Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Evaluation de la réponse immunitaire antitumorale après radiofréquence de tumeurs colorectales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales ou l'implantation d'un fragment de tumeur, subissent une intervention de vingt minutes pendant laquelle la tumeur est brûlée par radiofréquence, puis quatre injections de médicaments et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur prévoit des douleurs modérées, des infections locales, des saignements et des douleurs persistantes après l'opération. L'effectif de 2 744 souris n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant seulement que le nombre réellement utilisé sera probablement inférieur, les conditions jugées non optimales étant abandonnées en cours de route.
Objectifs
Le cancer colorectal est le 3e cancer le plus fréquent dans le monde, les métastases hépatiques qui apparaissent chez 50% des patients, sont responsables de la forte mortalité. Le traitement chirurgical de référence, la chimiothérapie et les biothérapies ciblées, ont une efficacité limitée par leur toxicité et par l’acquisition d’une résistance au traitement. Depuis quelques années, les traitements thermiques comme les radiofréquences sont très utilisés pour traiter métastases hépatiques. Ce traitement a l’avantage d’augmenter également la réponse immunitaire chez des patients mais insuffisamment. Dans ce projet, nous évaluerons, chez la souris, des formulations gélifiantes immunomodulatrices associées aux radiofréquences. Les résultats de ce projet permettront d’optimiser et de choisir la formulation, la plus efficace pour stimuler la réponse immune antitumorale et ainsi réduire le risque de récidive.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus chez la souris seront le socle d’un essai clinique de phase I ; qui a terme pourrait offrir une alternative thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer colorectal métastatique en combinant radiofréquences et immunothérapie.
Procédures
Injection de cellules tumorales ou implantation de fragments tumoraux après analgésie – durée 1min. Intervention chirurgicale sous anesthésie application des radiofréquences et injection des formulations des médicaments -durée 20 min. 4 Injections des médicaments - durée 1 min. Imagerie sous anesthésie – durée 5 min.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales peut induire un léger inconfort ou une irritation locale. Les implantations de fragments entraînent des douleurs modérées. L’intervention chirurgicale peut induire une réaction inflammatoire locale entraînant des douleurs modérées. Il existe un risque de complications post-opératoires telles que des infections locales, des saignements ou des douleurs persistantes. Les radiofréquences peuvent entraîner des douleurs locales et un inconfort au site d’intervention. Les Injections peuvent provoquer une douleur modérée ou de légères irritations, pouvant provoquer une gêne temporaire
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour étudier l’effet du traitement sur la survie et analyser son impact sur les organes.
Remplacement
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car elle constitue un organisme modèle fiable pour mimer le cancer colorectal humain. Il n’existe actuellement aucune alternative capable de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Le recours aux modèles animaux demeure dans notre cas essentiel pour garantir la validité et la transposabilité des résultats avant toute application clinique potentielle.
Réduction
Afin de maximiser la significativité et la robustesse de notre étude, les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Les expériences sont conçues de manière à ce chaque étape nous donne des informations permettant de réduire le nombre de souris utilisées dans l’étape qui suit. De plus, il est fort probable que le nombre de souris réellement utilisées soit inférieur à celui initialement prévu, car si certaines conditions ne sont pas optimales, elles ne seront pas retenues, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une grille d'évaluation du bien être des souris spécifiques a été élaborée pour assurer un suivi rigoureux de l’état général des animaux. Une surveillance quotidienne sera réalisée. Cette grille comprend la détermination de points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter le stress et la douleur à son minimum. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise à mort anticipée de l'animal.
Choix des espèces
La souris représente le modèle le plus adapté à l’étude de la réponse immunitaire en raison des nombreuses données disponibles dans la littérature et des travaux antérieurs du laboratoire. Nous utiliserons de souris de 7-8 semaines chez lesquelles le système immunitaire est mature et permet de refléter ce qui se passe chez l’Humain.
Etude de la réactivité cellulaire dans deux régions cérébrales lors de la réexposition au contexte après modulation du métabolisme cérébral du cholestérol chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le rat est retenu parce qu'il consomme spontanément la plupart des drogues d'abus et apprend vite les tâches qui lui en donnent accès. 800 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré: pose d'un cathéter intraveineux sous anesthésie, chirurgie crânienne de deux heures, puis jusqu'à vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration d'héroïne de trois heures ou dix séances de cocaïne de six heures. Ils vivent seuls dès la première opération et jusqu'à la fin, isolement que le porteur présente comme reproduisant les conséquences négatives de la consommation de drogues. Tous sont tués à la fin de l'expérience pour que deux régions de leur cerveau soient analysées.
Objectifs
L’addiction aux drogues est une maladie chronique, marquée par un risque important de rechute, c’est-à-dire la reprise de la consommation après une période d’abstinence. Ces rechutes sont souvent déclenchées par des situations, des lieux ou des contextes associés à la consommation passée. Elles seraient liées à des modifications durables du cerveau provoquées par les drogues. Des études chez l’animal montrent que le métabolisme du cholestérol dans le cerveau joue un rôle important dans les comportements addictifs et que manipuler le métabolisme du cholestérol dans le cerveau permettrait de réduire la recherche de drogue après une période d’abstinence. Cependant, les mécanismes précis à l’origine de cet effet restent mal compris. Une hypothèse est que cette diminution de la recherche de drogue serait liée à une baisse de la sensibilité aux contextes associés à la consommation, qui sont connus pour déclencher l’envie de consommer. Ce projet de recherche a trois objectifs principaux : 1. L’objectif est de déterminer le rôle respectif de deux zones cérébrales dans les effets bénéfiques de la manipulation du cholestérol, afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués. 2. Le projet vise également à déterminer si la modification du métabolisme du cholestérol dans ces régions du cerveau influence la réactivité aux contextes associés à la consommation de drogue. 3. Enfin, l’étude examinera si des effets similaires sont observés avec l’héroïne, une drogue appartenant à une classe différente de la cocaïne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et comportementaux expliqués dans la vulnérabilité à la rechute dans le cadre d’une addiction à la cocaïne ou à l’héroïne. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire les taux de rechutes (nouvelles consommations) de cocaïne ou héroïne, en particulier celles déclenchées par le contexte.
Procédures
Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale pour moduler l’expression d’un gène : 1 fois (2 heures par animal) Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection d'antalgiques et 1 injection d’analgésique - après la chirurgie, 2 injections d’antalgiques par animaux - 10 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session / jour, 6 heures par session) - 10 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 6 heures par session, contrôle de la cocaïne) - 25 sessions d’auto-administration d’héroïne (1 session / jour, 3 heures par session) - 25 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 3 heures par session, contrôle de l’héroïne)
Impact sur les animaux
Chirurgies : inconfort transitoire au réveil minoré par des antalgiques et une surveillance renforcée Implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons Auto-administration de drogue (cocaïne ou héroïne) et abstinence : induction d’un stress léger à modéré Effets liés à la cocaïne : L’administration contrôlée de cocaïne peut induire des effets secondaires comportementaux (hyperactivité, stéréotypies, anxiété), sans atteinte somatique attendue à court terme. Une surveillance comportementale est prévue pour prévenir toute dérive. Effets liés à l’héroïne : L’administration contrôlée d’héroïne peut induire des effets secondaires comportementaux tels que sédation, hypoactivité locomotrice et modifications transitoires de la vigilance, sans atteinte somatique attendue à court terme dans les conditions expérimentales prévues. Une surveillance comportementale est mise en place pour prévenir toute complication. Isolement : peut induire un stress modéré, qui fait partie intégrante du protocole utilisé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les bases comportementales, cellulaires et moléculaire du comportement de recherche de drogue et de l’apparition de nouvelles consommations chez les personnes addictes peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Les effectifs sont optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Chaque animal sera valorisé : il participe à des mesures comportementales, et son cerveau sera analysé à l’issue de l’étude, ce qui permet de combiner des données fonctionnelles et biologiques sans duplication des effectifs.
Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide à surveiller l’atteinte éventuelle des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée journalière pendant 3 jours après les chirurgies, journalière pendant les sessions de consommations et 1 fois par semaine pendant l’abstinence. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Lors de l’entrée en procédure (première chirurgie, les animaux seront séparés pour être exposés à des conditions de vie reflétant les conséquences négatives de la consommation de drogues isolement social et ce pendant toute la durée de la procédure. Un contact visuel sera maintenu. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Lors des chirurgies un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant sera effectué. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire pour une couverture totale de 72heures. Les animaux seront manipulés à partir du cinquième jour pour une habituation à l’expérimentateur.
Choix des espèces
Le rat est l’une des espèces les plus pertinentes et les plus utilisées pour l’étude des mécanismes d’addiction. Il présente une pharmacosensibilité aux substances addictives proche de celle observée chez l’humain, et consomme spontanément la plupart des drogues d’abus, dont la cocaïne et l’héroïne. Le rat apprend facilement des tâches opérantes complexes et développe des comportements addictifs reproductibles, ce qui n’est pas le cas d'autres espèces. Ceci en fait un modèle de choix pour étudier l’addiction et les rechutes. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.
Évaluation du risque à long terme de l’utilisation d’opioïdes chez les adolescents pour traiter la douleur induite par la chimiothérapie, dans un modèle rongeur. MODIFICATION.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Traitées par chimiothérapie puis par morphine pendant leur adolescence, à partir de cinq semaines, 920 souris reçoivent vingt injections quotidiennes sur animal vigile, dont une injection sous la plante de la patte que le porteur décrit comme aiguë et inflammatoire. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 320 d'un niveau sévère, et toutes sont tuées pour analyse post-mortem. Il s'agit de mesurer, une fois adultes, leur sensibilité à la douleur, leur humeur et leurs comportements de dépendance, la morphine induisant l'état de dépendance physique que le protocole cherche précisément à provoquer. Les tests comportementaux sont annoncés par grandes catégories, seuils nociceptifs, anxiété, récompense, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Environ 70 % des jeunes patients souffrant de cancers pédiatriques rapportent également des douleurs sévères. Ces dernières peuvent être le résultat des traitements destinés à éliminer les cellules cancéreuses. En effet, la plupart des agents chimiothérapeutiques détruisent les microtubules dans les nerfs périphériques, favorisent les processus inflammatoires et le dysfonctionnement axonal, provoquant ainsi des douleurs neuropathiques et des douleurs musculaires ou osseuses qui sont fréquemment décrites 4 à 5 jours après les cycles de traitement. Pour soulager ces douleurs, pour l’heure, les opioïdes tels que le tramadol ou la morphine restent le traitement de référence. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur les effets à long terme de l'utilisation répétée d'opioïdes à un stade précoce de la vie. Il est donc urgent de mieux comprendre les effets à long terme de l'utilisation d'opioïdes chez les enfants atteints de cancer et ce sous différents angles. Il semble notamment crucial de comprendre les effets sur la sensibilité à la douleur, l'humeur et l'utilisation abusive d'opioïdes une fois que ces jeunes enfants atteignent l’âge adulte. Ainsi, ce projet pilote, réalisé sur un modèle murin, sera développé autour de deux objectifs principaux : (i) évaluer l'impact de l'utilisation répétée d'opioïdes au début de la vie (adolescence), suite à des traitements chimiothérapeutiques, sur la nociception, l'humeur et les comportements d’addiction à l'âge adulte ; (ii) identifier les régions du cerveau affectées par l'utilisation d'opioïdes au début de la vie (adolescence) en se concentrant particulièrement sur les structures impliquées dans la matrice de la douleur et le traitement de la récompense.
Bénéfices attendus
Ce projet, validé par un comité d’évaluation scientifique, a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur les effets comportementaux à long terme d’une traitement anti-cancéreux combiné à la prise de morphine à un stade précoce de la vie. De plus, ce projet apportera les premières informations permettant de comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans ces effets et permettra de mettre en évidence de potentielles différences sexuelles, souvent sous-estimées dans les études axées sur les adolescents. A long-terme, ce projet permettra d’améliorer le soin des cancers pédiatriques et surtout la gestion de la douleur associée aux traitements utilisés.
Procédures
Le but de ce projet est d’étudier l’effet à long terme d’un traitement anti-cancéreux combiné à des morphiniques effectué lors de l’adolescence. Nous évaluerons les effets nociceptifs, émotionnels et en lien avec les comportements d’addiction. Ainsi des groupes de souris seront traitées avec ce traitement [20 injections au total (1/jour), sur animal vigile; durée d'une injection ~10sec]. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des tests comportementaux (de 5 min à 30 min de test) évaluant les seuils nociceptifs, les comportements anxiodépressifs et les en lien avec la récompense. Un seul test sera réalisé par jour et un délai minimal de 24h sera respecté entre chaque test. MODIFICATION : UNE INJECTION SUR ANIMAL VIGILE D'UNE DUREE DE 10 SECONDES SERA EFFECTUEE. Des chirurgies sur animal anesthésié seront nécessaires (1 chirurgie d'une heure maximum / animail). La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures nécessitent un traitement anti-cancéreux qui peut provoquer une douleur modérée aux animaux. L’administration aigue ou répétée de morphine peut induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies sur animal anesthésié (1 chirurgie d'une heure maximum / animal) pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. MODIFICATION : L'INJECTION SOUS CUTANEE AU NIVEAU PLANTAIRE induit UNE DOULEUR AIGUE AINSI QU’UNE POTENTIELLE INFLAMMATION AU NIVEAU DU SITE D’INJECTION nécessaires à l'étude réalisée. La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de réponses nociceptives, de comportement émotionnels et de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement et 10 pour les analyses immunohistologiques. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet et que les deux sexes soient utilisés, les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour notre projet et les approches sur cerveau entier permettront d’identifier un grand nombre de cibles potentielles sans avoir à répéter les expériences.
Raffinement
Tout au long des expériences, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), et observées quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors du traitement à la vincristine, une grille de score sera utilisée permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Cette grille de score visera également à évaluer la zone d’injection et d’ainsi vérifier l’absence d’inflammation locale, d’induration ou de dommages cutanés. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, en complément de la grille de score du suivi, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.
Choix des espèces
Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’humain, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Par ailleurs, d’autres expérimentations portant sur les conséquences d’une douleur neuropathiques ont déjà été réalisées par notre équipe sur des souris mâles et femelles. De ce fait, par soucis de cohérence et reproductibilité, nous souhaitons conserver la même souche de souris pour ce projet. Des animaux adolescents seront utilisés (début des procédures à 5 semaines pour le traitement anti-cancéreux/morphine) car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet à long terme des traitements subis à un stade précoce de la vie.
