Recherche fondamentale

Toutes tuées après le suivi de leurs fonctions locomotrices, 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou les muscles des pattes arrière, puis passent des tests de démarche, de sensibilité et de force pendant plusieurs mois. Le projet teste des approches de thérapie génique contre deux formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, sur des souris qui en reproduisent les atteintes nerveuses et musculaires. Le porteur présente une preuve de concept censée déboucher un jour sur des essais chez des patients, la mise à mort servant à examiner les tissus nerveux atteints.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester des approches de thérapie génique "ciblant le gène et le type cellulaire atteint " sur des modèles souris de la maladie de Charcot marie tooth (CMT). Il s'agit notamment de déterminer l'effet bénéfique d'injections de vecteurs viraux médicament exprimant un gène thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si les approches de thérapie génique proposées ont un effet bénéfique pour améliorer ces deux formes de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit d'une étude préclinique qui permettra, en cas de bénéfices thérapeutiques, d'établir la preuve de concept de l'efficacité de ce type d'approche de thérapie génique ciblée pour la maladie de Charcot marie tooth (CMT). A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour les patients atteints de CMT.

Procédures

L'ensemble des animaux (n=530) subiront des injections de type intrathécales au niveau lombaire ou intramusculaires dans les pattes arrières. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline et ne nécessite pas d’incision de la peau ou du muscle au préalable. En se basant sur notre expérience et celle de nos collaborateurs ,ces injections entrainent peu d'effets indésirables. Nous espérons notamment retarder voire prévenir l'apparition des symptômes grâce à l'approche thérapeutique que nous proposons. Néanmoins, elles peuvent occasionallement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention. Par la suite, les fonctions locomotrices de ces souris seront évalués au cours du temps au moyen de 3 ou 4 tests permettant d'analyser la démarche de la souris, la sensibilité de ces pattes ou encore la force de ces muscles. Ces tests entrainent peu d’inconfort aux souris. L’ensemble de ces tests pour un stade donné, seront effectué sur 3 ou 4 semaines afin de ne réaliser qu’un test par semaine et assurer une récupération aux animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer différents critères (poids, apparence, comportement général, blessure etc.) rendant compte de l'état de santé général de l'animal. La classification modérée des procédures prend en compte le cumul du phénotype de la souris CMT et des injections et tests effectués chez ces animaux.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT) (diminution de la dégénérescence axonale, réduction des défauts de myéline, etc.).

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann) et particulièrement les cellules de Schwann qu'il est impossible de différentier à partir de cellules pluripotentes humaines. Ainsi seuls des modèles souris nous permettent à l'heure actuelle d'établir la preuve de concept des thérapies que nous proposons pour envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion, force musculaire et vitesse de conduction nerveuse. De plus il s'agit d'une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,6 et 12 mois) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe, analgésiques après injection). Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu'ils atteindront le critères d'interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent la majorité des anomalies cellulaires et comportementales àpartir de 3mois, observés chez ces patients telles qu' une dégénérescence axonale, des défauts locomoteurs et des anomalies de myéline.

