients humains cérébrolésés en soins intensifs neurologiques (après une hémorragie méningée ou un traumatisme crânien par exemple). Le bénéfice secondaire sera de faire progresser nos connaissances sur les variations de concentrations du monoxyde d’azote et l’oxygène au cours des dépolarisations corticales, d’une stimulation sensorielle ou de l’ischémie -reperfusion. Enfin, les capteurs développés ici font partie d’une collaboration avec une équipe de Imperial College à Londres et seront intégrés dans un dispositif contenant quatre capteurs (glutamate, monoxyde d’azote, histamine et sérotonine) afin d’aider au diagnostic de la dépression chez le patient humain.
Procédures
Une procédure chirurgicale de quatre à six heures sous anesthésie et avec soins anti-douleur, sans réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
Les expérimentations chez l’animal auront lieu sous anesthésie générale sans réveil avec des nuisances très réduites. Les animaux seront mis à mort sans douleur. Aucune douleur supérieure à celle occasionnée par une piqûre d’aiguille n’est prévue lors du déroulement normal de l’expérience. Un déroulement anormal avec une levée de l’anesthésie en cours d’expériences pourrait mener à une douleur et un stress transitoires auquel il sera mis fin par augmentation de la concentration d’isoflurane respirée par l’animal. Cette possibilité est peu probable car l’animal est monitoré avec la saturation en oxygène et un pincement de la patte régulier en cours d’enregistrement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Le réveil après une chirurgie du crâne et préparation d'un volet osseux sera probablement douloureux et le réveil, voir le replacement de l'animal paraissent générateurs de souffrances inutiles
Remplacement
Les expérimentations in vivo auront lieu seulement une fois que le fonctionnement des capteurs aura été caractérisé in vitro. Notamment, une supériorité des nouveaux capteurs par rapport aux capteurs existants sera exigée avant passage au stade préclinique. Ainsi l’utilisation d’animaux est évitée pendant la phase de mise au point des procédés de dépôt de membranes ou de traitement de la surface des électrodes.
Réduction
Les effectifs des groupes ont été limités à un nombre de 12 individus. Ce nombre permet d’envisager un taux d’échec de 30% qui reste possible lors de l’utilisation de nouveaux capteurs au comportement biomécanique in vivo mal défini (n=4) tout en conservant un effectif suffisant pour mener des tests statistiques (n=8). Nous pourrons procéder à des comparaisons statistiques entre capteurs conventionnels et nouveaux capteurs à l'aide d'un test de Student ou d'une ANOVA. L’effectif de huit animaux est le minimum permettant de pratiquer un test de normalité de Shapiro-Wilk et de pratiquer une ANOVA en respectant les hypothèses mathématiques de normalité.
Raffinement
Concernant la douleur, un traitement analgésique est prévu avant la chirurgie avec une injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg/kg) et une administration de lidocaïne en crème sur le scalp et dans le conduit auriculaire. L’administration d’analgésique est pratiquée avant l’incision de la peau. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale par l'isoflurane. Les points limites sont définis par (1) un réveil de l'animal et (2) l'apparition d'une hémorragie incontrôlée au niveau du scalp. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à six dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (tuyau en plastique rouge, matériau de nidification).
Choix des espèces
Le rat Sprague-Dawley est une espèce qui a été largement caractérisée dans notre laboratoire à la fois pour le monitorage intracérébral et pour le modèle de neuroinflammation par administration de lipopolysaccharides. Plus généralement, de par sa taille et sa capacité à porter de l’équipement de monitorage, le rat est l’espèce privilégiée pour les développements précliniques de capteurs embarqués. Rats adultes de 10 semaines pour bénéficier d'une taille maximale
Les mécanismes cellulaires sous-jacents aux problèmes cognitifs chez un modèle murin de trouble neurodéveloppemental (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
258 souris adolescentes vont être utilisées, toutes tuées, dont 10 opérées sous anesthésie sans jamais être réveillées et 248 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de 45 minutes à une heure, avec des douleurs postopératoires, une perte de poids possible et un risque d'infection, une autre reçoit une injection sous contention. Le RNT ne nomme ni le gène, ni le modèle, ni le produit administré, et présente l'objectif comme l'approfondissement d'altérations cérébrales déjà relevées dans des travaux antérieurs. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal et que des études chez l'être humain sont exclues, la population concernée étant "fragile".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les déficits cognitifs chez un modèle de troubles neurodéveloppementaux. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs relevant les altérations au niveau du fonctionnement du cerveau de ces animaux. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs à l’origine des changements observés. Pour des raisons techniques, le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs : EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes sous jacents certains troubles de neuro-développement qui affectent la vie quotidienne d’environ 6 à 8 % de la population. En étudiant un modèle animal largement utilisé, notre travail permettra d’identifier les facteurs à l’origine des changements observés. Cette approche permettra de relier nos resultats à des stratégies thérapeutiques potentielles, ouvrant la voie à de nouveaux traitements ciblés. Ces connaissances sont essentielles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et pour soutenir l’inclusion des personnes concernées dans un milieu social ou professionnel. À terme, ce projet contribuera à améliorer la compréhension scientifique de ces conditions et à proposer des pistes concrètes pour en améliorer à quotidien la vie des personnes concernées.
Procédures
Certains animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie d'une durée d' environs 45 à 60 minutes. Certains animaux reçoivent une injection d'un produit médicamenteux sous contention (durée d'environs 5 à 10 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de cette procédure comprennent des douleurs postopératoires minorées par des antalgiques, une possible perte de poids et un risque d'infection.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet vise à mieux comprendre les altérations biologiques à l’origine des troubles cognitifs. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental qui soit : i) suffisamment complexe et intact, ii) génétiquement modifiable, iii) doté d’un cerveau présentant une organisation comparable à celle de l’être humain, et iv) compatible avec des approches comportementales avancées ainsi qu’avec des techniques expérimentales invasives. À ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico permettant de remplacer l’utilisation d’animaux pour ce type d’étude. Par ailleurs, des études directement menées chez l’être humain ne sont pas envisageables en raison du caractère invasif des procédures nécessaires et une population fragile.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons soigneusement estimé le nombre strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Cette estimation repose sur des études déjà publiées, une analyse de la littérature scientifique et des calculs statistiques permettant d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux. Nous nous engageons ainsi à n’utiliser que le nombre minimal d’animaux indispensable pour atteindre les objectifs de l’étude. Pour cela, nous avons mis en place une stratégie expérimentale qui permet d’anticiper et de prévenir toute utilisation inutile. Des études pilotes sont réalisées afin de vérifier que la méthode fonctionne correctement et de perfectionner les gestes techniques avant le lancement complet de l’étude. Cette approche permet d’ajuster le nombre d’animaux en fonction des premiers résultats et d’identifier rapidement d’éventuels problèmes, afin de modifier la procédure si nécessaire dans un objectif de réduction. Les résultats obtenus seront ensuite analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées, afin de garantir des conclusions fiables et rigoureuses.
Raffinement
i) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. ii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse. Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures adaptées. Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur consultera le vétérinaire iii) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. iv) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés avant les expériences pour réduire leur niveau de stress. v) Conditions d’hébergement adaptées afin de permettre l'intégration d'une approche de manipulation qui vise à réduire le niveau de stress.
Choix des espèces
Actuellement, la souris est le seul mammifère pour lequel il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour lequel les modèles développés ont été caractérisés de manière approfondie et correspondent de façon fiable à certaines conditions humaines. Nous utiliserons des souris adolescentes (âgées de 5 à 8 semaines) au début des expériences, parce que la condition étudiée est une condition neurodéveloppementale.
Études neurophysiologiques et cognitives chez les rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 960
Porteurs d'électrodes implantées au cours d'une chirurgie de deux à trois heures sous anesthésie, 960 souris et 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction hydrique ou alimentaire, un hébergement individuel pouvant aller jusqu'à un mois, une contention de la tête, et des séances quotidiennes de 25 minutes pendant environ quatre semaines. Ces effectifs couvrent vingt études sur cinq ans pour caractériser l'effet de molécules candidates sur la cognition, le porteur affirmant que le modèle animal est "indispensable" avant tout développement clinique. Les tâches sont présentées comme un "ensemble de tâches standardisées" sans qu'aucune soit nommée.