Rôle d’une protéine régulatrice du cytosquelette dans les plaquettes murines
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'essentiel de ce que subissent ces souris tient à leur élevage et à leur génotypage: 960 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le génotypage se fait à l'oreille sur animal vigile, les autres prélèvements sous anesthésie sans réveil. Pour mesurer le temps de saignement, les souris sont laissées vivantes le temps que le sang s'écoule, puis tuées aussitôt après. Une partie des animaux ainsi obtenus est utilisée pour entretenir les compétences du personnel, et certains portent une modification génétique qui les rend sourds, ce que le porteur signale comme une source de stress supplémentaire.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont des petites cellules indispensables à l'hémostase en cas de blessure, elles forment un bouchon qui colmate les vaisseaux et empêche le sang de couler. En cas de problème, leur rôle central dans l’hémostase peut se retourner contre nous : un déficit de plaquettes ou un défaut de fonctionnement peut provoquer soit des saignements excessifs, soit au contraire former des caillots indésirables dans les vaisseaux. Pour bien fonctionner, les plaquettes doivent sans cesse remodeler leur squelette interne, appelé cytosquelette. Ce "squelette" leur permet de changer de forme, de s’activer et de s’agréger au bon moment. Des anomalies dans ce processus perturbent leur efficacité et ont récemment été identifiées chez certains patients, entraînant des troubles de la coagulation. Notre projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine particulière du cytosquelette, présente dans les plaquettes. Cela nous permettra non seulement d’évaluer son impact sur la coagulation du sang mais aussi, à terme, d'ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant des maladies hémorragiques ou thrombotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la formation et les fonctions plaquettaires, et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies hémorragiques et thrombotiques.
Procédures
Toutes les procédures expérimentales longues ou invasives seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront euthanasiés à la fin de ces procédures, sans retour préalable à la conscience. Certaines interventions de courte durée (10 à 60 secondes maximum), comme le génotypage à l’oreille, unique, seront réalisées sous souris vigile afin de limiter le recours à l’anesthésie et réduire le stress.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d’élevage, un stress peut survenir lors de la contention des animaux pour le tatouage et le génotypage. Dans le cas des animaux porteurs de modifications génétiques entraînant une perte auditive, cette altération sensorielle peut également générer un stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leurs procédures expérimentales. Dans le cadre de certaines interventions, comme la prise de sang pour la NFS, les animaux sont laissés vivants pendant le temps nécessaire à la réalisation du temps de saignement.L’euthanasie est effectuée immédiatement après ce temps de saignement. Les tissus et organes seront ensuite prélevés pour analyses conformément aux objectifs expérimentaux.
Remplacement
Dans ce projet, une partie de notre étude repose sur de la culture cellulaire. Ces modèles cellulaires sont essentiels pour orienter nos recherches mais ces lignées ne sont pas des plaquettes. En effet, les plaquettes sont des cellules qui ne peuvent pas être mise en culture car elle ne possèdent pas de noyau et peuvent donc pas se multiplier. Par ailleurs, hors d'un organisme vivant, leur survie est limitée à quelques heures. Il est donc nécessaire de disposer de plaquettes isolées à partir de sang fraichement collecté. Nous avons alors généré un modèle de souris pour comprendre le rôle d'une protéine multifonctionelle dans les plaquettes. Ces souris permettront d'étudier les plaquettes sanguines dans un organismes vivant, d'évaluer les interactions entre toutes les composants du sang et d'évaluer les risques de saignement ou d'occlusion thrombotique des vaisseaux.
Réduction
Nous avons pu définir au plus juste le nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques. Enfin, une partie des animaux générés seront utilisés dans un objectif de formation et maintien des compétences du personnel.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Les souris sont anesthésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris aussi bien mâles que femelles, seront agées entre 4 semaines et 2 ans.
Identification des neurones impliqués dans le contrôle volontaire de la respiration
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
- Système respiratoire
895 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour que leur cerveau soit prélevé, 386 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 509 d'un niveau modéré. À partir du sevrage, à vingt et un jours, ils apprennent pendant six semaines à nager en apnée, puis subissent une ou deux chirurgies cérébrales ou spinales d'une heure et demie à deux heures et demie, la dernière sans réveil. Des diodes implantées dans le crâne servent à déclencher ou bloquer des apnées, pour identifier les neurones du contrôle volontaire de la respiration. Le porteur décrit l'entraînement à la nage comme un exercice ludique adapté au comportement naturel du rat, et qualifie d'"indispensables" les avancées que garantirait le caractère novateur de l'étude.
Objectifs
La respiration permet le renouvellement indispensable de l’oxygène dans l’organisme et l’élimination du dioxyde de carbone. L’activité respiratoire automatique est générée par des réseaux neuronaux du tronc cérébral dont la localisation ainsi que les mécanismes de fonctionnement sont à présent bien connus. En revanche, les réseaux situés dans les régions supérieures du cerveau qui permettent de contrôler volontairement la respiration ou de l’adapter à nos comportements ou émotions restent largement méconnus. Notre projet vise à identifier chez le rat les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration, en particulier ceux responsables de l’apnée volontaire. Le premier objectif aura pour but de localiser les neurones des régions cérébrales supérieures qui envoient directement des connexions vers les neurones contrôlant les muscles respiratoires. Pour cela nous utiliserons des traceurs injectés dans la moelle épinière ou le tronc cérébral. Le second objectif consistera à stimuler ou bloquer sélectivement ces neurones identifiés dans les expériences précédentes pour comprendre leur rôle dans la respiration. Les réponses respiratoires et cardiaques seront analysées chez l’animal anesthésié ou éveillé tandis que les neurones seront activés ou désactivés. D'autres expériences viseront à identifier les neurones activés lors de la nage en apnée, grâce à un marqueur d’activité cellulaire. Pour cela, les rats suivront un entraînement progressif et non contraignant à la nage, puis à l’apprentissage de l’apnée volontaire, sous forme d’un exercice ludique et adapté à leur comportement naturel. Ensuite, il s'agira de moduler l’activité des neurones activés lors de la nage en apnée. Nous devrions ainsi pouvoir déclencher des épisodes d’apnée suite à l’activation sélective de certains neurones, ou inversement, bloquer l’apnée suite à l’inhibition de ces mêmes neurones. L'originalité et la force des expériences proposées résident ainsi dans leur capacité à caractériser, de manière inédite, le réseau neuronal impliqué dans le contrôle volontaire de la respiration, tant dans son organisation structurelle que dans ses mécanismes fonctionnels.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche proposé vise à améliorer nos connaissances sur le contrôle nerveux de la respiration. Il a précisément pour but d’identifier les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration. De plus, les explorations fonctionnelles réalisées dans ce projet permettront pour la première fois d’établir une relation de cause à effet entre l’activité des neurones identifiés et les paramètres respiratoires et cardiovasculaires. La tâche comportementale sélectionnée, l’apnée associée à la nage en immersion, est particulièrement intéressante. En effet, une baisse du rythme cardiaque (ou bradycardie) est observée lors de l’apnée chez presque toutes les espèces animales étudiées ainsi que chez l’homme. Ainsi, les découvertes effectuées dans le cadre de ce projet pourraient permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles et de lutter plus efficacement contre le stress chronique, l’anxiété ou l’hypertension artérielle. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront également de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Procédures