Nées immunodéficientes, 360 souris reçoivent dans le cerveau, dès leurs premiers jours de vie, une greffe de cellules issues de tissus de patients épileptiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent ensuite l'implantation d'électrodes et un enregistrement cérébral prolongé en cage individuelle, avec un risque d'activité épileptique et de rejet maternel. Le projet veut savoir si des astrocytes humains issus de tissus malades peuvent déclencher une hyperexcitabilité une fois greffés dans un cerveau de souris. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer leurs tissus cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’approcher les mécanismes à l’origine de l’épilepsie chez l’homme. Notre laboratoire utilise déjà des tissus réséqués chez des patients souffrant de tumeurs cérébrales ou de dysplasies épileptogéniques ou non, pour préparer des tranches aiguës utilisées en électrophysiologie. Malheureusement, la durée de vie de ces prélèvements n’est que de quelques heures. Nous proposons donc d’utiliser une partie de ces tissus pour isoler et mettre en culture des progéniteurs neuraux qui seront différenciés in vitro en astrocytes humains. Ces astrocytes différenciés ou les progéniteurs seront ensuite greffés dans le cerveau de souriceaux immunodéficients (lignée NOD SCID), où ils pourront s’intégrer dans l’environnement cérébral murin. Dans ce contexte, les cellules humaines pourraient induire localement certaines altérations fonctionnelles caractéristiques de l’épilepsie. Ce modèle permettra d’étudier le rôle spécifique des astrocytes humains dérivés de tissus épileptiques dans les mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie sur une durée prolongée. Ce projet s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec les neurochirurgiens de l’AP-HP spécialistes de l’épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et physiopathologiques impliqués dans la dysplasie corticale focale (FCD), une cause majeure d’épilepsie pharmacorésistante chez l’humain. En utilisant des cultures primaires dérivées de tissus humains post-chirurgicaux, ce travail permettra d’étudier de manière unique le comportement des astrocytes humains, dans un contexte épileptique. Les greffes intracérébrales réalisées chez des souriceaux immunodéficients permettront d’évaluer in vivo le potentiel épileptogène des astrocytes humains issus de tissus dysplasiques comparés à ceux issus de tissus non épileptiques. Ces modèles permettront de : déterminer si les astrocytes humains issus de tissus de FCD contribuent à la genèse ou au maintien de l’hyperexcitabilité neuronale ; explorer les mécanismes d’interaction entre astrocytes humains et circuits neuronaux murins ; fournir des données expérimentales inédites susceptibles d’orienter de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment dans les cas d’épilepsie résistante aux traitements médicamenteux ; développer un modèle préclinique pertinent pour tester à terme des approches de modulation cellulaire ou pharmacologique ciblée. Ainsi, les bénéfices scientifiques et médicaux attendus sont considérables, tant sur le plan de la compréhension fondamentale des épilepsies focales que sur le plan de la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux (360 souris nouveau-nées immunodéficientes) seront soumis aux interventions suivantes : -Injection intracérébrale de cellules humaines chez le souriceau nouveau-né, réalisée sans ouverture du plan cutané. -Chirurgie cérébrale chez l’animal adulte, comprenant l’implantation d’électrodes intracérébrales. -Enregistrements EEG télémétriques réalisés sur une période prolongée, sans contention. -Procédure terminale permettant la récupération des tissus cérébraux nécessaires aux analyses prévues.

Impact sur les animaux

-Greffe intracérébrale néonatale : cette intervention peut entraîner un stress de manipulation et une douleur aiguë très brève au moment de l’injection, ainsi qu’un inconfort transitoire dans les heures qui suivent. Chez les souriceaux manipulés, il existe un risque de rejet maternel ou de difficultés de tétée dans les 12–24 h suivant la greffe, pouvant se traduire par un retard de croissance ou une altération de l’état général. -Phénotype lié à l’immunodéficience (NOD SCID) : le phénotype immunodéficient peut être associé à une fragilité accrue et à une sensibilité augmentée aux infections opportunistes, susceptible d’entraîner une altération progressive de l’état général (amaigrissement, baisse d’activité), de durée variable selon les individus. -Implantation d’électrodes EEG : cette chirurgie peut provoquer des douleurs post-opératoires modérées pendant quelques jours, ainsi qu’un inconfort local transitoire lié à la cicatrisation et au port de l’implant. Une irritation cutanée au niveau des sutures et/ou du site d’implantation peut également survenir, généralement de courte durée. -Hébergement individuel lié au dispositif télémétrique : l’hébergement en cage individuelle sur une période prolongée peut induire un stress lié à l’isolement social, d’intensité faible à modérée, pendant toute la durée concernée. -Effets biologiques potentiels liés à la greffe : dans certains cas, une activité épileptiforme peut apparaître, pouvant s’accompagner de modifications transitoires du comportement et/ou d’une altération de l’état général (baisse d’activité, amaigrissement), d’intensité variable et de durée variable selon les individus.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses fonctionnelles et histologiques.

Remplacement

L’étude porte sur les mécanismes cellulaires impliqués dans l’épilepsie humaine, et plus particulièrement sur le rôle des astrocytes dérivés de tissus post-opératoires. Ces phénomènes nécessitent un modèle biologique intégrant un réseau neuronal fonctionnel et un environnement cérébral vivant, ce qui ne peut être entièrement reproduit par des approches in vitro. Les cultures cellulaires humaines sont déjà utilisées pour les étapes préliminaires (isolement, différenciation, caractérisation des astrocytes), ce qui limite le recours aux animaux aux seules expériences indispensables pour étudier les interactions entre cellules humaines et tissu nerveux in vivo. Ainsi, le recours à l’animal est restreint à la validation physiologique du modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé a priori à partir de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir un effectif minimal compatible avec des résultats robustes. Les effectifs par groupe ont été estimés à l’aide du logiciel G*Power, sur la base de : (i) test statistique prévu (comparaisons multiples/ANOVA selon les paramètres analysés), (ii) risque de première espèce α = 0,05, (iii) puissance cible 1−β = 0,90, et (iv) taille d’effet attendue estimée à partir de la littérature et/ou de données antérieures du laboratoire. Ces calculs conduisent à un effectif de 20 animaux par groupe pour les analyses principales. Afin de limiter le nombre total d’animaux, plusieurs mesures de réduction sont mises en place : les mêmes animaux sont utilisés pour collecter plusieurs types de données (EEG in vivo, puis analyses histologiques et/ou fonctionnelles ex vivo selon les cohortes), ce qui évite la duplication d’expériences ; les procédures chirurgicales et les acquisitions sont standardisées entre expérimentateurs pour réduire la variabilité interindividuelle ; enfin, l’organisation en lots expérimentaux est planifiée de manière à maximiser les données obtenues par animal.

