Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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- Système immunitaire
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- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de la pollution atmosphérique dans les anomalies de résolution de l’inflammation dans la mucoviscidose
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 100 souris reproduisant l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, sous anesthésie, une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation des poumons, subissent des injections dans la veine de la queue sur animal éveillé, et une canule est placée dans leur trachée pour mesurer le flux d'air. Pendant 72 heures, l'air de leurs cages est modifié pour reproduire un pic de pollution parisien. Le porteur écrit que "seule l'expérimentation sur des animaux vivants" permet d'étudier ces interactions entre organes, tout en indiquant que les travaux préalables du laboratoire ont porté sur des cellules in vitro.
Objectifs
La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induisent une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de molécules aidant à résoudre l’inflammation et qui sont appelées SPMs. Une autre possibilité est que l’exposition à la pollution de l’air aggrave l’inflammation. Nous étudierons la production des SPMs dans un contexte de pollution de l’air sur un modèle murin mimant l’infection pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - une meilleure compréhension de l’impact de la pollution de l’air sur des souris dont l’atteinte mime la mucoviscidose des êtres humains, - une preuve de concept que les SPM pourrait traiter l’inflammation des poumons dans la mucoviscidose. - mieux comprendre les différences de gravité de la maladie respiratoire selon le sexe A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouvelles recommandations et de nouveaux traitements de l’inflammation des poumons pour les patients vivant avec la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux seront soumis à des traitements administrés en moins d’une minute soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes de solution par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, l’injection dans la veine de la queue sera réalisée sur souris éveillées, et l’administration intranasale sur les souris anesthésiées. Enfin pour mesurer la fonction pulmonaire des souris, celles-ci seront complètement anesthésiées et une canule sera placée (geste prenant moins d’une minute) dans leur trachée pour mesurer le flux d’air (la durée de la mesure est d’une dizaine de minutes). Pour induire un environnement pollué, l’air circulant dans les cages des souris sera modifié pour avoir une composition similaire à celle de Paris au cours d’un pic de pollution, cette exposition durera 72 heures.
Impact sur les animaux
Les souris exposées 3 jours à la pollution atmosphérique peuvent présenter des signes de stress liés au changement de lieu d’hébergement et au bruit environnant. Les animaux seront hébergés par 2 à 5 dans une cage identique à celle de leur environnement habituel afin de limiter leur stress. Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris qui en ont reçus. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés ici sera mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.
Remplacement
Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments. Cette étude vient compléter les études préalables de notre laboratoire qui ont été réalisées sur des modèles de cellules in vitro.
Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons étudié les publications préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence pertinente entre nos groupes de souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fournis dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Si besoin de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. Cette lignée de souris génétiquement modifiées est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose.
Etude cinétique chez le porcelet d’un biocide après exposition orale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Dans les élevages porcins, les ammoniums quaternaires servent à désinfecter camions, locaux, abreuvoirs et nourrisseurs sans rinçage, ce qui expose les porcelets dès leur arrivée. 24 porcelets de 28 jours vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, exposés cette fois à des doses connues par leur alimentation. Onze prélèvements de matières fécales sont effectués sur 28 jours, par défécation spontanée ou par écouvillon, et le porteur n'attend qu'une éventuelle diarrhée légère. Aucun porcelet ne sera tué à l'issue, tous étant réutilisés dans une procédure ultérieure, ce que le porteur présente comme une contribution à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le programme Ecoantibio, qui vise à limiter la sélection et la dissémination de bactéries résistantes aux antibiotiques ou antimicrobiens. Or, pour les pratiques d’hygiène dans les élevages porcins, des désinfectants sont utilisés. Il est reconnu que ces désinfectants, et notamment les ammoniums quaternaires (QAC), peuvent participer indirectement à la sélection et à la dissémination de bactéries résistantes aux antibiotiques. Ces QAC sont utilisés dans le cadre des procédures de nettoyage et de désinfection des camions de transport, des locaux, des abreuvoirs et des nourrisseurs, avant l’arrivée des porcelets (et ne sont pas rincés), ce qui provoque une exposition involontaire des porcelets et de leurs bactéries intestinales (microbiote intestinal). Ainsi, ce projet vise à mieux comprendre comment les populations bactériennes du microbiote intestinal des porcelets se comportent lors d’une exposition maîtrisée (différentes doses connues) aux QAC, et de suivre l’évolution des bactéries résistantes aux antibiotiques, suite à cette exposition, depuis les matières fécales des porcelets jusqu’au moment de l’épandage de ces lisiers dans l’environnement. De plus, un dosage des QAC dans les matières fécales des porcelets, puis dans les lisiers, permettra d’avoir un aperçu des concentrations présentes dans ces matrices suite à cette exposition, et un aperçu de la rémanence de ces molécules.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'approfondir nos connaissances sur l'évolution des populations bactériennes en lien avec l'exposition aux désinfectants usuels dans les élevages porcins, et de mieux caractériser le rôle de ces désinfectants, et notamment les QAC, dans la perturbation du microbiote intestinal des porcs et la sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques. Cela permettra in fine de proposer des pistes pour caractériser et optimiser les procédures d’hygiène en élevage porcin en prenant en compte la problématique de l’antibiorésistance, et d’émettre des recommandations éclairées concernant les pratiques.
Procédures
Durant l'experimentation, une récupération d'échantillons fécaux, soit par défécation spontanée, soit par stimulation avec un écouvillon sera effectuée régulièrement chez tous les animaux. Onze prélèvements de ce type auront lieu sur une période de 28 jours. La durée de cet acte ne dépassera pas 3 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’administration des QAC sera faite via l’alimentation à des doses ne provoquant pas d’effets indésirables cliniques. Eventuellement une légère diarrhée pourra être observée. Les prélèvements de féces n’engendreront qu’une légère contention qui pourra être source d’angoisse mais qui sera brève.
Devenir
Les animaux seront réutilisés dans une future procédure car la procédure effectuée sur ces animaux est légère. Cette réutilisation permettra de contribuer à la réduction (régle des 3R) du nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques, en évitant d'avoir recours à de nouveaux animaux.
Remplacement
En ce qui concerne l’étude de l’émergence ou sélection de bactéries/supports de la résistance aux antimicrobiens, il n’existe pas de modèle in vitro suffisamment développé et performant permettant de reproduire l’environnement complexe du tube digestif et du microbiote intestinal afin d’étudier les conséquences d’une exposition aux ammonium quaternaire et de prédire les niveaux de concentrations retrouvées. De plus, le remplacement partiel n’est pas possible car il s’agit de l’espèce cible de cette exposition (involontaire) aux biocides en élevage.
Réduction
Nous avons réduit au minimum le nombre de porcelets par groupe (6 animaux), à savoir 24 porcelets répartis dans 4 groupes ce qui permetra d’estimer correctement la variabilité inter-individuelle pour les concentrations fécales de QAC grâce à un modèle mathématique. Cela sera nécessire également pour obtenir la puissance statistique suffisante pour comparer la composition du microbiote entre les groupes.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine. Les animaux seront hébergés par groupe de 3 animaux dans des box sur caillebotis. Les cloisons en plexiglas transparentes entre chaque case permettent un contact visuel et olfactif entre les autres groupes voisins. Des jouets seront mis à disposition : balle, ainsi que jouets à mâcher suspendus. Une surveillance quotidienne du comportement et de l’état général des animaux sera effectuée, au regard de leur consommation d’eau, de leur alimentation, et en effectuant des mesures du poids.
Choix des espèces
Nous avons fait le choix d'utiliser des animaux similaires à ceux utilisés en élevage agricole afin de se rapprocher le plus possible des pratiques du terrain et avoir des résultats plus concrets. Les porcelets utilisés auront 28 jours. Ce stade correspond au passage au post-sevrage du porcelet, ce qui correspond à une exposition forte des animaux dans les élevages conventionnels aux biocides utilisés pendant les phases de désinfection des bâtiments, qui ont lieu quelques jours/heures avant le passage des animaux à la phase d’engraissement.