Ce projet expérimental sera mené exclusivement sur des rats. Les animaux seront répartis en plusieurs groupes selon les procédures prévues. Groupe 1 : Apprentissage de la tâche comportementale d’apnée pendant 6 semaines, suivie d’une chirurgie terminale sans réveil d’une durée moyenne de 20 minutes chez l’animal anesthésié. Groupe 2 : Première intervention chirurgicale sous anesthésie d’une durée variant entre 1h30 et 2h30, suivie d’un réveil. Après un délai de 3 à 6 semaines nécessaire à l’apprentissage de la tâche comportementale d’apnée, seconde chirurgie sans réveil, sous anesthésie, de même durée (1h30 à 2h30). Ces interventions pourront inclure des manipulations préparatoires, la mesure des paramètres cardiorespiratoires et des procédures terminales.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à la mise en œuvre de plusieurs protocoles décrits dans le présent projet. L’anesthésie, en soi, génère un stress. Les procédures chirurgicales invasives, dont les chirurgies cérébrales et spinales, sont susceptibles d’occasionner des douleurs locales, des démangeaisons et des irritations cutanées lors de la cicatrisation. La pose d’implants sous-cutanés ou cérébraux peut également occasionner une gêne mécanique. Les expériences d’optogénétique prévues dans ce projet nécessitent une illumination transcrânienne ou intracrânienne via des diodes électroluminescentes. Cette illumination sera effectuée avec une faible puissance sans effet thermique et n’entrainera donc aucune conséquence néfaste pour l’animal. Une réduction transitoire, plus ou moins marquée de l'activité locomotrice est observée pendant 12 à 24h environ suivant la chirurgie, et pendant cette période d’isolement post-opératoire, un stress peut être lié à la diminution des interactions sociales. La cicatrisation complète des plans cutanés suturés est observée dans les 5 à 7 jours qui suivent la chirurgie. L’apprentissage progressif de la tâche comportementale de nage, en particulier lors des premières interactions avec le milieu aquatique et la découverte du nouvel environnement, peut être une source de stress temporaire pour les animaux et de fatigue musculaire transitoire. Une légère hypothermie, induisant un inconfort thermique, peut être attendue à la sortie de l’eau. Enfin, l’activation des neurones potentiellement impliqués dans la génération de l’apnée volontaire chez un animal respirant à l’air libre pourrait provoquer une brève apnée sèche, limitée à quelques cycles respiratoires (quelques secondes), tandis que leur inactivation pourrait entraîner un refus de se lancer dans la phase de nage en apnée lors de la tâche comportementale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, le cerveau doit être prélevé pour localiser précisément les neurones d'intérêt et/ou circonscrire les régions cérébrales ciblées.
Remplacement
Ce projet a pour but d'identifier les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration. Pour l’instant, les connaissances incomplètes sur le sujet ne permettent pas d’envisager d’approches autres que l’expérimentation animale pour répondre à ces questions (comme une étude in silico par exemple). En effet, il s'agit de mécanismes physiologiques fondamentaux pour lesquels il n'existe que très peu ou pas de résultats antérieurs. Cette absence de connaissances a priori sur ces mécanismes explique donc l'incapacité actuelle à modéliser le fonctionnement des réseaux respiratoires centraux. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Réduction
Le présent projet repose sur l’utilisation de techniques modernes, encore jamais employées pour identifier les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration. L'aspect novateur de l'étude garantit des avancées majeures et indispensables sur la physiopathologie de ces systèmes. Les combinaisons de technique d’enregistrement des activités cardiorespiratoires et de manipulation des neurones par optogénétique permettront de fournir des résultats fonctionnels précis, et ainsi, répondre à de nombreuses questions grâce à la mise en œuvre des protocoles expérimentaux envisagés. Cela sert le double objectif d’optimisation des aspects scientifiques et éthiques. De plus, une analyse de puissance statistique sera réalisée systématiquement avant chaque expérimentation afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à la question expérimentale. Une fois les expérimentations réalisées, des tests statistiques appropriés permettront de valider ou non la question initiale posée. Les différentes stratégies expérimentales proposées ici nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour servir les objectifs scientifiques de cette étude en utilisant les outils et les approches techniques les plus appropriés à chaque partie de l’étude. En particulier l'usage de souches transgéniques chez le rat, combiné aux approches opto- ou pharmacogénétiques, permet de cibler beaucoup plus spécifiquement les neurones d'intérêt par rapport aux autres techniques existantes, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle où la température est contrôlée et les cages munies d'un environnement enrichi. Le nombre optimal d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards concernant les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Une analgésie locale et systémique permettra de couvrir la douleur induite par ces interventions. La température corporelle sera maintenue par un monitorage rectal associé à un tapis chauffant. Un onguent ophtalmique permettra de protéger les yeux des animaux pendant l’intervention. Un suivi post-opératoire rigoureux d’une durée minimale de 7 jours sera effectué, une fiche individuelle de suivi sera remplie et les points limites seront respectés. Lorsque différents dispositifs seront implantés pour effectuer des mesures physiologiques chroniques (2 à 3 semaines), le suivi individuel des animaux sera réalisé pendant toute la durée des expériences en respectant les points limites. Les implants thoraciques et crâniens utilisés sont miniaturisés et dépourvus de batterie interne et sont donc plus légers que les dispositifs télémétriques classiques. Cette conception réduit la charge supportée par l’animal et limite la gêne potentielle lors des déplacements ou de la nage. Dans le cadre de la tâche comportementale, l’apprentissage débutera chez de jeunes animaux afin de limiter le stress. L’entraînement se fera progressivement, avec d'abord une simple mise en contact avec l’eau, puis une nage en surface sur des distances progressivement allongées, puis un apprentissage de l’apnée sur des distances croissantes. L’eau du bassin sera thermostatée à 32 °C (zone de thermoneutralité du rat) afin d’éviter tout inconfort thermique. Après chaque session, les animaux seront séchés et frictionnés dans une serviette douce pour limiter l’inconfort lié à l’humidité. Cette manipulation constitue également une interaction sociale positive pouvant être assimilée à une récompense. Une récompense alimentaire appétente sera proposée à chaque réussite afin de renforcer la motivation et de compenser la dépense énergétique associée à l’effort.
Choix des espèces
Le rat sera la seule espèce d’animaux utilisée. L’intérêt général de ce modèle repose essentiellement dans la proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats), la reproduction rapide des animaux, et les conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes. Le rat est aussi plus robuste physiologiquement que la souris et permet de recueillir davantage de paramètres physiologiques, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés (car moins de perte expérimentale) dans chacun des protocoles envisagés. Des rats adultes seront utilisés comme reproducteurs. Les expériences seront exclusivement réalisées sur la descendance. Les expériences débuteront chez les animaux sevrés, c’est-à-dire à l’âge de 21 jours (P21). Ces animaux seront identifiés individuellement par implantation d’une puce (1.25 x 7mm) sous-cutanée stérile. Ce début commun à P21 des procédures garantit l’homogénéité des conditions expérimentales entre les différentes parties du projet. Selon les groupes expérimentaux, les animaux seront âgés d’un mois et demi environ pour les plus jeunes jusqu’à trois mois pour les plus âgés lors de l’étape terminale. Ce calendrier expérimental permettra d’atteindre notre objectif qui est d’identifier les neurones impliqués dans le contrôle volontaire de la respiration chez l’adulte, c’est-à-dire lorsque le développement du système nerveux central est achevé.
