Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Étude du système vasculaire intra-nerveux et des effets de molécules vasodilatatrices dans le cas d’une neuropathie périphérique chimiquement induite à des souris développant une carcinose péritonéale, une tumeur intra-caecale ou sous-cutanée.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le nerf sciatique est mis à nu par incision cutanée trois à huit fois par animal, une vingtaine de minutes à chaque fois. 1 530 souris porteuses d'une tumeur du colon reçoivent une chimiothérapie qui provoque une neuropathie périphérique, 1 440 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur qualifie les douleurs des pattes de "sensations d'inconfort", tout en précisant qu'elles peuvent apparaître dès les premiers jours et "ne disparaîtront pas". Toutes sont tuées pour prélever cerveau, nerfs sciatiques, peau des pattes, ganglions et tumeur, et les tests censés évaluer leur douleur, environ trois fois par semaine pendant deux à huit semaines, ne sont pas nommés.
Objectifs
Nous avons mis au point un modèle murin de neuropathie périphérique induite par la chimiothérapie sur des souris. Nos résultats suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices améliore les symptômes d’une neuropathie périphérique chimiquement induite. Afin d’évaluer cette piste thérapeutique, il est important de vérifier qu’elle n’interfère pas avec l’efficacité antitumorale de la chimiothérapie. Pour ce faire, nous souhaitons induire une neuropathie périphérique chez des souris présentant une tumeur abdominale provoquée par une injection de cellules cancéreuses du colon murin. Ce projet permettra donc de statuer sur l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par la chimiothérapie aux stades aigus et chroniques.
Bénéfices attendus
Si nous prouvons dans ces expériences que l’administration conjointe d’une chimiothérapie et de molécules vasodilatatrices, seules ou en combinaison, n’interfère pas avec l’efficacité du traitement anti-cancéreux, alors l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par une chimiothérapie aux stades aigus et chroniques pourra être envisagée. Cela permettra aux patients de mieux supporté les traitements anti cancéreux et pourra éventuellement, en évitant l’abandon des soins, augmenter le pronostic des patients.
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales par 3 voies différentes. Pour deux d’entre elles, une seule injection rapide dans l’abdomen de l’animal sera suffisante. Pour la dernière, la procédure nécessitera l’endormissement de l’animal et une petite procédure chirurgicale d’environ 20 minutes. Ensuite, les animaux recevront différentes molécules d’intérêt dans le traitement des douleurs. Ces injections sont rapides, tous les jours ou tous les deux jours pendant 2 à 8 semaines. Enfin, l’administration de chimiothérapie sera effectuée une fois tous les deux jours pendant 2 semaines ou une fois par semaine pendant 8 semaines. Afin de suivre la progression tumorale, les animaux recevront entre 3 et 8 injections d’un produit permettant la visualisation de la tumeur. Les animaux seront soumis à une incision cutanée afin d’exposer le nerf sciatique 3 à 8 fois pendant une vingtaine de minutes. Enfin, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux permettant d’évaluer leur douleur. Ces tests seront effectués en moyenne 3 fois par semaine pendant 2 à 8 semaines et auront une durée d'environ 15 minutes pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les souris recevant une dose cumulée de chimiothérapie, nous pouvons nous attendre à une petite perte de poids de nos animaux. Les souris traitées à la chimiothérapie développeront une neuropathie périphérique avec des sensations d’inconfort au niveau des pattes notamment. Ces sensations douloureuses pourront être ressenties dès les premiers jours de la procédure et ne disparaitront pas. Une sensation d’inconfort pourra être ressentie après l’incision cutanée nécessaire à la réalisation du laser doppler. La manipulation des animaux lors des différentes administrations pourra engendrer un léger stress chez les animaux. Le développement des tumeurs pourra, en fonction du modèle, engendrer une gêne causée par la présence d’une masse tumorale au niveau de l’abdomen ou une gêne post-chirurgicale au niveau des sutures au niveau de l’abdomen. Les tests comportementaux utilisés pour évaluer la douleur pourront également engendrer du stress et de la gêne chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chacune des procédures et nous prélèverons les organes (cerveaux, nerfs sciatiques, peaux de pattes, ganglions dorsaux, tumeur) afin de conduire des études post mortem.
Remplacement
Ce projet modélise une pathologie humaine, la neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique et l’effet d’une potentielle solution thérapeutique. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres comportementaux et physiologiques ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été dimensionné pour permettre l’obtention de résultats statistiquement valides en prenant en compte les différents risques inhérents aux types d’expériences réalisées.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine ou plus. Les incisions nécessaires seront effectuées avec une analgésie et une anesthésie appropriées. Les animaux seront suivis grâce à une grille de score permettant la mise en place de points limites précoces permettant la prise en charge de toute douleur ou souffrance de façon rapide. Certaines expériences ont été raffinées grâce à un suivi par fluorescence non invasif.
Choix des espèces
Nous utiliserons pour ces expériences des souris males immunocompétents, espèces largement utilisées dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. La neuropathie périphérique chimiquement induite est un effet secondaire de nombreux traitement anti-cancéreux. C’est donc une pathologie qui touche majoritairement les adultes. Nous travaillons alors chez la souris adulte, âgée entre de 3 et 6 mois.
Exposition à long terme de deux additifs alimentaires riches en aluminium, le carbonate de calcium E170 et le pigment nacré d’aluminosilicate de potassium (INS176ii) sur les fonctions immunitaires et métabolique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Nourries pendant environ trois mois avec des additifs riches en aluminium, le carbonate de calcium E170 et un pigment nacré d'aluminosilicate de potassium, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les gestes qu'elles subissent restent décrits en termes vagues, des "mesures réalisées ponctuellement" et des "prélèvements biologiques" effectués "de manière encadrée", sans que le texte précise lesquels ni à quelle fréquence. Une étape destinée à induire une réponse inflammatoire est annoncée avec une baisse de poids "plus marquée", elle aussi sans détail. Les bénéfices annoncés visent l'évaluation des risques et l'aide aux politiques publiques, quand le protocole imposé aux souris reste, lui, sans description précise.
Objectifs
Différentes études ont montré que l’aluminium peut avoir des effets délétères sur le système nerveux et le système immunitaire. La population générale y est principalement exposée par l’alimentation, en raison de sa présence naturelle dans l’environnement mais aussi de son utilisation dans de nombreux produits du quotidien. L’aluminium est notamment présent dans certains aliments transformés, du fait de son utilisation lors de leur fabrication ou de leur conditionnement. Étant donné que l’alimentation constitue la principale voie d’exposition à l’aluminium, ce projet vise à étudier le devenir de substances alimentaires riches en aluminium, administrées seules ou en combinaison. Nous chercherons à déterminer si une exposition à l’âge adulte à ces substances peut favoriser l’apparition d’altérations de la barrière intestinale et de dysfonctionnements du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale sur l’exposition à l’aluminium de sources alimentaires afin d'aider les politiques publiques. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention nutritionnelle correspondant à une exposition prolongée à certaines substances alimentaires intégrées à leur alimentation, sur une période d’environ trois mois à l’âge adulte. Au cours de l’étude, différents paramètres liés au métabolisme et au fonctionnement intestinal seront évalués à l’aide de mesures réalisées ponctuellement. Des prélèvements biologiques seront effectués de manière encadrée afin de permettre ces analyses, dans des conditions visant à limiter au maximum l’inconfort et le stress des animaux. Par ailleurs, des échantillons fécaux seront collectés régulièrement tout au long de l’expérience afin de suivre l’évolution des paramètres d’intérêt.
Impact sur les animaux
La mise en œuvre de l’étude pourra entraîner un stress ou un inconfort modéré chez les animaux. Celui-ci sera limité par une habituation régulière aux manipulations et par un suivi attentif tout au long de l’expérience. Certaines évaluations pourront occasionner un inconfort transitoire, notamment lors de l’administration de substances ou de la réalisation de prélèvements biologiques. Des mesures adaptées seront systématiquement mises en place afin de limiter la douleur associée à ces gestes. Enfin, une des étapes de l’étude visant à induire une réponse inflammatoire légère pourra s’accompagner d’une diminution du poids corporel plus marquée que lors des autres phases, qui fera l’objet d’une surveillance renforcée.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer différents prélèvements de tissus nécessaires pour l'étude.
Remplacement
Les modèles alternatifs ne permettent pas aujourd'hui d’étudier la répartition des particules d’Aluminium dans l’organisme ni de recréer la complexité des dialogues Microbiote-intestin -foie -cerveau.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour répondre à nos questions scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Le nombre d’animaux a été choisi avec soin afin d’obtenir des résultats fiables, sans en utiliser plus que nécessaire. D’après nos études précédentes, le nombre le plus adapté est de 10 mâles et 10 femelles (et donc un total de 20 animaux par groupe). Les résultats obtenus seront ensuite analysés à l’aide de méthodes scientifiques reconnues, afin de vérifier que les différences observées sont réelles et non dues au hasard.
Raffinement
Durant l'étude l'angoisse sera atténuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant les prélèvements sanguin. L’identification des animaux à l’aide d’un poinçon d’oreille permettra de réaliser un suivi individuel (observations, contrôles de prise de poids des animaux). Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin et le foie. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (6 semaines) afin d’être mature sexuellement. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition à l’âge adulte sur le développement des fonctions intestinales, métaboliques et immunitaires.
Rôle d’un neuropeptide dans la détermination de la préférence alimentaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour établir le rôle d'un neuropeptide dans la préférence alimentaire, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent cinq jours isolées en cage métabolique, reçoivent des injections quotidiennes pendant cinq jours et subissent sept prélèvements de sang par incision du bout de la queue, au cours de tests glycémiques d'une à deux heures. Le porteur reconnaît que l'isolement peut entraîner un stress et une perte de poids, et que les tests peuvent provoquer une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Toutes finissent par une ponction cardiaque sous anesthésie, qui provoque la mort, ou par une perfusion intracardiaque, pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier le rôle d'une molécule dans la détermination de la préférence alimentaire et des intolérances alimentaires chez la souris. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces intolérances et de maladies inflammatoires intestinales.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons mettre en lumière le rôle d'une molécule dans la préférence alimentaire et faire le lien avec les intolérances alimentaires et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez l'humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests glycémiques d'une durée de 1h et 2h durant lesquels des prélèvements de sang seront effectués à partir de l'extrémité de la queue des animaux. Ils resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements de microgouttes de sang par animal, moins d'une minute par prélèvement). Les traitements par injections auront lieu une fois par jour pendant 5 jours. On réalisera une mesure de la prise alimentaire des souris grâce aux cages métaboliques où les souris seront isolées pendant 5 jours. Les souris seront également soumises à un prélèvement de sang terminal (ponction cardiaque causant la mort de l'animal) ou à une perfusion intra-cardiaque en étant anesthésiées, cela durera 5 min avant d'être mises à mort.