Caractérisation d’une lignée murine pour étudier le développement des neurones précérébelleux.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Un gavage unique ou une injection intrapéritonéale unique, moins d'une minute par animal sur souris vigile : 36 femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées pour que leurs embryons soient prélevés. Le projet vise à caractériser le rôle d'un gène dans la migration des neurones précérébelleux, en lien avec le syndrome de Joubert, dont le porteur rappelle la prévalence d'un cas pour 100 000 personnes. Rien n'est dit du nombre d'embryons prélevés ni du nombre de gestations conduites par femelle, alors que le risque de fausse route et de microlésions lié à la canule de gavage est décrit par ailleurs.
Objectifs
Les neurones précérébelleux sont des neurones localisés au niveau du tronc cérébral dans le cerveau. Ces neurones projettent leurs axones dans le cervelet. Les neurones précérébelleux naissent au cours du développement embryonnaire. Tous ces neurones migrent ensuite de différentes façons dans la partie basse de cette structure. Chez l’homme, plusieurs pathologies perturbent la migration des neurones précérébelleux, notamment le syndrome de Joubert et le syndrome HGPPS (associant une paralysie des mouvements oculaires à une scoliose). Les neurones précérébelleux participent au contrôle de la motricité et la planification des mouvements. Des analyses transcriptomiques (analyses sur l'expression des gènes dans différents organes) nous ont permis d'identifier un gène qui est exprimé dans cette population neuronale. L’objectif de notre projet est de caractériser l’implication de ce gène dans le développement et la migration des neurones précérébelleux.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Joubert a une prévalence d'un cas pour 100000 personnes. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement des neurones qui vont former les différentes régions du cerveau et permettra de mieux comprendre le développement de cette maladie.
Procédures
Une partie des animaux recevra un traitement par gavage (réalisé une seule fois, sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). L’autre partie des animaux recevra une injection unique (sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront un traitement unique par gavage ou par injection. La contention au moment de sa réalisation peut être source de stress chez les animaux. L'introduction de la canule de gavage peut quelques fois provoquer des microlésions. Lors de l'introduction de la canule, il existe également un risque de fausse route. Pour les animaux qui recevront le traitement par injection intrapéritonéale, l'introduction de l'aiguille peut être source de stress et une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Un faible risque d'infection existe également lors de l'introduction de l'aiguille.
Devenir
L'ensemble des 36 femelles utilisés dans le projet seront euthanasiés afin de prélever les embryons.
Remplacement
Du fait de la complexité de tissus, de la cinétique de développement et de migration de cette population neuronale, il n'est pas possible de modéliser les mécanismes que nous étudions par des modèles in vitro. L'utilisation de l'animal nous est donc indispensable pour étudier de façon complète et précise ces mécanismes développementaux.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 36 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Le nombre minimal d'animaux requis a été déterminé par un test de puissance et en fonction de nos expériences précédentes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température des cages (20-24degrés) et l’hygrométrie (45-55 pourcent) sont contrôlées, le cycle jour-nuit est de 12h. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis et des étiquettes de surveillance indiquant l’acte subi permettent une surveillance adaptée de l’animal par le personnel qualifié de l'animalerie et/ou l'expérimentateur. Nous les considérons en bonne santé si leur pelage est brillant, et que leur comportement est normal. S'il s'avérait qu'un animal présente des signes de souffrance, il sera immédiatement euthanasié. Les critères sont l'absence de locomotion, le pelage hérissé et/ou terne, présence de comportement d'évitement, prostration, dos vouté, identification d'une grosseur pouvant révéler la présence d'une tumeur.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est homologue à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Les lignées que nous utilisons ont déjà été publiées car utilisées dans d'autres système. Nous utiliserons des animaux matures sexuellement et en âge de reproduction (entre 8 semaines et 6 mois).
Instillation de composés à visée antalgique dans le traitement de la douleur oculaire dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 000 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 32 instillations dans l'œil, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon la cohorte, la cornée est râpée de son épithélium sous anesthésie, une toxine bactérienne est instillée, ou les glandes lacrymales sont retirées chirurgicalement pour installer une sécheresse oculaire durable. Le porteur annonce comme effets attendus une inflammation de la cornée, des irritations, des brûlures et une sécheresse oculaire d'intensité variable, y compris avec les agents censés soulager. Les tests comportementaux sont nommés, exploration et sensibilité mécanique et chimique de la cornée, et les retombées pour les patients restent au stade de l'identification de composés "prometteurs" quand l'atteinte oculaire des souris, elle, est le point de départ du protocole.
Objectifs
La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant les différentes parties de l’œil. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, entraînent une altération de la qualité de vie. On estime que près de plus d’un patient sur 2 est gêné lors de ses activités quotidiennes. Ces douleurs peuvent être liées à diverses pathologies, telles que des maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. La cornée, tissu le plus innervé de l’organisme, est l’un des générateurs de douleur les plus puissants. Parmi les pathologies oculaires, la sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes ou à une altération de leur composition, entraînant des lésions de la surface oculaire et des nerfs cornéens. Les symptômes sont variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Ces manifestations s’accompagnent d’une atteinte de la vie quotidienne : troubles du sommeil, anxiété et dépression. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Cette étude vise à évaluer les effets analgésique et anxiolytique de divers agents pharmacologiques à visée antalgique, administrés par instillation oculaire sur différents modèles de douleur oculaire développés chez la souris. La douleur oculaire, en particulier dans sa forme chronique, demeure aujourd’hui largement dépourvue de traitements efficaces. Ce projet permettra de comparer plusieurs agents pharmacologiques, à différentes concentrations, afin d’identifier les composés les plus prometteurs pour le développement de nouvelles thérapies ciblées contre la douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent des symptômes variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une altération de la qualité de vie (troubles du sommeil, anxiété et dépression). On estime que plus d’un patient sur deux est gêné dans ses activités quotidiennes. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra d’identifier des agents pharmacologiques au travers de modèles précliniques et d’applications topiques, ciblant directement la surface de l’œil, afin de soulager ou de traiter la douleur oculaire. En effet, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant la douleur oculaire sont encore peu connus et sont considérés comme des pistes d’exploration thérapeutiques.
Procédures
Une première cohorte des animaux vigile recevra une instillation biquotidienne pendant 7 jours d’un conservateur de collyre et d’un agent pharmacologique (deux administrations par jour, espacées de 4 heures). Une seconde cohorte d’animaux sera soumise à une desépithélialisation cornéenne unique (1min), réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois pendant 10 minutes). Une instillation (quelques secondes) de toxine bactérienne sera effectuée lors de la chirurgie, puis une seconde 2 jours plus tard sur animal vigile. Parallèlement les animaux auront des instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique, (soit 2 fois par jour espacées de 4h, sur 5 jours). Une troisième cohorte sera dédiée au modèle d’exérèse des glandes lacrymales. Les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie (anti-douleur) 1 fois pendant 15 minutes. Ils recevront des instillations biquotidiennes répétées d’un agent pharmacologique (2 fois par jour, sur 14 jours) sur animal vigile. Tous les animaux seront soumis à des contentions manuelles brèves (quelques secondes) nécessaires pour l’instillation des composés et à la réalisation des tests comportementaux suivants : test d’exploration (2 fois, 10min par animal pour les 3 modèles), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 fois, 30 sec par animal : pour le 1er et le 3ème modèle et 2 fois, 30 sec par animal pour le 2ème modèle), test de sensibilité chimique cornéenne (1 instillation, 1 fois, 30 secondes par animal pour le 1er et le 2nd modèle et 4 instillations 4 fois, pendant 30 secondes par animal pour le 3ème modèle). Le nombre total d’instillations par animal s’élève à 29 pour le premier modèle (1ère cohorte), à 13 pour le second modèle (2nde cohorte) et à 32 pour le troisième modèle (3ème cohorte). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (5 minutes et 4 fois au total pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Certaines administrations d’anesthésiques ou d’analgésiques peuvent aussi induire un stress transitoire de courte durée (maximum 30 sec, lié à l’insertion de l’aiguille et à la contention de l’animal), ainsi qu’une légère douleur. L'anesthésie peut entraîner un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie, et dans de rare cas une mortalité. Les chirurgies peuvent entraîner une perte de sang durant l’opération, une perte de poids, des infections et des douleurs oculaires durant la période postopératoire. Les instillations des agents non thérapeutiques biquotidiennes induisent un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec). La chirurgie et les instillations biquotidiennes des agents non thérapeutiques pour la mise en place des modèles étudiés, entraîneront une inflammation de la cornée, des irritations ou brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d’intensité variable. Les instillations des agents thérapeutiques et des solvants peuvent induire un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec), mais également peuvent entraîner une inflammation de la cornée, des brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d'intensité variable.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure. Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés.