Évaluation préclinique de l’amélioration du lipofilling (= lipostructure) par association à un hydrogel d’acide hyaluronique
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Vingt des 220 souris seront transférées vers un projet de formation interne aux gestes techniques, à condition de n'avoir subi qu'une partie du protocole et de ne garder aucune séquelle. Les 200 autres sont tuées. Toutes sont immunodéficientes, greffées sous la peau de tissu adipeux associé à un hydrogel d'acide hyaluronique, rasées à la crème dépilatoire et identifiées par puce, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. L'objet déclaré est de réduire la résorption du greffon, qui atteint aujourd'hui 30 à 80 %, pour épargner aux patients des interventions répétées, mais le porteur reconnaît qu'aucun calcul statistique n'a servi à fixer les 220 animaux, l'effectif découlant du nombre de formulations à tester sur dix études.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer, dans des modèles précliniques, si l’association du tissu adipeux à un hydrogel d’acide hyaluronique permet d’améliorer l’efficacité et la prédictibilité des procédures de lipofilling (=lipostructure). Plus spécifiquement, ces études visent à : -Démontrer une réduction du taux de résorption du greffon de tissu adipeux après injection sous-cutanée. -Évaluer l’impact de l’hydrogel d’acide hyaluronique sur la qualité, la structure et la persistance du greffon adipeux au cours du temps. -Étudier les interactions entre le tissu adipeux greffé et l’hydrogel d’acide hyaluronique, notamment en termes d’intégration tissulaire et de maintien volumique. Le lipofilling (=lipostructure) est une technique largement utilisée en chirurgie reconstructrice, notamment dans les cas suivants : - Reconstruction mammaire après mastectomie pour cause de cancer - Traitement des séquelles de radiothérapie - Chirurgie reconstructrice dans le cas d’accidents, brûlures, chirurgies mutilantes - Traitement des plaies chroniques et troubles de cicatrisation (ulcères des diabétiques, plaies post-chirurgicales) - Correction de malformations congénitales (par ex, séquelles de fentes labio-palatines, malformations cranio-faciales, syndrome de Poland) Malgré son usage répandu, cette technique présente une forte variabilité des résultats, principalement liée à un taux de résorption du greffon de tissu adipeux pouvant varier entre 30 et 80 %. Cette imprévisibilité contraint souvent les chirurgiens à réaliser plusieurs interventions successives afin d’atteindre le volume souhaité, augmentant ainsi la morbidité pour les patients.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’acquérir des données sur l’impact de l’acide hyaluronique sur la survie du greffon et les mécanismes de revascularisation, résorption et remodelage tissulaire et l’amélioration de la prise et stabilité du greffon adipeux. Ces progrès contribueront à la réduction du nombre d’interventions chirurgicales nécessaires pour les patients, ainsi qu’une réduction de la morbidité.
Procédures
-Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. -Administration de composés de recherche avec possible anesthésie gazeuse. Volumes proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. Durée de 10-15 secondes. Nombre défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Implantation du greffon : douleur à l’injection. -Administration de traitements ou de composés : douleur à l’injection. -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux ayant atteint les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.
Remplacement
Les tests in vitro permettront de présélectionner des formulations d’acide hyaluroniques prometteuses. Néanmoins, étudier l’impact de l’acide hyaluronique sur la survie/rétention du greffon dépend d’un environnement tissulaire complet : revascularisation fonctionnelle, dégradation enzymatique de l’acide hyaluronique et remodelage de la matrice extracellulaire. Ainsi, l’animal est indispensable pour mesurer la rétention volumique sur plusieurs semaines, l’intégration tissulaire et la revascularisation perfusée, ainsi que les phénotypes de résorption (nécrose, kystes huileux, fibrose) au sein d’un tissu vivant.
Réduction
Un total de 220 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser 10 études précliniques de 22 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre de différents composés de recherche et différentes conditions qui sont envisagés d’être testés dans le cadre de ce projet. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées par groupes sociaux, préférentiellement stables, de 2 à 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée dans le cadre de toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais per os dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique ou perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
Le lipofilling consiste en une greffe autologue, ce qui veut dire que le tissu adipeux greffé provient du patient lui-même. Cela permet d’éviter le rejet de greffe. Pour les études précliniques de ce projet, afin d’éviter des réactions immunitaires qui viendraient impacter la prise de greffe et les conclusions de l’étude, uniquement des souches de souris immunodéficientes seront utilisées. Les souches de souris immunodéficientes sont choisies pour ce projet afin d’étudier les greffons tout en évitant les problèmes de rejet de greffe. Les animaux seront inclus dans les études à partir de l’âge minimum de 6 semaines.
Mise au point d’un modèle murin d’hyperparathyroïdie primaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris dont l'état général se dégrade au-delà de seuils fixés à l'avance sont mises à mort avant la fin du protocole. 173 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus. Chacune subit jusqu'à deux opérations du cou de quinze minutes sous anesthésie, la seconde retirant la ou les glandes parathyroïdes rendues malades, avec des douleurs cervicales attendues pendant les cinq jours suivants, et une prise de sang à la queue toutes les quatre semaines pendant six mois. Le porteur affirme qu'il est "absolument nécessaire" de comprendre l'ensemble du retentissement de l'hyperparathyroïdie et qu'aucune méthode in vitro ne remplace l'animal dans ce domaine.
Objectifs
L’hyperparathyroïdie primaire est la troisième maladie hormonale en termes de fréquence après le diabète et les pathologies thyroïdiennes. Elle est due à un défaut de sécrétion de parathormone (PTH) et se manifeste sur le plan biologique par une augmentation de la concentration en calcium sanguin. Ses conséquences cliniques sont nombreuses : osseuses, rénales, métaboliques, cognitives. L’ablation de la ou des glandes malades est le seul traitement curateur de cette maladie. L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle d’hyperparathyroïdie primaire réversible après chirurgie chez la souris (élimination de la/des glandes atteintes), afin d’étudier les conséquences de cette pathologie et de sa guérison.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues de notre projet au-delà du modèle murin sont de mieux comprendre les conséquences et mécanismes impliqués : 1) dans le développement de cette maladie et 2) les bénéfices de l’ablation chirurgicale de la glande malade. Ces informations nous permettront de mieux soigner les patients atteints de cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à deux procédures chirurgicales (Durée : 15 minutes) sous anesthésie générale gazeuse et analgésie. Un prélèvement de sang à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sera réalisé avant la première chirurgie, une fois toutes les 4 semaines pendant 24 semaines jusqu’à la seconde chirurgie, puis une fois toutes les semaines pendant 4 semaines (durée par prélèvement : 1 min). Enfin, un prélèvement de sang par ponction cardiaque lors de l’euthanasie (animal sous anesthésie générale pendant le prélèvement : durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Il s’agit de procédures modérées, et aucune mortalité n’est attendue après les différentes chirurgies. Les principaux effets indésirables attendus pourraient concerner : une douleur faible au site d’incision réalisé pour les prélèvements sanguins ; des douleurs au niveau du cou pendant les cinq premiers jours après chirurgie.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés sera mis à mort à l’issu des expérimentations pour collecter des échantillons sanguins et tissulaires nécessaire à la mesure de l’efficacité de la transduction et des conséquences de l’hyperparathyroïdie primaire.