Raffinement

Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale appropriée et associées à une analgésie systématique. Pour les chirurgies d’implantation d’électrodes EEG, l’anesthésie est réalisée par injection intrapéritonéale de kétamine (95 mg/kg)/xylazine (12 mg/kg), et une analgésie pré-opératoire est administrée par buprénorphine (0,1 mg/kg, S.C.). Une anesthésie locale (pommade EMLA / lidocaïne) est appliquée sur la zone d’incision. La température corporelle est maintenue à 37 °C pendant l’intervention et au réveil à l’aide d’un tapis/couveuse chauffant(e), et les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Après chirurgie, les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne pendant 7 jours permettant de détecter précocement tout signe de douleur, de détresse ou d’altération de l’état général. Les critères d’arrêt (points limites) incluent notamment : perte de poids significative ou retard de croissance, prostration ou baisse marquée d’activité, troubles moteurs persistants, automutilation/grattage au niveau de l’implant ou plaies, signes de déshydratation, ou tout comportement anormal durable. En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal est retiré du protocole et euthanasié sans délai conformément aux modalités décrites dans l’item relatif à la mise à mort. Le raffinement de l’environnement repose sur un hébergement adapté avec enrichissement (matériel de nidification) et accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Lorsque l’implantation EEG impose une protection du dispositif et la qualité des enregistrements, un hébergement individuel temporaire est mis en place ; il est limité au strict nécessaire et s’accompagne d’un enrichissement maintenu. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en limitant la durée de contention et le nombre d’interventions, afin de réduire le stress et l’impact sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus appropriée pour ce projet car elle permet d’utiliser des lignées immunodéficientes compatibles avec la greffe de cellules humaines. Les souris NOD SCID présentent un phénotype immunodéficient caractérisé par l’absence de lymphocytes T et B fonctionnels, sans phénotype dommageable spontané sur le plan moteur ou comportemental dans les conditions d’élevage et d’expérimentation prévues. L’absence de cellules immunitaires limite le risque de rejet des cellules humaines greffées et permet un suivi stable de leur intégration dans un cerveau vivant. Des travaux pionniers utilisant ce type de matériel cérébral humain ont été réalisés par des équipes internationales de recherche, validant ainsi ce choix. Les greffes seront réalisées chez des souriceaux âgés de 1 à 2 jours (P1–P2), car cette fenêtre développementale favorise la survie et l’intégration des cellules greffées dans le tissu cérébral, tout en permettant un suivi prolongé de leur maturation et de leurs effets fonctionnels au cours du développement postnatal.

Pour comparer deux régimes d'entraînement sur tapis roulant chez des rats vieillissants, 98 rats âgés de 12 à 15 mois vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal court trois fois par semaine pendant huit semaines, passe trois séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie et subit jusqu'à quatre prélèvements de sang par incision de la queue. À la fin, ils sont tués pour prélever leur cerveau et leurs muscles, que le porteur juge exploitables seulement frais et intacts. Les retombées annoncées, mieux calibrer l'exercice contre le déclin cognitif des personnes âgées, sont renvoyées à moyen terme, alors que le porteur affirme qu'aucun modèle sans animaux ne peut relier muscle et cerveau.

