Recherche fondamentale

Portant des modifications génétiques ciblant le récepteur CB1 ou les neurones à POMC, 1 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 696 d'entre elles reçoivent une injection de particules virales dans le cerveau, 232 se voient implanter une lentille intracérébrale au cours d'opérations de 45 à 75 minutes, et 192 sont gavées de tamoxifène cinq jours d'affilée. Le protocole repose sur un conditionnement à la peur, dont le porteur reconnaît qu'il augmente le niveau de stress, complété par des tests qualifiés d'anxiogènes sans qu'aucun ne soit nommé. Toutes sont tuées à la fin, par dislocation cervicale ou par perfusion intracardiaque après sédation, pour prélever le cerveau et d'autres tissus.

Objectifs

Notre corps réagit à la peur en utilisant ses réserves d’énergie et en modifiant certaines fonctions internes pour nous aider à faire face à la situation. La peur influence notre cerveau de différentes façons, ce qui peut changer nos émotions et notre comportement. Elle peut parfois provoquer des réactions peu adaptées, comme manger de façon compulsive. Dans le cerveau, une zone particulière joue un rôle important dans le contrôle de l’alimentation. Certaines neurones de cette zone (appeler les neurones à POMC) aident normalement à réduire la sensation de faim. Une molécule bien connue, appelée récepteur CB1, intervient à la fois dans la manière dont nous réagissons à la peur et dans la façon dont nous régulons notre alimentation. Le but de ce projet est de comprendre si ce récepteur CB1 peut influencer à la fois la réaction à la peur et le comportement alimentaire dans ces cellules qui participent à limiter la prise de nourriture. Pour cela, nous avons deux objectifs : Voir si le récepteur CB1 modifie l’activité de ces cellules lorsque les souris ont peur et déterminer si ce même récepteur influence la façon dont les souris mangent lorsqu’elles vivent une situation de peur

Bénéfices attendus

Nous souhaitons souligner la nouveauté de ce projet, puisque le rôle de la POMC dans la réponse à la peur n'a jamais encore été étudié auparavant. Les neurones à POMC ont été largement explorés dans le domaine du comportement alimentaire, mais leur rôle dans la régulation de l'anxiété et celui de la peur n'a pas encore été étudié. Il est admis que le stress ou l'anxiété altère le comportement alimentaire, ce qui peut entraîner des troubles du comportement alimentaire et l'obésité. Cependant, les mécanismes moléculaires reliant ces deux phénomènes ne sont toujours pas clairs. Dans ce contexte, les neurones à POMC et le récepteur CB1, par leur capacité à réguler à la fois l'alimentation et la réponse au stress, semblent être de bons candidats pour expliquer l’interaction entre alimentation et comportement de peur.

Procédures

Au cours de ce projet, nous réaliserons des opérations chirurgicales sur des souris POMC*CB1, POMC-Cre et CRH-Cre afin d'injecter des particules virales dans le cerveau. Les souris POMC*CB1 subiront une seule injection de vecteur viral dans le cerveau (696 souris). Les souris POMC-Cre seront également utilisées pour implanter une lentille qui nous permettra d'étudier l'activité neuronale en temps réel (232 souris). Ces procédures durent entre 45 et 75 minutes et sont réalisées sous anesthésie locale et générale (traitement à la lidocaïne au site d'incision et isoflurane pendant la chirurgie). De plus, les souris recevront un traitement analgésique pendant la chirurgie et un traitement antiflamatoire 48h après la chirurgie pour éviter la douleur et assurer une bonne récupération après la procédure. L'état général des souris, ainsi que le poids corporel, seront évalués les jours suivant la chirurgie selon les points limites de définies dans l'annexe 2. Les souris POMC-Cre+ et CRH-Cre+ (96 souris) avec une injection intracérébrale de virus AAV contenant le DREADDS, 4 semaines après la chirurgie, lorsque le virus sera exprimé, nous effectuerons une injection du CNO soit 30 minutes avant le test par voie intrapéritonéale, soit 1 heure avant le test par voie sous-cutanée. Ces procédures seront effectuée seulement une seule fois par animal. Les souris POMC-vglut2 at POMC-GAD (192 souris) recevront une administration orale de tamoxifène pendant 5 jours. Le tamoxifène induit une réduction temporaire du tissu adipeux, entraînant une perte de poids réversible. Pour réduire le stress de l’animal au moment de la procédure, une période d’habituation sera réalisée 3 jours avant le début des 5 jours de gavage.

Impact sur les animaux

Pour les procédures chirurgicales, afin d'éviter toute douleur, nous utilisons des analgésiques en pre-opératoires et réalisons une anesthésie locale de la peau avant l'incision. Après la chirurgie, un traitement analgésique est administré pendant 48h, nous suivons le poids corporel quotidiennement et nous évaluons les animaux selon les points limites. Pour les tests anxiogènes, nous laisserons un intervalle de 7 jours entre les tests effectués sur les mêmes animaux pour leur permettre de récupérer. Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests chez les mêmes souris. Le test de conditionnement à la peur augmente le niveau de stress chez les souris. Les animaux ayant subi une peur conditionnée ne seront pas réutilisés pour ce même test ou pour un test anxiogène.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront sacrifiées à la fin de l'expérience pour récupérer les tissus et réaliser des études moléculaires. Nous sacrifierons les souris de deux manières différentes : la dislocation cervicale pour le prélèvement de tissus frais et la perfusion intracardiaque sur cœur arrêté afin de fixer le cerveau pour les études histologiques. La persufion intracardiaque se fait après une injection intrapéritonéale de Xylazine à une dose de 20mg/kg pour la sédation. Une injection d’euthanasiant (pentobarbital à une dose de 400mg/kg) sera ensuite réalisée 10 à 20 minutes après. Nous attendrons que la souris ne présente plus de signe de coeur battant avant de procéder à l'ouverture de la cage thoracique pour la perfusion.

Remplacement

Pour évaluer l'implication des neurones à POMC et du système endocannabinoïde dans la régulation de la peur et du comportement alimentaire, il n'existe aucune alternative à l'heure actuelle que l'expérimentation animale. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement ne serait pas approprié. Le niveau de complexité de l'étude que nous proposons de réaliser est tel qu’aucun modèle informatique ne pourrait remplacer l’animal.

Réduction

Nous avons déterminé, en utilisant un calcul de puissance statistique, que nous avons besoin de 12 à 29 animaux par groupe pour obtenir des données exploitables.