Remplacement
L’hyperparathyroïdie induit de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade sur de nombreux tissus. Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. ll n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de l’hyperparathyroïdie.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Nous avons pris en compte le bien-être animal, une visite quotidienne des animaux par les zootechniciens formés permettra de prévenir les risques de stress et de souffrance. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées, notamment un protocole péri-opératoire afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, basé sur nos précédentes expériences de chirurgie chez la souris. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent avant la chirurgie puis pendant une durée de 3 jours une analgésie. Les souris reprendront une alimentation normale dès le jour de la chirurgie. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis et un dôme ou un tube tunnel en polycarbonate rouge. Afin de limiter les souffrances post-expérimentales, une surveillance attentive des animaux sera réalisée par l'expérimentateur (toutes les 2 heures pendant premières heures post-chirurgie, 2 fois par jour pendant les 5 jours, puis une fois par jour jusqu'à la fin de l’étude). Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, ont été fixés.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix, il est utilisé depuis de longue date dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale et les études précliniques en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Les procédures débuteront chez des animaux à 8 semaines de vie, pour travailler sur des adultes jeunes mais matures sexuellement.
Impact d’une exposition chronique aberrante à la lumière sur l’humeur et la vision d’un rongeur diurne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposés à de la lumière bleue la nuit dès le sevrage, à trois semaines, 558 rongeurs diurnes reçoivent des injections dans l'œil, subissent des électrorétinographies d'une heure et des chirurgies cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun vit seul en cage à partir de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures. Le porteur range cet isolement parmi les nuisances attendues, puis parmi ses mesures de raffinement, en précisant que les animaux se voient et s'entendent d'une cage à l'autre. Six tests comportementaux qu'il dit validés sont annoncés sans être nommés, et l'espèce n'est jamais précisée, désignée seulement comme un rongeur diurne de laboratoire, avant que tous soient tués pour prélever la rétine et le cerveau.
Objectifs
Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'humain. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme à travers la rétine et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques et l’humeur. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit de manière chronique, et ce dès l’adolescence, va contribuer au développement de troubles affectifs et visuels sur le long terme. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne la rendant plus pertinente que celles menées habituellement sur les modèles de rongeurs nocturnes utilisés en laboratoire tels que les rats ou les souris. Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur l'humeur à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant l'humeur. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition aberrante à la lumière bleue de manière chronique et sur le long terme, sur le développement direct de troubles affectifs et visuels chez un rongeur diurne. En effet, les études actuelles se concentrent davantage sur l’étude de la lumière bleue en se basant sur des modèles de rongeur type souris ou rat, en débit de leur physiologie nocturne et donc, éloignée de celle de l’humain. Les données obtenues sur le modèle diurne pourront donc permettre une réflexion translationnelle plus pertinente.
Procédures
Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte différents types d'interventions. Dans un cas, les animaux seront soumis à 6 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur humeur. La durée d'un test est variable, mais dure environ 10 minutes pour un animal. Afin d'étudier les effets de l’exposition lumineuse sur les cellules à mélanopsine de la rétine, les animaux seront soumis à des injections oculaires, qui se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’exploration de la fonction visuelle se fera par électrorétinographie (ERG), sous anesthésie. Les ERG durent environ 1h et auront lieu à 3 reprises : avant l’exposition, et à 2 âges post-nataux pertinents pour les cinétiques des autres expériences : P50 et P80. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulation de l'humeur, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, La totalité de la procédure dure environ 1h. Une chirurgie terminale sera réalisée sous anesthésie générale afin de prélever les tissus d'intérêts.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien et de l’humeur (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupes. 3) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 4) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)
Devenir
Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière à partir de l’adolescence et sur le long terme chez l’adulte, sur l’humeur et la vision. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base de notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L’effet sur la vision sera évalué par une approche longitudinale à différents stades de l’exposition à la lumière. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification, tunnel et bâton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement, état des yeux) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le choix de notre modèle animal s'est porté sur un modèle de rongeur diurne de laboratoire. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères à long terme d'une exposition aberrante à la lumière bleue commençant dès l’adolescence, afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'humain. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (dès le sevrage, c'est à dire à 3 semaines) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur l’humeur et la fonction visuelle.
Étude du rôle du système lymphatique dans la régulation du sommeil chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six heures de chirurgie crânienne pour implanter le matériel d'enregistrement, après une première opération d'une heure et demie trois semaines plus tôt: 24 souris subissent ces deux interventions, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées ensuite pour prélever leurs tissus. À partir de la seconde opération, chacune vit seule pendant dix-sept jours au plus, isolement dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress chez un animal social. La question posée est de savoir si les vaisseaux lymphatiques des méninges interviennent dans la structure du sommeil, et le RNT présente l'ensemble comme des données préliminaires à un projet ultérieur plus ambitieux. La souris est retenue parce que les techniques chirurgicales y sont maîtrisées et que la croissance de la boîte crânienne est achevée à six semaines, ce qui facilite la pose des implants.
Objectifs
Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans la dure-mère, l’enveloppe la plus externe du cerveau. Ils contribuent au drainage du liquide céphalorachidien (LCR), un liquide clair qui entoure le cerveau et la moelle épinière, transporte les nutriments et aide à éliminer certains déchets produits par les cellules cérébrales. Ce processus de circulation du LCR, appelé système glymphatique, est particulièrement actif pendant le sommeil, lorsque le cerveau échange davantage de substances entre le LCR et les tissus cérébraux. En revanche, le rôle exact du drainage lymphatique de la dure-mère dans certaines phases du sommeil et dans la circulation et l’élimination des déchets cérébraux reste mal compris. L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication des vaisseaux lymphatiques méningés dans la structure du sommeil. Pour cela, une approche expérimentale sera mise en œuvre chez la souris : – une modulation de l’activité des vaisseaux lymphatiques sera réalisée par injection de substances dans le LCR qui soit amplifieront soit feront disparaitre les vaisseaux lymphatiques. – la structure du sommeil et l’activité cérébrale et vasculaire seront ensuite évaluées par enregistrements via des ultrasons captant le flux sanguin et des électrodes captant l’activité électrique des neurones. Les données obtenues permettront de mieux caractériser comment les vaisseaux lymphatiques sont impliqués dans les fonctions réparatrices du sommeil et la circulation du LCR dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre sommeil, circulation du liquide cérébral (lymphatique et glymphatique) et élimination des déchets du cerveau. Plusieurs maladies neurodégénératives montrent des troubles précoces du sommeil ainsi que des dysfonctionnements des systèmes lymphatique et glymphatique comme la maladie de Parkinson ou d’Alzheimer représentant plus de 60 millions de personnes dans le monde. En modulant l’activité des vaisseaux lymphatiques et en étudiant leurs effets sur le sommeil et l’activité cérébrale, ce projet pourrait permettre d’identifier des mécanismes clés de ces interactions. Les résultats fourniront des données préliminaires pour un futur projet plus ambitieux, visant à approfondir ces mécanismes et à étudier leur pertinence chez l’humain.