Objectifs

Dans ce projet, nous étudions l’efficacité de deux types de programmes d’entraînement physique, un à intensité modérée et un autre à haute intensité, sur des rats adultes. Nous observons comment ces entraînements influencent leurs capacités physiques, leur motricité, leur mémoire ainsi que les changements dans leurs muscles et leur cerveau. Pour cela, les animaux passeront des tests de comportement et d’endurance sur un tapis roulant, ainsi que des examens d’imagerie cérébrale. Des prélèvements sanguins seront réalisés plusieurs fois au cours de l’étude pour analyser certains paramètres biologiques. Enfin, à la fin du protocole, des analyses seront faites sur les tissus musculaires et cérébraux pour mieux comprendre les effets des entraînements.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment différents types d’exercices physiques influencent le cerveau, la mémoire et la motricité chez les individus âgés, chez qui des troubles liés à l’âge sont fréquents. En adaptant les entraînements à chaque individu grâce à des mesures physiologiques précises, les résultats pourront être plus facilement appliqués chez l’humain. Les bénéfices attendus sont les suivants : Pour la santé humaine : améliorer les recommandations d’exercices pour prévenir ou ralentir les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement. Pour la santé animale : mieux comprendre les effets de l’exercice sur le vieillissement animal, ce qui peut aider à améliorer le bien-être des animaux dans divers contextes. Pour l’environnement : indirectement, en favorisant des approches non médicamenteuses pour la santé, ce projet peut contribuer à réduire l’utilisation de traitements chimiques. Les résultats devraient être accessibles à moyen terme (quelques années) et pourront être appliqués à grande échelle, notamment dans les domaines de la santé publique, de la rééducation et du bien-être des personnes âgées.

Procédures

Les exercices physiques sont adaptés individuellement à chaque animal afin d’éviter des efforts trop intenses qui pourraient les stresser. Chaque séance dure environ 30 minutes et est réalisée trois fois par semaine pendant la durée du protocole (jusqu’à 8 semaines selon les groupes). Pour le prélèvement des tissus cérébraux et musculaires à la fin de l’étude, les animaux reçoivent un traitement contre la douleur environ 30 minutes avant la procédure. Ils sont ensuite profondément anesthésiés afin que le prélèvement se fasse dans les meilleures conditions possibles, garantissant un état optimal des tissus. Les examens d’imagerie cérébrale sont réalisés à trois reprises (environ aux semaines 2, 4 et 8). Chaque examen dure moins de 45 minutes et se fait sous anesthésie gazeuse pour minimiser le stress et les mouvements de l’animal. Des prélèvements sanguins sont effectués à la base de la queue sous anesthésie légère pour limiter le stress et les mouvements. Au maximum, quatre prélèvements sont réalisés sur les 8 semaines d’étude, avec un volume total de sang prélevé qui reste inférieur à 20 % du volume sanguin total sur une semaine, garantissant la sécurité des animaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’apparaître dans ce protocole sont les suivants : Des blessures cutanées légères peuvent survenir occasionnellement lors des entraînements sur tapis roulant, notamment à cause des frottements contre la bande roulante. Lors des tests d’effort, une petite incision partielle est réalisée à la pointe de la queue pour permettre les prélèvements sanguins, ce qui peut entraîner une douleur légère. Les anesthésies nécessaires aux examens d’imagerie cérébrale peuvent provoquer une détresse cardiaque ou respiratoire, liée à la sensibilité variable des animaux aux produits anesthésiques. Une anesthésie prolongée peut également entraîner une déshydratation des animaux. Aucun effet indésirable n’est attendu lors des tests de comportement, les animaux étant préalablement habitués aux procédures pour limiter le stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole afin de pouvoir prélever rapidement et dans de bonnes conditions des tissus essentiels (cerveau, muscles) nécessaires pour réaliser des analyses scientifiques précises. Ces analyses permettront d’étudier les effets des programmes d’entraînement sur les fonctions musculaires et cérébrales, ce qui ne peut être fait qu’avec des échantillons frais et intacts. Cette étape est indispensable pour répondre aux objectifs de la recherche.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d’un entrainement d'endurance au niveau musculaire et cérébral et qui puisse faire le lien entre ces 2 systèmes. Le rat est considéré comme un modèle de choix car les adaptations musculaires et cérébrales induites par l'entrainement sont proches de celles observées chez l’Homme.

Réduction

Un unique groupe contrôle est prévu sur l'ensemble de la durée du projet. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux mâles et femelles pour chaque groupe, nécessaire à la réalisation d’un test statistique paramétrique.

Raffinement

Les méthodes utilisées sont soit non invasives, soit très peu invasives (prise de sang) soit sans réveil. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les rats afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible en assurant le bien- être de l'animal. Par exemple, l’environnement des cages sera enrichi par la présence d'objets afin de réduire l'ennui des animaux. L’environnement enrichi comprend des igloos cartonnés, des tunnels en Carton 5 mm et en polycarbonate ainsi que des mini-rouleaux de papier. L’enrichissement est renouvelé toutes les semaines. Les mêmes expérimentateurs restent en contact avec les animaux tous les jours afin qu'ils s'habituent à eux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée en recherche car sa réponse à l’exercice physique présente de nombreuses similarités avec celle de l’être humain. Par exemple, on observe chez le rat des changements dans la manière dont ses muscles produisent et utilisent l’énergie, une amélioration de l’endurance et une augmentation de la force musculaire, comme chez l’humain. Le rat permet également d’évaluer les effets de l’exercice sur la mémoire, la motricité et le fonctionnement du cerveau à l’aide de tests de comportement et d’analyses en laboratoire. Les animaux seront inclus à un stade adulte avancé (entre 12 et 15 mois), ce qui correspond à un début de vieillissement. À cet âge, les rats ont un bon taux de survie et restent capables de réaliser les exercices physiques demandés. Ce modèle est souvent utilisé pour étudier les effets du vieillissement sur le cerveau et les capacités physiques.