Raffinement

De manière générale, les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines, en cages collectives, et seront manipulés de façon bi-hebdomadaire pendant au minimum une semaine avant le début des expériences. Ces manipulations permettront d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. Les animaux auront une période de récupération d’au moins une semaine entre chaque expérience afin de limiter le stress et l’angoisse. Les animaux soumis à un test de peur conditionnée ne seront pas utilisés pour un autre test stressant ou anxiogène, ils seront sacrifiés après le test. L’enrichissement se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnet en bois pour ronger et de tunnel en carton pour se cacher/manipuler les animaux. Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. Les souris seront hébergées en cages collectives, sauf lorsqu'elles auront à subir une chirurgie, et que la consommation de nourriture devra être consignée.

Choix des espèces

La peur et le comportement alimentaire sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente une espèce pertinente pour ce type d’étude. La grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de réponse à la peur, ainsi que l'étude du système endocannabinoïde sont réalisées chez la souris. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, ce qui implique que les résultats obtenus chez le rongeur seront transposable à l'humain, ce qui aura pour conséquence de faire avancer les connaissances dans ce domaine et à plus long terme de trouver de nouvelles voies thérapeutiques. Par ailleurs, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour répondre à nos questions ne sont disponibles que chez la souris. Les expériences ne commenceront que lorsque les souris seront adultes (8 semaines). Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude, car il a été montré que le système endocannabinoïde du cerveau de souris femelles est différent de celui des mâles, à la fois dans les conditions basales et lorsque les souris sont dans une situation de stress.

Injectées deux fois par semaine pendant huit semaines sur animal vigile, saignées quatre fois sur la même période, puis anesthésiées pour un temps de saignement mesuré jusqu'à trente minutes, 448 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles ont été génétiquement modifiées pour développer un lupus et présentent dès huit semaines perte de poids, défaut de toilettage, gonflements articulaires et inflammation des reins. Le traitement testé cible les plaquettes sanguines, dont le nombre chute chez les personnes atteintes de lupus, et l'étude mesure son effet sur l'arrêt du saignement. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur décrivant des procédures invasives et terminales incompatibles avec un réveil, les organes étant ensuite prélevés.

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune (le système de défense de l’organisme s’attaque aux constituants normaux de l’organisme) responsable d’une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des lésions d’organes avec présence d’une inflammation généralisée. L’objectif de notre étude est de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement suite à une lésion et les fonctions des plaquettes sanguines. La thrombopénie (réduction du nombre de plaquettes) et l’activation plaquettaire sont fréquemment observées chez les patients présentant un lupus, contribuant à des complications de type formation d’un caillot sanguin et hémorragie, ainsi qu’à des atteintes de la peau et des reins. Les plaquettes activées favorisent leurs interactions avec les globules blancs ce qui amplifie la pathologie. Il est proposé aujourd’hui d’utiliser un traitement ciblant les plaquettes sanguines afin de diminuer leur capacité à former des agrégats et à interagir avec les globules blancs, prévenant ainsi l’inflammation et la réduction du nombre de plaquettes dans le cadre du lupus. Néanmoins, l’effet de ce traitement sur l’arrêt du saignement, les fonctions plaquettaires ainsi que sur la réduction du compte plaquettaire associés au lupus est à ce jour peu décrit. Comprendre l’impact du lupus sur l’arrêt du saignement et la fonction plaquettaire permettra d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour des traitements dans le cadre du lupus.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement et les fonctions plaquettaires. Cela permettra d’identifier de nouveaux traitements qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus et donc leur qualité de vie.

Procédures

Un lot d’animaux sera soumis à un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 prélèvements sanguins sous anesthésie : l’un d’une durée de 5 minutes, l’autre de 20 minutes. Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile) et un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile), 4 prélèvements sanguins sur ces 8 semaines (durée de 5 minutes chacun, animal anesthésié) et 1 prélèvement sanguin d’une durée de 20 min sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux atteints de lupus présentent, aux alentours des 8 semaines de vie, une perte de poids, un défaut de toilettage, des gonflements articulaires et ganglionnaire, ainsi qu’une inflammation des reins provoquant une présence de protéines dans les urines, ce qui est caractéristique des maladies auto-immunes. Le traitement testé pourrait réduire les signes de la maladie. Les procédures réalisées peuvent également induire des nuisances : >Anesthésie : impact sur le rythme respiratoire >Prélèvements sanguins : risque de douleur modérée et de saignement au site de prélèvement >Injection : durcissement de la peau et lésion au site d’injection

Devenir

Les procédures expérimentales réalisées sont invasives et terminales, ce qui ne permet pas le réveil des animaux sans induire une forme de souffrance incompatible avec leur bien-être. Par conséquence, à la fin de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort selon les méthodes réglementaires. Après la mise à mort, leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).

Remplacement

Les fonctions plaquettaires ainsi que l’arrêt du saignement sont des processus particulièrement complexes, faisant intervenir plusieurs types de cellules ainsi que des conditions physiques (pression artérielle, flux sanguin). Les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèles cellulaires humains permettant d’étudier le lupus et capable de générer assez de plaquettes pour les analyses prévues.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum tout en permettant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. De plus, du fait d’une différence de sévérité du lupus en fonction du sexe de l’animal, les données obtenues pour les femelles et les mâles seront analysés séparément. A la fin des procédures, les souris seront mises à mort, puis leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).

Raffinement

Une acclimatation de 14 jours ara lieu entre l’arrivée des animaux à l’animalerie et leur utilisation. Une habituation à la manipulation et à la contention est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : >Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi (tissu, tunnel, …), >Par une anesthésie avant et pendant les procédures expérimentales, >Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures expérimentales > Les souris avec un phénotype impactant la qualité de vie auront accès à de la nourriture sous forme de pâté, ainsi qu’à de l’eau gélifiée. Elles seront suivies 3x par semaine pour détecter tout inconfort. Les souris atteignant un point limite seront soustraite à l’expérimentation. Durant toutes les procédures, les animaux seront suivis par un personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’un mammifère proche de l’Homme pour sa physiologie et ce modèle de souris génétiquement modifié se rapproche fortement de la pathologie humaine. Nous utiliserons dans ce projet des souris mâles et femelles de manière équilibrée, car une différence dans le développement de la pathologie est attendue entre mâle et femelles. A partir d’environ 8 semaines d’âge, les souris présenteront la maladie, associée à une thrombopénie. Le traitement testé dure 8 semaines. De plus, il est nécessaire que les individus aient un poids suffisant. Les animaux utilisés dans ce projet auront donc entre 7 et 16 semaines d’âge, ce qui correspond à un stade adulte, tout en évitant les effets liés au vieillissement.