Objectifs
Le présent projet s’inscrit dans un contexte de recherche préclinique visant à caractériser l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition et le fonctionnement cérébral. Les techniques utilisées incluent l’enregistrement et la modulation de l’activité neuronale chez l’animal anesthésié ou vigile et libre de ses mouvements. Ces approches permettent d’évaluer en temps réel l’impact potentiel d’un traitement thérapeutique sur les fonctions neuronales, cognitives et comportementales. Le modèle animal est indispensable pour étudier le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques avant leur éventuel développement clinique. Les rongeurs (souris et rats) sont classiquement utilisés pour la recherche préclinique en santé humaine, notamment dans des études de molécules susceptibles de modifier l’activité neuronale, le comportement et/ou la cognition. Les procédures employées suivent des standards établis dans les laboratoires de recherche publique, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des données expérimentales. Avec le nombre d’animaux prévu dans ce projet, 20 études expérimentales pourront être réalisées sur une période de 5 années.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’accompagner des études précliniques combinant approches comportementales et neurophysiologiques afin de mieux comprendre les effets de composés pharmacologiques à visée thérapeutique. Ce projet permettra de caractériser de manière précise l’impact de ces composés sur la cognition, le comportement et le fonctionnement cérébral, en fournissant des données fiables et reproductibles sur leurs effets neuronaux et cognitifs. Ces informations contribueront à identifier les cibles thérapeutiques pertinentes et à orienter le développement de nouveaux traitements dans un contexte préclinique.
Procédures
Les animaux reçoivent un traitement par injection ou dans l’eau.1 à plusieurs administrations (max 2–4 semaines) (Une seule injection dans le cerveau lors de l’opération), petits volumes adaptés au poids. Lorsque le traitement est donné dans l’eau, les animaux le reçoivent progressivement en buvant chaque jour. Ils sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée approximative de 2 à 3 heures, permettant l’enregistrement de l’activité neuronale dans une région cérébrale d’intérêt. Selon les études, les animaux effectueront différentes tâches comportementales adaptées aux molécules et aux régions cérébrales étudiées. Un ensemble de tâches standardisées est utilisé, dont la récurrence et la durée peuvent varier d’une séance unique de 15 minutes jusqu’à une séance quotidienne de 25 minutes sur environ 4 semaines. Cette approche combinant mesures neurophysiologiques et évaluation comportementale permettra de mieux caractériser l’impact des composés pharmacologiques sur la fonction cérébrale et la cognition. L’hébergement individuel sera appliqué uniquement aux animaux porteurs d’implants ou soumis à un contrôle hydrique ou calorique,(de quelques jours à plusieurs semaines, maximum 1 mois), tandis que la restriction hydrique ou alimentaire sera mise en place sur la période expérimentale correspondante afin de mesurer individuellement les apports (de quelques jours à une semaine).
Impact sur les animaux
Le stress sera limité grâce à une habituation progressive à l’expérimentateur. Toutes les interventions ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution de ces interventions. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : Un risque de douleur durant la chirurgie et une douleur aiguë liée à la récupération post-chirurgie implantatoire. Ce risque est compensé par l’analgésie. Un risque de perte de poids durant le contrôle calorique. En cas de perte de poids, l'animal est nourri ad libitum pendant 48 h. Un risque de perte d’implant lié aux chirurgies implantatoires pouvant induire une douleur. Un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Les tests de comportement peuvent induire du stress pour les animaux. Un risque de stress lié à l'hébergement individuel des animaux
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation de contrôles histologiques.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus cognitifs/comportementaux. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus l'espèce humaine. 3) De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est éveillé et soumis à des tests comportementaux : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.
Raffinement
À chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de carton, leur permettent de construire des nids, de jouer et de ronger. Leur soin est confié à du personnel qualifié et expert. Il surveille quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suivent les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures chirurgicales. L’expérimentateur possède une solide expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance animale, avec la mise en place de mesures pour les soulager, comme la réhydratation, le réchauffement et une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris et le rat : -sont des mammifères étroitement liés à l'espèce humaine sur le plan phylogénétique, et certains de leurs comportements peuvent être comparés à ceux de l'humain. Ces rongeurs sont fréquemment utilisés dans les études électrophysiologiques, utilisant la technique de fiber photométrie, ainsi que dans les manipulations optogénétiques. -permettent des approches in vivo pour étudier les effets de composés thérapeutiques sur le système nerveux central, ainsi que leurs corrélations avec les fonctions cognitives, à travers l'analyse comportementale. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les rongeurs adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie que les plus jeunes. L’utilisation d’animaux génétiquement altérés permet de diriger l’expression de différents senseurs dans des neurones spécifiques, afin d’obtenir des conclusions plus précises et pertinentes.
Etude du role des vaisseaux sanguins sur les cancers du sang chez la souris 1/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 296 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 312 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant subir jusqu'à six séances de microscopie de deux heures et trois semaines d'isolement en cage individuelle. Elles reçoivent une injection de cellules leucémiques, une implantation de tissu sous la peau, des prélèvements de sang ou de moelle osseuse chaque semaine jusqu'à la fin de l'expérience, et des traitements par gavage ou injection quotidienne. Le porteur reconnaît qu'aux stades avancés les animaux perdent leur tonicité et présentent des difficultés de locomotion, et demande une dérogation à l'hébergement en groupe qu'il justifie par la "nécessité" d'éviter blessures et stress. Les bénéfices annoncés, des traitements plus ciblés et mieux tolérés contre certaines leucémies, restent au conditionnel.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment certains cancers du sang, comme les leucémies, interagissent avec les vaisseaux sanguins dans leur tissu. L’objectif est d’identifier les anomalies présentes dans cet environnement lors du développement de la maladie. En utilisant des modèles de souris et des outils d’imagerie avancés, on veut repérer les mécanismes qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses et tester de nouvelles approches pour les bloquer. Le projet sera réalisé dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet pourraient permettre d’améliorer l’efficacité des traitements contre certaines leucémies, en ciblant l’environnement tumoral. Comprendre comment l'environnement vasculaire influence la progression de la maladie pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus ciblées et mieux tolérées par les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de cellules leucémiques (1 fois, duree:
Impact sur les animaux
Les seances d'imagerie répétées peuvent entraîner un stress modéré chez les animaux, notamment en raison des manipulations et du transport associés aux séances d’imagerie. L’implantation des systèmes utilisés pour l’imagerie peut gêner légèrement le comportement de l’animal, sans toutefois compromettre sa mobilité ou son alimentation. L'hébergement individuel pendant une durée maximale de trois semaines peut induire un stress lié à l’isolement. À un stade avancé de la maladie, les animaux peuvent présenter des signes de souffrance (perte de tonicité, difficultés de locomotion, altération de l’état général). Les injections en sous-cutané, intra-vein, intra-peritoné peuvent cause une gene legere aux souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement
Remplacement
Pour « Remplacer », nous avons mis en place un système de culture 3D qui reproduit le tissu leucemique humain et permet certaines expériences sans utiliser d’animaux. Afin de limiter le nombre de souris utilisées, nous veillons à ce que toutes les expériences possiblement réalisables in vitro sur système de culture 3D le soient. Cependant, celui-ci ne mimant que les interactions locales et pas systemiques, le développement de modèle in vivo reste nécessaire.
Réduction
L’étude directe des tumeurs humaines étant très limitée, nous utilisons des souris immunodéficientes pour mieux comprendre les leucémies humaines. Ce modèle est aujourd’hui le seul qui permette d’étudier ces maladies de manière fiable. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des modèles d’organoïdes de leucémie humaine greffés chez ces souris. Ces greffes sont plus efficaces et plus reproductibles que les méthodes classiques, ce qui permet d’utiliser moins de souris par expérience. Nous utilisons également des techniques d’imagerie qui permettent de suivre l’évolution de la leucémie au cours du temps chez un même animal. Cela évite de devoir euthanasier les souris à chaque étape de l’étude. Les expériences sont réalisées avec des souris mâles et femelles, car le sexe n’influence pas le développement de la leucémie dans nos modèles. Enfin, le nombre de souris nécessaires est calculé à l’avance à l’aide d’outils statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation des animaux.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures d’imagerie et l’implantation d’organoïdes se feront sous anesthésie générale et avec administration d’analgésique. De plus, afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, leur état fera l’objet d’une surveillance continue. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées, incluant des éléments d’enrichissement appropriés. Enfin des points limites spécifiques ont été mis en place. Une dérogation à l’hébergement en groupe est demandée pour certains animaux. Cette dérogation est scientifiquement justifiée par la nécessité d’éviter toute blessure ou stress. Des mesures compensatoires seront mises en œuvre pour limiter l’impact de l’isolement sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour les expériences menées pour la recherche en oncologie thérapeutique du cancer. En effet, la connaissance complète du génome de la souris permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt, ainsi qu’un grand nombre de modèles de cancers. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes de 6-12 semaines. Cela représente l’âge permettant une bonne prise de greffe, et qui laisse le temps a la maladie de se développer sans que la souris vieillisse.