Impact sur les animaux
L'isolement dans les cages métaboliques pendant 5 jours peut entraîner un stress et une perte de poids chez les souris. Le gavage, les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress. La légère incision à l'extrémité de la queue peut provoquer une douleur. Les tests glycémiques peuvent entraîner une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Les injections des molécules ont déjà été réalisées lors de précédentes études et n'ont pas montré d'effets indésirables. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement par le personnel de l'animalerie ou les expérimentateurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car nous avons besoin de prélever leur sang et/ou leurs organes pour les analyser ultérieurement.
Remplacement
Pour étudier le rôle de notre molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures cellulaires puisque nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire.
Réduction
Les expériences seront limitées à un nombre de 24 souris (12 femelles et 12 mâles) par condition de traitement pour être statistiquement analysables. Les tests glycémiques, qui n'impliquent pas d'effet néfaste à long terme pourront êtres menées successivement sur les mêmes animaux en respectant une période de repos aux cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour analyser les résultats efficacement.
Raffinement
L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées selon les procédures décrites dans ce document, des points limites seront mis en place et le bien-être des souris sera vérifié régulièrement par le personnel de l'animalerie et les expérimentateurs.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Au cours de cette étude nous étudierons la physiologie de la souris adulte. Elles seront donc âgées d'au moins 8 semaines.
Régulation par les endocannabinoïdes et la corticostérone des processus de mémoire et de la dynamique du calcium dans les cellules hippocampiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Opérées pendant une heure et demie pour recevoir dans le cerveau un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement, les souris de ce projet reçoivent aussi jusqu'à deux injections de molécules agissant sur le système du stress avant des tests de mémoire. 2 856 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Les tests sont nommés, reconnaissance d'objets nouveaux et mémoire de localisation, trois essais de neuf à dix minutes sur trois jours, pour comprendre comment la corticostérone altère la mémoire et si le mécanisme décrit chez les mâles vaut aussi chez les femelles. Le porteur décrit le génotypage comme la coupe de 0,2 cm du bout de la queue entre cinq et douze jours de vie, suivie d'un tatouage des orteils, et reconnaît que cela provoque "un état de stress et de douleur", tout en classant 864 de ces souris en souffrance légère.
Objectifs
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent les effets cognitifs du stress, via la sécrétion d’une hormone (la corticostérone), et d'établir (et à long terme d'exploiter) les propriétés thérapeutiques potentielles des substances cannabinoïdes dans les troubles liés au stress. On sait qu'une interaction entre les corticostéroïdes et le système endocannabinoïde intervient dans la régulation des processus cellulaires impliqués dans les troubles de la mémoire. Ceci est exclusivement connu pour les animaux mâles. C'est pourquoi, dans ce projet, un premier objectif est d'étudier si les mécanismes d'altération de la mémoire induits par la corticostérone sont les mêmes chez les animaux femelles. Des preuves suggèrent également l'implication d'une autre sous-population de récepteurs cannabinoïdes dans l'altération de l'effet du stress et de la corticostérone sur les processus de mémoire spatiale. Nous souhaitons répondre aux questions suivantes : (i) quel est le mécanisme par lequel la corticostérone altère la mémoire, (ii) comment la corticostérone engage-t-elle le système endocannabinoïde dans les processus de mémoire affectés, et (iii) quel est le rôle de calcium dans cet effet ? Ce projet ouvrira ensuite la voie au développement de stratégies thérapeutiques efficaces pour les troubles de la mémoire liés au stress.
Bénéfices attendus
Le stress est associé à plusieurs états pathologiques, dont les déficits cognitifs. Les actions des corticostéroïdes dans le cerveau peuvent provoquer des effets aigus et chroniques dans plusieurs zones du cerveau qui sont associées à la mémoire. Ce projet contribuera à donner un nouvel éclairage sur la modulation de la mémoire par les corticostéroïdes. Bien que l'effet du stress et des corticostéroïdes sur la mémoire ait été bien décrit dans diverses études humaines et animales et que le rôle du système endocannabinoïde dans ces effets ait commencé à attirer l'attention, les détails de cette interaction corticostéroïde-endocannabinoïde affectant la mémoire sont largement inconnus. Ce projet a pour but de caractériser les processus moléculaires induits par les corticostéroïdes et liés à l'apparition des déficits de mémoire. À cet égard, ce projet aidera à disséquer l'interaction des corticostéroïdes avec le système endocannabinoïde impliquée dans les différents processus de mémoire. En contribuant à disséquer davantage les déficits cognitifs liés au stress, ce projet débouchera sur de nouvelles stratégies de traitement des troubles associés.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris seront soumises à des tests comportementaux pour évaluer leur capacité de mémoire (test de reconnaissance d'objets nouveaux ou test de mémoire de localisation d'objets). Ces tests consistent en 3 essais sur 3 jours consécutifs, chacun durant 9 ou 10 minutes, respectivement. Dans le cadre de ces tests de mémoire, l'animal subira des injections de différentes molécules afin de tester l'implication de différentes protéines dans l'effet du stress sur la mémoire. Les animaux recevront au maximum 2 injections de molécules différentes (à au moins 30 minutes d'intervalle), dont une sous-cutanée et une intrapéritonéale. De plus, les souris subissent également une procédure chirurgicale comprenant l'injection d'une molécule ainsi que l'implantation d’un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement. Ces interventions chirurgicales durent typiquement 1,5h.
Impact sur les animaux
Les différentes procédures décrites dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. En fonction des résultats obtenus, la nécessité d'effectuer des expériences supplémentaires conformes aux procédures sera évaluée. Les lignes suivantes décrivent ce que les animaux subiront au maximum. En fonction des retours expérimentaux, certains animaux pourraient ne pas subir l’intégralité de la procédure. Comme nous utilisons des lignées de souris mutantes, chaque procédure comprend le génotypage, qui se fait en coupant 0,2 cm de l'extrémité de la queue des souris à l'âge de p5-p12 et, pour une identification future, les orteils des pattes seront tatoués par micro-tatouage. Cela provoque un état de stress et de douleur chez l'animal. Nous utiliserons des tests de mémoire. Pour tester l'effet des corticostéroïdes sur les performances de la mémoire, les souris recevront une injection des molécules qui interagit avec le system du stress. Un animal ne recevra pas plus de deux injections et ces deux injections seront espacées d'au moins 30 minutes. Ces manipulations conduisent à un état de stress chez les souris. Les niveaux élevés de corticostérone dans le sang, déclenchés par une injection directe de corticostérone, se normalisent en 1 à 2 heures. De même, les autres composés injectés n'agissent pas plus de quelques heures sur l'animal. De plus, les animaux subissent une intervention chirurgicale. Les animaux seront manipulés et soumis à une anesthésie générale [induction à l'isoflurane 5,0 % - entretien à 2,0 %]. Il a 3 phases d’anesthésie lors de la procédure. L’animal peut ressentir du stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boite à induction) et de réveil. Au cours de ces opérations, le scalp des animaux est ouvert, ce qui peut entraîner un risque d'infection et un inconfort après l'opération. Par ailleurs, l’animal peut présenter un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant l’opération. Pour les procédures 3 et 4, l'implantation d'une fibre optique ou d'une canule représente un risque supplémentaire d'infection. De plus, ces implants augmentent le temps d'inconfort après la chirurgie car l'animal doit s'adapter.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'utiliser les cerveaux pour des analyses biochimiques ou électrophysiologiques ou, en cas de manipulation préalable (injection de molécules ou d'implants), pour l'histologie qui permettra de vérifier la présence des molécules et la et l'implantation correcte.
Remplacement
Pour comprendre les mécanismes complexes de la mémoire, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons malheureusement pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico) car celles-ci fournissent des informations trop limitées et ne peuvent reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. La réponse au stress et aux niveaux élevés de corticostéroïdes dans le cerveau est immensément complexe et peut influencer le comportement des souris et de tout autre organisme de manière cruciale. L'effet des corticostéroïdes sur différentes cellules du cerveau a déjà été décrit. Dans une prochaine étape, l’observation des effets des corticostéroïdes au comportement est cruciale pour mieux comprendre les conséquences cognitives du stress. En ce qui concerne l'effet de la corticostérone sur le calcium, nous utilisons un modèle in vitro complexe d'une région cérébrale majeure impliquée dans les processus de mémoire. Pour relier les résultats obtenus à partir de ces expériences ex vivo aux processus de mémoire, nous nous appuyons malheureusement sur les performances comportementales actives des souris afin de garantir la transposition à une situation in vivo.
Réduction
Pour le R de réduire, en effectuant un petit nombre d'expériences pilotes au début de ce projet, nous pouvons réduire considérablement le nombre d'expériences ultérieures (et donc le nombre d'animaux) nécessaires pour tirer des conclusions. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour dégager une conclusion statistique solide à partir de cette population. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation d'un maximum de 2856 souris sur une période de 5 ans. Ce nombre est justifié par l'utilisation de différentes approches comportementales et pharmacologiques dans plusieurs lignées de souris avec différentes modifications des protéines que nous souhaitons étudier. Pour les études incluant le comportement et l’analyse moléculaire, les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne dépasseront pas le chiffre de 12. Ce nombre de souris est le minimum requis pour avoir une signification statistique et est conforme aux études antérieures utilisant des méthodologies similaires. Cependant, si nos premières expériences montrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence.