Remplacement
L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. En outre, ce projet vise à évaluer les effets antalgiques de composés, nécessitant des expériences comportementales et également des évaluations ex vivo de certains marqueurs biologiques qui nécessitent l’analyse de tissus préalablement prélevés sur animaux euthanasiés. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l’animal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun modèle in silico n’existe pour répondre à ces questions.
Réduction
Dans le respect du principe de réduction, le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, avec un effectif total n’excédant pas 4 000 sur 5 ans. Plusieurs structures seront prélevées sur chaque animal (cornée, ganglion trigéminal, cerveau) afin d’optimiser les données obtenues par animal. L’estimation du nombre d’animaux à inclure repose sur des études antérieures de l’équipe utilisant des approches expérimentales comparables, ainsi que sur des calculs de puissance statistique, indispensables pour garantir une interprétation fiable et robuste des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimisées pour réduire leur stress et conformes à la réglementation en vigueur. Ils seront pris en charge uniquement par du personnel formé et expérimenté, et des professionnels s’occuperont de leur hébergement, de leur manipulation et des éventuelles interventions chirurgicales. La proximité entre les lieux d’hébergement et le laboratoire permet de réagir rapidement si un animal a un problème de santé. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement grâce à un système d’identification et à un suivi informatisé partagé entre les équipes. Ils seront observés tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés, et leur santé et leur niveau de douleur seront régulièrement évalués selon des critères validés par des experts en bien-être animal. Toutes les interventions pouvant provoquer inconfort ou stress seront réalisées sous anesthésie, avec un traitement contre la douleur avant, pendant et après la procédure. Si un animal présente un problème grave, l’intervention sera immédiatement arrêtée et des mesures appropriées seront prises pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées dans les études précliniques, notamment pour mieux comprendre la douleur oculaire. Dans ce projet, la souris constitue le modèle animal de choix car les yeux et leur cerveau sont assez similaires à ceux de l’humain, et il existe des outils génétiques avancés spécialement adaptés à cette espèce. Des souris adultes, mâles et femelles, seront utilisées. Certaines sont des souris « classiques » tandis que d’autres ont été élevées pour permettre le suivi de certaines cellules inflammatoires. Ces modifications n’entraînent pas de troubles connus et n’affectent pas le bien-être des animaux. Les animaux seront accueillis à l’animalerie à l’âge adulte et bénéficieront d’une période d’adaptation avant le début des procédures. Toutes les expérimentations dureront peu de temps, entre une et trois semaines maximums, ce qui signifie que les animaux n’auront pas plus de 11 semaines à la fin des procédures.
Suivi des déplacements post-lâchers de sub-adultes d’esturgeons européens Acipenser sturio – MODIFICATION
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Sortis du bassin d'élevage sur une civière, anesthésiés par diffusion d'anesthésique dans les branchies, ouverts pour recevoir une marque acoustique dans l'abdomen, 14 esturgeons européens de 17 ans subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération dure moins de dix minutes. Ces individus sont nés et ont grandi en captivité, et le projet sert à savoir si un lâcher tardif permet à des géniteurs potentiels de rejoindre les frayères, la marque devant les suivre pendant cinq ans. Le porteur écarte tout remplacement au motif que l'expérience porte sur l'espèce elle-même, et juge l'effectif faible mais acceptable au vu de la rareté de l'esturgeon européen. Les 14 poissons sont ensuite relâchés dans le milieu naturel.
Objectifs
Dans le cadre des programmes de repeuplement, on relâche de préférence des poissons jeunes afin que leur temps passé en captivité (où il y a des risques de domestication) soit limité, facilitant ainsi leur adaptation au milieu naturel. Toutefois, la survie des jeunes poissons, issus de relâchés ou sauvages, peut être très faible, car ils sont plus sensibles aux conditions environnementales et à la prédation. Afin d’améliorer la survie post-lâcher, des individus plus âgés et plus grands peuvent être déversés mais la question se pose de savoir si ces individus vont adopter un comportement adapté au milieu naturel et s’ils vont savoir rejoindre les frayères pour se reproduire et ainsi participer à relancer la dynamique de la population. Pour ce projet, dédié au suivi du programme de repeuplement de l’esturgeon européen, nous avons l’opportunité de relâcher des individus nés et élevés en captivité à un âge avancé afin de documenter leurs déplacements vers les zones de frayères potentielles et ainsi identifier si un lâcher tardif est pertinent ou non. Nous prévoyons donc de lâcher dans le milieu naturel 14 individus subadultes nés et élevés en captivité. Il s’agit d’équiper ces individus avec des marques acoustiques longues durées (env. 5 ans) et de détecter leurs déplacements grâce à un réseau d’hydrophones qui sera mis en place dans le milieu naturel pendant cette durée pour documenter la période de migration de reproduction. La marque acoustique sera placée dans leur abdomen, sous anesthésie générale. Ce projet de recherche est complémentaire à un précédent dans lequel la même pose de marques est autorisée sur des esturgeons européens capturés dans leur milieu naturel et libérés ensuite.
Bénéfices attendus
Le suivi dans le milieu naturel du devenir de ces individus lâchés à un âge avancé (géniteurs potentiels) nous permettra de tester s’il est pertinent de relâcher des individus à ce stade (déplacements avérés et fréquentation des frayères) ou si ce n’est pas pertinent (aucune détection des déplacements, pas de retour dans les fleuves) pour participer à relancer une dynamique de population en milieu naturel.
Procédures
Il sera procédé à un marquage intrapéritonéale de chacun des poissons,sous anesthésie ; la durée de cette opération est inférieure à 10 minutes.
Impact sur les animaux
Pendant la procédure expérimentale correspondant à la chirurgie, les individus peuvent subir un stress dû à la manipulation : transfert du bassin d’élevage au bassin d’anesthésie puis du bassin d’anesthésie vers la civière de marquage. La procédure de marquage étant réalisée sous anesthésie, nous nous attendons à un stress très limité. De même, pendant le transport et la phase d’acclimatation au site de lâcher, les individus peuvent subir un stress.
Devenir
Les poissons seront relâchés dans le milieu naturel, le but du projet étant de caractériser leur comportement post-lâcher.
Remplacement
Aucun remplacement ne peut être envisagé car l’expérience porte sur l’espèce considérée.
Réduction
Nous prévoyons de marquer 14 individus en captivité avant de les relâcher dans le milieu naturel. Il s’agit d’une opportunité de documenter le devenir de poissons lâchés à un âge avancé. Ce nombre est faible, cependant, au vu de la rareté de l’espèce, il nous semble acceptable pour avoir de premiers éléments de réponses et décider s’il y a un intérêt à équiper et relâcher d’autres individus de grande taille dans le futur.
Raffinement
Pour la manipulation entre les bassins (élevage/anesthésie/réveil) les individus seront maintenus et transportés dans des civières spécifiques adaptées à la taille des animaux. Le marquage se déroulera à proximité du bassin d’élevage afin de limiter la durée et la distance de manipulation. Les individus seront anesthésiés et surveillés de l’anesthésie au réveil (surveillance des différentes étapes de l’endormissement, des battements operculaires, du comportement de nage). Pendant la chirurgie, les individus seront placés sur le dos dans une civière en V dotée d’un matelas humide, et une dose sédative d’anesthésique sera diffusée au travers des branchies ; leur corps sera maintenu humide. Les manipulations seront effectuées par du personnel qui est habitué à travailler avec l’espèce en question et qui dispose des formations adaptées en terme d’expérimentation animale et de chirurgie sur les poissons en général et cette espèce en particulier.