Tous tués à la fin de la procédure, 8 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux d'entre eux sont infectés par le virus influenza A porcin par voies trachéale et nasale, les six autres étant placés en contact direct ou indirect pour qu'ils s'infectent à leur tour. Chaque animal subit deux prises de sang et treize prélèvements de fluides oraux par lingette mâchée, et l'infection provoque hyperthermie, baisse d'appétit, toux et éternuements pendant la première semaine. Le porteur écarte l'alternative d'un générateur d'aérosols au motif qu'elle ne reproduit pas l'excrétion naturelle, et conclut que la production d'aérosols par les porcs eux-mêmes est "nécessaire".

Objectifs

Le projet vise à produire des connaissances sur la transmission par l’air du virus influenza A porcin provoquant la grippe du porc. L’intérêt porté à ce virus relève de sa forte contagiosité et de sa capacité à se transmettre de l’animal à l’homme. Il induit un impact économique et sanitaire important pour la filière porcine lors d’épidémies. Le protocole expérimental proposé porte sur l’exposition de porcs au virus influenza A. Il s’agit d’évaluer la quantité et la viabilité du virus présent dans l’air ambiant d’une animalerie hébergeant des porcs infectés expérimentalement ou naturellement. Dans la pratique, des collectes d’air seront effectuées quotidiennement sur une période de plusieurs heures à l’échelle de la salle hébergeant trois lots de 8 porcs au total : un lot de deux animaux infectés expérimentalement et deux lots d’animaux en contact direct ou indirect des animaux infectés.

Bénéfices attendus

Les résultats du projet contribueront à évaluer et modéliser les risques d’exposition des animaux, mais également des hommes, en cas de foyer détecté dans un élevage. Ils permettront de proposer des mesures environnementales pour limiter la propagation du virus telles que des stratégies de traitement de l’air, des préconisations organisationnelles, des recommandations quant au port d’équipements de protection individuelle, etc.

Procédures

Deux animaux seront infectés par le virus par voies trachéale et nasale : acte réalisé en moins de 2 min 30. Une prise de sang sera réalisée sur tous les animaux à 2 reprises, acte également rapide (moins de 2 min 30). Tous les animaux seront soumis sur toute la durée de l’essai expérimental à 13 prélèvements de fluides oraux à l’aide d’une lingette mâchée pendant quelques minutes. Ces procédures seront réalisées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

L’infection des porcs par le virus de la grippe provoque une hyperthermie ne persistant pas plus de 4 jours ainsi qu’une baisse de l'appétit et des troubles respiratoires très modérés (toux et éternuements) au cours de la première semaine suivant l'infection. Aucun symptome sévère n'est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Une alternative non animale consisterait à l’aérosolisation du virus influenza avec un générateur d’aérosols. Toutefois, cette technique physique ne reproduit pas totalement le processus naturel d’excrétion et d’aérosolisation qui se produit au niveau de l’animal. Le projet ayant pour objectifs d’étudier l’exposition d’animaux sains au contact d’animaux infectés et de mesurer l’infectiosité des particules virales dans l’air, l’utilisation d’une technique produisant des aérosols de manière artificielle n’est pas envisageable. La génération naturelle d’aérosols par les animaux est nécessaire dans cette expérimentation.

Réduction

Le dispositif expérimental repose sur un minimum d’animaux utilisés. Des études antérieures de transmission du virus Influenza A porcin ont montré qu’un dispositif de 2 porcs inoculés étaient suffisants pour infecter des porcs sentinelles dans une animalerie. Ainsi, 8 porcs élevés dans deux parcs distants seront utilisés : 2 porcs inoculés et 2 autres en contact direct dans un premier parc et 4 porcs dans un second parc distant. Les 2 porcs inoculés et les 2 porcs au contact direct des inoculés devraient produire suffisamment de virus pour infecter les 4 porcs sentinelles à proximité. L'objectif du projet étant de produire des connaissances sur l’exposition de porcs à un air contaminé par un virus Influenza, le dispositif ne comporte pas de lots Témoin et les données ne feront l'objet d'aucune analyse statistique du type Cas/Témoin. Le projet visant à mesurer le niveau d’infectiosité de l’air, la collecte des aérosols sera sans impact sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Le suivi de l’excrétion virale des animaux sera effectué grâce à un prélèvement de salive sans nécessité de contention. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort (cf. grille en annexe).

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus Influenza A porcin. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs Exempt d'organisme pathogène spécifié (EOPS) seront inoculés par un virus Influenza A porcin à 10 semaines d'âge, au même stade physiologique que dans un précédent essai impliquant cette souche virale dans le laboratoire. A cet âge, il est attendu que l’animal génère un volume suffisant de bioaérosols émis dans la salle pour être captés par les différents collecteurs d’air. Par ailleurs, les animaux seront suivis pendant 15 jours post-inoculation, période considérée maximale pour l’excrétion virale des 3 lots (inoculé, contact direct et indirect).

Pour caractériser les effets rénaux d'un morphinique que les protocoles d'expérimentation recommandent comme antidouleur, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des travaux antérieurs de la même équipe avaient relevé une baisse d'environ vingt pour cent de la filtration rénale et une hausse de la mortalité après opération. Toutes reçoivent deux injections sur animal vigile puis deux mesures de fonction rénale sous anesthésie générale, et une partie subit une chirurgie de 90 à 120 minutes pour la pose de deux cathéters, avec risque d'hémorragie et d'arrêt cardiorespiratoire. Douze souris sont tuées pour dosages, les 48 autres réutilisées ailleurs au motif qu'elles n'auront subi que des mesures qualifiées de non invasives.

Objectifs

Des travaux antérieurs ont mis en évidence que l’administration préopératoire d’un morphinique, à des doses usuellement considérées comme faibles et recommandées en expérimentation animale dans les protocoles douloureux, induisait une diminution de la fonction rénale (capacité du rein à filtrer le sang) en conditions physiologiques normales chez le rat et la souris. Plus spécifiquement, la capacité de filtration du rein ou débit de filtration glomérulaire mesurée de manière non invasive était diminué d’environ vingt pour cent par rapport aux valeurs normales habituellement constatées. Ces observations suggèrent que le morphinique pourrait exercer, en conditions physiologiques normales, des effets directs sur le rein, indépendamment de toute pathologie. D’autre part, dans des modèles de maladies rénales, nous avons observé une hausse de la mortalité post opératoire avec les mêmes doses administrées plusieurs fois au cours des premiers jours. Dans le but de mieux appréhender les implications de l’utilisation de morphinique dans nos protocoles expérimentaux futurs, il apparaît essentiel de caractériser plus finement ses effets sur la fonction rénale dans un contexte physiologique sain. Trois axes principaux seront explorés dans cette étude : 1. Effet dose-dépendant du morphinique sur la fonction du rein Évaluer l’impact de doses croissantes sur le débit de filtration glomérulaire, reflet de la capacité de filtration du rein, chez la souris. 2. Cinétique des effets du morphinique sur la fonction du rein Étudier la dynamique temporelle des effets du morphinique sur la fonction rénale, afin de déterminer la durée et l’intensité des effets. 3. Effets du morphinique sur la pression artérielle et le débit sanguin rénal

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces données permettra d’identifier les mécanismes par lesquels le morphinique influence la fonction rénale en l’absence de pathologie. Elles contribueront également à affiner les conditions expérimentales futures, afin de réduire les biais pharmacologiques des projets de recherche dans le domaine des maladies rénales.