Raffinement
Lorsque les animaux arrivent, ils sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et l'environnement d'élevage des souris est enrichi (matériel de nidification). Les animaux sont logés dans des cages collectives et pas dans des cages individuelles, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 20% sur deux jours consécutifs, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Cette évaluation est basée sur un gille de score qui comprend des aspects comportementaux et physiques et des mesures seront prises en fonction des scores obtenus. Ainsi, si le score est supérieur à ce qui est décrit sur la grille de score, l'animal sera euthanasié après consultation de la vétérinaire référente. Si le score ne passe pas ce seuil fixe, des mesures conservatoires seront mises en place. Ces mesures comprennent la mise en place de matériel d'enrichissement supplémentaire comme des tunnels ou des grésillements en cas de comportement agressif, des soins adéquats en cas de blessures cutanées, l'application de médicaments analgésiques en cas de signes de douleur, injection de sérum physiologique chaud, hébergement temporaire en enceinte thermostatée et maintien du régime à base de la nourriture humide. En cas de chirurgie, nous procédons à une anesthésie générale des animaux et pendant la procédure chirurgicale, toute hypothermie sera prévenue à l'aide d'un tapis chauffant. Le dessèchement oculaire sera prévenu par administration de gel ophtalmique. Une analgésie de la zone de chirurgie et aussi une analgésie générale sera appliquée. Dans la période postopératoire un analgésique sera administré systématiquement pour éviter la douleur et répétée une fois par jour pour 2 jours. De plus, le poids des souris sera enregistré quotidiennement pendant 5 jours en post-chirurgie. La mise en place des points limites chez l'animal repose sur une évaluation comportementale (voir ci-dessus) et le suivi de leur courbe de poids (réduction de plus de 20% de son poids sur 2 jours consécutifs).
Choix des espèces
Pour évaluer l'implication du système endocannabinoïde dans la régulation des effets du stress et de la corticostérone et de ses conséquences sur l'apprentissage et la mémoire, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée. De plus, la grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de formation de la mémoire ainsi que l'étude du système endocannabinoïde ont été réalisées dans le modèle murin. Par ailleurs, l'utilisation de lignées de souris transgéniques est l'épine dorsale technologique de cette étude. Donc, la grande majorité des outils génétiques disponibles pour étudier la fonction de protéines spécifiques sont disponibles exclusivement dans le modèle murin. Enfin, les infrastructures sont équipées pour l'étude systématique de la souris et pour assurer le bien-être approprié requis. Les souris utilisées seront adultes (âgées de 8 à 14 semaines post natales). Cela se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence, impliquant notamment une fluctuation de l’abondance et de la répartition du récepteur CB1 lors de cette période. En outre, cela nous permet de rester cohérents avec la littérature, car la plus grande quantité de souris adultes utilisées pour des expériences comportementales est âgée de 8 à 14 semaines.
Production d’anticorps chez le lama immunisé (lama glama) – MODIFICATION
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Jusqu'à huit épisodes d'injections d'antigènes et d'adjuvant, une prise de sang finale de cinq à dix minutes dans un couloir de contention avec licol et sangles sous-ventrières, et pour les meilleurs répondeurs jusqu'à trois campagnes supplémentaires espacées de six mois. 375 lamas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés vivants, 200 restant à l'élevage comme reproductrices et 175 placés chez des détenteurs qualifiés. Les anticorps polyclonaux obtenus sont produits à la demande de clients, un anticorps monoclonal étant ensuite sélectionné pour son potentiel thérapeutique. Le porteur affirme qu'il est "indispensable", "du moins pour le moment", de passer par le système immunitaire d'animaux, les banques d'anticorps synthétiques demandant selon lui encore une dizaine d'années de recherche.
Objectifs
MODIFICATION : L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux à usage thérapeutique. Les anticorps polyclonaux ont plusieurs cibles sur l'antigène, tandis que les anticorps monoclonaux n'en ciblent qu'une seule. Après plusieurs étapes de sélection, un anticorps monoclonal sera sélectionné parmi la masse d’anticorps polyclonaux sur la base de son potentiel thérapeutique, par example le traitement de maladies inflammatoires comme la myasthénie grave. Les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisations de lamas, car les anticorps du lama ont une structure très proches des anticorps humains, ce qui pourrait de fait limiter les risques de rejet thérapeutique chez l’homme et accélérer le développement pré-clinique. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors d’une stimulation spécifique. Le lama ne sera pas utilisé pour la production en masse du produit thérapeutique, mais celle-ci se fera en laboratoire. L’objectif de ce projet est donc de produire des anticorps à la demande de clients (prestation de services) à but thérapeutique dans le cadre des recherches translationnelles ou appliquées réalisées par ceux-ci. La recherche translationnelle (ou recherche de transfert) se situe entre la recherche fondamentale, dont le travail consiste à comprendre les mécanismes à l’origine du développement d’un cancer par example, et la recherche clinique (ou appliquée) qui vise à évaluer l’efficacité et thérapeutique dans des champs d’application aussi variés que: La prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé ou d’autres anomalies, ou de leurs effets chez l’homme, les animaux ou les plantes. L’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez l’homme, les animaux ou les plantes. Le bien-être des animaux et l’amélioration des conditions de production des animaux élevés à des fins agronomiques. La protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal. MODIFICATION : L’objectif additionnel améliore l’affinité et augmente la réactivité croisée des anticorps candidats grâce à la réutilisation des animaux les plus réactifs pour entre une à trois immunisations supplémentaires (rappel utilisant un déterminant antigénique éprouvé ou un changement d’antigène) après un délai minimal de six mois entre chaque procédure.
Bénéfices attendus
MODIFICATION: Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez des patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques. Ils sont particulièrement petits, ce qui leur permet de pénétrer des tissus autrement impénétrables (barrière sang/cerveau) et de plus elles résistent à des environnements hautement acides ou des températures élevées. Leurs qualités se sont avérées très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre de nombreuses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Chaque immunisation a pour but d’augmenter la réponse immunitaire et d’accroitre l’affinité des anticorps générés par le lama pour obtenir une grande variété de candidats anticorps à portée thérapeutique. Plus le nombre de candidats est élevé, plus la chance d’avoir un anticorps efficace en clinique dans une maladie donnée est élevée. MODIFICATION : Les immunisations supplémentaires (au maximum 3) accroissent la probabilité d’obtenir des anticorps de plus forte affinité et/ou à réactivité croisée vers des gènes communs à différents espèces et réagissant spécifiquement entre eux. Ceci permet des programmes non cliniques plus efficaces tout en épargnant des espèces supérieures. Les comparaisons intra-individuelles réduisent la variabilité et diminuent le nombre d’animaux requis.
Procédures
MODIFICATION - Au jour 0, un prélèvement de sang non-encore immunisé est prélevé du lama (durée du geste 1 à 2 minutes), après quoi l'animal reçoit immédiatement la ou les injections d’immunisation qui prennent quelques secondes. La quantité totale injectée ne dépassera pas les 4ml. L'injection du cocktail d'antigènes et de l'adjuvant est effectuée 1x/semaine ou à des intervalles de temps plus longs (2 semaines, ou jusqu’à 4 semaines dans de rares projets pour lesquels le nombre d’injections sera alors réduit à 3), répétée généralement 6 fois, rarement jusqu’à un maximum de 8 épisodes d’injections. Un prélèvement sanguin unique (1 à 2 minutes) ou à intervalles réguliers (2-4 semaines) pendant les séquences de « vaccination » pourra permettre d’évaluer la réponse immunitaire avant la fin de la procédure. Dans un délai de 4 à 14 jours après la dernière injection d'antigène, un prélèvement de sang sera réalisé en bas du cou. La prise de sang finale dure 5 à 10 minutes pendant lesquelles l'animal sera immobilisé dans un couloir de contention à l'aide d'un licol et de sangles sous-ventrières. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile. MODIFICATION - Les lamas ayant produit les meilleures réactions à la première immunisation pourront être utilisés pour 1 à 3 campagnes supplémentaires maximum (après un délai de repos d’au moins six mois entre chacune d'elles), suivant un protocole similaire à la première immunisation (prélèvements décrits ci-dessus). Ceci pour créer premièrement des réactions croisées améliorant les anticorps identifiés pendant la première campagne, en se concentrant sur les parties de la protéine qui importent le plus, afin d’augmenter leur efficacité. Le deuxième but est de trouver des anticorps capables de réagir avec différentes espèces afin de développer des traitements tout en réduisant l’utilisation d’espèces supérieures, conformément au principe du bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’utilisation d'un adjuvant lors des immunisations peut provoquer une réponse inflammatoire locale classique, accompagnée d'un gonflement. Comme pour toute vaccination, un épisode de fièvre peut survenir accompagnant cette inflammation. Les injections peuvent provoquer des douleurs aiguës transitoires (selon le produit injecté), ainsi qu’un inconfort dû à la contention légère nécessaire à la réalisation des gestes, un bras autour du cou pour quelques secondes. Même s’il peut y avoir un risque théorique de choc anaphylactique par l’utilisation d’un cocktail antigénique, il est finalement quasi nul, car les antigènes utilisés (protéines ou séquences ADN humaines) n'ont rien en commun avec le lama. Les prises de sang finales nécessitent une immobilisation plus longue, source d’un inconfort, voire d’un stress de 10 à 15 minutes, d’intensité et de durée variable selon les individus.
Devenir
Les femelles resteront en grande partie à l'élevage en tant que reproductrices, les mâles et les autres femelles seront placés chez des détenteurs qualifiés. Ceci après inspection par notre vétérinaire sanitaire en vue de leur état de santé et de leur socialisation.