Efficacité thérapeutique de l’elesclomol fonctionnalisé au cuivre dans un modèle murin de myélome multiple par radiothérapie interne MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 mm3, qui perdent plus de 20 % de leur poids ou dont le point d'injection s'ulcère sont mises à mort avant paralysie complète. 792 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de myélome, une injection du composé radioactif, des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer deux heures, puis une ponction cardiaque terminale suivie d'une dislocation cervicale. Le projet reprend une molécule abandonnée en essai clinique de phase II sur le cancer du pancréas, reformulée avec du cuivre radioactif pour cumuler chimiothérapie et radiothérapie interne.
Objectifs
Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple (MM) reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive après traitement sont des défis centraux pour améliorer le taux de survie des patients atteints de MM. Le mécanisme de cuproptose induisant la mort cellulaire dépendante du cuivre a été exploré à travers l'utilisation de l'elesclomol en chimiothérapie. En raison d'un effet thérapeutique suboptimal dans le cancer du pancréas ainsi que de problèmes de solubilité, celui-ci a été abandonnée lors des essais de phase II . Actuellement, il a été mis au point une version hydrosoluble de l'elesclomol offrant ainsi la possibilité d'améliorer l'efficacité thérapeutique de cette molécule et suscitant un nouvel intérêt clinique. À travers ce projet, l'objectif est d'exploiter le double effet de l'elesclomol en le fonctionnalisant avec le cuivre (Cu64 ou Cu67), permettant ainsi la réalisation de la cuproptose tout en associant l'efficacité potentielle de la radiothérapie interne du cuivre radioactif. Le cuivre est l'un des radioéléments les plus prometteurs pour l'approche théranostique en raison de sa disponibilité en cyclotron et de ses propriétés physiques. Les objectifs du projet sont de développer de nouvelles molécules à base d’elesclomol dans le cadre de traitement du myélome multiple mais également le dépistage et le suivi du développement tumoral chez l’homme. Après la confirmation par les études in vitro, les molécules présentant les meilleurs résultats sur les lignées cellulaires de MM seront étudiées in vivo sur modèles murins. Le projet in vivo consistera aux études de pharmacocinétiques, de biodistribution et d’efficacité thérapeutique sur souris après greffe tumorale. L’étude de biodistribution des molécules radiomarquées sera réalisée par tomographie d’émission de positons (TEP) couplée à l’imagerie par tomodensitométrie X (TDMX). Cette démonstration de concept pourrait conduire au développement d'une nouvelle approche thérapeutique de radiothérapie interne vectorisée en utilisant la chimiothérapie comme double vecteur thérapeutique, ouvrant ainsi la voie à une nouvelle approche thérapeutique.
Bénéfices attendus
Menée à bien, cette étude devrait permettre d’ajouter ces molécules comme nouvel outil de traitement et de diagnostic du myélome multiple. Elle permettra également de mieux comprendre la conjugaison des effets liés à l’elesclomol combiné à l’approche par radiothérapie interne vectorisée. Cette étude devrait également démontrer l’intérêt de cette approche pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.
Procédures
L’administration des molécules se feront par voie intraveineuse sur animal vigil d’une durée
Impact sur les animaux
L’elesclomol a été testé chez l’Homme dans des essais cliniques précoces dont aucune nuisance n’a été observée. L’ensemble des informations liées à la toxicité cellulaire de la molécule et de sa formulation ont été établies in vitro sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses. Nous n’attendons pas de nuisances liées à la molécule sur les souris immunodéficientes car celle-ci sera réalisée à 70% de la MTD identifié en PE1 au maximum. Les nuisances et les points limites identifiées sur souris avec tumeur attendues sont une perte de poids (max >20%), une augmentation du volume tumoral excessif (jusqu’à induire des difficultés locomotrices, à induire une souffrance/une douleur ou >1500mm3), l’apparition de nécrose/ulcération/infection possible au lieu d’injection. Un score de 3 sur la grille de score impliquera la mise à mort de l’animal avant paralysie complète
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.
Remplacement
Des études in vitro déterminant la cytotoxicité de la molécule ont été préalablement réalisés afin de remplacer une partie des expérimentations in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. La pharmacocinétique et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peuvent être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation de ces molécules radiomarquées pour étudier la biodistribution par imagerie TEP ainsi que le traitement du myélome multiple et du glioblastome, et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérents à un organisme entier.
Réduction
Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Une approche statistique a déterminé que le nombre d'animaux par groupes nécessaire pour déterminer un effet significatif lors de l'analyse des données est de 6 individus. Cette taille fournira la puissance nécessaire pour détecter une réduction du volume tumoral de ≥30% par rapport au contrôle, avec un écart-type de 25% au maximum dans le groupe de contrôle. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude de 3 fonctionnalisations de elesclomol.
Raffinement
Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées et la croissance des tumeurs sera mesurée régulièrement. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance animale par interruption de la procédure. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera observée avant le début d’une procédure. Les animaux seront habitués 2-3x par semaine pendant au moins 1 semaine avant le début d’une procédure, afin de réduire le stress dû aux manipulations lors de l’étude. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels. L’imagerie se fait sous anesthésie gazeuse dans une enceinte chauffée avec monitora de la température et de la fréquence respiratoire.
Choix des espèces
La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La disponibilité d’animalerie agrée pour la souris ainsi que l’expertise présente à proximité facilite le suivi et la qualité des expérimentations. Le modèle murin est d’autant plus indiqué car il permet de combiner une étude de toxicité et d’efficacité thérapeutique sur des souches immunodéprimées particulièrement adaptées à l’études de la biologie des cancers. Les souris mâles et femelles auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation et seront âgés de 8-12 semaines, soit l’âge de leur maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prés pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu.
Elevage d’un modèle de souris reproduisant la Myopathie de Duchenne
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Ces souris développent une dystrophie musculaire qui leur coûte jusqu'à 50 % de leur poids et réduit leurs déplacements, sans qu'aucune procédure leur soit appliquée. 900 souris vont être élevées ainsi, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur indique qu'aucune intervention n'est prévue et que la pathologie se développe seule, les animaux étant utilisés entre 8 et 12 semaines, au pic de l'atteinte musculaire. Leurs muscles sont prélevés puis exploités pour plusieurs expériences, jusqu'à "épuisement de la ressource".
Objectifs
Ce projet concerne l'élevage d'un modèle de souris qui développent une maladie musculaire qui mime la myopathie de Duchenne au bout de quelques semaines. Le modèle de souris présente un muscle malade sans que des signes cliniques soient observables à la période étudiée.
Bénéfices attendus
L'utilisation des muscles de ces souris permet l'étude des mécanismes impliqués dans la myopathie de Duchenne
Procédures
Aucune intervention n'est prévue, la pathologie se développe naturellement.
Impact sur les animaux
Les souris développent une maladie qui mime une dystrophie musculaire et comportent des signes physiques qui les différencient d'une souris saine. Leur poids est jusqu'à 50% plus faible mais possèdent un développement normal. Elles se déplacent normalement, mais moins que des souris sauvages. Les signes de dystrophie musculaire atteignent un niveau maximal entre 8 et 16 semaines et s'améliorent à partir du 8e mois. Les souris sont utilisées entre 8 et 12 semaines lorsque la maladie atteint une sévérité élevée dans la muscle. Les conditions d'élevage sont en accord avec les dernières recommandations de février 2025 concernant l'élevage de souris comportant des pathologies musculaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever et analyser les muscles.