Procédures
Chaque souris subira deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée : la première consistant en une injection dans le liquide entourant le cerveau (1,5h maximum), puis, 21 jours plus tard, la deuxième permettant l’implantation du matériel nécessaires aux enregistrements (6h maximum). Après la deuxième chirurgie, les animaux bénéficient de 7 jours de repos, 2 à 5 jours d’habituation au matériel, puis 3 heures continues d’enregistrements quotidiens sur 5 jours consécutifs. A partir de la deuxième chirurgie les animaux devront être hébergés seuls (17 jours maximum).
Impact sur les animaux
Certaines interventions chirurgicales prévues dans ce projet peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires, surtout dans les deux jours suivant les opérations. Des signes comportementaux inhabituels, comme agitation, prostration ou mobilité réduite, peuvent également être observés. L’anesthésie générale nécessaire pour les chirurgies comporte des risques tels que baisse de la température corporelle, une sécheresse oculaire ou des difficultés cardio-respiratoires. Après la chirurgie de mise en place du matériel pour les enregistrements, les animaux sont hébergés seuls pour protéger les implants et les animaux de blessures potentielles, s’agissant d’animaux sociaux cela génèrera un stress. Le matériel implanté sera associé à un inconfort pour l’animal et un risque rare de fragilisation voire perte du matériel et un risque d’infection. Le matériel d’enregistrement peut entraîner une petite gêne temporaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.
Remplacement
L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire, le drainage des fluides cérébraux, et le sommeil nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques du sommeil. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
L’étude nécessitera 24 souris, avec 6 animaux par groupe expérimental (3 groupes) et un risque de pertes évalué à 6 animaux (30 pourcent). Ce nombre a été déterminé par des calculs statistiques. Cette taille permettra d’assurer la puissance statistique nécessaire pour l’analyse des données obtenues.
Raffinement
Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont conçues pour réduire au maximum le stress, la douleur et l’inconfort des animaux. À leur arrivée, les souris bénéficient d’une période d’acclimatation d’une semaine dans une animalerie agréée, avec un hébergement en groupe, un environnement enrichi (nids, objets à ronger) et un accès libre à l’eau et à la nourriture. Tous les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, avec l’administration systématique d’antalgiques avant et après l’opération. Pendant la chirurgie, la température corporelle est maintenue, les yeux sont protégés et l’hydratation assurée. Après chaque intervention, les animaux font l’objet d’une surveillance rapprochée, permettant d’adapter les soins si nécessaire. Après la chirurgie d’implantation destinée aux enregistrements du sommeil, les animaux sont hébergés individuellement afin de protéger à la fois l’implant et la souris, en évitant toute blessure liée aux interactions avec les congénères. Une période de récupération d’une semaine est respectée, suivie d’une phase d’habituation de 2 à 5 jours, durant laquelle les animaux s’adaptent progressivement au port de l’implant et aux conditions d’enregistrement. Tout au long de cette période, un enrichissement adapté est maintenu afin de préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent à l’élimination naturelle de certains composés du cerveau. Ces mécanismes reposent sur des interactions complexes entre la circulation des fluides cérébraux, l’activité neuronale et le sommeil, qui ne peuvent pas être étudiées de manière intégrée chez l’être humain ni à l’aide de modèles in vitro, tels que les organoïdes cérébraux, qui ne reproduisent ni la vascularisation ni la circulation des fluides du cerveau intact.La souris a été choisie comme modèle expérimental car elle est particulièrement adaptée à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral sont maîtrisées chez cette espèce, tout comme les implantations chirurgicales permettant des enregistrements de l’activité électrophysiologique. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures seront réalisées chez des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. À cet âge, la croissance de la boîte crânienne est achevée, ce qui permet une meilleure précision chirurgicale et réduit les risques liés aux implants. Cette tranche d’âge correspond également à une période où les systèmes impliqués dans la circulation des fluides cérébraux sont pleinement fonctionnels.
Développement d’une thérapie innovante afin d’améliorer les conditions de conservation et la fonction des greffons marginaux hépatiques – Etude chez le modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
La veille de la chirurgie, chaque cochon reçoit une injection d'anti-douleur d'action longue, puis le jour même une injection de prémédication à l'état éveillé, avant 20 minutes de transport et l'anesthésie générale. 12 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, tous tués avant tout réveil au terme d'une chirurgie de trois heures qui leur retire le foie, avec une biopsie hépatique et des prises de sang toutes les heures, pour tester un anticorps censé réduire l'inflammation des greffons de foie. Le porteur décrit la prémédication comme le "premier et seul acte invasif réalisé vigile", sans préciser si l'anti-douleur de la veille est injecté à un cochon éveillé. Il écarte les foies d'abattoir parce qu'il doit "contrôler le décès de l'animal" pour reproduire un don d'organe "à cœur arrêté", et prévoit de réemployer greffons et tissus pour des formations et d'autres recherches.
Objectifs
Ce projet vise à améliorer la qualité des greffons de foie disponibles, afin d’augmenter le nombre d’organes utilisables et sauver plus de vies. En France, 1 342 transplantations hépatiques curatives ont été réalisées en 2023, avec un taux de survie à un an de 88 % et 76% à 5 ans. Au 1er janvier 2024, 1332 patients étaient en attente de greffe soit 2,4 candidats pour un greffon. Cette pénurie de greffons conduit à des décès sur liste d’attente. Certains greffons sont de qualité insuffisante pour être transplantés. La technique de perfusion hypothermique oxygénée (HOPE), développée à Lyon, permet de mieux conserver les greffons de qualité dite « marginale », mais des problèmes d’inflammation persistent. Le principal défi est de diminuer ces lésions pour améliorer le pronostic des greffons marginaux et des patients transplantés. Un traitement par un anticorps nommé NP-137 sera testé pour réduire cette inflammation en bloquant une protéine spécifique : la nétrine-1. La nétrine-1 joue un rôle dans les maladies chroniques du foie et l’inflammation. Ceci permettra d’améliorer la qualité et la quantité des greffons disponibles et ainsi de réduire le nombre de patients en attente de greffe.
Bénéfices attendus
Cette étude de preuve de concept est la première étape indispensable à l’utilisation chez l’humain. Elle explore l’utilisation de l’anticorps NP-137 pour dépléter la nétrine-1, afin de réduire les lésions inflammatoires des greffons dues aux différentes phases d’ischémie-reperfusion. Grâce à l’homologation clinique du NP-137 en oncologie et l’utilisation de la machine de perfusion en clinique et de notre modèle pré-clinique, cette approche pourrait être testée chez les patients dans des délais très raisonnables. Si les résultats sont positifs, cette stratégie pourrait alors être testée et étendue à d’autres greffons d’organes solides impactés par l’ischémie-reperfusion et l’inflammation.