Procédures

Tous les animaux recevront deux injections de morphinique, administrées à l’état vigile. Chaque injection dure environ 10 secondes. Une partie des animaux recevra deux injections supplémentaires destinées à induire une anesthésie locale. Tous les animaux seront soumis à deux mesures de la fonction rénale à une semaine d’intervalle, impliquant l’injection du traceur fluorescent sous anesthésie générale, suivie de la pose d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal. Cette première étape dure environ 5 minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie générale sera pratiquée pour retirer le capteur, cette intervention ne durant que 2 minutes. Une partie des animaux sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et locale. Cette procédure consiste à poser deux cathéters afin de mesurer la pression artérielle et le débit sanguin rénal. La durée totale de cette intervention est estimée entre 90 et 120 minutes. Une partie des animaux sera euthanasiée à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. L’autre partie sera réutilisée.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : 1.Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Les injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation. 2. La chirurgie pour les mesures de pression artérielle peut provoquer des douleurs et entraîner des saignements / hémorragies. 3. Les complications liées à l'anesthésie générale au moment de la chirurgie vasculaire et de la mesure de la fonction rénale : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Afin d’effectuer des dosages et analyses spécifiques, douze animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. Les 48 autres seront réutilisées car elles n’auront reçu que deux injections de morphinique et auront eu deux mesures de fonction rénale non invasive.

Remplacement

Le rein est un tissu complexe, qui comporte des dizaines de types cellulaires. Les organoïdes rénaux ne sont pas encore optimaux, notamment car il est encore impossible d'y réaliser une circulation sanguine. Ils ne permettent pas de mesurer la fonction rénale, c'est-à-dire la fonction de filtration du sang par le rein. Or, ce paramètre est le critère majeur de la caractérisation de l'effet du morphinique sur le rein. Les mesures de pression artérielle ne peuvent être envisagées que sur un modèle in vivo.

Réduction

Du fait de la simplicité du modèle et du caractère pilote de l’étude, des lots de 6 animaux sont suffisants pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux. Les expériences seront renouvelées une fois de manière indépendante. Pour les mesures de pression artérielle, deux lots indépendants de 6 souris suffiront à mettre en évidence les effets potentiels du morphinique en aigu. Nous utiliserons des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux est de 60 souris dont 48 qui seront réutilisées.

Raffinement

1. Raffinement de l’hébergement et de la surveillance Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Le bien- être des animaux est également assuré par plusieurs types d’enrichissements. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. 2. Raffinement pour les injections Les injections sont réalisées à l’état vigile avec une aiguille très fine qui limite les risques hémorragiques et la douleur. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. 3. Raffinement pour la mesure de la fonction rénale : Après anesthésie générale, les souris sont placées sur un plateau chauffant. Après application d’une goutte d’anesthésique local, les injections du traceur sont réalisées avec une aiguille très fine qui va limiter les risques hémorragiques. Le site d’injection est alterné d’une mesure à l’autre. Un gel ophtalmique est appliqué ensuite pour atténuer la gêne après l’injection. Le produit utilisé comme traceur est parfaitement toléré, il appartient à la famille des sucres. Les souris sont placées dans une couveuse à 28 degrés Celsius , installée dans une pièce d'expérimentation de l'animalerie dans des cages individuelles pour ne pas risquer d'abimer le dispositif de mesure. Les souris ont accès à l'eau et à la nourriture. Les cages individuelles sont toutes placées dans la couveuse. A la fin de la mesure, les animaux sont remis dans leur cage initiale en respectant bien les groupes initiaux avec le même enrichissement. 4. Raffinement pour les mesures de pression artérielle et de débit sanguin rénal L’antalgie pré opératoire est assurée par des injections d’un anesthésique local aux sites d’incisions, dix minutes avant. La préparation chirurgicale pour la pose des cathéters et de la sonde rénale dure environ 30 minutes. Le morphinique injecté en bolus viendra prendre le relais de l’antalgie jusqu’à l’euthanasie finale après une heure d’enregistrement. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant pour mieux tolérer l’anesthésie. Une perfusion continue de sérum physiologique permet d’assurer la stabilité pendant toute la durée de l’expérience.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce utilisée dans ce projet. Elle constitue le modèle animal de référence pour la majorité de nos projets. Bien que des résultats similaires aient été observés antérieurement chez le rat et la souris, l’utilisation exclusive de la souris est suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le recours à une seconde espèce n’apporterait pas de bénéfice scientifique supplémentaire. Ce choix permet d’assurer la cohérence et la comparabilité des données avec les projets existants, tout en respectant le principe de Réduction en évitant l’utilisation d’une espèce animale supplémentaire. Pour toutes les procédures, les souris sont âgées entre 9 et 12 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système glomérulaire mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.

4 800 rongeurs, 4 200 souris et 600 rats, vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut enchaîner jusqu'à cinq tests sur animal vigile, tapis de course, roue, équilibre, agrippement, analyse de la marche et de la respiration, puis jusqu'à deux séries d'électrophysiologie et d'échographie musculaire sous anesthésie. La mesure finale de force musculaire est pratiquée sur la totalité des animaux sous anesthésie sans réveil, avant le prélèvement des muscles pour l'histologie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité physiologique de l'animal vivant, et présente sa combinaison de techniques comme une contribution aux 3R.