Remplacement
La compréhension des évènements cellulaires et moléculaire liés à la progression de la myopathie de Duchenne nécessite des analyses ex vivo à partir d'animaux affectés par la pathologie. En effet, la pathologie n'est actuellement pas modélisable in vitro car elle engage de nombreux types celulaires qui communiquent ensemble. Néanmoins, autant que faire se peut, le laboratoire utilise des cellules d'origine humaine, mais qui sont très rares et dont la quantité est limitée.
Réduction
Les souris sont uniquement utilisées pour prélèvements de tissus. Les prélèvements sont utilisés pour de multiples expériences jusqu'à épuisement de la ressource. La pathologie humaine touche les hommes et les analyses sont réalisées à partir des tissus provenant d'individus mâles. Cependant, toutes les mises au point expérimentales sont réalisées à partir de tissus prélevés chez les femelles
Raffinement
Les souris montrent un phénotype dommageable à partir de 12 mois et seront mises à mort à 6 mois au plus tard. Les animaux présentent un poids inférieur que les souris normales ou mdx et sont sujettes au stress. Il y aura un enrichissement de leur environnement pour limiter le stress, ainsi que des conditions de contentions spécifiques les premières semaines.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la structure du muscle est très similaire à celle observée chez l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines, au pic de la pathologie musculaire observée au niveau du tissu musculaire.
Mécanismes d’adaptation pour améliorer la résilience de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) dans le contexte du changement climatique
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rendre l'élevage de truites plus résistant aux canicules : 270 truites arc-en-ciel juvéniles sont soumises pendant 18 jours à un manque d'oxygène, à des températures proches de leur limite physiologique, ou aux deux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont ensuite anesthésiées puis tuées par surdosage de tricaïne pour prélever leur système digestif. Le porteur annonce une léthargie initiale et une baisse de prise alimentaire de 15 à 20 %, qu'il présente comme temporaire, et n'attend aucune mortalité. Il justifie ces conditions en indiquant qu'elles correspondent à ce que les poissons rencontrent dans le milieu naturel, et rappelle que la truite arc-en-ciel est l'espèce piscicole la plus produite en France.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les mécanismes de réponse cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumis à un stress thermique et à une diminution de la disponibilité en oxygène dans le milieu (hypoxie).
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est la production de données expérimentales solides sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumise à un stress thermique et hypoxique. Ces connaissances apporteront des éléments essentiels pour identifier les cibles physiologiques et moléculaires clés permettant des interventions nutritionnelles adaptées, nécessaires pour renforcer la résilience des poissons face aux épisodes de canicule, dont la fréquence augmente avec le changement climatique.
Procédures
Les animaux seront soumis, pendant une durée de 18 jours, à des contraintes spécifiques, en fonction du groupe de traitement : • Traitement 2 : exposition à des conditions hypoxiques. • Traitement 3 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 4 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. • Traitement 5 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 6 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. À la fin de la période expérimentale, les poissons seront capturés par du personnel formé et expérimenté, anesthésiés dans un bain de tricaïne méthanesulfonate, puis euthanasiés par surdosage de tricaïne.
Impact sur les animaux
Le stress thermique et hypoxique auquel les animaux seront soumis est susceptible d’induire une léthargie au début, le temps que les poissons s'habituent, mais cette gêne sera temporaire. Par ailleurs, la prise alimentaire diminuera, mais cette réduction sera faible (de 15 à 20% retour d’expérience sur des expérimentations similaires), car l'impact global reste limité en raison de l'exposition à des températures proches de la limite physiologique des poissons. Aucune mortalité n’est attendue, du moins pas en conséquence de la manipulation des animaux, des conditions expérimentales ou des modifications physiques de leur environnement.
Devenir
Tous les poissons impliqués (270 animaux) seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour les analyses biologiques et biochimiques essentielles aux objectifs du projet.
Remplacement
L’objectif de cette étude est d’examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse digestive de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) lorsqu’elle est exposée à un stress thermique et hypoxique. Ces processus physiologiques reposent sur des interactions complexes et intégrées entre plusieurs tissus du système digestif, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des approches in vitro (culture cellulaire) ou in silico (modélisation informatique). Par conséquent, le recours à des animaux vivants est indispensable afin d’obtenir des données précises et biologiquement pertinentes sur les impacts physiologiques de ces facteurs de stress environnementaux dans des conditions expérimentales contrôlées.
Réduction
Le plan expérimental a été soigneusement conçu pour utiliser un nombre minimal de poissons, tout en garantissant la rigueur scientifique et la reproductibilité des résultats. L’étude comprend six traitements (un témoin et cinq conditions de stress), chacun répliqué dans trois bacs, soit un total de 18 bacs, avec 15 truites arc-en-ciel juvéniles par bac, pour un total de 270 poissons. Cette taille d’échantillon et ce niveau de réplication ont été déterminés afin de fournir une puissance statistique suffisante pour détecter les effets des traitements sur les réponses moléculaires, tout en évitant une surreprésentation inutile. Les poissons seront répartis aléatoirement dans les bacs et acclimatés avant le début des traitements expérimentaux, afin de minimiser la variabilité et de maximiser les informations obtenues de chaque individu. De plus, le choix des conditions de stress et de la réplication des bacs a été guidé par l’expérience préalable et la littérature scientifique, dans le but de réduire le nombre d’animaux tout en maintenant la robustesse et la fiabilité des résultats.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures seront mises en œuvre afin d’améliorer le bien-être animal et de minimiser la douleur, la souffrance et le stress : • Les conditions d’hébergement seront optimisées en termes de nutrition, densité de peuplement, qualité de l’eau et photopériode. • Les stress thermiques et hypoxiques appliqués dans l’étude correspondent à des conditions naturellement rencontrées par les animaux dans le milieu naturel, ce qui limite l’introduction de facteurs de stress artificiels. • Une surveillance continue des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe de détresse et de permettre la mise en place rapide de mesures correctives. Ces mesures garantissent que les procédures expérimentales sont conduites conformément aux principes de raffinement, en priorisant le bien-être des animaux tout en maintenant la validité scientifique de l’étude. Le bien-être animal sera évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de scoring basée sur des points limites prédéfinis. Les critères pris en compte incluront : comportementaux : prostration ou isolement prolongé, anomalies de nage, diminution marquée de la prise alimentaire, positions inhabituelles dans la colonne d’eau ; physiques : altérations de l’état corporel, lésions cutanées, signes de pathologies ou dégradation de l’aspect général. En cas d’atteinte d’un seuil critique (score ≥3 pour l’un des critères), l’animal concerné sera euthanasié sans délai, conformément aux procédures réglementaires en vigueur, afin de prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce piscicole la plus produite en France et présente une importance agronomique et commerciale majeure. Cependant, cette espèce est de plus en plus confrontée à la fréquence et à l’intensité croissantes des vagues de chaleur liées au changement climatique. Ces épisodes thermiques peuvent avoir des effets sévères sur sa physiologie, sa croissance et sa survie. Ainsi, l’identification de stratégies d’atténuation efficaces constitue une priorité pour assurer à la fois la durabilité de l’aquaculture et le bien-être des animaux. Pour développer de telles stratégies, il est essentiel de comprendre comment la température et la disponibilité en oxygène influencent le métabolisme cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel. Les poissons auront un poids moyen compris entre 20 et 40 g au début de l’expérience, ce qui indique qu’ils seront au stade juvénile. Cette taille permettra de réaliser les expériences dans des conditions optimales au sein de l’unité expérimentale, tout en étant suffisamment grande pour prélever des échantillons de tissus digestifs en quantité adéquate pour les différentes analyses moléculaires ultérieures.
Suivi comportemental de la lamproie marine par radio télémétrie
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturées dans un piège lors de leur migration de reproduction, 300 lamproies marines sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées dans la rivière. Chaque poisson est maintenu jusqu'à 18 heures en bassin de stabulation, anesthésié, mesuré, pesé, puis équipé d'un émetteur radio et acoustique implanté dans la cavité abdominale, avant un réveil d'une dizaine de minutes en nasse amarrée d'où il repart seul. L'espèce figure sur la liste rouge de l'UICN en France et ses indicateurs de population baissent depuis onze ans, avec une absence récurrente de nids. L'effectif retenu, deux échantillons de 30 lamproies par an pendant cinq ans, est justifié par la variabilité des débits et par une mortalité naturelle qui "pourrait réduire légèrement" ce nombre.