Remplacement
Il est indispensable, du moins pour le moment, d’obtenir les anticorps polyclonaux en utilisant le système immunitaire d’animaux (in vivo). En effet, les techniques pour produire des anticorps à partir de librairies d’anticorps synthétisées (in vitro) ne sont pas encore au point et leur utilité est limitée à un nombre de domaines restreint (certains experts estiment qu’il faudrait au moins encore une dizaine d’années de recherches pour améliorer leurs capacités même dans ceux-ci). Elles génèrent des anticorps de moins bonne qualité car nous sommes encore loin de la complexité et de l’efficacité des anticorps obtenus via le système immunitaire des mammifères (ou même des humains dans le cas du covid), qui a évolué sur des millions d’années. De produire des anticorps à l’aide d’animaux fait usage d’une série de processus naturels améliorant, entre autres, leur capacité de se lier aux molécules de la maladie. Ceci car l’organisme animal est capable de sélectionner l’anticorps le mieux à même de se lier à une cible spécifique parmi mille milliards d’anticorps à l’aide un processus hautement complex, impossible à réaliser in vitro. Ce processus est déclenché par le démarrage de la réponse immunitaire de l’animal. La plus efficace des techniques in vitro arrive à gérer dix milliards. Étant donné que les anticorps des camélidés sont structurellement très proches des anticorps humains, il n'y aura que des modifications minimes qui seront nécessaires pour convertir les anticorps de lamas en anticorps pleinement tolérés par le système immunitaire humain. Ces qualités rendent les petits camélidés uniques. Les anticorps polyclonaux obtenus par immunisations de lamas sont la base pour les anticorps thérapeutiques sélectionnés (monoclonaux) qui seront séquencés et produits en masse en laboratoire (in vitro) sans utilisation d'animaux. Les anticorps prennent une place de plus en plus importante dans la recherche et les thérapeutiques humaines et vétérinaires, voir même agricoles. Nous avons donc besoin d’anticorps de la plus haute qualité. Naturellement les conditions dans lesquelles ces immunisations sont réalisés doivent obligatoirement se faire sous les meilleures conditions, afin d’éviter toutes souffrances inutiles aux animaux.
Réduction
MODIFICATION: En utilisant des cocktails de différents antigènes cibles, sous forme de protéine purifiée par exemple, le nombre d'animaux dans les essais est fortement réduit, tout en préservant le rendement expérimental. Nous visons une compatibilité suffisante des différentes protéines pour maximiser le nombre de cibles dans le cocktail. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors de chaque stimulation spécifique. Pour chaque expérience d’immunisation ciblée, 2 à 4 animaux maximum seront utilisés, car un individu seul pourrait produire des réactions atypiques ou non-concluantes. Le nombre d'animaux est basé sur les résultats des expériences précédentes. Des lamas non consanguins sont utilisés; donc des lamas qui sont génétiquement éloignés les uns des autres, ce qui rend leurs systèmes immunitaires plus efficaces. MODIFICATION : L’utilisation continue d’animaux présentant une forte réponse immunitaire réduit la nécessité de constituer de nouveaux groupes d'animaux naïfs pour des objectifs similaires, diminuant ainsi le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
MODIFICATION: Toutes nos installations sont conçues pour permettre aux lamas de vivre de sorte que soient respectés le mieux possible leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux sont logés en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Nous élevons des animaux de pâturage et les hébergeons sur nos 30 hectares de prairies permanentes et de bois. Dans le cours des soins de routine, nos lamas sont régulièrement manipulés. Traitements vermifuges par injections sous-cutanées et par solutions administrées oralement, tous les trois mois (Moxidectine, Praziquantel, Fenbendazol). Prises de sang pour les analyses de santé, tonte, coupe des ongles etc. La tonte annuelle étant l’intervention la plus stressante dans ce cadre, mais entièrement réalisée pour le confort des lamas, nous ne commercialisons pas la laine. Ces interventions ont comme effet collatéral d’habituer les animaux aux interventions humaines, ce qui nous permet de limiter le stress ou l’inconfort liés aux gestes d’injection ou de prélèvements sanguins répétés. Comme nos lamas sont destinés à une utilisation en tant qu’animaux de loisirs et de bât, voir de médiation animale, ils suivent également un entrainement à la longe. Nous sélectionnons nos lignées depuis plus de 30 ans selon des critères d’anatomie, de laine, de couleur, mais avant tout de caractère. Même dans ces conditions il y a toujours des individus plus sensibles que d’autres, qui auront droit à des séances d’éducation complémentaires. Nos interventions durant les procédures expérimentales prévues ne dépassent pas le cadre de ce qu’ils sont habitués à subir pour leurs soins courants et sont réalisés sur des animaux vigiles. L’impact léger de ces procédures ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques. Naturellement les animaux peuvent avoir un problème de santé sans relation avec la procédure durant celle-ci, en quel cas la vétérinaire les traitera selon leurs symptômes et décidera, en consultation avec le donneur d’ordre, s’ils doivent être retirés de la procédure. Les gestes réalisés sont de nature à ne provoquer qu’un inconfort voire du stress sur les animaux les plus sensibles au contact, malgré les séances d’habituation lors des soins quotidiens. MODIFICATION : Un intervalle minimal de six mois entre deux nouvelles campagnes d’immunisation est systématiquement respecté.
Choix des espèces
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez les patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques telles que leur taille et leur stabilité. Leur spécificité et leur sélectivité se sont avérés très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre diverses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin, c’est à dire 250ml pour les lamas de moins de 100kg et entre 250 et 400ml pour les individus plus lourds. Nos clients potentiels nous indiquent que 250ml pourraient désormais être la norme et que le maximum de 400ml sera normalement abandonné, ce qui constituerait un raffinement de la procédure.
Etude des mécanismes régulant la formation et la survie des lymphocytes T résidents mémoires dans le cerveau lors de l’infection par Toxoplasma gondii chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Exposées sept minutes aux rayons X, infectées par Toxoplasma gondii, gavées une fois par jour pendant deux semaines et soumises à des injections hebdomadaires, les souris de ce projet subissent aussi jusqu'à deux prélèvements sanguins. 1 680 souris vont être utilisées, dont 1 605 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leur cerveau et leurs organes lymphoïdes. Le projet porte sur les lymphocytes T résidents mémoires qui contrôlent la persistance du parasite dans le cerveau, avec des retombées annoncées pour les personnes immunodéprimées exposées à une encéphalite toxoplasmique. Pour décrire ce que subissent ces souris, le porteur retient une perte de poids pouvant atteindre 20 % entre le septième et le quinzième jour, puis une phase chronique qu'il qualifie de généralement asymptomatique, sans expliquer ce qui justifie de classer 1 605 d'entre elles en souffrance sévère.
Objectifs
Le parasite Toxoplasma gondii (Toxo) peut infecter une large gamme d’animaux , dont la souris (hôte dit naturel) et l’homme (hôte dit accidentel). Chez l’Homme, il est responsable d’encéphalites (inflammation du système nerveux central) chez les sujets immunodéprimés et de malformations chez le fœtus. Les lymphocytes T (LT) CD8 jouent un rôle primordial dans la lutte contre les pathogènes intracellulaires tels que Toxo. Nous avons récemment demontré que la différenciation des LT CD8 en LT dit résidents mémoires des tissus, aussi appelés Trm, était requise pour contrôler la persistence du parasite au sein du cerveau lors de la phase chronique de l’infection. La compréhension de la réponse immunitaire médiée par les Trm contre Toxo est donc essentielle au developpement de nouvelles thérapies contre ce type de pathogène chronique qui établit une latence à long-terme chez son hôte et peut se ré-activer de manière souvent fatale chez les sujets immunodéprimés. Nos résultats préliminaires ont identifié des voies de signalisation qui pourraient contribuer à la persistence et aux fonctions protectrices des Trm dans le cerveau. Dans ce projet, nous utiliserons l’infection chez la souris par le parasite Toxo pour étudier le rôle de molécules impliquées dans le developpement et la persistance des Trm dans le système nerveux central. En particulier nous déterminerons les conséquences de l’élimination de molécules cibles dans les Trm sur le contrôle de l’infection. Ainsi, les résultats attendus de notre étude aideront au développement de nouvelles thérapies ciblées et plus efficaces contre de nombreuses infections chroniques, mais aussi potentiellement dans le cancer où la présence de Trm a été montrée comme étant un indicateur de bon prognostic et de réponse à l’immunothérapie du cancer.
Bénéfices attendus
Sous sa forme latente, le parasite Toxo présent dans le cerveau d'une personne exposée peut se réactiver et causer une encéphalite en cas de défaillance immunitaire. Notre projet permettra d'identifier des mécanismes de protection immunitaire contre l'infection chronique du cerveau par T. gondii et de mieux comprendre comment les réactions immunitaires influencent le fonctionnement cérébral. Ainsi ce projet pourrait améliorer la prise en charge de personnes à risque d'encéphalite toxoplasmique en cas d'immunodépression (SIDA, cancer...) mais aussi plus généralement les résultats attendus de notre étude aideront au développement de nouvelles thérapies contre les infections chroniques.
Procédures
Les souris recevront une exposition aux rayons X pendant environ 7 minutes. Elles subiront des injections intraveineuses et/ou intrapéritonéales (1 injection toutes les semaines pour un maximum de 4 semaines), des administrations orales (gavage) de médicaments une fois par jour pour un maximum deux semaines, et des prélèvements de sang (maximum 2 prélèvements espacés de 4 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections d'anticorps et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La phase aiguë de l'infection par T. gondii est habituellement symptomatique entre Jour 7 et Jour 15 (phase aiguë de la toxoplasmose) et les souris peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial. S’en suit la phase chronique qui est généralement asymptomatique avec le parasite latent.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes (Cerveau, organes lymphoides secondaires) nécessaires aux analyses phénotypique et fonctionnelles des cellules immunitaires et en particulier des Trm mais aussi des mesures de charges parasitaires et d'inflammation.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Lorsque cela est possible, des expériences in vitro utilisant des lymphocytes T et des lignées cellulaires infectées par T. gondii sont réalisées. De plus, au lieu d'être propagé in vivo dans des souris comme c'était le cas historiquement, le parasite est cultivé sur des fibroblastes humains. Cependant, ces techniques ne permettent pas d’étudier l’impact des lymphocytes T sur le contrôle du parasite et la neuroinflammation, et n’interviennent qu’en complément de l’expérimentation animale. La complexité des systèmes immunitaires et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences en culture cellulaire) la ‘connectique’ des populations cellulaires mises en jeu. Il n’est donc actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos expériences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec un logiciel de statistique adapté.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux qui évaluera leur état général (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis dans notre fiche de scoring pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les signes cliniques attendus de l’infection sont : - En phase aiguë (J7-15) : perte de poids et mobilité réduite. Les animaux seront mis à mort sous 24h si ils atteignent un des score limite défini sur notre fiche de scoring. Il sera nécessaire de respecter un délai de 24h car le développement d’une réponse immunitaire permet dans bon nombre de cas une amélioration rapide de l’état général et la transition vers la phase chronique moins symptomatique. - En phase chronique (>J15) : ataxie / syndrome vestibulaire. Les animaux seront euthanasiés en cas de présence de l’un de ces signes. La procédure ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation.