Objectifs

L’objectif général de ce projet est d’améliorer la compréhension fonctionnelle et mécanistique des maladies neuromusculaires en analysant différents paramètres du système neuromusculaire, notamment la coordination motrice, la fonction respiratoire et la fatigue musculaire. Plus spécifiquement, ce projet vise à : – caractériser les altérations neuromusculaires associées à différentes pathologies à l’aide d’approches expérimentales complémentaires ; – explorer le rôle de gènes et de protéines d’intérêt impliqués dans le fonctionnement et la maintenance du muscle et des motoneurones ; – développer et caractériser de nouveaux modèles murins pertinents de maladies neuromusculaires ; – évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de stratégies thérapeutiques expérimentales. Les études s’appuieront sur des approches in vivo et in vitro chez la souris et le rat, permettant une analyse intégrée des propriétés des fibres musculaires, des motoneurones et de leurs interactions avec les autres types cellulaires contribuant à l’homéostasie du système neuromusculaire. À terme, ces travaux ont pour objectif d’identifier des cibles thérapeutiques transposables à l’humain et de contribuer à l’amélioration des stratégies de diagnostic et de prise en charge précoce des maladies neuromusculaires.

Bénéfices attendus

Les maladies neuromusculaires constituent un ensemble d’environ 200 pathologies d’origine génétique ou acquise, touchant les muscles et/ou le système nerveux. En France, elles concernent près de 30 000 à 50 000 personnes, avec une prévalence estimée entre 4 et 7 pour 10 000 habitants. Si certaines peuvent être stabilisées lorsqu’elles sont diagnostiquées précocement, d’autres évoluent vers des formes sévères, neurodégénératives et parfois fatales. Ces affections entraînent fréquemment une perte progressive de l’autonomie (altérations de la marche, de la respiration, de la déglutition, etc.) et nécessitent une prise en charge médicale et médico-sociale lourde et multidisciplinaire. Ce projet vise à générer de nouvelles connaissances sur la fonction neuromusculaire en étudiant de manière approfondie des paramètres tels que la coordination motrice, la fonction respiratoire et la fatigue musculaire. Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes biologiques, physiopathologiques et médicaux impliqués dans ces maladies, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques transposables à l’humain et l’amélioration du diagnostic précoce, condition essentielle pour une prise en charge efficace. Les approches expérimentales combinées (in toto, ex vivo et in situ) permettront une évaluation intégrée et fonctionnelle des atteintes neuromusculaires, maximisant la valeur scientifique des données obtenues. Cette stratégie méthodologique contribue également à limiter le nombre d’animaux utilisés et à réduire leur impact, conformément aux principes des 3R (remplacement, réduction, raffinement), tout en garantissant des résultats robustes, fiables et reproductibles, au bénéfice de la recherche biomédicale et, à terme, des patients atteints de maladies neuromusculaires.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux pourront pratiquer un ou plusieurs exercices fonctionnels sans anesthésie permettant d'évaluer différents paramètres comme la respiration, la coordination, la marche etc... Ces tests seront faits une fois ou plus (maximum 5) avec un temps de repos imposé entre les tests de 2 jours et peuvent durer de 5 à 25 minutes. Dans un second temps les animaux effectueront des tests sous anesthésie générale et analgésie adéquate permettant l'évaluation de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs, l'enregistrement de l'activité électrique vers le muscle en passant par le système nerveux et une échographie du muscle squelettique. Les animaux subiront ces tests une fois ou deux maximums avec un temps de récupération d'un mois imposé. La durée de ces tests est comprise entre 10 et 20 minutes. Enfin, l'évaluation de la mesure de force musculaire (sans réveil) s'effectuera sur la totalité des animaux une seule fois et se fera sous anesthésie générale et analgésie adéquate. Sa durée est comprise entre 20 à 30 minutes. Ce test pourrait être associé à un prélèvement sanguin (toujours sous anesthésie générale et analgésie) qui est une procédure de courte durée (entre 1 à 2 minutes), réalisée par du personnel formé, permettant l’obtention d’un volume de sang suffisant en une seule manipulation.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles sont le stress lié à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à la mise en place des rongeurs dans les appareillages de mesure. Une fatigue musculaire peut survenir pour le tapis de course. Concernant l’évaluation des paramètres d’évaluation de la marche et de la respiration, seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir. Pour les tests nécessitant une anesthésie, les effets indésirables pouvant survenir sont l’hypothermie, la détresse respiratoire, des douleurs au réveil au site de placement d’aiguilles, et du stress au réveil de l’anesthésie le cas échéant. Les animaux présentant un phénotype dommageable pourraient être atteint musculairement (faiblesse musculaire, dégénérescence neuromusculaire, altérations motrices ou respiratoires selon la lignée).

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés en suivant la réglementation en vigueur. Tous les tissus et échantillons musculaires seront prélevés pour des analyses histologiques et moléculaires réalisées ultérieurement en laboratoire de recherche.

Remplacement

Les techniques utilisées dans le cadre de ce projet visent à évaluer la physiologie fonctionnelle de l’animal. À ce jour, aucune méthode alternative ou approche in vitro ne permet de reproduire avec une précision suffisante la complexité physiologique et les interactions systémiques observées chez l’animal vivant. Ainsi, l’utilisation de modèles murins demeure indispensable et scientifiquement justifiée pour l’évaluation de l’efficacité et des effets fonctionnels ou histologiques induits par les traitements en cours de développement. Les modèles de culture cellulaire ou tissulaire existants, bien qu’utiles pour des approches mécanistiques, ne permettent pas de récapituler l’ensemble des réponses intégrées au niveau musculaire, nerveux et systémique. Ce projet vise donc à combiner, au sein d’un protocole cohérent, un ensemble de techniques complémentaires permettant une évaluation complète, rigoureuse et transposable des effets thérapeutiques, tout en respectant les principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).

Réduction

4800 animaux seront utilisés (4200 souris et 600 rats sur 5 ans). Pour limiter le nombre, les animaux seront analysés avec un maximum 5 tests. Au total 12 actes seront testés dont 7 sont des tests fonctionnels sur animaux vigiles (roue volontaire, tapis de course, test d’équilibre, test d’agrippement, évaluation de la marche et de la coordination, évaluation des paramètres respiratoires), 3 sont des tests sous anesthésie générale pour les analyses électrophysiologiques et l’échographie des muscles squelettiques puis réemployés pour l’étude in situ ou in vitro des muscles après une anesthésie sans réveil. Ce nombre d’animaux a été déterminé grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques permettant la comparaison des groupes expérimentaux deux à deux. Des prélèvements tissulaires seront réalisés pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures

Raffinement

Si les animaux ne proviennent pas de l’établissement utilisateurs, ils pourront subir du stress dû aux mouvements des cages, ou lors du transport entre les deux animaleries, mais aussi lors du transfert dans les nouvelles cages ou encore lors d’un changement d’environnement et d’alimentation. Une période d’acclimatation d’une semaine minimum sera alors effectuée dans ces cas-là. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes plastiques/cartons ou batônnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés. Un suivi quotidien sera réalisé pour détecter tout signe d'inconfort. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le nombre d’animaux par cage est réduit à 2 minimum et à 5 maximum pour la souris, les rats seront répartis 2 par cage. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettent de suivre le bien-être de l’animal : observation d'apparition de comportement anormal (hypertoilettage, prostration), posture en cas de douleurs, absence d’interactions avec les congénères, consommation d’aliments et d’eau, sommeil. Pour limiter l'expression des phénotypes dommageables, le matériel des cages est irradié, des croquettes sont mis au sol et si nécessaire de la bouillie ou de l'hydrogel seront apportés dans les cages pour faciliter la prise alimentaire et hydrique. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse et une analgésie adaptée pour les actes techniques le nécessitant. En vue de réduire au maximum le stress des animaux, un exercice d’habituation sera réalisé pour les actes ne nécessitant pas d’anesthésie.