Objectifs
La lamproie marine est un poisson migrateur amphihalin, c’est-à-dire qu’il effectue une partie de son cycle biologique dans l’océan (phase de grossissement) et l’autre partie en eau douce (phase de reproduction et développement des larves). Cette espèce est historiquement présente sur de nombreux systèmes fluvio-estuariens. Elle fait partie depuis 1992 des espèces prioritaires d’intérêt communautaire de l’Union Européenne qui doivent être protégées au titre de la biodiversité grâce à la conservation des habitats naturels aquatiques. Elle est inscrite sur la liste rouge des espèces menacées en France par l’UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature). Les principales menaces recensées sur cette espèce sont l’entrave à la libre circulation (difficulté d’accès aux frayères du fait des barrages présents sur les cours d’eau), la dégradation potentielle de l’habitat nécessaire à la reproduction et une prédation en rivière lors de sa migration. De nombreux suivis sont mis en place depuis ces dernières années pour suivre l’état des populations (comptages sur frayères ainsi qu’au niveau de stations de contrôle et suivi de l’efficacité de la reproduction). Or, depuis presque 11 ans, l’ensemble de ces indicateurs est à la baisse, et tendent vers un constat de situation alarmante de la population avec notamment une absence récurrente de reproduction (absence de nids). Des suivis complémentaires doivent donc être mis en place afin d’évaluer le comportement de migration d’un échantillon de la population préalablement équipé d’émetteurs radio et acoustique afin de comprendre la réelle problématique rencontrée lors de cette phase fondamentale du cycle de vie.
Bénéfices attendus
L'objectif de cette étude est de mieux appréhender le comportement des lamproies marines pendant la phase de migration. Il s'agit d'une approche intraspécifique chez la lamproie où la variabilité des trajectoires individuelles sera décrite pour une prise en compte spatiale et temporelle des données de suivi par télémétrie. L’étude cherche à amener des éléments pertinents permettant d’expliquer la chute drastique du stock reproducteur.
Procédures
La procédure débute par le prélèvement des poissons dans la zone de stabulation. Les poissons seront capturés dans un piège puis ils auront une anesthésie d’une durée de 1 à 2 minutes. Une fois sédaté, le poisson fait l’objet de mesures de taille et de poids durant environ 1 minute, avant de procéder à un marquage unique télémétrique et acoustique dans la cavité abdominale, en moins de cinq minutes. La totalité des opérations effectuées pendant la phase de sédation ne dépasse pas 5 minutes. Enfin, le poisson est placé dans une nasse de réveil pour une durée d’environ 10 minutes, assurant une récupération complète avant son retour dans le milieu naturel. Cette nasse de réveil est amarrée dans la rivière et dispose d’ouvertures sur les bords permettant aux lamproies de partir d’elles même lorsqu’elles sont réveillées sans manipulation humaine supplémentaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles sont les suivantes : - Stress du maintien des lamproies dans les bassins de stabulation (durée max 18 heures, intensité légère et modérée) - Stress de la contention et anesthésie (durée totale < 4 min intensité légère), - Stress du marquage pour l’insertion des marques (durée < 5 min, intensité légère) - Retard migratoire (temps de piégeage et manipulations estimée entre 10 et 30 min nuisance légère) - Inconfort et douleurs légères post marquage (classe légère durée < 10 min)
Devenir
Tous les poissons seront libres dans leur milieu naturel
Remplacement
Le projet porte sur le comportement migratoire des lamproies, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus de l’espèce et du stade visé (lamproie marine adulte en migration de reproduction) afin d’obtenir des données pertinentes.
Réduction
Dans des systèmes ouverts de grande taille, le choix de deux échantillons contenants chacun n=30 lamproies/an correspond au minimum d'individus nécessaires pour rendre compte des variabilités des paramètres environnementaux (débit notamment) et de la variabilité intraspécifique sachant que la mortalité naturelle pourrait réduire légèrement cet effectif. Par ailleurs, la reconduction de l’étude pendant 5 ans permet de mener les suivis dans différentes conditions environnementales et ainsi objectiver les résultats vis-à-vis des différents partenaires techniques.
Raffinement
L’ensemble des manipulations a été raffiné et conçu pour limiter au maximum le stress et l’épuisement des animaux. Le marquage des animaux est réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront suivis jusqu’à récupération complète après l’anesthésie et relâchés dans le milieu naturel. Aucun poisson faible ou malade ne sera sélectionné pour l’implantation de l’émetteur (mycose, nageoire abîmée…). Par ailleurs, le poids des individus marqués sera toujours supérieur ou égal à 1000 g pour que la marque ne représente pas plus de 1 % du poids de l’individu et ainsi garantir au maximum un comportement normal après implantation de la marque. En cas de difficulté à l’endormir, la lamproie sera positionnée dans l’eau claire pour un réveil total avant d’être relâchée dans le milieu naturel sans être marquée. Une injection d'un analgésique sera effectuée pour réduire la douleur post opératoire au droit de l'incision.
Choix des espèces
L’étude cible la migration de la lamproie marine et cherche à amener des éléments pertinents permettant d’expliquer la chute drastique du stock reproducteur. L’objectif étant d’étudier le comportement des lamproies pendant leur migration de reproduction sur la partie moyenne des fleuves. Les individus utilisés seront donc nécessairement adultes et matures sexuellement.
Caractérisation de la réponse immunitaire aux interfaces méningées suite à une exposition chronique d’un cocktail de pesticides dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pour mesurer les effets d'un cocktail de fongicides sur les cellules immunitaires des méninges, 126 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les pesticides sont ajoutés à l'eau de boisson des parents deux mois avant l'accouplement, puis maintenus pendant la gestation, la lactation et après le sevrage. Le porteur écrit que la quantité administrée correspond à ce que nous buvons chaque jour dans notre eau, que ses collaborateurs n'ont détecté aucun trouble du comportement ni de la croissance, et présente pourtant le modèle murin comme "indispensable". Les souriceaux sont tués à 15 puis 60 jours pour prélever leurs méninges et trier leurs cellules immunitaires.
Objectifs
L’usage intensif des pesticides en agriculture suscite des inquiétudes croissantes en raison de leurs effets néfastes sur la santé humaine. Des études épidémiologiques ont établi des liens entre l’exposition aux pesticides et les maladies neurodégénératives ainsi que des troubles neurodéveloppementaux. La contamination de l’eau, des sols et des aliments par ces substances est également préoccupante. Parmi les pesticides, les anilinopyrimidines (AnPy), couramment utilisés comme fongicides, sont retrouvés dans l’alimentation et pourraient avoir des effets délétères sur la formation du cerveau. Ils constituent une classe de fongicides utilisés en agriculture pour lutter contre un large éventail de champignons pathogènes, Le système nerveux central (SNC) est protégé de la périphérie par différentes barrières anatomiques en particulier le cerveau est protégé par les méninges - Les méninges, et plus particulièrement la dure-mère, sont peuplées de cellules immunitaires résidentes. En raison de leur localisation stratégique à l'interface entre la périphérie et le cerveau, les cellules immunitaires des méninges peuvent communiquer avec les deux compartiments. Notre étude portera sur les effets d’une exposition chronique aux pesticides sur l’interface méningée. Nous réaliserons cette étude chez des souris de type sauvage des deux sexes. Nous analyserons les différentes populations de cellules immunitaires présentes dans les méninges sur des animaux issus d’accouplements où les parents et en particulier les femelles gestantes auront été traitées 2 mois avant l’accouplement, ainsi que durant la gestation et la lactation. Nous poursuivrons également cette exposition après le sevrage. Notre étude permettra de fournir des données cruciales sur les effets des pesticides sur le développement cérébral et contribuera à mieux comprendre les interactions entre environnement et troubles neurodéveloppementaux. Cette étude est basée sur la caractérisation des différentes populations de cellules immunitaires par cytométrie en flux. Cette technique nous permettra d’identifier le statut inflammatoire de chaque population de cellules immunitaires. Pour cette étude nous utiliserons un nombre total de 126 animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet innovant fournira à court terme des données cruciales sur les effets des pesticides sur le système immunitaire dans les méninges et contribuera à mieux comprendre les interactions entre environnement et troubles neurodéveloppementaux. Il vise à plus long terme à alerter les populations exposées et à fournir une base scientifique pour orienter les politiques publiques
Procédures
Il n’y a pas d’intervention sur les animaux puisque le cocktail est ajouté à l’eau de boisson. Afin d’étudier les effets potentiels des pesticides sur le développement du Système Nerveux Central, la descendance sera également exposée aux pesticides.