Choix des espèces
T. gondii peut infecter tout animal homéotherme mais les rongeurs sont des hôtes naturels du parasite. Compte-tenu des nombreux outils d'analyse de la réponse immunitaire qui existent chez la souris, cette espèce est pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions hôte-parasite. De plus, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit plusieurs caractéristiques retrouvées chez l’homme : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite, modifications comportementales. Des souris adultes, âgées de 2 à 5 mois (afin de participer à l’effort de réduction car la susceptibilité à l’infection varie peu à ces âges), seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système nerveux central et immunitaire mature. Dans le cas des transferts de moelle osseuse, la reconstitution du système hématopoïétique prend 8 à 10 semaines, puis les souris subiront la procédure d'infection par Toxo et seront suivies 11 semaines après infection, donc l’âge maximal d’utilisation des souris sera de 30 semaines.
Les cellules du sang pour diagnostiquer l’insuffisance cardiaque dans un modèle de rat diabétique, obèse et hypertendu
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
216 rats génétiquement modifiés, obèses et hypertendus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Ils subissent des jeûnes de seize heures, des injections de glucose ou d'insuline avec mesure de la glycémie tous les quinze minutes, des échographies cardiaques sous anesthésie à dix et vingt semaines, puis une mesure de pression intracardiaque par sonde avant la mise à mort et le prélèvement des organes. L'objectif déclaré est d'établir la carte d'identité de cellules sanguines qui pourraient devenir un marqueur de la cardiomyopathie diabétique, testable ensuite chez les patients par une simple prise de sang. Le texte situe cette mesure de pression intracardiaque chez des souris, alors que le projet ne porte que sur des rats.
Objectifs
La cardiomyopathie diabétique est une maladie du muscle du coeur qui touche particulièrement les patients diabétiques de type 2, ayant souvent un syndrome métabolique. Elle est associée à un mauvais fonctionnement du coeur qui peut engendrer le développement d’autres maladies cardiovasculaires dont l’insuffisance cardiaque. L’insuffisance cardiaque se définit par une mauvaise distribution du sang dans le corps par le coeur et cliniquement aboutit à une fatigue et un essoufflement dans les gestes de la vie courante. Actuellement, les techniques d’analyses/identifications de cette maladie ne sont pas spécifiques du diabète de type 2 et sont souvent tardives, impliquant que la maladie est déjà bien installée. Récemment, des cellules circulantes du sang (PBMC) ont été identifiées comme des indicateurs biologiques potentiels de plusieurs maladies dont certaines en lien avec le diabète de type 2 et des maladies cardiaques. Ces biomarqueurs peuvent être isolés et étudiés à partir d’une simple prise de sang. Notre objectif est d’établir la carte d’identité des PBMC que nous pourrions associer à l’insuffisance cardiaque dans un modèle de rat diabétique, obèse et hypertendu, pour identifier un indicateur biologique spécifique de la cardiomyopathie diabétique dans le sang qui pourra ensuite être testé chez les patients.
Bénéfices attendus
Notre étude pourrait permettre d’identifier un indicateur biologique spécifique de la cardiomyopathie diabétique dans le sang qui pourra ensuite être testé chez les patients par simple prise de sang.
Procédures
Sur un groupe d’animaux, un test de raffinement du mode d’injection de l’insuline sera effectué pour le suivi de la glycémie afin de déterminer le statut du diabète. Après une période de repos (minimum une semaine), un jeun de 16h sera réalisé avant la mise à mort pour avoir un état nourri similaire pour les analyses ultérieures. Le lendemain matin, sous anesthésie profonde, un prélèvement de sang sera réalisé, entrainant la mort de l’animal. Les organes seront ensuite prélevés post-mortem pour les analyses. Sur un autre groupe, le suivi sera de 5 ou 10 semaines chez des rats génétiquement modifiés obèses ou minces, avec suivi de la glycémie toutes les deux semaines. Le développement du diabète chez les rats sera mesuré par un test à 8 ou 18 semaines. Pour cela, les rats seront mis à jeun pendant 16 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Une échographie sera effectuée à 10 et 20 semaines sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie générale :30min) pour étudier la fonction contractile du cœur. La pression du sang dans le cœur sera mesurée à l’aide d’une sonde sur des souris sous anesthésie et sous analgésie avant la mise à mort pour prélèvements des organes à analyser.
Impact sur les animaux
Ce type de rats obèses et hypertendus développe une insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée, c’est-à-dire un remplissage en sang diminué du cœur, mais une éjection normale du sang par le cœur. Comme chez les patients, face à un effort, ces rats sont plus fatigués. L’obésité peut entrainer un inconfort avec une diminution des mouvements. Les tests de tolérance au glucose ou à l’insuline peuvent entrainer une légère douleur de courte durée due à l’injection et au prélèvement de sang. La mise à jeun peut entrainer un risque d’hypoglycémie. Les prélèvements de gouttes de sang peuvent entrainer une légère douleur et un court stress.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse des différents organes.
Remplacement
Cette maladie comporte un dérèglement métabolique qui altère plusieurs organes, avec une communication par le sang entre eux : notre objectif étant d’identifier un marqueur circulant de cette maladie, le recours à l’animal est donc nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les prélèvements (sang et tissus) seront utilisés sur d’autres projets (analyses des molécules circulantes du sang, fonction des cellules du cœur et du foie).
Raffinement
Notre projet comporte un test de raffinement du mode d’injection de l’insuline (sc versus iv) au cours d’un test de tolérance. Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous médication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis
Choix des espèces
Ce type de rats obèses et hypertendus est à ce jour considéré comme l’un des meilleurs modèles précliniques de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée d’origine métabolique. Des rats ZSF1 obèses et minces seront utilisés à 10 et 20 semaines pour étudier la progression de la maladie.
Essai d’un traitement d’une maladie apparentée à la maladie de Parkinson par une substance chimique dans un modèle de souris transgénique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Conçu comme une expérience pilote destinée à constituer une plateforme d'évaluation d'autres substances, ce projet utilise 35 souris modifiées génétiquement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Trente d'entre elles reçoivent une inoculation de fibres protéiques dans le cerveau, sous anesthésie, au cours d'une intervention de trente à quarante-cinq minutes, puis un dérivé d'un composé du thé vert leur est injecté sous la peau deux fois par jour, cinq jours par semaine, pendant six semaines. Quatre tests d'agrippement mesurent leur force musculaire, et la confirmation des premiers signes moteurs, démarche saccadée et posture voûtée, déclenche la mise à mort avant la paralysie du train postérieur. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale, sans dire ce qui a été cherché de ce côté.
Objectifs
Le projet vise à évaluer l’intérêt d’un traitement par une substance chimique dérivée d’un composé du thé vert, ayant montré une capacité à désagréger la protéine (alpha-synucléine) présente dans les lésions du cerveau des patients atteints d’atrophie multisystématisée (AMS), une maladie apparentée à la maladie de Parkinson, mais rendant les patients rapidement dépendants et avec une survie inférieure à 10 ans. Nous souhaitons évaluer la possibilité d’utiliser un traitement par injections répétées sous la peau de cette substance chimique pour freiner le processus d’agrégation de cette protéine et la perte de force musculaire et les déficits de locomotion qui en résultent chez des souris modifiées génétiquement atteintes de cette maladie.
Bénéfices attendus
Le projet vise à évaluer dans un modèle expérimental une possibilité de traitement de l’atrophie multisystématisée, alors qu'aucun traitement neuroprotecteur n'est actuellement disponible. Nous pouvons disposer d’une substance prototype susceptible d’interagir avec la région de la protéine qui serait déterminante dans cette sévérité. La mise en place de ce protocole représente plus largement une expérience pilote qui permettra de constituer une plateforme expérimentale disponible pour évaluer d’autres substances ciblant l’agrégation protéique. Il n’existe en effet pas à ce jour de thérapie spécifique de la progression de ces maladies chez l’homme.
Procédures
Les souris, modifiées génétiquement, font l’objet d’une inoculation dans le cerveau de fibres protéiques (à l’âge de 6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez 30 des 35 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes. Aucun prélèvement n’est réalisé du vivant de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux font l’objet d’une inoculation intra-cérébrale de fibres protéiques sous anesthésie générale et locale, puis d’un traitement par la substance chimique par injections sous la peau deux fois par jour et 5 jours par semaine, pendant 6 semaines. Les injections dans le cerveau sont réalisées régulièrement au laboratoire et peuvent induire de faibles pertes de poids et un faible risque d’infection au site d’incision chez les souris. Cette inoculation est réalisée afin de reproduire la maladie humaine (atrophie multisystématisée) et mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs et son évolution à l’issue du traitement. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal, qui peuvent présenter une posture voûtée. La confirmation de ces premiers signes cliniques, tels qu’évalués selon une grille de scoring, détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire ad libitum. Afin d’évaluer plus précisément l’influence du traitement sur le statut clinique des animaux un suivi de la force musculaire par la réalisation d’un test d’agrippement est prévue, à 4 reprises au cours de la vie de chaque animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, les modifications génétiques présentes chez les souris utilisées dans ce projet conduisent à une paralysie, survenant plus précocement suite à l’inoculation de fibres protéiques. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers signes cliniques, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures. Celle-ci n’apparaît lors du vieillissement de ces souris qu’à partir de l’âge de 22 mois et les souris éventuellement survivantes à l’âge de 1 an seront mises à mort.