Choix des espèces
L’étude porte sur l’esturgeon européen (Acipenser sturio), une espèce protégée qui bénéficie d’un programme national d’actions en faveur de sa restauration. Les poissons impliqués sont des subadultes ; l’objet du projet étant de suivre le comportement des individus de cette catégorie lâchés après de nombreuses années en captivité dans le milieu naturel, il s’agit de caractériser leur devenir, notamment leurs déplacements pendant plusieurs années (5 ans) et d’identifier s’ils effectuent une migration de reproduction vers les fleuves où ils ont été relâchés. Les 14 individus sont âgés de 17 ans, car il s’agit de l’âge auquel l’espèce peut commencer à se reproduire et donc initier une migration de reproduction en milieu naturel.
Enregistrement de neurones nociceptifs périphériques pour le criblage de candidats médicaments antalgiques chez la souris et le rat MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 630
Une douleur chronique installée exprès, puis un enregistrement électrophysiologique qui interdit toute survie : 630 souris et 630 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. 1 080 subissent une chirurgie nerveuse ou une injection de substance inflammatoire, 180 sont rendus diabétiques, et tous passent au moins deux tests mesurant leur hypersensibilité mécanique ou thermique. Le commanditaire est l'industrie pharmaceutique, qui fait cribler ses candidats médicaments antalgiques sur l'activité des nocicepteurs. Le porteur justifie le rat par "des raisons historiques" et la souris par la disponibilité d'animaux transgéniques, et présente l'anesthésie comme un raffinement permettant de tester des stimuli "très nociceptifs sans aucune souffrance".
Objectifs
Le projet consiste à tester des candidats médicaments de l'industrie pharmaceutique sur l'activité des nocicepteurs chez le rat ou la souris anesthésié. Ces mesures se font chez l'animal sain, ou chez l'animal présentant un état douloureux de type inflammatoire ou neuropathique, induit expérimentalement. Il y a 2 aspects distincts dans ce projet : la procédure de mesure d'activité des nocicepteurs (réalisée chez l'animal anesthésié, dite terminale ou sans réveil) et la génération des modèles physiopathologiques qui seront utilisés dans cette procdure (modèles physiopathologiques réalisés chez l'animal anesthésié avec réveil). Ce projet implique un travail de recherche fondamental car il n'y a pas ou peu de données publiées sur l’activité des nocicepteurs chez la souris, espèces qui forment pourtant via l'utilisation des souris génétiquement modifiés le coeur des avancés dans le domaine de la recherche sur la douleur.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, ce projet améliorera ou apportera une connaissance nouvelle sur l’effet de conditions physiopathologiques connus pour sensibiliser l’activité des nocicepteurs périphériques et supposé comme sous tendant un état de douleur chronique. Il permettra ensuite de déterminer l’efficacité analgésiques de candidats médicaments sur ces nocicepteurs de manière spécifique (par opposition à la mesure globale réalisée en comportement).
Procédures
1080 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale ou à une injection de substance inflammatoire sous anesthésie (durée inférieure à 15 min). 180 animaux seront rendus diabétiques et subiront 3 prélèvement sanguins vigiles (durée de 20 s). Tous les animaux seront soumis à au moins 2 tests comportementaux permettant de mesurer l’allodynie mécanique et/ou thermique (durée de 30 min).
Impact sur les animaux
Les modèles physiopathologiques mis en œuvre induisent un état de douleur chronique, modérée à sévère (c’est leur but, ce projet s’inscrit dans le développement de nouveaux traitements antalgiques). La mise au point de traitements analgésiques efficaces et dénués d’effet secondaire contre les douleurs neuropathiques nécessite l’utilisation de modèles de douleur neuropathique préclinique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car les mesures électrophysiologiques sont invasives et n'autorisent pas la survie des animaux.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes physiopathologiques comme les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexe impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques). C’est seulement chez l’animal entier (et non in vitro) que l’impact des caractéristiques physico-chimiques des candidats médicaments peut être évalué. D’autre part, l’électrophysiologie in vivo (et non in vitro) permet d’aboutir à une compréhension mécanistique du mode d’action des candidats médicaments analgésiques/antalgiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience, conjugué à plus de 10 ans de pratique dans le domaine (une spécialisation extrême est indispensable pour obtenir un taux de succès élevé dans ces expériences délicates); 2) le ciblage d’une population de neurone bien définie, les nocicepteurs non-myélinisés, qui permet de réduire les variations expérimentales liées aux caractéristiques individuelles des neurones enregistrés; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les plans d’expériences improductifs.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, la mesure de l'activité des neurones spinaux se fait chez l'animal anesthésié et permet de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience, et il est possible de faire des prélèvements sanguins au cours de l’expérience pour corréler l’exposition plasmatique aux effets observés. Troisièmement, le nombre d'animaux utilisés est réduit par le fait que chaque animal est son propre contrôle lors du test de candidats médicaments (principe des mesures répétées avant/après). Enfin, la mesure concomitante des paramètres cardiovasculaires apporte des renseignements connexes essentiels sur les caractéristiques du candidats médicaments. Pour assurer leur bien-être, les animaux disposent dans leur cage de bois à macher, de petits abris et de matière pour faire des nids. Les animaux sont contrôlés quotidiennement et des points limites sont mise en place pour éviter toutes souffrance excessive que les animaux pourraient subir.
Choix des espèces
L’utilisation du rat est due à des raisons historiques. C’est l’espèce sur laquelle le plus grand nombre de données a été obtenus dans le domaine de l’algologie. L'utilisation de la souris permet de tirer parti d’animaux transgéniques, et certains aspects physiologiques font de la souris une espèce plus appropriée que le rat pour obtenir des prédictions d’efficacité clinique. Par exemple, il a été montré que chez la souris, seules les fibres exprimant le récepteur TRPV1 étaient insensibles aux stimuli mécaniques. Cette situation est similaire chez l’homme, mais différente chez le rat. Il existe aussi parfois une plus grande homologie dans la structure de certaines cibles thérapeutiques entre la souris et l’homme que l’homme et le rat, comme c’est le cas pour le canal au sodium voltage dépendant 1.7. Les animaux sont utilisés au stade adulte, 8-12 semaines pour les souris, 6-8 semaines pour les rats. On utilise des animaux au stade jeune adulte, car ils présentent un système neurophysiologique mature et sont en forme (ce projet ne s'intéresse ni au développement, ni à l'animal âgé).
Etude du rôle d’une voie de signalisation dans la protection des greffons cardiaques hypertendus pendant la conservation hypothermique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tous tués en fin de protocole pour le prélèvement du cœur et des tissus, 488 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypertension leur est induite par une mini-pompe implantée sous la peau sous anesthésie générale, puis leur fonction cardiaque est suivie par deux échocardiographies. Dans certains groupes, une mort encéphalique est provoquée sous anesthésie profonde, avec des perturbations physiologiques importantes attendues en péri-mortem. L'objectif est d'élargir les critères de sélection des donneurs de greffons cardiaques humains, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre état hypertendu, conservation du greffon et reperfusion, ce qui rend selon lui le recours au rat "nécessaire".