Impact sur les animaux
A ce jour nos collaborateurs n’ont pas détecté de phénotype comportemental sur la descendance et aucune altération du comportement maternel n'a été observé. Ils n’ont pas non plus observé de différence pour la courbe de poids sur leurs individus descendance et géniteurs. La quantité de pêsticides correspond à ce que nous buvons tous es jours dans notre eau. Il existe cependant un risque de troubles neurodéveloppementaux ou de retard de croissance sur les souriceaux dont nous tenons compte dans l'écriture des points limites.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont mis à mort pour prélever les tissus pour analyse.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal murin est essentielle dans ce projet, car dans l’état actuel des connaissances, il est impossible de recréer in vitro les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement (méninges, cerveau et système immunitaire)
Réduction
Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Une approche statistique solide requiert 12 animaux par groupe de chaque sexe. Des exemples de données publiées ainsi que nos précédents travaux non publiés prévoient un effet sexe en particulier lors des interactions cellules immunitaires et système nerveux. Nous traiterons tous les animaux des portées en les sexant pour obtenir au final 12 femelles et 12 males dans les groupes.
Raffinement
Les souriceaux et les souris seront suivis régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance avérée de prendre des mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure SBEA (surveillance renforcée, analgésie, enrichissement, etc.). Avant manipulation des souriceaux, l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera le stress.
Choix des espèces
LÉtant donné l’organisation anatomiquement complexe du SNC, le modèle murin reste indispensable pour effectuer cette étude. Les organoïdes n’arrivent pas à reproduire actuellement toute la complexité des échanges et la souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Les animaux des 2 sexes seront utilisés car il est montré dans différentes études des effets différents entre les sexes. Nous utiliserons des souris C57BL6J de type sauvage de 8 semaines (accouplements) et nous analyserons les souriceaux à jour post natal 15, stade clé de la maturation de l’unité gliovasculaire (unité maintenant l’équilibre homéostatique entre sang et cerveau) et à jour post natal 60 où la maturation de cette unité est terminée.
Etude des mécanismes conduisant au développement de la cachexie rénale (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Une partie des souris porte une mutation qui détruit progressivement leur fonction rénale et les fait maigrir, l'autre reçoit un régime qui produit le même effet. 1 636 souris au total vont être utilisées, toutes tuées, dont 512 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des mesures toutes les deux semaines, des prélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à sept jours d'isolement en cage métabolique et, pour certaines, deux injections par jour pendant quinze jours. Le porteur qualifie chacune de ces nuisances de légère et affirme que l'insuffisance rénale ne provoque ni douleur ni stress avant les stades avancés, tout en indiquant que les animaux seront gardés plusieurs mois, jusqu'à ce qu'ils aient développé cette insuffisance accompagnée d'une cachexie.
Objectifs
La cachexie est un syndrome d’amaigrissement sévère et involontaire qui ne peut pas être corrigé simplement par une approche nutritionnelle, et qui réduit fortement la qualité et l’espérance de vie des patients. Elle touche souvent les patients à des stades avancés de maladies chroniques telles que le cancer, les maladies rénales, cardiaques et pulmonaires ou maladies infectieuses. Jusqu'à présent la plupart des études se sont concentrées sur la cachexie associée au cancer, les autres types de cachexie, et en particulier celle associée aux maladies rénales chroniques (MRC), ont été peu étudiées. Les maladies rénales constituent un grave problème de santé publique, puisqu'elles touchent plus de 850 millions de personnes et représentent l'une des dix principales causes de décès prématurés dans le monde. À un stade avancé de la maladie rénale, notamment chez les patients sous dialyse, un syndrome appelé cachexie rénale peut apparaître. Elle se caractérise par une perte de masse maigre et/ou grasse menant à une altération fonctionnelle des patients. Il n’existe aujourd’hui aucune norme de soin pour la cachexie rénale et une meilleure compréhension des altérations métaboliques menant à son développement représente un enjeu crucial. L’objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge de la cachexie rénale. A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro qui permette de reproduire la complexité de la physiopathologie de la cachexie rénale, ce qui rend indispensable le recours à des modèles animaux pour appréhender les interactions biologiques complexes associées à cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
La cachexie rénale est un syndrome grave qui touche de nombreux patients atteints d’insuffisance rénale chronique. Elle réduit l’espérance de vie, entraîne une fatigue importante, des hospitalisations fréquentes, et rend difficile une vie sociale et professionnelle normale. Elle contribue donc au très fort impact économique des maladies rénales en Europe, qui est à la hauteur de 140 milliards d’euros par an. Ce projet de recherche vise à court terme à mieux comprendre la cachexie rénale et à développer des outils de diagnostic. À plus long terme, il pourrait mener à de nouveaux traitements, et ainsi améliorer la qualité de vie et la survie des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subiront des mesures de composition corporelle (3 minutes/animal), de force musculaire (5 minutes/ animal) et de fonction rénale (45 minutes/animal) au maximum toutes les 2 semaines à partir de l’âge de 6 semaines. Ces mesures se font chez les animaux vigiles et sont non-invasives, les animaux pourront cependant être anesthésiés pendant quelques minutes pour certains gestes techniques. Des prélèvements sanguins (2 minutes) seront réalisés sous anesthésie toutes les 2 semaines également. Les animaux seront mis en cages métaboliques une fois pendant une durée maximum de 7 jours. Certains lots d’animaux recevront des traitements : soit 3 injections par semaine pendant une durée maximale de 2 mois ; soit 2 injections par jour pendant une durée maximale de 15 jours ; soit une injection unique. Certains animaux seront mis sous régime particulier. Dans le second établissement utilisateur, seules les procédures terminales seront réalisées.
Impact sur les animaux
Certains animaux de sont porteurs d’une mutation génétique responsable du développement d’une maladie rénale chronique. Celle-ci provoque une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement, qui sont les critères recherchés dans notre projet. D’autres groupes d’animaux sont soumis à un régime alimentaire qui induit également une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement. Le poids des animaux et leur état général seront suivis attentivement. L’insuffisance rénale ne provoque pas de douleur, ni de stress avant des stades avancés au cours desquels une baisse de l’alimentation et une altération de l’état général peuvent apparaitre. Tous les animaux seront soumis à : (1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vice-versa (2) prise de sang à la queue : léger stress et risque de saignement (3) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) (4) mesures du métabolisme : léger stress lié à l'isolement (7 jours au maximum) dans une cage individuelle (5) mesure de la fonction rénale: légère douleur liée à l’injection, et léger stress lié à la présence du capteur pendant 1h maximum (6) traitements pharmacologiques : léger stress dû à la contention + légère douleur liée à l’injection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
La cachexie est un syndrôme multifactoriel, initiée par le tissu affecté (ici le rein), qui va conduire à l’altération métabolique et à la dysfonction de nombreux tissus vitaux. Ces tissus vont à leur tour sécréter de nombreux médiateurs pro-cachectiques, initiant un cercle vicieux qui aggrave la fonte des tissus musculaires et adipeux. De telles interactions inter-tissulaires dans un contexte d’insuffisance rénale sont donc impossibles à reproduire in vitro. Une approche complémentaire ex vivo sur des cellules primaires en culture est également utilisée, elle permet d’obtenir une grande quantité de cellules à partir d’un nombre restreint d’animaux
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 1636 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés, par groupes de 2 à 5 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement par les zootechniciens et plusieurs fois par semaine par les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être . Une grille de scoring et des points limites ont été établis. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (des anesthésiques et antalgiques seront utilisés pour les gestes qui le nécessitent, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale et la cachexie. Pour l’un des 2 modèles, nous utiliserons des souris âgées de 6 semaines au début de l'expérience, afin d’effectuer des mesures en conditions basales avant tout amaigrissement et perte de fonction rénale. Pour l’autre modèle, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines au début du protocole. A cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques chez l’adulte. Nous garderons les animaux jusqu’à ce qu’ils aient développé une insuffisance rénale accompagnée d’une cachexie (processus se mettant en place sur plusieurs mois).