Remplacement
Le projet ne peut être réalisé que chez la souris, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et les lésions du cerveau suite à un traitement médicamenteux, ainsi que la structure de la protéine qui s’accumule dans le cerveau lors de la maladie. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.
Réduction
Les effectifs sont définis sur la base d'outils statistiques afin de pouvoir mettre en évidence un bénéfice éventuel du traitement sur la force musculaire et sur la durée de survie. Les échantillons cérébraux collectés permettront de réaliser des comparaisons des marqueurs des lésions du cerveau.
Raffinement
Pour les inoculations dans le cerveau réalisées sous anesthésies générale et locale, associées à l’administration d’un antalgique, afin de limiter la douleur. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie. Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé et les enrichissements présents dans la cage, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de conflits dans la cage. L’expérience des zootechniciens permet de repérer rapidement les souris qui présentent les premiers signes de déficits moteurs, se traduisant par une démarche saccadée et un déséquilibre, selon une grille de score adaptée à ce modèle de souris. Ceci permet d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris.
Choix des espèces
Les souris sont des souris modifiées génétiquement et développent rapidement la maladie suite à l’inoculation d’extraits cérébraux provenant de patients atteints d‘atrophie multisystématisée ainsi que de certaines fibres protéiques, telles que celle choisie pour le projet. Le projet prévoit des inoculations de fibres protéiques dans le cerveau chez la souris adulte (2 mois). Le choix de cet âge à l’inoculation permet de réaliser l’inoculation chez un animal adulte et son observation jusqu’au développement des signes cliniques annonciateurs d’une paralysie.
Nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des syndromes de Noonan dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
À partir de six semaines, les souris reçoivent deux injections par semaine, un prélèvement sanguin toutes les quatre semaines, une mesure de pression artérielle au brassard de queue de vingt minutes, et quatre échographies cardiaques sous anesthésie, jusqu'à l'âge de neuf ou dix mois. 2 880 souris porteuses d'un syndrome de Noonan vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que ces souris présentent un retard de croissance, des dysmorphies du crâne et des troubles cardiaques reproduisant les manifestations humaines, et qu'elles restent "globalement en bonne santé" jusqu'à dix mois. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes et conduire des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la continuité de recherches précédentes portant sur des approches innovantes pour traiter certaines maladies génétiques rares. Le syndrome de Noonan est une maladie héréditaire qui se manifeste dès la naissance par des traits du visage particuliers, une petite taille, des malformations cardiaques et un retard du développement. Il existe une forme apparentée de ce syndrome, caractérisée par des taches pigmentaires sur la peau et un épaississement du muscle cardiaque. Ces maladies sont liées à des anomalies du fonctionnement cellulaire, qui perturbent la croissance et le développement de l’organisme. À ce jour, il n'existe pas de traitement spécifique pour ces troubles. Nous souhaitons explorer une piste thérapeutique originale fondée sur la stimulation des mécanismes naturels de protection et de renouvellement des cellules. Ces mécanismes permettent notamment de préserver l’équilibre interne des cellules et de limiter les effets du vieillissement prématuré ou des défauts liés à la maladie. Le but de notre projet est de tester, dans un modèle animal adapté, si l’activation de ces processus naturels permet de réduire les signes cliniques associés à la maladie. Pour cela, nous utiliserons différentes méthodes, comme l’administration de substances actives ou la stimulation des défenses internes, et nous observerons leur effet sur la croissance, le fonctionnement du cœur et l’état général des animaux. À terme, ce projet pourrait déboucher sur de nouvelles stratégies de traitement visant à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par ce syndrome.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de valider, dans plusieurs modèles précliniques, une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant les mécanismes moléculaires du syndrome de Noonan (SN) et de ses variantes. Le syndrome de Noonan, une maladie génétique autosomique dominante, touche environ 1 naissance sur 1 000 à 2 500 et se caractérise par des malformations cardiaques, un retard de croissance, des anomalies crâniofaciales et des complications hématologiques et lymphatiques. Une thérapie capable de corriger ces altérations pourrait améliorer la qualité de vie des patients, prolonger leur espérance de vie et réduire les complications graves associées à cette pathologie. En validant cette approche, ce projet pourrait non seulement transformer la prise en charge des patients atteints de SN, mais aussi ouvrir des perspectives pour le traitement d’autres pathologies similaires.
Procédures
À partir de l’âge de six semaines, les animaux recevront des injections sur animal vigile deux fois par semaine. Chaque injection durera environ cinq secondes, et ces traitements seront poursuivis jusqu’à 9–10 mois d’âge maximum. Des prélèvements sanguins seront réalisés toutes les quatre semaines sur animal vigile, sous contention manuelle brève. Chaque prélèvement durera environ dix secondes et sera jusqu’à 9–10 mois d’âge maximum. Les animaux vigiles seront également soumis à des mesures de la pression artérielle toutes les quatre semaines, à l’aide d’un système non invasif utilisant un brassard de queue. Chaque session de mesure durera environ vingt minutes par animal, secondes et sera jusqu’à 9–10 mois d’âge maximum. Enfin, 4 échographies cardiaques seront réalisées sous anesthésie légère générale afin d’évaluer la morphologie et la fonction cardiaque. Chaque séance d’échographie durera environ 30 minutes par animal, soit sur une durée totale d’environ 3 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux transgéniques porteurs d’un syndrome de Noonan présentent un phénotype clinique progressif, qui peut entraîner un certain inconfort au fil du temps, notamment des anomalies de croissance, des troubles cardiaques et une altération de l’état général. Ces animaux restent globalement en bonne santé jusqu’à 10 mois. À partir de l’âge de 6 semaines, les souris sont soumises à différentes manipulations expérimentales répétées, susceptibles d’occasionner du stress ou une douleur transitoire. Les injections bihebdomadaires peuvent induire une douleur brève au point d’injection. Les prélèvements sanguins réalisés sur animal vigile sont générateurs de stress, avec un risque modéré d’hématome ou d’inflammation locale. Les mesures de pression artérielle, bien que non invasives, nécessitent une contention prolongée dans un environnement spécifique, ce qui peut engendrer un stress. Enfin, les échocardiographies réalisées sous anesthésie légère exposent les animaux à un inconfort temporaire lié à la contention, à la tonte et à la procédure elle-même.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
Avant d’engager des expérimentations in vivo, des étapes préalables ont été réalisées sur modèles non animaux : études bio-informatiques et analyses in silico pour identifier les voies moléculaires d’intérêt ; expérimentations in vitro sur lignées cellulaires et cultures primaires. C’est pourquoi, les études in vivo chez la souris sont indispensables pour étudier les mécanismes systémiques complexes impliqués dans le syndrome de Noonan et ses variantes. Cette pathologie affecte simultanément plusieurs organes (cœur, tissu adipeux, système squelettique, système immunitaire), et repose sur des interactions dynamiques entre différents tissus et compartiments physiologiques. Ces interactions ne peuvent être correctement modélisées ni reproduites dans des systèmes in vitro, même complexes, comme les cultures organotypiques ou les organoïdes. À ce jour, aucun modèle cellulaire, informatique ou ex vivo ne permet d’évaluer les effets systémiques, chroniques et multifactoriels des traitements envisagés dans ce projet. Avant d’engager des expérimentations in vivo, des étapes préalables ont été réalisées sur modèles non animaux : études bioinformatiques et analyses in silico pour identifier les voies moléculaires d’intérêt ; expérimentations in vitro sur lignées cellulaires et cultures primaires afin d’évaluer la faisabilité des approches et affiner les doses de traitement.
Réduction
Ce projet implique l’utilisation d’un maximum de 2880 souris, réparties entre les phases d’élevage, de traitement expérimental et d’analyses biologiques. Le nombre d’animaux a été rigoureusement estimé à l’aide d’un calcul de puissance statistique, afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables tout en limitant au strict nécessaire le recours aux animaux. Les expériences seront organisées de manière à regrouper les groupes témoins, et chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses (immunologiques, histologiques, moléculaires, métaboliques), permettant ainsi d’extraire un maximum de données de chaque individu. Certaines analyses seront également réalisées en collaboration avec d’autres équipes, ce qui contribuera à réduire globalement le nombre d’animaux utilisés. Enfin, des tests statistiques appropriés seront réalisés afin d’assurer une interprétation rigoureuse des résultats obtenus dans les différents groupes expérimentaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires et seront adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux auront un accès ad libitum à une alimentation standard et à de l’eau. L’environnement sera enrichi (coton de nidification, objets manipulables) pour favoriser l’exploration et limiter le stress. Une surveillance quotidienne permettra de détecter précocement tout signe de mal-être : yeux mi-clos, baisse d’activité, altération du pelage, posture anormale, respiration difficile, comportements stéréotypés. La douleur sera évaluée notamment à l’aide de la grille de score reconnue basée sur les expressions faciales des animaux, outil validé de reconnaissance faciale. Le poids sera contrôlé au moins une fois par semaine. Une perte supérieure à vingt pour cent du poids maximal ou une diarrhée persistante pendant plus de quatre jours sera considérée comme un point limite. Les sites d’injection seront régulièrement inspectés pour détecter toute inflammation ou infection; des soins locaux seront administrés si nécessaire (antiseptique). Les signes de douleur justifieront l’administration d’un traitement analgésique adapté au cas par cas. En cas de faiblesse ou de réduction de la prise alimentaire, un gel nutritionnel sera ajouté dans la cage. Toutes les manipulations seront réalisées par un personnel qualifié, formé aux bonnes pratiques. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie ou analgésie lorsqu’elles sont indiquées (échocardiographie, gestes potentiellement douloureux). Des lampes chauffantes seront utilisées pendant l’anesthésie et la phase de réveil pour maintenir la température corporelle. En cas de comportement agressif, les mâles seront hébergés individuellement afin de prévenir les blessures, qui seront immédiatement soignées. Des ajustements seront effectués en temps réel si une souffrance imprévue est observée. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel spécifiquement formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale, en veillant à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental s’explique par des raisons scientifiques et pratiques. La souris est largement utilisée en recherche, techniques expérimentales et suivi vétérinaire. Les lignées transgéniques disponibles permettent d’étudier des modèles spécifiques, comme les souris développant un syndrome de Noonan, présentant un phénotype clinique similaire à celui des patients humains. Ces souris affichent un retard de croissance (taille réduite, masse corporelle moindre), des anomalies corporelles (dysmorphies du crâne et traits du visage, cou court) et des troubles cardiaques. Ces caractéristiques reproduisent fidèlement les manifestations humaines, rendant ce modèle particulièrement pertinent pour l’étude des pathologies liées. Bien que leur viabilité soit réduite pendant la gestation, ces souris survivent généralement jusqu’à 10 mois, permettant des études approfondies tout en maintenant leur état de santé global. Les animaux seront inclus dans les procédures expérimentales à partir de 7 semaines, âge correspondant à un stade de développement physiologique complet, garantissant la fiabilité des résultats expérimentaux.