Certaines des souris utilisées ont été développées pour permettre la suppression de cellules immunitaires, des caractéristiques dont le porteur affirme qu'elles n'entraînent "pas de problèmes de santé connus". 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit quatorze instillations d'un conservateur de collyre en sept jours, une autre subit une désépithélialisation de la cornée suivie de deux instillations de toxine bactérienne, avec des tests d'anxiété et de sensibilité mécanique de la cornée, ici nommés. Le porteur affirme que l'étude de la douleur oculaire exige un "organisme entier" et qu'aucun système in vitro ne permet d'évaluer une expérience à la fois sensorielle et émotionnelle.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant les différentes parties de l'œil. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, entraînent une altération de la qualité de vie. On estime que près de plus d’un patient sur 2 est gêné lors de ses activités quotidiennes. Ces douleurs peuvent être liées à diverses pathologies, telles que des maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. La cornée, tissu le plus innervé de l’organisme, est l’un des générateurs de douleur les plus puissants. Parmi les pathologies oculaires, la sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes ou à une altération de leur composition, entraînant des lésions de l’épithélium et des nerfs cornéens. Les symptomes sont variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Ces manifestations s’accompagnent d’une atteinte de la vie quotidienne : troubles du sommeil, anxiété et dépression. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Cette étude vise à étudier le rôle de l’inflammation dans le maintien et la chronicisation de la douleur cornéenne dans différents modèles précliniques développés chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier l’impact de la déplétion des cellules immunitaires ainsi que de comprendre leurs contributions spécifiques dans les mécanismes de maintien des syndromes douloureux au cours de la douleur oculaire. Ainsi, nous faisons l'hypothèse qu’après une atteinte cornéenne, à lieu un recrutement et une activation importante de cellules immunitaires localement au niveau de la lésion cornéenne et dans le système trigéminal, et ainsi participer aux mécanismes conduisant à la centralisation et à la chronicité de la douleur oculaire.

Procédures

Une partie des animaux recevra, sur animal vigile, une instillation biquotidienne pendant 7 jours d’un conservateur de collyre ou d’une solution saline tamponnée (deux administrations par jour, espacées de 4 heures) soit un total de 14 instillations par animal. Les animaux subiront des contentions manuelles de 30 secondes maximum pour chaque instillation et pour les tests comportementaux suivants : test d’anxiété (2 fois ou 3 fois, contentions 30 secondes et durée de test 10min par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (2 fois ou 3 fois, contentions durée 30 sec et test : 30 secondes). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (2 fois ou 3 fois par animal en fonction des procédures et durée du test de 5 minutes par animal). Une seconde partie des animaux subira une desépithélialisation cornéenne unique (1min), réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois pendant 10 minutes). Une instillation cornéenne (30 secondes) de toxine bactérienne sera effectuée lors de la chirurgie, puis une seconde 2 jours plus tard sur animal vigile (contention de l’animal pendant 30 secondes). Soit 2 instillations au total par animal. Les animaux subiront des contentions manuelles de 30 secondes maximum pour chaque instillation et pour les tests comportementaux suivants : test d’anxiété (2 fois ou 3 fois, contentions 30 secondes et durée de test 10min par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (2 fois ou 3 fois, contentions durée 30 sec et test : 30 secondes). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (2 fois ou 3 fois par animal en fonction des procédures et durée du test de 5 minutes par animal). Certains animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier contenant un agent pharmacologique dans les croquettes pendant 1, 2 ou 3 semaines en fonction des groupes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées lors des instillations biquotidiennes, pouvant entraîner un stress de courte durée (30sec). Les administrations des anesthésiques/analgésiques, peuvent aussi induire un stress ainsi qu’une légère douleur. L'anesthésie peut entraîner un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie, et dans de rare cas une mortalité. La desépithélialisation mécanique cornéenne induit une augmentation de la sensibilité cornéenne chez les souris. L’instillation des agents non pharmacologiques sur la cornée, induisent une augmentation de la sensibilité oculaire et l’apparition d’une inflammation cornéenne. Les procédures d’imagerie de surface oculaire présentent un léger risque car elles nécessitent une anesthésie générale, et peuvent induire une légère irritation de la surface oculaire.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure. Tous les animaux de ce projet (pour chaque procédure) seront euthanasiés