Choix des espèces

Les espèces souris Mus musculus et le rat Ratus norvegicus ont été choisies car elles représentent deux excellents modèles pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus le rat et la souris sont des modèles de choix pour l'étude des dysfonctionnements musculaires car de nombreuses voies de régulation dans le système neuro-musculaire sont conservées entre souris, rat et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiologie et la physiopathologie de ces deux rongeurs sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ces modèles animaux. Les expériences seront réalisées sur des rongeurs (souris et rats) adultes âgés de 2 à 24 mois environ chez lesquels le système neuromusculaire est complètement développé. En fonction des phases de l’étude, de la réalisation des actes, les animaux pourraient être âgés de 3 à 24 mois lorsqu’ils seront euthanasiés pour les prélèvements.

Porteuses par construction génétique d'une mucoviscidose, les souris de ce projet développent un amaigrissement, des difficultés respiratoires et une constipation qu'un laxatif administré en continu dans l'eau de boisson doit atténuer. 128 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingts subissent une injection intrapéritonéale par jour pendant six semaines, une mesure de glycémie hebdomadaire par coupe de l'extrémité de la queue, et des tests métaboliques de deux heures comportant cinq prélèvements sanguins. Une perte de poids supérieure à 15 % déclenche la mise à mort, les autres étant tuées en fin de procédure pour le prélèvement du pancréas et des tissus enflammés.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique qui touche environ une naissance sur 3 500 en France. Elle est causée par une anomalie d’un gène qui perturbe le fonctionnement d’une protéine essentielle à la régulation des sécrétions dans l’organisme. Cette anomalie rend le mucus trop épais et collant, ce qui provoque principalement des atteintes respiratoires et digestives chroniques. Grâce aux importants progrès médicaux, l’espérance de vie des personnes atteintes de mucoviscidose a fortement augmenté : elle est passée d’environ 7 ans dans les années 1960 à plus de 50 ans aujourd’hui. Cette avancée permet aux patients de vivre plus longtemps, mais elle s’accompagne aussi de l’apparition de nouvelles complications liées au vieillissement, appelées comorbidités. Parmi elles, le diabète associé à la mucoviscidose est l’une des plus fréquentes. Il concerne près de 50 % des adultes atteints. Ce diabète est dû à un mauvais fonctionnement du pancréas, l’organe qui produit l’insuline et régule le taux de sucre dans le sang. Dans la mucoviscidose, les canaux du pancréas peuvent se boucher, entraînant une inflammation persistante qui abîme progressivement l’organe et favorise l’apparition du diabète. Des travaux réalisés dans notre laboratoire suggèrent que certains mécanismes impliqués dans l’inflammation du pancréas pourraient jouer un rôle important dans l’apparition de ce diabète. Sur la base de ces observations, nous souhaitons mieux comprendre comment ces mécanismes participent à la dégradation progressive du pancréas dans la mucoviscidose. Ce projet de recherche vise donc à étudier l’état inflammatoire du pancréas dans des modèles de la maladie et à évaluer si certaines approches thérapeutiques pourraient permettre de réduire cette inflammation et de préserver le fonctionnement du pancréas. Cette étude contribuera à améliorer les connaissances sur les mécanismes responsables des complications métaboliques associées à la mucoviscidose et pourrait, à terme, aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes atteintes.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de construire une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans le diabète associé à la mucoviscidose et d'identifier des cibles potentielles afin de proposer une stratégie thérapeutique plus complète, capable de limiter la progression du diabète chez les patients atteint de mucoviscidose, améliorant, ainsi leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux de la procédure 1 (48 souris) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie et un prélèvement de 70 microlitres de sang à la queue pour le dosage d’insuline plasmatique. Ce prélèvement dure moins d'une minute. Les animaux de la procédure 2 (80 souris) subiront plusieurs prélèvements d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie 1 fois par semaine pendant toute la durée du traitement (6 prélèvements sur 6 semaines). Ce prélèvement dure quelques secondes et engendre une douleur légère. Ils subiront 2 prélèvements de sang pour les dosages d'insuline (70 microlitres) : - un prélèvement avant et un prélèvement à la fin du traitement. Ce prélèvement dure moins d'une minute. Les animaux de la procédure 2 subiront des injections répétées de traitement pouvant engendrer une douleur légère (1 injection par jour pendant 6 semaines). Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, la 80 souris subiront une injection et 5 prélèvements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont principalement dues au phénotype dommageable des souris mutantes. Dans les 2 lignées utilisées, les mutations touchent le gène impliqué dans la mucoviscidose (2 modifications génétiques différentes) induisant des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. L’utilisation d’un laxatif dans l’eau de boisson en continu permet de réduire les symptômes de constipation et donc d’amaigrissement. La mise à jeun des animaux constitue une nuisance, correspondant à une privation alimentaire temporaire, susceptible d’entraîner un inconfort transitoire. De plus, des légers effets indésirables seront liés à la piqure lors de l'injection répétée intrapéritonéale du traitement (ou de la solution saline), mais également à la piqure lors de l'injection du glucose, de l'insuline et du pyruvate pendant les tests métaboliques in vivo, ainsi qu'à la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque l’étude de la mucoviscidose et du DAM ne peut se faire que sur un organisme vivant dans son intégralité afin d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante (pancréas, poumon, intestin), aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation du pancréas. Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. Pour les tests in vivo des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 8 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats de tests statistiques).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilé en groupe pour respecter leur comportement social naturel. Pour les souris mutantes, en raison de leur symptômes digestif, un laxatif doux sera administré en continu dans l'eau de boisson, ce qui permet de réduire l'inconfort digestif. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique (manque de toilettage, poils ébouriffés, dos arrondi), le comportement (modification de la prise alimentaire, prostration) et les modifications de poids. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place. L'inconfort généré par la piqure d'aiguille sera limité en alternant le coté d'injection. Le traitement pharmacologique pourrait engendre une perte de poids. Si celle-ci est supérieur à 15% l'animal concerné sera mis à mort. Les tissus seront prélevés après la mise à mort qui sera effectuée selon les procédures recommandées pour assurer leur confort et limiter la souffrance