Effets de gradients environnementaux climatiques et des pressions anthropiques sur la sénescence biologique dans des populations naturelles de lézards
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés dans des populations naturelles, 1 125 lézards vivipares vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous relâchés à l'endroit de leur capture. Chaque individu subit une mesure de température corporelle, des mesures de taille et de masse, des photographies, un prélèvement de tissu caudal et, pour les adultes, une prise de sang au sinus suborbital sur animal vigile, puis jusqu'à six heures d'attente en tube individuel. Le projet cherche à mesurer comment le réchauffement, l'humidité, le couvert forestier, le tourisme et l'agriculture accélèrent l'érosion des télomères et la sénescence des individus. Le porteur justifie le relâcher par les autorisations de capture d'une espèce protégée et par ses suivis de population à long terme.
Objectifs
Le changement climatique bouleverse les équilibres écologiques des animaux ectothermes pour lesquels toute activité physiologique dépend de l’environnement thermique. Chez ces espèces, l’augmentation des températures environnementales accélère les processus métaboliques et physiologiques et favorise l’accumulation de dommages biologiques. Par exemple, des dérivés réactifs de l’oxygène s’accumulent au sein de l’organisme et occasionnent des dégâts importants à l’ADN ou favorisent l’érosion des télomères. Avec le réchauffement climatique, ces dommages liés au stress sont plus intenses et plus fréquents et peuvent accélérer le vieillissement cellulaire, entraîner une sénescence précoce des individus et diminuer leur longévité. Des travaux sur le lézard Zootoca vivipara ont par exemple démontré un lien entre longueur des télomères, réchauffement climatique et risque d’extinction locale dans les populations de lézard vivipare du Massif Central. Cependant, si certaines populations semblent particulièrement menacées par le réchauffement climatique, d’autres semblent peu impactées et nous suspectons donc que d’autres facteurs environnementaux interfèrent dans les processus physiologiques ou écologiques du déclin comme l’humidité, le couvert forestier ou des perturbations liées au tourisme ou à l’agriculture. Pour explorer ces effets, nous procéderons à un bilan écophysiologique de plusieurs populations à reproduction ovipare réparties sur un gradient d'altitude de plus de 2500 m étalé entre les Landes et les Hautes-Pyrénées. Nous contrasterons le long de ce gradient altitudinal deux niveaux de précipitation (humide et sèche) et échantillonnerons à la fois des populations éloignées et d’autres proches de zones d’activités humaines (pastoralisme et tourisme). En échantillonnant des populations ovipares dans la région sud-ouest de la France, nous pourrons tester si les altérations physiologiques observées le long d’un gradient climatique sont comparables ou non à celles déjà mises en évidence avec des protocoles semblables dans des populations vivipares du Massif Central.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de faire progresser notre compréhension des effets environnementaux sur le stress chronique et le vieillissement biologique dans les populations ovipares de lézards vivipares. Nos précédents travaux suggèrent l'existence d'une boucle d’accélération de la sénescence avec le réchauffement climatique. Elle implique notamment la transmission de télomères érodés des parents à leur descendance sous l’effet du stress et participe à accélérer l’extinction locale de populations. Ils suggèrent aussi une variation de ces processus thermiques entre populations. Ce projet permettra de franchir une étape complémentaire dans la compréhension écologique et physiologique de ce processus. Surtout, en caractérisant finement les différences de conditions environnementales entre populations, et au sein même des populations, nous pourrons mieux comprendre quels facteurs du milieu peuvent atténuer ou amplifier cette boucle d’accélération du stress (altitude et climat d’un côté versus précipitations, micro-habitat et perturbations anthropiques de l’autre).
Procédures
Une fois capturés, les individus feront l'objet d'une mesure de température corporelle puis de mesures morphométriques (taille et masse corporelle), photométriques (face ventrale et dorsale) et de prélevements sur animaux vigiles (une prise de sang sur les adultes et un prélèvement de tissu caudal sur tous les individus). L'ensemble des actes est effectué par un experimentateur aguerri aux gestes techniques afin de ne pas dépasser 10 minutes de contention. Les animaux seront conservés temporairement dans des tubes pendant un maximum de six heures.
Impact sur les animaux
Une première nuisance transitoire sera associée au stress induit par la capture et lors de la contention nécessaire aux mesures. Une seconde nuisance sera associée aux prélèvements de tissus et à la prise de sang par un microcapillaire au niveau du sinus suborbital.
Devenir
L'ensemble des animaux sera relâché à l'endroit de leur capture 6 heures après les captures. Le fait de devoir relacher les animaux est obligatoire étant donné les demandes d'autorisation de capture de cette espèce protégée et pour nos suivis à long terme des populations étudiées.
Remplacement
Il existe des modèles mécanistiques pour décrire le fonctionnement hydrique, thermique et métabolique des lézards mais pas pour leur vieillissement biologique. Il n’est donc pas possible de remplacer in vivo ou in silico le modèle biologique utilisé car cette étude vise à comprendre l’effet du changement climatique et des variations environnementales sur l’augmentation du stress métabolique et l’accélération du cycle de vie des individus en conditions naturelles. Le projet nécessite donc l’utilisation d’animaux sauvages afin de pouvoir comparer les effets des conditions de l’environnement local entre populations.
Réduction
Un nombre important d’animaux sera utilisé pour quantifier les conséquences de caractéristiques individuelles et environnementales sur le vieillissement biologique des individus. Pour correctement caractériser l’effet des facteurs individuels (e.g., âge, sexe), nous avons estimé en tenant compte de nos travaux précédents qu’un effectif de 45 individus par population permettrait d’obtenir une population statistique suffisante à nos analyses. Ce choix est justifié par un test de puissance statistique sur une ANOVA pour une taille d'effet équivalente à l'étude que nous avons menée en 2022 et en 2025 dans les populations du Massif Central. Cet échantillon comportera 25 adultes et 20 subadultes. Le nombre plus important d’adultes permettra de correctement caractériser l’effet de l’âge (2 à 10 ans d’âge en moyenne) qui peut varier entre chaque individu. Dans la mesure du possible, nous équilibrerons les sex-ratios, même si la probabilité de capturer des mâles adultes diminue fortement avec l’avancement de la saison. Pour correctement caractériser les effets environnementaux, nous capturerons cet effectif dans 25 populations. Ces populations sont réparties selon un gradient altitudinal (0 à 2500m) qui permet de correctement échantillonner des populations chaudes, intermédiaires et froides contrastées pour leurs précipitations, le couvert végétal et les perturbations anthropiques au sein de chaque classe altitude-température. Les sites d’étude ont été choisis parmi une liste de populations connues de nos équipes de façon à maximiser les différences environnementales et phénotypiques. Pour réduire notre impact sur les populations, chacune d’entre elle sera visitée un maximum de trois fois, même si les effectifs ne sont pas tout à fait atteints sur certaines d’entre elles. L’effectif total sera donc de 45 individus maximum pour 25 populations, soit 1125 lézards. Une technique d'imagerie sera utilisée pour identifier les animaux.
Raffinement
Les populations seront visitées chronologiquement en suivant leur phénologie naturelle pour collecter des individus à des stades de vie similaires et de minimiser les biais de comparaisons entre populations. La période de capture (mai/juin) correspond à une période où les individus se sont déjà reproduits et à laquelle les femelles entament leur gestation. Les captures seront effectuées par du personnel formé afin d’éviter les événements d’autotomie. La contention des individus suivant la capture sera limitée à quelques secondes. Une fois la température corporelle prélevée, les lézards seront immédiatement isolés en tubes individuels opaques, ventilés et équipés d’un morceau de papier absorbant humide. Ces tubes seront placés dans un conteneur ventilé et maintenu à une température constante (25°C). Le conteneur possède un thermomètre interne muni d’une alarme sonore nous indiquant si les températures dépassent les 26°C (température létale autour des 40°C). L’ensemble des mesures sera effectué sur le terrain pour éviter le stress de transport vers un laboratoire. Pour limiter la détresse associée à la contention lors des mesures, nous effectuerons ces dernières en moins de 10 minutes. Les mesures seront effectuées par un expérimentateur entraîné et assisté d’une équipe en charge de la logistique de chaque individu. Pour éviter des manipulations inutiles, les individus de moins de 2 g ne subiront pas de prise de sang. Des mesures d’hygiène strictes seront appliquées pour éviter toute contamination entre individus (e.g., thermomètres, outils chirurgicaux et scanners nettoyés entre chaque animal, et mains des expérimentateurs avec des lingettes imprégnées d'hypochlorite de sodium). Des points limites seront appliqués tout au long des procédures, avec l’arrêt immédiat des actes en cas d’atteinte de ces derniers. Un transfert vers un élevage en captivité sera alors envisagé. Après les mesures, les individus seront maintenus en observation et réhydratés avec un buvard humecté afin de surveiller leur état de santé. Nous enregistrons les coordonnées GPS du point de capture afin de relâcher les individus dans leur domaine vital une fois nos mesures prises. En cas de recapture (identifiée grâce au prélèvement caudal), les individus seront relâchés immédiatement. Les individus seront relâchés depuis leur tube, pour éviter une manipulation supplémentaire.
Choix des espèces
Notre étude vise à comprendre comment les conditions environnementales locales altèrent le niveau de stress et la dynamique de sénescence des populations de lézards vivipares dans le sud-ouest de leur répartition en Europe, au sein de l’aire de distribution d’un clade à reproduction ovipare. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux issus de la faune sauvage pour atteindre nos objectifs et à différentes classes d'âge dont des jeunes et des vieux lézards.