Objectifs
La transplantation du cœur est souvent limitée par le nombre de cœurs disponibles. Pour pallier cette pénurie, les médecins utilisent parfois des cœurs dits « à risque », provenant de donneurs plus âgés ou ayant certaines maladies, comme l’hypertension artérielle. L’hypertension artérielle peut provoquer un épaississement de la paroi du cœur, rendant le tissu plus fragile lors de la transplantation. En effet, le cœur subit deux étapes critiques : le prélèvement, lorsqu’il est privé d’oxygène, et la réimplantation, lorsqu’il est à nouveau oxygéné. Ces phases peuvent provoquer des dommages aux cellules cardiaques, surtout si le cœur est déjà affaibli. Au niveau cellulaire, certaines protéines, comme YAP1, aident le cœur à résister au stress et à survivre aux contraintes. Des recherches récentes montrent que réguler cette protéine pourrait protéger les cellules cardiaques et améliorer le fonctionnement des cœurs transplantés.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer, dans un modèle préclinique de rat hypertendu représentant des cœurs à critères élargis, comment une conservation contrôlée à température modérée (15–20 °C pendant 20 h), associée à une modulation ciblée d’une voie de signalisation spécifique, peut préserver la structure et la fonction du muscle cardiaque. L’ambition est de limiter les dommages cellulaires et tissulaires provoqués par la privation temporaire de sang (ischémie) et son rétablissement oxygéné (reperfusion) lors de la transplantation. L’hypertension chronique rend le cœur particulièrement vulnérable à ces lésions, aggravant la dysfonction du greffon et réduisant à la fois sa durée et la qualité de conservation. Les bénéfices attendus comprennent : • L’identification de nouvelles stratégies pharmacologiques ou combinatoires capables d’améliorer la tolérance des greffons cardiaques aux contraintes de la transplantation ; • La limitation de la perte fonctionnelle après greffe ; • L’élargissement potentiel des critères de sélection des donneurs, augmentant ainsi le nombre de cœurs disponibles. Enfin, ces résultats pourraient servir de base pour l’optimisation des solutions de conservation et le développement de traitements ciblés pour les greffons à critères élargis. Cette approche combinée devrait, à terme, améliorer la qualité des greffons, réduire les complications liées à l’ischémie-reperfusion et renforcer les résultats cliniques des transplantations cardiaques.
Procédures
Le protocole s’étendra sur 4 semaines. Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les groupes expérimentaux. L’hypertension artérielle sera induite par implantation sous-cutanée d’une mini-pompe, réalisée sous anesthésie générale (30–45 min). La fonction cardiaque sera suivie par deux échocardiographies non invasives (10–15 min), réalisées à 2 semaines d’intervalle sous anesthésie légère. Dans certains groupes, une mort encéphalique sera induite sous anesthésie générale profonde (30–60 min).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent principalement : - Induction de l’hypertension : inconfort local et douleur transitoire au site opératoire, avec une mortalité péri-opératoire faible mais possible, liée à des complications anesthésiques ou chirurgicales. - Examens échographiques : stress léger et de courte durée lors de l’induction et du réveil. - Induction de la mort encéphalique sous anesthésiée : des perturbations physiologiques importantes sont attendues en peri-mortem.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation afin de permettre la récupération des organes et tissus pour les analyses fonctionnelles, cellulaires et moléculaires. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie générale profonde, conformément aux recommandations vétérinaires et aux normes éthiques, garantissant l’absence de douleur ou de souffrance.
Remplacement
Avant de recourir au modèle animal, la solution et la température optimale de conservation ont été testées sur des modèles cellulaires dans notre laboratoire, avec des résultats concluants. Cependant, aucun modèle in vitro ou alternative non animale ne permet de reproduire l’interaction dynamique entre l’état hypertendu, la conservation du greffon et la reperfusion, incluant les réponses systémiques, cellulaires et mitochondriales. Le rat est donc choisi comme modèle car il permet de reproduire de manière fiable et contrôlée l’hypertension induite par infusion d’Angiotensine II, ainsi que la physiopathologie complexe de la mort encéphalique. Cette approche est nécessaire pour répondre aux objectifs précliniques du projet et garantir la pertinence translationnelle.
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables. Par ailleurs, les animaux de la première étape du projet seront intégrés aux groupes contrôles de la suite du projet. Le projet est organisé par étape de validation successives et seuls les paramètres optimaux sont appliqués d’une étape à l’autre.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur ou souffrance, les injections et prélèvements seront effectués sous prémédication analgésique associée à une anesthésie locale. Les examens échographiques seront réalisés sous anesthésie générale afin de garantir l’absence de stress ou d’inconfort. Les interventions chirurgicales seront menées sous anesthésie générale, précédée d’une prémédication analgésique administrée par voie sous-cutanée. Des points limites spécifiques et adaptés à chaque type de procédure ont été définis, afin de garantir une prise en charge rapide en cas de signes de douleur, de détresse ou de complication.
Choix des espèces
Le rat est utilisé car ses cœurs isolés perfusés ont été largement étudiés et les voies de signalisation ciblées dans cette étude sont conservées chez l’homme. Les jeunes adultes (250–450 g) permettent de reproduire les altérations cardiovasculaires observées chez les patients hypertendus, offrant un modèle pertinent pour évaluer l’effet de la modulation des voies étudiées sur la fonction cardiaque et l’intégrité du tissu après conservation et reperfusion.
Prélèvement invasif en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour génotyper des lignées génétiquement modifiées, 2 880 souris subissent une coupe du bout de la queue et une entaille à l'oreille au sevrage, à quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte dure environ cinq minutes, sous anesthésie gazeuse et anesthésie locale, et peut laisser un saignement arrêté par compression s'il dépasse deux minutes. Le porteur indique avoir abandonné le génotypage par poils, infructueux, et par bout d'oreille, non concluant dans plus de 90 % des cas. Les souris du bon génotype partent en accouplement ou vers d'autres projets, celles dont le génotype ne convient à aucun groupe expérimental sont tuées après analyse.
Objectifs
La présente demande est réalisée afin de couvrir réglementairement la réalisation d’une biopsie de queue dans le cadre du génotypage des animaux transgéniques utilisés dans nos projets de recherche. Le génotypage sur biopsie de queue est à l’heure actuelle plus fiable et robuste que le génotypage à partir d’une biopsie d’oreille, ce dernier menant souvent (plus de 50 % des cas) à des résultats non concluants ou non robustes. L’entretien des lignées de souris transgéniques est déjà réglementairement encadré par d’autres demandes d’autorisation de projet.Le monde est aujourd’hui affecté par une explosion de maladies métaboliques caractérisées par un déséquilibre de l’homéostasie glucidique telles que l’obésité ou le diabète de type II. Ces maladies ont de lourdes conséquences socio-économiques sur nos sociétés et représentent un enjeu majeur de santé publique. La compréhension des mécanismes permettant la régulation centrale de la glycémie ainsi que de leurs dysfonctionnements physiopathologiques est cruciale pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement de ces maladies. Nos projets de recherche s’inscrivent dans ce contexte puisque nous nous intéressons aux systèmes moléculaires de l’hypothalamus, identifiés comme des acteurs clés dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Afin de mener à bien nos études, nous avons recours à l’utilisation de modèles murins transgéniques. L’invalidation de ces systèmes nous permet de mieux comprendre leurs rôles dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune technique efficace pour marquer ces neurones, nous utilisons également des souris transgéniques exprimant une molécule fluorescente nous permettant leur visualisation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ces projets que nous puissions génotyper ces animaux de manière fiable et robuste : à partir d’une biopsie caudale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de permettre un génotypage fiable et robuste des différents animaux transgéniques qui serviront d’une part à l’entretien et à la reproduction des lignées de souris et d’autre part aux expérimentations. Les expérimentations réalisées sur ces modèles transgéniques ont pour but de mieux comprendre les rôles respectifs et conjoint des systèmes moléculaires d’intérêt dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique ainsi que d’étudier leurs altérations dans un contexte pathologique d’obésité / de diabète. Ces études ont pour objectif de proposer des stratégies thérapeutiques innovantes dans la lutte contre l’explosion actuelle des maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type II.
Procédures
Les animaux subiront, de façon concomittante, une biopsie caudale et une entaille à l’oreille pour le marquage, sous anesthésie / analgésie lors de leur sevrage à 4 semaines d’âge, une seule fois, l’acte dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La biopsie caudale réalisée pour génotyper les animaux peut induire une douleur légère et de courte durée, prise en charge par anesthésie / analgésie des animaux. Un léger saignement consécutif à la biopsie peut être observé, s’arrêtant généralement rapidement. S’il persiste au-delà de 2 minutes, il sera arrêté par compression légère du bout de la queue dans une compresse. La désinfection du bout de la queue préalablement à la biopsie permettra de limiter le risque d’infection et toute éventuelle complication de cicatrisation de la plaie sera également surveillée par le personnel qualifié.
Devenir
Une partie des animaux (dont le génotype sera adéquat en fonction des besoins en expérimentation) sera placé en accouplement, dont l’entretien des lignées est encadré par d’autres demande d’autorisation de projet. L’autre partie des animaux de génotype adéquat (en fonction des besoins en expérimentations) sera utilisée dans des procédures d’expérimentations encadrées par d’autres demandes d’autorisation de projet. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation. Les animaux de génotypes inadéquats (ni mutants, ni pouvant convenir pour un groupe contrôle adapté au plan expérimental donné) donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage.