Remplacement

L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. En outre, ce projet vise à évaluer, le rôle de l’inflammation dans les mécanismes de douleur, lié à une suppression des cellules inflammatoires dans l’organisme entier de la souris, nécessitant des expériences comportementales et également des évaluations ex vivo de certains marqueurs biologiques qui nécessitent l’analyse de tissus préalablement prélevés sur animaux euthanasiés. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l’animal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun modèle in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Le projet a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible. Au total, le nombre d’animaux ne dépassera pas 1 800 sur une période de 5 ans. Afin de tirer un maximum d’informations de chaque animal, plusieurs tissus seront étudiés (comme la cornée, un ganglion nerveux et le cerveau). Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à partir d’études précédentes menées par l’équipe et de calculs statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimisées pour réduire leur stress et conformes à la réglementation en vigueur. Ils seront pris en charge uniquement par du personnel formé et expérimenté, et des professionnels s’occuperont de leur hébergement, de leur manipulation et des éventuelles interventions chirurgicales. La proximité entre les lieux d’hébergement et le laboratoire permet de réagir rapidement si un animal a un problème de santé. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement grâce à un système d’identification et à un suivi informatisé partagé entre les équipes. Ils seront observés tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés, et leur santé et leur niveau de douleur seront régulièrement évalués selon des critères validés par des experts en bien-être animal. Toutes les interventions pouvant provoquer inconfort ou stress seront réalisées sous anesthésie, avec un traitement contre la douleur avant, pendant et après la procédure. Si un animal présente un problème grave, l’intervention sera immédiatement arrêtée et des mesures appropriées seront prises pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées en recherche pour mieux comprendre certaines maladies, notamment la douleur oculaire. Dans ce projet, la souris est le modèle le plus adapté car la structure de l’œil et certaines fonctions du cerveau sont proches de celles de l’humain, et il existe de nombreux outils scientifiques spécifiques à cette espèce. Des souris adultes, mâles et femelles, seront utilisées. Certaines sont des souris « classiques », tandis que d’autres ont été spécialement développées pour permettre l’étude de certaines cellules impliquées dans l’inflammation. Ces caractéristiques particulières n’entraînent pas de problèmes de santé connus et ne nuisent pas au bien-être des animaux. Les souris seront accueillies à l’animalerie à l’âge adulte et bénéficieront d’un temps d’adaptation avant le début des expériences. Les procédures seront de courte durée, entre une et trois semaines maximum, si bien que les animaux auront moins de 11 semaines à la fin des expérimentations.

Produites pour être vendues à des chercheurs et à des entreprises, 72 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans la méthode principale, les nouveau-nés de moins de cinq jours reçoivent une irradiation de trois minutes puis une injection de cellules souches humaines dans le foie, avant un transport de quarante-cinq minutes en camion vers un éleveur professionnel. Le porteur explique que seules les femelles sont humanisées, "car il n'existe pas de demande du marché pour les mâles", et que la production est ajustée chaque semaine aux besoins prévus. Aucune de ces souris n'est tuée dans le cadre du projet, toutes étant gardées vivantes pour être utilisées ensuite par les clients, ce qui laisse leur devenir réel hors du champ de ce résumé.

Objectifs

Depuis plusieurs années, certaines souris spéciales, dites « immunodéficientes », sont utilisées comme modèles pour étudier le système immunitaire humain. Ces souris n’ont pas de défenses immunitaires propres, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines. On leur injecte notamment des cellules souches du sang humain, capables de reconstruire un système immunitaire complet. L’objectif est de créer des souris dont le système immunitaire est en grande partie humain, afin de mieux comprendre les maladies, tester des traitements ou développer des vaccins. Le but de ce projet est de produire ces souris « humanisées » et de les mettre à disposition de chercheurs et d’entreprises pour enrichir la connaissance et développer les médicaments de demain.

Bénéfices attendus

Les souris dotées d’un système immunitaire humain sont des modèles essentiels pour la recherche médicale, car elles reproduisent des caractéristiques proches de celles de l’être humain. Elles permettent de tester des médicaments dans des conditions plus réalistes, notamment pour des maladies liées au système immunitaire, au cancer, à l’inflammation ou au métabolisme. Ces modèles améliorent la qualité des recherches en offrant des résultats plus fiables et reproductibles. Cela contribue à réduire les échecs lors des essais cliniques et à accélérer le développement de nouveaux traitements. En utilisant des modèles adaptés, la recherche gagne en pertinence et limite le recours à des approches moins efficaces.