Etude des mécanismes cérébraux de la prise de décision dans les troubles du spectre autistique – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
631 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie de 45 minutes à une heure trente, puis un branchement quotidien de leurs implants à électrodes, certaines recevant quatre injections intrapéritonéales sous contention. L'optogénétique employée peut déclencher des mouvements incontrôlables, lever une patte ou tourner la tête, que le porteur décrit comme non douloureux. Il présente les tests comportementaux, des "jeux de décisions" fondés sur la récompense, comme "positifs pour le bien-être animal", et écrit que ce protocole augmente le bien-être des souris.
Objectifs
En temps normal, les synapses (les espaces de contact et de communication entre neurones) présentent un équilibre entre stabilité et plasticité qui permet à un individu d'être "flexible" sur le plan comportemental : il a un schéma de fonctionnement stable dans son environnement (croyances, habitudes) mais il peut s'adapter à un changement d'environnement. La flexibilité comportementale est un processus central au développement social et cognitif typique des individus. Les troubles du spectre autistique (TSA) sont caractérisés par une forte altération de cette flexibilité comportementale. Les TSA résultent parfois d'une variation sur un gène qui maintient l'équilibre entre plasticité et stabilité synaptique, car ce gène permet de fabriquer les protéines de "charpente" pour les synapses . Nous testerons donc le lien entre les protéines de "charpente" liées aux TSA, la plasticité neuronale et la flexibilité dans un contexte d'apprentissage. Notre hypothèse est que le lien entre protéines synaptiques et flexibilité comportemental est fait dans les différentes aires du cortex préfrontal, nous cherchons donc à comprendre comment.
Bénéfices attendus
Précisément, nous déterminerons: - le rôle causal des aires du cortex préfrontal dans la flexibilité - le codage au niveau neuronal de la flexibilité dans les différentes aires préfrontales - le rôle des protéines de "charpente" dans ces processus.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des neurochirurgies. La durée de l'opération est de 45 minutes à 1h30, avec toutes les précautions possibles pour éviter la douleur (anesthésie gazeuse, anesthéisques locaux, morphiniques en péri-opératoire). Les seules manipulations quotidiennes consisteront en un branchement des implants à électrodes (geste non douloureux). Des injections intra-péritonéales seront réalisées pour certains animaux (4 injections par animal sur la totalité de l'expérience). Le reste des procédures implique des tests comportementaux de type "jeux de décisions", basés sur des récompenses, et décrits comme positifs pour le bien-être animal dans la littérature
Impact sur les animaux
Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux interventions effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certains effets indésirables peuvent être causés par une technique ("optogénétique") qui permet d’allumer ou d’éteindre des neurones grâce à la lumière comme troubler l'activité locomotrice (le mouvement est incontrôlable mais non douloureux, comme lever une patte ou tourner un peu la tête). Les animaux d'une des procédures auront des contentions (pour lesquelles ils seront habitués en douceur) en vue d'injections intrapéritonéales sur quatre jours.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour vérifier que les sites (les zones très précises du cerveau) pour l'injection et d'implantation sont corrects.
Remplacement
Nous cherchons à évaluer le rôle des neurones pendant le comportement de décision, il est donc impossible de remplacer les méthodes in vivo par des methodes in vitro.
Réduction
Nous avons déjà effectué des expériences similaires (pour étudier d'autres zones cérébrales) ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire. De plus nous développons un modèle informatique de réseau de neurones récurrent capable de modéliser la prise de décision. L'activité électrique des neurones y est fonction des connexions synaptiques, qui elle-mêmes évoluent en fonction de l'activité électrique des neurones et des récompenses reçues par l'animal (plasticité synaptique). ce modèle fournira des prédictions précises sur ce qu'il est important d'enregister comme activité électrique, ce qui réduit le nombre d'animaux.
Raffinement
Pour diminuer et abolir les douleurs chirurgicales, nous utilisons une combinaison d'anesthésiques et d'antiinflammatoires pendant la chirurgie et en péri-opératoire. La technique sera réalisée en conditions d'asepsie pour prévenir les infections. Si la technique ("optogénétique") qui permet d’allumer ou d’éteindre des neurones grâce à la lumière déclenche des mouvements incontrôlables, même non douloureux, comme lever une patte ou tourner un peu la tête, le protocole sera interrompu. Le protocole sera aussi interrompu si les points limites définis sont atteints. Nous tiendrons une feuille de suivi post-opératoire sur les deux jours suivant l'opération pour évaluer rapidement ces points. Le stress de l’animal sera limité par un enrichissement permanent de l’environnement, ainsi qu’une habituation quotidienne à l’expérimentateur/rice et à la salle expérimentale. Le protocole de comportement consiste en un jeu de décisions et augmente le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le système de décision (le circuit de la récompense) est plus proche anatomiquement et fonctionnellement entre mammifère (rongeurs et Humains) qu'entre mammifères et invertébrés, poissons ou oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux. Enfin, nos tâches comportementales de type "jeux" ont été spécifiquement développées et adaptées à l'étude des prises de décision de la souris, tout en assurant leur bien-être. Ce projet implique d'utiliser des groupes de souris de même stade de développement (8 semaines) qui est un stade classique dans les études sur les prises de décision (8 semaines étant considéré comme le début de l'âge adulte dans cette espèce).
Étude du renouvellement intestinal au cours du développement et en conditions inflammatoires chez la souris – MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Séparés de leur mère, gavés de lait artificiel quatre fois par jour et exposés à un manque d'oxygène dix minutes trois fois par jour pendant trois jours, des souriceaux de huit jours comptent parmi les 699 souris de ce projet, toutes tuées, dont 371 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les adultes reçoivent pendant cinq jours, sur trois cycles, un composé dans l'eau de boisson sucrée qui provoque une inflammation intestinale, une perte de poids et des diarrhées, ou un gavage unique après quatre heures de jeûne. Le porteur qualifie le gavage d'inconfortable mais non douloureux, et les épisodes d'hypoxie de sources de stress bien que courts. L'objectif reste fondamental, comprendre le rôle des cellules souches dans le renouvellement de l'intestin, les applications pour les patients étant qualifiées de potentielles.
Objectifs
La régénération et le renouvellement tissulaire sont orchestrés par les cellules souches, qui se différencient et s'auto-renouvellent. L'équilibre entre l'auto-renouvellement, la prolifération et la différentiation dépend du microenvironnement des cellules souches. Ici, nous utilisons un tissu à fort renouvellement, l'intestin et ses cellules souches résidentes, comme modèle pour étudier la régénération.
Bénéfices attendus
Les découvertes issues de ce projet de recherche fera progresser significativement notre compréhension de la biologie intestinale et d'offrir des applications translationnelles potentielles pour améliorer les résultats pour les patients dans divers contextes médicaux.
Procédures
Les souris seront soumises à un traitement dans l'eau de boisson sucrée pendant 5 jours sur 3 cycles, une seule courte injection d'un composé chimique pendant 15 secondes ou un seul gavage d'une minute d'un composé chimique après un jeun de 4 heures. Une petite quantité de sang sera prélevée quelques minutes avant la fin de la procédure sous analgésie et anesthésie générale Les jeunes souris seront nourries de lait artificiel par gavage 4 fois par jour (1 minute) pendant 3 jours consécutifs et exposées à de l'hypoxie (10 min) 3 fois par jour pendant 3 jours.
Impact sur les animaux
La séparation de la mère et les épisodes d'hypoxie bien que courts peuvent être source de stress pour les souris. Le gavage par sonde adaptée à la taille de l'animal est considéré comme inconfortable mais non douloureux. Les souris seront soumises à un protocole induisant une légère perte de poids et des potentielles diarrhées. L'injection peut engendrer une douleur modérée mais locale. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'intestin et analyses dans le cadre de notre étude.
Remplacement
L'intestin est un organe complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, circulation sanguine et lymphatique, neurones, muscles et système immunitaire. Le but de ce projet est d'identifier le rôle des cellules souches dans l'homéostasie, le développement et la régénaration de l’intestin. Réduire le projet à un système in vitro pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions systémique présentes dans l'intestin et il est donc essentiel d'étudier les cellules dans leurs conditions physiologiques.
Réduction
Nous utilisons autant que possible des animaux de mêmes portées afin de limiter la variabilité. Chaque souris fera l'objet de multiples analyses et les tissus prélevés seront exploités pour plusieurs types d'expériences, maximisant ainsi les données obtenues par animal. Nous utilisons des modèles cellulaire qui permettent de reproduire partiellement l'intestin en culture. Enfin, des outils statistiques seront systématiquement appliqués pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire et assurer la signification statistique de nos résultats.
Raffinement
L'introduction par voie orale de composé chimique ou de lait est fait avec une sonde et un volume adapté à la taille de l'animal. Les injections sont faites avec une aiguille adaptée à la taille de l'animal. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale. Pour limiter la perte de poids, les souris ont à disposition de la nourriture humidifiées pendant toute la durée du traitement. Les jeunes souris sont gardées dans un incubateur pour maintenir leur température corporelle à 37°C. Les épisodes d'hypoxie sont courts et limités au minimum et se font en présence de poches de gel chaudes. Les animaux sont gardés en groupe dans un environnement enrichi, surveillés et pesés tous les jours et manipulés par des zootechniciens et manipulateurs formés. Une grille de score pour évaluer l'état général des souris est mise en place et en cas d'atteinte de points limites irréversible, l'animal sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est un modèle largement reconnu et particulièrement avantageux pour nos recherches car des protocoles mimant la régénération tissulaire et les maladies inflammatoires de l'intestin ont été établis et validés. Enfin, la grande similarité génétique, métabolique et immunitaire de la souris avec l'Homme, notamment au niveau de son système intestinal, en fait un excellent modèle translationnel, promettant des avancées inestimables pour la compréhension des fonctions intestinales en santé comme en maladie. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines pour étudier les maladies chroniques intestinales affectant les adultes et des jeunes souris de 8 jours pour étudier les maladies inflammatoires touchant les jeunes enfants.