Choix des espèces

Nous développerons notre projet en utilisant deux lignée de souris transgéniques qui présentent des symptômes similaires à la mucoviscidose humaine avec une maladie intestinale chronique aboutissant à une obstruction intestinale en absence de traitement. Les grandes similitudes que ces modèles présentent dans sa physiopathologie avec la maladie chez l’homme, les rendent un modèle de choix pour étudier la mucoviscidose et les maladies associées, telle que le DAM. L’utilisation conjointe des deux modèles murins se justifie par l’absence de caractérisation pancréatique détaillée de ces deux modèles, en particulier concernant l’inflammation et la fonction endocrine. Leur comparaison est nécessaire pour déterminer si les altérations pancréatiques sont liées à l’absence complète ou à une dysfonction partielle du gène impliqué dans cette maladie. Cette approche comparative permet d’optimiser les informations obtenues tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte et seront âgés de 4 à 6 mois au moment du traitement car nous étudions les effets de l'inhibition à l'âge adulte.

L'automutilation, les vocalisations ou l'agression des petits par la mère déclenchent l'arrêt du protocole et la mise à mort. 806 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les vingt-quatre premières heures de vie, les ratons passent quatorze jours en atmosphère hyperoxique pour reproduire l'hypertension pulmonaire des grands prématurés, leurs mères échangées tous les jours pour épargner à elles seules la toxicité de l'oxygène, avant des échographies cardiaques, des mesures de pression et une pléthysmographie invasive sous anesthésie. Le porteur justifie la cotation modérée par le fait que les animaux ne seront pas soumis à l'effort, seule situation où la gêne respiratoire s'exacerbe selon lui.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons un modèle animal (rats) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (J15 etJ60 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence l’effet thérapeutique de deux molécules pharmacologiques ciblant cible thérapeutique. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme avec un rapport bénéfice- risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. Des substances pharmacologiques dirigées vers la cible thérapeutique seront injectées soit en intranasal soit en intrapéritonéal pour le protocole préventif et pour le protocole curatif. Après 14 jours, une partie des ratons sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du tissu. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du tissu. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le tissu. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60 jours. Durant cette période, les animaux auront une échographie cardiaque sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole jusqu’à J60. Ainsi, les animaux explorés à J60 auront au total 2 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue du protocole, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la survenue de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Etant donné que les substances pharmacologiques sont déjà utilisées en clinique, on ne s’attend pas à l’observation d’effets secondaires importants. Globalement, les nuisances suivantes seront surveillées par les expérimentateurs ou les animaliers : Anesthésies répétées Concentrations potentiellement toxiques en oxygènes Points d’injections à répétition Prise de poids ralentie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer les tissus pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie le poumon gauche, une planification des expériences sera établie pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal et enfin des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales en culture exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre chercheurs/enseignant-chercheurs statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur le modèle de ratons HTP-DBP donc l’utilisation des animaux contrôles pourra être optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires afin d’utiliser tous les tissus disponibles. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). Nous avons besoin de 6 lots différents par condition car les expériences doivent être réalisées sur différentes lots et nos expériences nécessitent de conditionner les poumons différemment, de plus étant donné la petite taille des poumons, nous avons besoin de plusieurs poumons pour réaliser toutes les expériences avec un nombre d’expériences entre 6 et 9 en fonction des expériences. L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire et en accord avec les données de la bibliographie. Le nombre d’animaux sera ensuite réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12 ratons et 1 rate seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement par les expérimentateurs ou les animaliers et conservés sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. Différents paramètres physiologiques (courbe de poids, piloérection, détresse respiratoire) seront surveillés. Un arrêt de la courbe de croissance ou une baisse de poids corporel prolongé dans le temps et non réversible, un comportement anormal des animaux (vocalisation, comportement malveillant vis-à-vis des bébés, automutilation) ou des signes de détresse respiratoire conduiraient à un arrêt du protocole et à la mise à mort de l’animal. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et seront pesés tous les deux jours. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal. L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques, un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduiraient à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. De plus, le rat est particulièrement adapté pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux.

30 miniporcs adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est glissé dans leur canal rachidien lombaire et relié à un boîtier fixé sur la douzième côte, lors d'une opération de deux heures, puis retiré par une seconde chirurgie après un suivi pouvant aller jusqu'à douze mois. Il s'agit de vérifier qu'un sécrétome plaquettaire humain, injecté directement dans le liquide céphalorachidien, peut être administré sans toxicité avant tout essai chez des malades de sclérose latérale amyotrophique. Le porteur attribue à ce produit une "immense activité neuroprotectrice" dans de nombreux modèles expérimentaux, et annonce comme retombée à court terme des publications scientifiques.

Objectifs

La SLA est une maladie neurodégénérative des neurones moteurs qui entraîne une paralysie progressive conduisant irrémédiablement au décès avec une médiane de trois ans. Nous ne disposons d’aucun traitement permettant d’améliorer de manière satisfaisante l’espérance de vie. Ainsi, nous avons développé une biothérapie à partir de plaquettes sanguines de sujets sains qui a démontré une immense activité neuroprotectrice dans de très nombreux modèles expérimentaux. Il s’agit d’un sécrétome plaquettaire qui est dépourvu de membrane plasmique et qui n’entraine donc aucune réaction contre l’hôte (l’administration de sécrétome plaquettaire humain peut être réalisée dans n’importe quelle espèce (humain, rat, souris, singe, porc, …)). Cependant, il ne passe pas la barrière digestive ni la barrière hématoencéphalique. Il nécessite donc une administration directe au niveau du système nerveux central. L’administration intrathécale permet la meilleure biodistribution au niveau du système nerveux central, et notamment de la corne antérieure de la moelle épinière, particulièrement atteinte dans la sclérose latérale amyotrophique. Avant de débuter l’essai thérapeutique, il est essentiel de valider la faisabilité et l’absence de toxicité dans des conditions les plus proches de l’humain. Le modèle de miniporc permet d’utiliser le même matériel que chez l’humain, ce qui n’est pas possible pour les animaux plus petits. Nous espérons améliorer de manière majeure l’espérance et la qualité de vie des personnes atteintes de SLA et ainsi insuffler un espoir thérapeutique pour une maladie mortelle actuellement incurable.Le projet vise à confirmer la sécurité et la tolérance du dispositif médical (DM) ainsi que la procédure d’implantation chez le miniporc, le bon fonctionnement du matériel implanté dans des conditions similaires à l’humain et la sécurité et la tolérance de la biothérapie chez le miniporc. L’utilisation de miniporcs est extrêmement intéressante afin d’obtenir une meilleure transposition des résultats chez l’homme , notamment sa taille et son espace au niveau du canal rachidien qui en fait un bon candidat pour cette étude.