Remplacement
Le génotypage de nos lignées de souris à partir de poils ou bien du surplus de bout d’oreille généré lors du marquage des souris s’est avéré infructueux. Nous n’avons pas réussi à génotyper les souris à partir de poils. De même, malgré plusieurs tentatives de mise au point du protocole, à partir de l’excédent de bout d’oreille, les résultats étaient insatisfaisants dans plus de 90% des cas : soit nous n’avions pas de résultat, soit le résultat n’était pas fiable : deux tests sur le même échantillon donnaient deux résultats différents. Lorsque deux tests sur le même échantillon ne donnent pas de résultat ou un résultat douteux, nous avons besoin de prélever à nouveau la souris afin de lever le doute, multipliant donc les interventions sur cette dernière. Nous souhaitons par conséquent réaliser le génotypage de nos animaux à partir d’une biopsie de l’extrémité de la queue des souris. Cette technique est utilisée car elle est robuste, c’est-à-dire efficace, répétable et fiable : un prélèvement unique nous permet dans plus de 99% des cas de génotyper nos souris correctement. De plus, ce prélèvement n’entraine pas de signes visibles de douleur.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie (encadrée par nos autres demandes d’autorisation de projet) vise à obtenir dans les mêmes portées les animaux mutants et les animaux contrôles dont les proportions sont calculées selon les règles de la génétique mendélienne. Les cohortes d’animaux ainsi produites seront soumises à plusieurs tests physiologiques successifs, en respectant toujours un délai de repos, afin d’évaluer les rôles des systèmes moléculaires étudiés dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique. Cela permettra de réduire le nombre de cohortes produites et d’augmenter la fiabilité des résultats puisque les animaux contrôles seront les « littermates » des animaux mutants. L'utilisation de test de puissance statistique est ici sans objet dans la mesure où nous nous fondons sur les probabilités mendéliennes pour estimer le nombre d'animaux du génotype recherché dans les portées obtenues.
Raffinement
Les conditions de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Pour la biopsie caudale, l’extrémité de la queue de la souris sera d’abord désinfectée à la Bétadine® puis localement analgésiée grâce à l’application de Lidocaïne® liquide vétérinaire. La souris sera ensuite anesthésiée par inhalation d’isoflurane. Un léger saignement consécutif à la biopsie peut être observé, s’arrêtant généralement rapidement. S’il persiste au-delà de 2 minutes, il sera arrêté par compression légère du bout de la queue dans une compresse. La cicatrisation de la plaie sera également surveillée par le personnel qualifié.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle in vivo chez l’animal est indispensable pour une compréhension globale du rôle physiologique des systèmes moléculaires étudiés, de leurs interactions fonctionnelles avec d’autres systèmes, de la physiopathologie de l’obésité et du diabète, ainsi que pour caractériser les altérations neuroanatomiques et le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques dans la régulation de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. L’acte de biopsie caudale ne peut se faire par définition que sur le modèle animal. La biopsie caudale permettant le génotypage des souris se fera lors de leur sevrage à 4 semaines d’âge.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et études de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle murin d’arthrite rhumatoïde
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrite leur est déclenchée par injection, puis elles reçoivent jusqu'à 120 administrations de composés, subissent cinq prises de sang sur animal vigile et jusqu'à 45 mesures de leurs poignets et chevilles gonflés. La mise à mort sert à prélever articulations et organes pour l'analyse immunologique et histologique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ni aucune modélisation informatique ne peut remplacer "l'animal entier" pour tester des molécules candidates, et qualifie ce test de "nécessaire" avant une phase clinique.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune qui touche entre 0,5 et 1 % de la population adulte, avec une incidence constante à travers le monde. Si la maladie peut survenir à tout âge, elle apparaît généralement entre 30 et 50 ans. Elle est deux à trois fois plus fréquente chez les femmes que chez les hommes, une différence probablement en partie due à un effet des œstrogènes sur la fonction immunitaire. La polyarthrite rhumatoïde se manifeste au départ le plus souvent par un enraidissement douloureux et le gonflement de plusieurs articulations, généralement au niveau des poignets, des mains et des doigts. Par la suite, la maladie évolue sous la forme de poussées, entrecoupées de rémissions plus ou moins complètes. Au bout de plusieurs années d’évolution, la polyarthrite rhumatoïde finit par provoquer des déformations articulaires et des destructions des tendons. La chirurgie orthopédique est alors nécessaire pour réparer, et souvent remplacer les articulations par des prothèses. Ce projet a pour but d’étudier l'effet de nouvelles cibles thérapeutiques potentiellement inhibitrices de l’inflammation articulaire dans un modèle in vivo d'arthrite rhumatoïde. D'autre part ce projet a pour but d'étudier l'implication de différentes sous population de leucocytes dans un modèle d'arthrite chez des souris modifiées génétiquement pour avoir des gènes non fonctionnels. Ces modèles permettront d’évaluer l’implication de la sérotonine dans les érosions osseuses de la polyarthrite rhumatoïde et d’étudier les mécanismes de l’inflammation. Nous proposons 3 modèles d’induction de l’arthrite (CIA : collagen-Induced Arthritis, CAIA (Arthitomab : cocktail d’anticorps) et K/BxN). Le choix de l’un de ces 3 modèles se fera selon l’objectif de l’étude. Il y a 3 phases dans la maladie : la phase de tolérance (le système immunitaire fonctionne correctement), phase d’auto-immunité (le système immunitaire se trompe de cible) et phase effectrice (inflammation). Le modèle CIA étudie la perte de tolérance et l’auto immunité. Le modèle K/BxN étudie le passage de l’auto-immunité à l’inflammation et le modèle CAIA étudie la phase effectrice.
Bénéfices attendus
Ce projet a donc pour but d’étudier et de valider l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle in vivo d’arthrite rhumatoïde. Les thérapies ciblées sont le plus souvent très bien tolérées mais elles réduisent les défenses immunitaires des patients. Le risque de rechute est important, avec la possibilité que les mêmes médicaments ne soient pas aussi efficaces par la suite. Notre projet de recherche se porte sur la sérotonine et sa potentielle implication dans l’érosion osseuse ainsi que l’autophagie, modulateur majeur de l’inflammation dans les pathologies articulaires. Les premiers résultats obtenus sont encourageant et doivent être approfondis, ce projet est la continuité du précédent projet clôturé.
Procédures
induction de la maladie: 2 administrations maximum selon le protocole (30 secondes max/souris). Prélèvements de sang : maximum 5 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes max/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes max/souris). Administrations de composés : maximum 120 administrations (30 secondes max/souris ; dans le cas de 2 administrations/jour pendant 60 jours). Mesures des poignets/chevilles (45 mesures max au cours des études, 1x/jour, 30 secondes max pour les 4 membres).
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Aucun effet ou nuisance inattendue n’a été observé sur le précédent projet clôturé. Les animaux OGM seront préalablement génotypés chez le fournisseur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation, polyarthrite rhumatoïde, chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules « candidat médicament », test nécessaire avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables. Le nombre d’animaux a été déterminé par une estimation de puissance statistique (10 animaux par groupe) visant à détecter une réduction cliniquement pertinente des scores de la maladie avec un risque alpha = 5% et une puissance de 80%, tout en respectant la réduction des 3R. Dans ces conditions, on s’attend à une diminution d’un score de la maladie d’environ 25-35%. Ce nombre garantit des résultats exploitables sans l’utilisation excessive d’animaux. Ce calcul est basé sur les résultats des études réalisées sur le précédent projet.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur et agir rapidement pour les limiter. Dès le début de l’étude, des croquettes non humidifiées avec de l’hydrogel seront disposés dans les cages. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Les mesures mises en place sur le projet précédent ont été efficaces (croquettes humides, hydrogel, pour pallier à la perte de poids) et seront maintenues dans ce nouveau projet.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : _ Nos modèles d'études ont été développés sur les souches de souris C57BL/6, BALB/c dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendue. _ La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. _ Manipulation, coût, animalerie disponible sur place, nombreuses publications avec des protocoles validés (Le modèle d’arthrite rhumatoïde est très bien décrit dans la littérature chez la souris). _ Le bien-être animal est suivi, contrôlé (suivi journalier avec des points limites établis) et justifié par un potentiel bénéfice sur la recherche pré-clinique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature.