Procédures

Deux méthodes sont utilisées pour humaniser le système immunitaire humain chez les souris. Méthode 1, la plus courante, concerne les nouveau-nés âgés de moins de 5 jours. Ils reçoivent une irradiation unique, très courte (environ 3 minutes), suivie d’une injection de cellules souches humaines directement dans le foie, qui ne dure que quelques secondes. Méthode 2, utilisée uniquement dans de très rares cas (2% d'humanisations), concerne des jeunes femelles âgées de 4 à 5 semaines. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales de busulfan à 24 heures d’intervalle, chacune ne durant que quelques secondes. Ensuite, une seule injection de cellules est réalisée par voie rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse. Bien que l’injection elle-même prenne seulement quelques minutes, l’animal reste anesthésié pour une durée totale maximale de 7 à 10 minutes. Chaque animal ne suit qu’une seule méthode complète, soit au stade nouveau-né, soit à l’âge adulte.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux immunodéficients et doivent donc être maintenues dans des conditions très protégées pour éviter les infections. Lorsqu’elles ne sont pas exposées à des agents infectieux, elles restent en bonne santé. Un léger stress peut survenir lors de leur transport entre les sites, ainsi que lors de la manipulation des nouveau-nés et de leur séparation avec la mère. Chez les nouveau-nés, l’injection dans le foie peut provoquer une légère gêne de courte durée. Les injections intrapéritonéales de busulfan peuvent entraîner un inconfort transitoire au point d’injection ainsi qu’une période limitée de malaise, se manifestant par une baisse d’activité, un appétit diminué et une légère perte de poids. L’injection rétro-orbitale peut causer une irritation oculaire passagère liée à la manipulation, mais le produit injecté n’est pas irritant. Pour garantir une qualité optimale des soins et des conditions sanitaires, les animaux humanisés sont hébergés chez un éleveur professionnel jusqu’à leur expédition vers l’utilisateur final. En conséquence, ils doivent être transportés depuis notre site vers celui de l’éleveur. Ce trajet, d’une durée d’environ 45 minutes en camion agréé, est direct et réalisé dans des conditions contrôlées. Bien que court, ce déplacement peut entraîner un stress transitoire chez les souris.

Devenir

Tous les animaux sont gardés à vie à l’issue de chaque procédure de ce projet. Ils sont destinés à être utilisés dans des études scientifiques menées par les utilisateurs finaux, ce qui constitue l’objectif principal de leur production.

Remplacement

Les souris immunodéficientes portant un système immunitaire humain reconstitué sont aujourd’hui des modèles essentiels pour étudier le fonctionnement de cellules humaines dans un organisme vivant, avant les phases cliniques. Des méthodes alternatives sans animaux se développent, comme les systèmes organ-on-chip, les co-cultures avancées ou les organoïdes, qui permettent de reproduire certaines fonctions de tissus humains. Ces approches offrent des avantages, notamment la possibilité d’utiliser des cellules provenant de patients, et elles sont progressivement intégrées aux stratégies de développement pour réduire l’usage d’animaux. Toutefois, elles ne permettent pas encore de reproduire les interactions complexes entre organes, les régulations hormonales ou métaboliques, ni la dynamique complète du système immunitaire. Pour ces raisons, les modèles de souris humanisées restent indispensables pour comprendre les réponses immunitaires dans un organisme entier et obtenir des données fiables avant les essais chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris humanisées produites est défini en fonction des besoins prévus pour les six prochains mois. La production est répartie en petits lots hebdomadaires, ce qui permet d’ajuster les objectifs de production chaque semaine. Les fluctuations naturelles peuvent être compensées grâce à des lots produits jusqu’à deux semaines avant ou après. Ainsi, seules les souris réellement nécessaires sont produites et toute surproduction est évitée. Enfin, seules les femelles sont actuellement humanisées, car il n’existe pas de demande du marché pour les mâles. Des méthodes innovantes sont à l’étude pour, à terme, permettre l’utilisation des mâles ou réduire leur proportion à la naissance.