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet aboutira à plusieurs publications scientifiques internationales. A moyen et long termes, cette étude aboutira à la mise au point d'un sécrétome plaquettaire injectable par voie intrathécale pour ralentir l’évolution de la SLA.

Procédures

Tous les animaux de l'étude seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place du dispositif médical et une procédure chirurgicale finale afin d'extraire et d'étudier l'implant et son impact sur l'individu. Pour le miniporc, la chirurgie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum.

Impact sur les animaux

Chez le miniporc, les effets indésirables post-opératoires peuvent inclure une douleur ou un hématome au niveau lombaire où pénètre le cathéter intrathécal, de la paroi dorsale et sous-costal (le long du trajet du cathéter), ou au niveau du port qui sera fixé au niveau costal latérale (12ème côte). Une sensation de corps étranger ou une gêne locale liée au cathéter et au port est possible. Plus rarement, des infections superficielles des plaies ou une infection du dispositif peuvent survenir. A noter que la chirurgie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum. Les animaux seront suivis au maximum durant 12 mois

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car les prélèvements de biopsies ne sont pas compatibles avec la survie de l'animal

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux est strictement limitée à cette étude où aucun modèle alternatif ne permettrait de répondre aux questions scientifiques posées. En amont, de nombreux tests in vitro sur neurones en culture et des expérimentations in vivo sur souris ont été réalisée afin de valider la pertinence et la sécurité de l’approche, réduisant ainsi le nombre d’expérimentations sur le miniporc nécessaires. Cependant, malgré ces efforts, le remplacement total des modèles animaux demeure actuellement difficile. Les interactions complexes entre le dispositif, le traitement et l’environnement biologique ne peuvent être entièrement reproduites par des modèles in vitro ou par des approches alternatives comme les organoïdes ou les simulations informatiques. Les études sur des modèles animaux sont donc indispensables pour évaluer la faisabilité et la tolérance de l’approche dans un organisme vivant, en tenant compte des paramètres neurologiques.

Réduction

Le protocole expérimental est conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés. Les études seront rationalisées en intégrant plusieurs objectifs dans un même protocole. De plus, les observations seront effectuées en combinant différentes analyses afin d’exploiter chaque modèle au maximum de sa pertinence scientifique, réduisant ainsi le besoin de nouveaux groupes expérimentaux. 24 miniporcs sont prévus dans ce projet avec potentiellement 6 miniporcs supplémentaires en cas de problèmes lors des 3 études préliminaires soit 30 miniporcs au final maximum. Nous avons estimé qu’il s’agit du nombre minimal car en dessous de 4 animaux par sous-groupe de sexe aucune conclusion ne peut être tirée. Ce nombre est très classique pour les études de toxicologie sur les grands animaux comme chez le primate non humain. L’analyse est donc principalement descriptive en termes de surveillance clinique (effets indésirables) et en termes d’analyse histologique (pas d’altération des tissus : pas d’inflammation et pas de prolifération cellulaire notamment au niveau des racines rachidiennes). Il est attendu aucune anomalie pour la dose de 3,45 mL. Une dose supérieure est réalisée pour confirmer le seuil de tolérance et aider à l’interprétation d’éventuelles anomalies.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être animal, des mesures de raffinement rigoureuses seront appliquées. Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires : logement individuel, cycle lumineux de 12 h et enrichissement adapté. Les miniporcs bénéficieront de balles, de Kongs garnis de bouillie, de luzerne et de friandises. Les procédures seront réalisées dans des salles dédiées, distinctes des espaces d’hébergement. Une prise en charge analgésique optimale sera assurée : Fentanyl transdermique (patch Durogésic jusqu’à 1 µg/kg/h, efficacité 3 jours), Buprénorphine (0,5 mL/10 kg IM toutes les 8h), Méloxicam (1 mL/10 kg IM, anti-inflammatoire). Les soins seront réalisés sous avis vétérinaire en cas de complications (infection des cathéters…). Un suivi quotidien, voire pluriquotidien, garantira une évaluation rigoureuse. L’échelle visuelle CNRS VetAgroSup aidera à ajuster les traitements antalgiques. Les critères de retrait immédiat incluront : Douleurs sévères non soulagées sous morphiniques (12 h), Perte de poids excessive (≥20 % chez le miniporc), Infections résistantes après 48h, Prostration, absence de réaction ou escarres. En cas d’infection locale, une réintervention sous anesthésie sera réalisée avec parage chirurgical et rinçage antiseptique. L’analgésie au fentanyl pourra être renforcée. Une infection généralisée nécessitera une antibiothérapie adaptée (amoxicilline/acide clavulanique, oxytétracycline, sulfamides/triméthoprime). Un antiémétique (métoclopramide) sera administré si besoin. Une phase d’adaptation de 10 jours précédera toute expérimentation. Un suivi minutieux de la cicatrisation assurera un rétablissement optimal, garantissant des conditions expérimentales rigoureuses et éthiques. Afin de limiter le risque, 3 animaux seront d’abord traités puis le reste des animaux seront inclus, ces 3 premiers miniporcs seront conservés dans l’étude principale si aucun effet secondaire n'est constaté durant l'étude préliminaire.

Choix des espèces

Il n’existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’éviter le recours aux animaux pour ce projet. Les essais in vivo sont menés sur des espèces décrites dans la littérature. Dans un premier temps, nous avons utilisé des rongeurs pour répondre aux principales questions d’efficacité et de sécurité. La faisabilité de l’implantation, du retrait et de la tolérance doit donc nécessairement être validée chez le miniporc. En effet, la transposition des résultats obtenus chez les rongeurs à l’homme est limitée par leurs différences anatomiques et physiologiques, tandis que le miniporc présente de nombreuses similarités avec l’humain et constitue un modèle bien établi. Contrairement aux miniporcs juvéniles, dont le métabolisme et la croissance rapide peuvent biaiser les résultats, l’utilisation de miniporcs adultes permet d’obtenir des données plus transposables à l’Homme. Nous utiliserons des miniporcs adultes de 20 kg à 30 kg.