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Onze prélèvements sanguins sur vingt semaines, deux séries d'injections dans les deux muscles et deux injections intrapéritonéales par semaine suivies de passages en imagerie sous isoflurane : 1 840 souris vont être utilisées. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour doser les vecteurs dans leurs organes. Le projet met au point des vecteurs synthétiques capables de faire entrer de l'ARN messager dans les cellules, les prélèvements au sinus rétro-orbitaire ou mandibulaire pouvant provoquer inflammation, gonflement et infection. Le porteur affirme que ces vecteurs polymériques ne délivrent leur ARN ni dans des cellules en culture ni dans des organoïdes, ce qui rend selon lui le recours aux souris "indispensable".
Objectifs
La prévention et le traitement des maladies infectieuses sur la base de la production d’anticorps neutralisant directement par l’organisme est une stratégue prometteuse. Ce projet a pour objectif de développer une plateforme universelle d’ARNm codant pour ces anticorps pour concevoir rapidement des traitements antiviraux, et offrir des solutions thérapeutiques plus confortables et plus efficaces pour les patients et à moindre coût. Cette approche pourrait être un tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies. Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs synthétiques est un élément indispensable à son succès car les molécules d’ARN sont incapables de franchir la membrane cellulaire, étape pourtant indispensable pour la production de la protéine thérapeutique par l’organisme receveur. Les avancées récentes dans la chimie des vecteurs synthétiques ont permis le développement de vecteurs composés de polymères ou lipides, et qui possèdent des caractéristiques permettant d’envisager le transfert d’acides nucléiques (ARNm) avec des efficacités similaires à celles obtenues avec des vecteurs d’origine virale. Cela permet d’envisager simplement l’utilisation de ce type de vecteur à des fins de vaccinations, ou afin d’induire la production de protéines thérapeutiques in vivo. Les études animales réalisées avec des vecteurs synthétiques de ce type ont ainsi débouché sur la commercialisation pour la protection de populations humaines de vaccins à base d’ARNm contre le SARS CoV2 (Cominarty, Spikevax). Les objectifs de ce projet sont de poursuivre l’optimisation de vecteurs synthétiques existants et la découverte de nouveaux, d’optimiser leur développement en évaluant l’efficacité (par dosage dans le sang et les tissus) des vecteurs pour le développement de traitements antiviraux à base d’anticorps produits directement dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra de poursuivre la caractérisation et l’identification des vecteurs synthétiques de nouvelles générations efficaces, simples et non-toxiques. Également, cela permettra d’évaluer l’efficacité de ces vecteurs synthétiques dans le cadre du développement d’alternatives aux anti-viraux chimiques pour lutter contre les maladies infectieuses. - Long terme : en cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des maladies infectieuses ou toute maladie nécessitant la production d’un anticorps thérapeutique, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables et ii) le développement de méthodes de prévention d’infection non chimiques qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels tout en préservant l’environnement de l’accumulation de métabolites chimiques dans l’environnement et (iii) limiter l’utilisation d’antibiotiques qui induisent des résistances. L’impact du succès de ce projet serait de proposer une approche ARNm universelle, immédiatement disponible pour toutes les indications thérapeutiques, offrant une réponse biologique robuste et facilement industrialisable grâce à un outil standardisé et unique quel que soit le produit.
Procédures
Les animaux subiront des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie gazeuse de l'animal, placé sur tapis chauffant. La procédure durera moins de 5 min. Au maximum 2 séries d'injections intramusculaires dans les 2 muscles par souris espacées d’au moins 14 jours. Des prélèvements de sang seront également effectués sur animal anesthésié. Des prélèvements sanguins sont prévus avant l'injection puis 1 fois toutes les 2 semaines pendant toute la durée de l’étude pour un durée totale de 20 semaines, soit 11 prélèvements sanguins en tout. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des injections intrapéritonéales 2 fois par semaine seront réalisées. Ces injections seront suivies d’une courte installation dans un appareil d’imagerie permettant de maintenir l’animal sous anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant une durée inférieure à 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus à l’injection ou aux prélèvements de sang au sinus retro orbitaire ou mandibulaire. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une inflammation au site de prélèvement sanguin, une léthargie… Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Inflammation transitoire au niveau du site d’injection (intra- musculaire) du vecteur, qui pourra être détectée quand l’animal à tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. - Risque infectieux lié à la réalisation du geste invasif (prélèvement de sang).
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs qui seront évalués in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, la meilleure efficacité de transfection étudiée ici correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur, donc seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer leur efficacité. En outre, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN dans des cellules en culture, ni même des organoïdes. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteurs a été récemment validée et qui a fait l’objet d’un développement préclinique réglementaire dont le plan d’étude a été validé par l’ANSM et les résultats présentés également à l’ANSM démontrant aucune toxicité ni mortalité.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité autant que possible tout en garantissant l’obtention de résultats interprétables, afin d’éviter la nécessité d’une étude supplémentaire. Un premier criblage in vitro a permis de ne retenir que les vecteurs les plus efficaces. En tenant compte de la variabilité attendue des réponses et conformément à l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, un maximum de 10 animaux par groupe a été prévu. Ce seuil permet d'assurer la pertinence des analyses et la fiabilité des comparaisons, tout en respectant le bien-être animal. Le nombre a été déterminé à partir de données historiques et d’une approche statistique (calcul de puissance), et l'utilisation de chaque animal a été optimisée grâce à des mesures longitudinales et à des études pilotes. L’effectif sera revu à la baisse si les résultats préliminaires d’efficacité le permettent, en visant des données cohérentes et reproductibles entre les individus. Pour chacune des procédures, un test statistique de Kruskall-Wallis suivi d'un test de Dunn sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement - tube, frisotis, dôme, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins. Dans le cas de l'observation d'un inconfort liée aux injections intramusculaires, une injection d'un analgésique sera effectuée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sera effectué une fois par semaine. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors des prises de sang), et les injections seront réalisées sous anesthésie et les animaux positionnés sur tapis chauffant.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont déjà été validés in vivo sur cette espèce. De plus, la souris présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets des vecteurs chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française (article R. 214-87 du Code rural et de la pêche maritime), le projet sera conduit des souris adultes d’environ 8 à 10 semaines pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux.
Développement d’un protocole d’immunothérapie de l’endométriose
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
7 254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines pouvant recevoir jusqu'à sept administrations de traitement par semaine. Une partie subit une castration, puis une chirurgie d'implantation destinée à reproduire une endométriose, dont les lésions peuvent provoquer des douleurs abdominales pendant les 63 jours de la procédure. S'y ajoutent un prélèvement sanguin hebdomadaire et jusqu'à trois tests comportementaux par animal, dont un test d'hypersensibilité viscérale et une mesure de la capacité à faire son nid qui suppose quinze heures d'isolement. Le calcul d'effectif cité aboutit à dix souris par groupe pour des expériences reproduites deux fois, sans que le passage à 7 254 animaux soit expliqué.
Objectifs
Ce projet a un objectif principal : mettre au point un protocole d’immunothérapie de l’endométriose. Il permettra aussi de mieux comprendre l’importance de la composante immunitaire dans les mécanismes qui conduisent à l’endométriose.