État du réseau neuronal responsable du sommeil chez un modèle de souris transgénique de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérées sous anesthésie pendant une heure trente pour l'implantation d'électrodes, puis maintenues éveillées deux heures ou privées de sommeil paradoxal pendant 48 heures par un dispositif qui secoue leur cage, 192 souris porteuses d'une mutation de la sclérose latérale amyotrophique subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'élevage nécessaire porte le total à 378 souris, toutes tuées. L'objectif est de cartographier l'activité des réseaux cérébraux du sommeil avant l'apparition des symptômes moteurs, une question que le porteur présente comme jamais explorée. Il écrit que ce "sacrifice" est justifié par la "nécessité" d'accéder au tissu cérébral pour le marquage post-mortem des neurones activés.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), aussi connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie neurologique grave et incurable qui s'attaque aux cellules nerveuses contrôlant les muscles. Elle entraîne une paralysie progressive et conduit malheureusement au décès, généralement 2 à 5 ans après l'apparition des symptômes. Si la paralysie est le symptôme le plus connu, la maladie provoque également d'autres problèmes sévères qui dégradent fortement la qualité de vie des patients, notamment une perte de poids importante et des troubles majeurs du sommeil. Pour étudier cette maladie, la recherche utilise des modèles animaux (souris) qui développent des symptômes très similaires. Aujourd'hui, nous ne comprenons toujours pas précisément pourquoi la SLA perturbe aussi gravement le sommeil. Les premières pistes suggèrent un dysfonctionnement dans une petite zone du cerveau (l'hypothalamus), qui gère à la fois l'appétit et le sommeil. Cependant, le cycle veille-sommeil est en réalité contrôlé par un ensemble de réseaux de neurones bien plus complexes et interconnectés, situés dans différentes zones du cerveau. L'état de ces autres réseaux n'a jamais encore été étudié dans le contexte de la SLA. L'objectif de notre projet est donc de combler cette lacune fondamentale. Nous allons, pour la première fois, cartographier l'activité de tous ces réseaux cérébraux durant les différentes phases de vigilance (éveil, sommeil léger et sommeil profond). Cette "cartographie" nous permettra d'identifier précisément quels circuits du sommeil sont altérés par la maladie, une étape essentielle pour comprendre l'origine de ces troubles et espérer un jour développer des traitements pour améliorer la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet est important car il nous aidera à comprendre exactement pourquoi le sommeil est si perturbé chez les personnes atteintes de SLA, un symptôme qui dégrade fortement leur qualité de vie au quotidien. En réussissant à identifier précisément quelles zones du cerveau sont responsables de ces troubles, nous espérons ouvrir la voie au développement de nouveaux traitements. L'objectif à terme serait de pouvoir corriger ces problèmes très tôt dans l'évolution de la maladie, et peut-être même avant que les symptômes moteurs, comme la paralysie, ne commencent à apparaître.
Procédures
Les souris transgéniques utilisées dans les expérimentations de ce projet seront soumises à une seule procédure chirurgicale. Cette chirurgie consiste en une implantation d’électrodes pour les enregistrements du sommeil. Elle est faite sous anestesie d’une durée totale de 1h30. À la fin du protocole, toutes les souris seront séparées en 3 groupes : Le groupe "Éveil" : Pour étudier le cerveau en état d'éveil, nous maintiendrons un groupe de souris éveillé pendant 2 heures. Le groupe "Sommeil lent" : Pour la comparaison, un deuxième groupe sera laissé au repos complet dans sa cage habituelle, pendant exactement la même période. Le groupe "Sommeil paradoxal" (Sommeil des rêves) : Pour étudier spécifiquement les effets du "sommeil paradoxal", nous utiliserons un système automatisé développé par notre équipe. Ce système surveille la souris et détecte le moment précis où elle entre dans cette phase de rêve. Il envoie alors une stimulation très légère, juste assez pour interrompre cette phase spécifique, sans pour autant réveiller complètement l'animal ni le stresser. Cette privation qui dure 48h sera suivie d’un rebond de 2 heures, durant lequel la quantité de sommeil paradoxal augmente fortement.
Impact sur les animaux
Une chirurgie légère sous anesthésie générale : Un traitement antidouleur est administré systématiquement avant l’intervention, combinant deux analgésiques complémentaires. Une douleur post-opératoire transitoire peut survenir mais est prise en charge efficacement par une analgésie continue. Une période de récupération de 10 jours est prévue, avec un suivi quotidien par fiche d’observation. Une privation sélective du sommeil paradoxal de 48h est également réalisée, qui interrompt doucement chaque épisode de REM par un léger mouvement de la cage, sans générer de stress significatif. L’ensemble du protocole est conçu pour minimiser toute souffrance ou détresse des animaux.
Devenir
À l’issue de l’ensemble des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés de manière rapide et éthique afin de permettre l’analyse histologique du cerveau, notamment des structures activées pendant l’éveil, le sommeil lent et le sommeil paradoxal (via le marquage cFos). Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, en identifiant précisément les neurones recrutés après manipulation expérimentale. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde terminale, garantissant l’absence de douleur ou de souffrance. Aucun animal ne sera réutilisé dans un autre protocole. Ce sacrifice est justifié par la nécessité d’accéder au tissu cérébral pour les analyses anatomiques post-mortem.
Remplacement
L'étude des circuits neuronaux régulant le sommeil et leur dysfonctionnement dans une maladie aussi complexe que la maladie de charcot ne peut être modélisée autrement que par l’animal. La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude du sommeil et de la maladie de charcot, sa neuroanatomie des circuits du sommeil est bien caractérisée et proche de celle de l'homme. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc). Le modèle murin est le plus pertinent car sa neuroanatomie des circuits du sommeil est bien caractérisée et proche de celle de l'homme.
Réduction
La taille d’échantillon a été déterminée à partir de données préliminaires de l’équipe sur des paramètres de sommeil et d’activité locomotrice, en tenant compte de la variabilité interindividuelle observée. Un minimum de 16 animaux par groupe est nécessaire pour détecter un effet significatif portant le nombre d’animaux à 192 animaux sur l’ensemble du projet. Aucun test inutile ou répété n’est prévu : chaque animal ne participe qu’à un seul paradigme de sommeil et l’ensemble des données exploitables est recueilli sur le même individu, ce qui contribue à limiter le nombre total d’animaux. un élevage sera mis en place dans l'animalerie du laboratoire, portant ainsi le nombre de souris total du projet à 378, permettant le maintient de l’élevage.
Raffinement
Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre à toutes les étapes du protocole. La chirurgie d’implantation d’éléctrodes est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie systématique. Les animaux sont installés sur un tapis chauffant, leurs yeux sont protégés par un gel ophtalmique, puis ils sont suivis quotidiennement pendant au moins 10 jours. En cas de dépassement des points limites définis, les animaux sont immédiatement retirés du protocole et mis à mort. Les conditions d’hébergement sont règlementaires : enrichissement systématique des cages (matériel de nidification, bâtonnets à ronger), limitation du bruit et de la lumière, manipulations réalisées par un personnel formé et, autant que possible, par les mêmes expérimentateurs afin de limiter le stress. La privation sélective de sommeil paradoxal repose sur un système validé qui interrompt les épisodes de REM par un déplacement très léger de la cage, sans augmentation mesurable du stress. Enfin, compte tenu des souris qui vont devellopper une maladie neurodegenerative du système moteur, elle seront mises à mort avant toute apparition des symptomes.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude expérimentale de la maladie de charcot et de la régulation du sommeil. Ses circuits du sommeil sont bien décrits et proches de ceux de l’humain, et il existe des lignées transgéniques de la maladie largement caractérisées. Les techniques utilisés dans ce projet ne sont actuellement possible que chez la souris. Dans le cadre de la question posée aucune autre espèce ne permettrait de répondre aussi précisément, et aucun modèle non animal ne peut reproduire l’organisation fonctionnelle des réseaux du sommeil in vivo. Les animaux seront utilisés à partir d’environ 60 jours d’âge, au moment de la chirurgie. Ce stade correspond à un âge adulte jeune chez la souris, où les circuits du sommeil sont matures et un stade présymptomatique. Tous les enregistrements de sommeil et les paradigmes comportementaux seront réalisés entre 2 et 3 mois d’âge afin d’étudier spécifiquement les altérations précoces des réseaux d’éveil et de sommeil.