Raffinement

Les souris sont maintenues en conditions sanitaires strictes afin de les protéger des infections, auxquelles elles sont très sensibles en raison de leur immunodéficience. Pour l’humanisation selon la méthode 1, les petits sont manipulés avec précaution afin de limiter leur stress et permettre leur retour sans difficulté auprès de la mère. Avant toute manipulation, le technicien frotte ses gants avec de la litière afin de conserver l’odeur du nid. Cela est appliqué lors de l’irradiation et de l’injection des cellules humaines. Pour la méthode 2, l’injection rétro-orbitale est réalisée sous anesthésie afin de garantir le confort de l’animal. Après chaque procédure, les animaux font l’objet d’une surveillance attentive pendant 1 à 2 jours afin de détecter rapidement toute complication. En cas de perte d’appétit ou de poids, de la nourriture molle ou en gel est ajoutée pour faciliter l’alimentation.

Choix des espèces

Les progrès en génétique permettent aujourd’hui de créer des rongeurs présentant un système immunitaire humain ou l’humanisation de certains organes. Ces modèles sont essentiels pour mieux comprendre les maladies humaines et développer des traitements adaptés. Le rongeur est choisi pour sa taille et sa manipulation aisée, ce qui en fait un modèle idéal pour l’humanisation du système immunitaire par injection de cellules souches humaines. Ces modèles sont utilisés pour des études précliniques avant les essais chez l’Homme, notamment pour évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments. Ils permettent d’analyser le rôle des cellules immunitaires humaines dans des contextes complexes, comme les tumeurs ou les réactions inflammatoires. Le stade de développement des animaux utilisés est déterminé par la méthode d’humanisation : pour l’humanisation par irradiation et injection intra-hépatique de cellules souches de sang, des nouveau-nés âgés de 4 à 5 jours sont utilisés, car cette approche fonctionne mieux chez les très jeunes animaux. Pour la méthode utilisant le busulfan et l’injection en rétro-orbitale, des rongeurs âgés de 4 à 5 semaines sont choisis, car ils tolèrent ce traitement, qui serait toxique chez les nouveau-nés.

Jusqu'à sept mesures de force sous anesthésie générale, trois lavages vaginaux, quatre injections intrapéritonéales et une séance d'imagerie pouvant durer trois heures: 1 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses tissulaires et cellulaires. L'exercice imposé par électrostimulation sous anesthésie provoque une blessure du muscle du mollet droit, que le porteur compare à un claquage chez l'être humain. Le projet cherche à établir l'influence du sexe sur les étapes de la réparation musculaire et à identifier les mécanismes cellulaires en jeu. Le porteur affirme qu'aucun signe de souffrance n'est visible lors des lavages vaginaux ni au décours du dommage musculaire, tout en déclarant des nuisances modérées pour l'ensemble des animaux du fait du cumul des actes.

Objectifs

Le projet se déroule dans 2 EU. Il vise i) à mettre en évidence l’influence du sexe sur les différentes étapes de la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par un exercice d’intensité variable (i.e., de légère à élevée) ; ii) à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de i) à mettre en évidence l’influence du sexe sur les différentes étapes de la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par un exercice d’intensité variable (i.e., de légère à élevée) ; ii) à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques (vieillissement, cancer...)

Procédures

Les souris sont soumises à des lavages vaginaux (3 maximum, EU1/2), un protocole d’exercice par électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum, EU1/2), à une mesure de force (sous anesthésie générale, durée 5 minutes maximum, 7 mesures maximum, EU1/2). Une partie des animaux est également soumis à des injections ip (4 maximum, EU1/2) (moins d’une minute), une injection sous-cutanée et à une analyse par imagerie (sous anesthésie générale, durée 3 heures maximum, EU2/2)

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (contention, injections, lavages vaginaux, électrostimulation, anesthésies). Les souris femelles sont soumises à des lavages vaginaux (3 maximum) afin de contrôler leur cycle ovarien. L’ensemble des animaux est soumis à un protocole d’exercice qui induit une blessure des muscles du mollet droit mimant ainsi un « claquage » chez l’homme. Des mesures de force sont réalisées sous anesthésie générale pour déterminer la cinétique de réparation de la fonction musculaire. Notre expérience depuis le début du projet montre qu'il n'y a aucun signe de souffrance visible chez les animaux lors des lavages vaginaux et au décours de l'induction du dommage musculaire et des mesures de force. Toutefois, le cumul de ces actes peut générer du stress pour les animaux. Enfin, le traitement antalgique préalable à la session d’imagerie peut générer du stress lors de la contention.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses tissulaires et cellulaires

Remplacement

Le laboratoire a une longue expérience des essais in vitro par la culture cellulaire. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis). Un traitement antalgique est réalisé 30 minutes avant la session d’imagerie.

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont à l'âge adulte (8-12 semaines).