Bénéfices attendus
L'endométriose est un trouble œstrogèno-dépendant fréquent chez les femmes en âge de procréer (10%). Cette pathologie se caractérise principalement par la présence de tissu endométrial à l'extérieur de l'utérus. Bien que les mécanismes qui conduisent à l’endométriose (pathogénèse) ne soit pas complètement décrits, on sait que le système immunitaire joue un rôle central dans son étiologie, sa pathophysiologie et les morbidités associées de douleur, d'infertilité. Il est maintenant admis que l'endométriose est une maladie inflammatoire chronique. Nous avons montré que cibler la réponse immunitaire peut diminuer l’installation et le développement des lésions. Nous avons identifié plusieurs médicaments en cours de développement dans des protocoles d’immunothérapie antitumorale qui pourraient permettre de moduler la réponse immunitaire et ainsi induire la disparition des lésions d’endométriose. L’objectif de ce projet est donc de developper un protocole de traitement et définir l’impact des traitements sur l’initiation et le développement des lésions d’endométriose, sur les cellules immunitaires et sur la douleur induite par l’implantation et le développement des lésions. Dans un deuxième temps et en fonction de toutes les premières observations, nous définirons les meilleurs protocoles d’administration de ces molécules dans le traitement de l’endométriose. Pour tout ce projet, nous utiliserons un modèle expérimental de référence déjà décrit dans la littérature et maîtrisé dans notre laboratoire. Globalement, ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’origine et le développement de l’endométriose. Ces mécanismes pourraient être exploités pour découvrir d’autres pistes thérapeutiques innovantes.
Procédures
Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris -Chirurgie pour modélisation de l'endométriose sous anesthésie générale (injection 30 sec)- des administration de traitement (durée moins de 1 min) au maximum 7 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure -des tests comportementaux: test du niveau d'anxiété 10 minutes, une fois par semaine, test des comportements compulsifs: 30 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité, 5 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité viscerale, 5 minutes une fois par semaine, capacité à faire son nid (représentatif de la douleur) 15h d'isolement, une fois par semaine. Tous les animaux ne seront pas soumis à tous les tests comportementaux (pas plus de trois tests par animal).
Impact sur les animaux
Une partie des animaux subira une castration. Les animaux récupèrent parfaitement de cette opération. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires (48 h maximum). Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires (moins de 5 minutes) au point d’injection. La croissance des lésions d’endométriose peut induire des douleurs abdominales pendant toute la durée de l'expérience (63 jours maximum). Ces douleurs potentielles seront évaluées quotidiennement par observation du comportement des souris dans les cages et avec des tests comportementaux. En cas de douleur, les souris recevront un analgésiant. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections) (durée maximum 5 minutes). les injections hebdomadaires peuvent induire un stress transitoire lié à la contention, une douleur brève au point d’injection (5 minutes maximum) et, occasionnellement, une réaction inflammatoire locale modérée (24h maximum). Les effets systémiques attendus sont limités aux variations physiologiques liées à la stimulation hormonale, sans altération durable de l’état général lorsqu’elles sont administrées aux doses usuelles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure
Remplacement
Les réponses immunes dans l’endométriose sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (l ésions, liquide péritonéal et ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées/reproduites in vitro.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons analysé les résultats déjà obtenus sur ce projet et nous avons réalisé un calcul d'effectif avecun logiciel qui aide à calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour une expérience en se basant sur des études statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant d’en utiliser plus que nécessaire. Ce calcul nous a donné une valeurs de 10 souris par groupe Les expériences seront reproduites 2 fois (5 souris par groupe et par expérience). Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (matériel permettant la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du sérum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Une molécule permettant l'anesthésie locale sera administrée en intradermique au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures (injection intraveineuse d'une molécule analgésique). Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les acteurs de la réponse immunitaire chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site d’implantation des lésions ou dans les organes lymphoïdes). Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines d’âge correspondant à un système immunitaire fonctionnel
Dynamique des changements biochimiques de la cellule lors d’un apprentissage
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection intracérébrale de 45 minutes, la pose d'un implant d'une heure et demie, puis une restriction alimentaire destinée à pousser l'animal à parcourir un dispositif de navigation spatiale : 150 souris subissent ce protocole. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer les tissus, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que la restriction alimentaire engendre une perte de masse qui peut être excessive ou s'accompagner de signes de souffrance, le tout pour mettre au point un fibroscope permettant d'observer l'activité de neurones pendant un apprentissage. Le nombre de 150 souris n'est adossé à aucun calcul, la seule précision chiffrée du dossier portant sur un maximum de 80 animaux pour la mise au point de la technique.
Objectifs
L’objectif principal est de comprendre comment les cellules du cerveau communiquent lorsqu’une mémoire se forme ou lorsqu’un comportement se produit, que ce soit dans des situations normales ou lors de maladies. Pour cela, le projet prévoit de créer un microscope couplé à une fibre optique (un fibroscope) permettant de suivre la souris pendant un comportement de façon peu invasive. Ce dispositif permettra d’observer directement, chez un animal vivant, l’activité de groupes de neurones pendant un apprentissage (mémorisation).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre, à moyen terme, le déroulé des évenements conduisant à l'adaptation de la communication entre deux neurones (la plasticité synaptique). Cette plasticité, impliquant des réseaux de neurones, est nécessaire à l'adaptation à l'environnement via des processus d'apprentissage et de mémorisation. Ainsi, une meilleure compréhension de ces phénomènes, répond parfaitement aux contraintes liées au fonctionnement cérébral. Les résultats de ce projet seront accessibles via des publications. Sur le long terme, ce projet permettra de mieux comprendre le phénomène d'apprentissage et de mieux connaitre les potentielles cibles thérapeutiques en cas de maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chirurgies comme des injections à l'intérieur du cerveau (environ 45 minutes) et la fixation d'un implant (environ 1h30) ainsi qu'une légère restriction alimentaire permettant de motiver la souris lors des tâches comportementales de navigation spatiale (environ 1-2h).
Impact sur les animaux
Les manipulations par les expérimentateurs et les expériences de navigation spatiale peuvent induire un stress chez la souris. La chirurgie peut également induire des douleurs secondaire. Enfin, la restriction alimentaire engendrera une perte de masse qui peut etre excessive ou associée à des signes de souffrance.
Devenir
Afin d’observer la signalisation dans chaque cellule, nous devons récupérer en fin d’expérience les tissus. Nous devons pour cela procéder a euthanasie de l'ensemble des animaux du projet afin d’obtenir un maximum d’information de l’animal.
Remplacement
Pour bien étudier la plasticité neuronale (c’est-à-dire la façon dont les connexions entre neurones changent), il faut absolument observer cela chez un animal vivant, car les résultats varient beaucoup selon les conditions de l’expérience. En particulier, une tâche de navigation dans l’espace (comme faire parcourir un labyrinthe à un animal) est nécessaire, et elle ne peut être réalisée que sur un animal vivant. Elle renforce les connexions dans l’hippocampe, une partie du cerveau impliquée dans la mémoire spatiale. Cela fournit des données précises et réalistes. Ces données sont ensuite utilisées pour nourrir un modèle mathématique prédictif. Ce modèle permet de prévoir ce qui pourrait se passer et ainsi guider les futures expériences pour les rendre plus efficaces.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, la mise au point des biosenseurs sera intégralement réalisée in vitro. De plus, l'étude histologique post-mortem, réalisée sur les animaux utilisés pour les tâches de comportement, permet d’acquérir le plus d’information possible en utilisant le moins d’animaux possible. Le modèle de prédiction théorique alimenté par les données vise également à réduire l’utilisation des animaux dans les futurs projets. Les souris utilisées pour la mise en place et l’optimisation de notre technique est associé à un maximum de 80 animaux. Ce nombre sera réduit autant que possible. Chaque fois que cela sera possible, cette mise au point sera effectuée chez des animaux déjà présents dans l'animalerie pour d'autres projets.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera quotidiennement suivi et l'administration d’analgésique sera systématique en cas de signe de douleur. Le stress des souris sera réduit par l’habituation de ces dernières à l’expérimentateur et à l’environnement ainsi que des enrichissements de cages, avec a minima du matériel de nidification (igloo et coton). Les manipulations de souris sont faites dans une pièce différente, hors de vision des souris en stabulation d’hébergement.
Choix des espèces
La souris est le modèle idéal pour ce type d’étude car il s’agit d’un mammifère, ayant donc des mécanismes cérébraux généralisables dans une grande mesure à l'homme, chez qui l’expression de biosenseurs est bien caractérisée. Nous utiliserons des animaux adultes, afin de découpler la plasticité induite par le comportement de celle inhérente au neurodéveloppement.