Etudes d’efficacité des immunomodulateurs dans la réadministration du vecteur AAV chez la souris sauvage C57BL/6
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Des prélèvements sanguins tous les deux jours pendant une semaine, jusqu'à trois injections intraveineuses dont deux à trente minutes d'intervalle sur deux sites distincts : 197 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre molécules capables de dégrader les anticorps circulants sont testées à trois doses chacune, pour rendre possible une seconde administration de vecteurs AAV chez des personnes déjà immunisées. Le porteur situe le bénéfice au stade de la preuve de principe, qui "ouvrira la porte" à d'autres études avant tout passage en clinique. Il justifie le choix de la souris C57BL/6 par la disponibilité de données précliniques et par une petite taille qui limite les volumes biologiques requis.
Objectifs
Les vecteurs adéno‑associés (AAV) sont des virus naturellement inoffensifs que l’on vide de leur contenu pour en faire de petits transporteurs capables d’apporter un gène thérapeutique. Ils permettent ainsi de traiter certaines maladies génétiques dépourvues de traitement curatif, grâce aux avancées de la thérapie génique. Cependant, comme ces virus circulent largement dans la population, beaucoup de personnes ont déjà été exposées et possèdent des anticorps capables de les reconnaître et de les neutraliser. Le système immunitaire garde en mémoire ces anticorps : en cas de nouvelle exposition, il réagit rapidement et massivement. Cette protection naturelle peut devenir un obstacle pour la thérapie génique, car les anticorps anti‑AAV peuvent empêcher le traitement d’agir. Certaines personnes ne peuvent donc pas recevoir un traitement par AAV, et celles qui en ont déjà reçu un développent ensuite des anticorps rendant une seconde administration difficile. Ce projet vise à développer de nouvelles approches pour contourner cette limite. Il repose sur l’utilisation de molécules capables de réduire temporairement la quantité d’anticorps circulants, y compris ceux dirigés contre les AAV. Contrairement aux immunosuppresseurs classiques, qui affaiblissent globalement le système immunitaire, ces molécules agissent de façon plus ciblée, plus rapide et pour une durée limitée, ce qui réduit le risque d’effets secondaires. Quatre molécules ayant déjà montré leur efficacité sur des cellules en laboratoire seront testées chez la souris, chacune à trois doses différentes. L’objectif est d’identifier la dose la plus efficace pour diminuer les anticorps dans le sang et déterminer la durée de cet effet. À cette dose, on vérifiera ensuite si chaque molécule permet l’administration d’un vecteur AAV même en présence d’anticorps préexistants. Enfin, la molécule la plus prometteuse sera évaluée dans un protocole simulant une réadministration, étape essentielle pour permettre des traitements durables en thérapie génique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de définir un immunomodulateur efficace à dégrader les immunoglobulines in vivo et de faire la preuve de principe qu’il est possible en l’utilisant de réaliser un transfert de gène médié par l’AAV efficace voire de réaliser une réadministration AAV. Ces démonstrations ouvriront la porte à d’autres études visant à amener cette stratégie en clinique.
Procédures
Dans ce projet, les traitements, qu’il s’agisse des AAV, des immunoglobulines ou des immunomodulateurs seront administrés soit sur animal anesthésié, en moins de 3 min., soit sur animal vigile, en moins de 2 min. Sur une durée expérimentale de 21 à 49 jours, les animaux recevront au cours des protocoles au maximum 3 injections par voie intraveineuses espacées de 24h à plusieurs jours. Cependant, une seule fois, deux injections seront réalisées à trente minutes d’intervalles à deux sites bien distincts. Des prélèvements sanguins sont effectués régulièrement pour le suivi biologique à raison d’une fois par semaine, sauf après l’injection des composés immunomodulateurs, où la fréquence passera à tous les deux jours pendant 7 jours. Ils seront réalisés sur animal vigile (très courte durée
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur et stress) attendues sur les animaux sont estimées de degré de gravité de légère à modérée. Elles sont liées à la nature des différents actes réalisés. Les actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs seront réalisées sous anesthésie gazeuse (classe légère). Une des nuisances est liée à la douleur de l’injection lors de l’administration des molécules ou lors des prélèvements sanguins (classe légère). Une nuisance liée à l’acte d’anesthésie est que celle-ci peut entrainer une sécheresse oculaire (classe légère). Une seule fois dans l’étude, deux injections sont à réaliser dans une fenêtre de 30 minutes et sont donc faites à deux sites distincts, l’une sur animal vigile et l’autre avec anesthésie (classe modérée). Dans une partie de l’étude, des prélèvements sanguins seront réalisés une fois tous les 2 jours sur une courte période de 7 jours (classe modérée).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes et des muscles pour l’analyse des tissus et des niveaux de produits thérapeutiques reçus afin de vérifier l’efficacité thérapeutique et l’absence de toxicité.
Remplacement
Avant d’envisager un traitement chez l’animal, nous réalisons d’abord des tests en laboratoire sur des cellules (tests dits in vitro). Cela nous permet d’éliminer les approches qui ne sont pas efficaces et de mieux comprendre comment certains composés agissent. Ces premières études ont déjà montré que certains immunomodulateurs peuvent réduire les anticorps qui empêchent les vecteurs AAV d’agir correctement, et ainsi améliorer leur efficacité sur les cellules. Toutefois, les expériences sur cellules ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement du système immunitaire dans un organisme vivant. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle animal, en l’occurrence la souris, dont le système immunitaire présente des similarités importantes avec celui des autres mammifères. Ce modèle nous aidera à vérifier si les traitements sont bien tolérés et efficaces dans un organisme complet, avant d’envisager des applications chez l’humain.
Réduction
Ce projet a été conçu pour limiter au strict minimum le recours aux animaux, en ne réalisant que les expériences jugées indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques. La sélection méticuleuse sur des cellules (in vitro) des immunomodulateurs les plus pertinents permet de réduire au mieux le nombre d’animaux nécessaires aux approches expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour déterminer le nombre de souris par groupe, afin de garantir des résultats fiables, tout en évitant l’usage excessif d’animaux. Les mêmes souris témoins seront utilisées dans plusieurs expériences, en tant que groupes contrôles pour différentes conditions expérimentales.
Raffinement
Les interventions potentiellement douloureuses ou stressantes seront réalisées sous anesthésie appropriée, précédée d’un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang seront effectués avec une méthode rapide (moins de 2 minutes) et bien tolérée, avec un faible volume et une alternance des deux côtés pour limiter les effets locaux. Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Nous utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir une température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Une attention particulière est également portée au risque d'infection, notamment durant les phases de vulnérabilité immunitaire induites par certains traitements, avec des mesures barrières renforcées pour limiter toute exposition.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour sa pertinence scientifique, sa compatibilité avec les vecteurs AAV et la disponibilité de données précliniques robustes. Cette souche présente une réponse immunitaire bien caractérisée et répertoriée dans de nombreuses publications, permettant une évaluation précise des effets des immunomodulateurs sur la neutralisation des vecteurs viraux. Elle est largement utilisée dans les études de thérapie génique, notamment pour la validation de stratégies de transduction et de réadministration d’AAV, facilitant ainsi la comparaison avec les données existantes. Sa petite taille permet de limiter les volumes biologiques requis tout en assurant une puissance statistique suffisante avec un nombre réduit d’animaux. L’utilisation de ce modèle s’inscrit pleinement dans le respect des principes des 3R, en particulier la réduction, grâce à l’optimisation des conditions expérimentales et à l’exploitation des résultats obtenu. Les souris de génotype sauvage sont réceptionnées au stade jeune adulte, pour une période d’acclimatation avant leur utilisation expérimentale entre 4 à 12 semaines d’âge. À ce stade, le système immunitaire est mature. De plus, leur condition physique est optimale pour les études de thérapie génique, notamment celles ciblant le tissu musculaire, car l’efficacité du transfert de gène rapporteur et son expression sont significativement plus élevées chez les jeunes adultes comparé aux animaux plus âgés. Ce choix d’âge garantit ainsi la robustesse des résultats.