Procédures
Le premier et seul acte invasif réalisé vigile concerne la réalisation d’une prémédication, réalisée très rapidement en une injection (5 min), permettant ensuite le transport (20 min) et la réalisation de l’anesthésie générale (30 min) dans de bonnes conditions. La période d’acclimatation préalable permet de réalisér cette prémédication dans des conditions moins stressantes pour l’animal. Par la suite, il s'agit d'une procédure chirurgicale sans réveil (3 heures) au cours de laquelle l'animal sera anesthésié et analgésié en continu sans réveil. La chirurgie consiste en la réalisation d’un prélèvement hépatique, qui dure environ 180 minutes. Lors de la procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, des prélèvements sanguins sont prévus afin de contrôler l’état physiologique de l’animal toutes les heures (pendant 3 heures). Une biopsie hépatique (1 min) sera réalisée en début de procédure pour avoir un examen des tissus du foie de référence avant toute manipulation mais sera là encore réalisée sous anesthésie générale. Tous ces prélèvements ne durent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Il s’agit dans le contexte de ce projet, d’une procédure sans réveil, réalisée sous anesthésie générale, avec un monitoring de l’analgésie per opératoire. Par ailleurs, le déroulé des sessions respecte la période d’acclimatation de ces animaux et les séances se déroulent dans le respect du bien-être animal. Les nuisances habituellement rencontrées dans ce type de modèle comprennent le choc anesthésique et le risque hémorragique, plus rarement le risque de reprise de conscience généralement couvert par un monitorage approprié de l'anesthésie/analgésie et des administrations médicamenteuses adaptées. La procédure étant sans réveil, il n’y a par ailleurs pas de nuisances ou effets secondaires attendus après la procédure.
Devenir
Il s’agit d’une procédure chirurgicale sans réveil qui est principalement motivée par des raisons scientifiques qui justifient l’utilisation du modèle décrit. En effet, dans le respect du bien-être animal, par soucis de standardisation, mais aussi pour permettre une analyse pertinente et exhaustive du greffon hépatique, seule la première partie nécessitant le prélèvement d’un greffon hépatique est réalisé chez l’animal. Dans la mesure où il s’agit d’un prélèvement d’organe la mise à mort de l’animal est indispensable en fin de procédure.
Remplacement
Pour limiter au maximum, le nombre de biais, il est important que la procédure expérimentale reflète au plus près les conditions réelles d'une procédure de transplantation hépatique chez l'humain. C'est pourquoi un modèle uniquement cellulaire n'est pas envisageable pour cette étude. De plus pour se servir des machines de perfusion, il est d'indispensable d'obtenir un organe entier à perfuser de taille comparable à l'humain, éliminant le modèle murin. Il n'est pas possible de récupérer cet organe en abattoir car nous devons contrôler le décès de l'animal pour que celui-ci soit semblable aux conditions d'obtention des greffons issues de donneur à cœur arrêté en transplantation hépatique chez l'humain.
Réduction
L’utilisation de ce modèle expérimental permet ensuite de s’intégrer dans une dynamique de réduction, n’utilisant qu’un seul animal au lieu de deux. Nous n’avons en effet pas recours à un second animal pour une transplantation (un animal donneur et un animal receveur) ou pour utiliser du sang lors de la reperfusion puisqu’il s’agit du sang provenant du même animal. Sur le plan statistique, le nombre d’animaux par groupe est le nombre minimal afin d’obtenir une puissance statistique significative. Enfin, les greffons ainsi que les prélèvements d’organes et tissus seront utilisés ultérieurement pour les formations et recherches.
Raffinement
Durant toute la période d’acclimatation, les animaux sont hébergés sur de la litière. Nous leur donnons en complément des briques de litières compactées avec du pop-corn ce qui leur permet de faire de la recherche de nourriture et réduit les bagarres entre individus liées au stress du voyage et de leur arrivée. Quotidiennement, le personnel passe les voir pour donner à manger et interagir avec les individus permettant leur socialisation avec l’homme. Cette socialisation est faite par un enrichissement positif avec de la banane qui est très appréciée par le porc. Afin de détecter tout mal-être, nous utilisons une grille de suivi individuel durant la période d’acclimatation. Durant la chirurgie, l’enregistrement des paramètres vitaux en continu, associé à des alarmes sonores, est complété par une vérification humaine toutes les 30 minutes, effectuée par le personnel compétent dédié. Ce suivi permet de s’assurer du stade anesthésique et de son maintien pendant toute la durée de la procédure. Pour lutter contre l’hypothermie (baisse de la température corporelle), les animaux sont installés sur une table chauffante à 37°C et sont perfusés avec du liquide de perfusion chaud (37°C). La présence d’un vétérinaire sur le site permet d’intervenir rapidement et à tous moments durant la période de présence de l’animal dans nos locaux. Pour toutes les chirurgies, l’animal est intubé puis placé sous ventilation avec un anesthésique gazeux et sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. Un anti-douleur (analgésique) d'action longue sera injecté à l’animal pour prévenir la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique.
Choix des espèces
Le foie de porc présente une taille, un poids et une microstructure similaire au foie humain. Ces caractéristiques anatomiques et histologiques permettent d’effectuer un prélèvement d’organe standardisé et reproductible, ainsi que d’utiliser des machines de perfusion d’organes identiques à celles utilisées en pratique clinique. Un argument supplémentaire est l’utilisation et la validation de ce modèle animal dans la littérature scientifique sur la préservation des greffons hépatiques.
Mise en place et évaluation du développement des anévrismes de l’aorte thoracique par imagerie non invasive
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour provoquer puis suivre un anévrisme de l'aorte, 512 souris subissent l'ouverture puis la fermeture de la cage thoracique sous anesthésie, une opération d'environ vingt-cinq minutes. 432 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 80 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélever le cœur. Chacune reçoit ensuite des injections deux fois par semaine pendant six mois au plus et passe jusqu'à treize échographies sous anesthésie gazeuse. Le porteur écrit que la dilatation de l'aorte ne provoque généralement pas de symptômes, tout en indiquant qu'elle peut comprimer les organes voisins et se rompre en hémorragie interne.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre comment certaines cellules des vaisseaux sanguins se comportent et interagissent lors du développement d’un anévrisme de l’aorte, une maladie caractérisée par une fragilisation et une dilatation de l’aorte. Plus précisément, ce projet vise à : 1-Mettre en place un modèle expérimental de l’anévrisme de l'aorte thoracique chez la souris à l’aide de techniques chirurgicales de précision guidées par l’imagerie. 2- Identifier les premiers signes biologiques associés à l’apparition et à l’évolution de l’anévrisme. 3-Tester et valider de nouvelles cibles pouvant conduire à de futurs traitements. 4- Développer des « jumeaux numériques » de souris, c’est-à-dire des modèles informatiques combinant les données d’imagerie et les informations biologiques, afin de mieux prédire l’évolution de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de certaines cellules dans la fragilisation de l’aorte lors d’un anévrisme. En identifiant les mécanismes moléculaires responsables du durcissement et de l’affaiblissement de la paroi du vaisseau, ces travaux pourront contribuer à mieux évaluer le risque de rupture de l’aorte, une complication grave et potentiellement mortelle. Les connaissances obtenues aideront à orienter le développement de nouveaux traitements visant à réduire la gravité de la maladie et à améliorer la survie des patients. Par ailleurs, l’utilisation de techniques d’imagerie avancées permettra d’identifier de nouveaux indicateurs mesurables de la maladie, ouvrant la voie à un diagnostic plus précoce, un meilleur suivi de l’évolution de l’anévrisme et une évaluation plus précise de l’efficacité des traitements.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale d’une durée approximative de 25 minutes, réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptées, permettant l’induction d’un anévrisme de l’aorte. Un suivi non invasif par imagerie échographique, d’une durée d’environ 20 minutes, sera réalisé sous anesthésie gazeuse deux fois par mois, pour un maximum de 13 examens par souris. Les animaux recevront des traitements expérimentaux administrés par voie orale dans l’eau de boisson et par injections, à raison de deux injections par semaine pendant une période maximale de six mois. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé. À l’issue des procédures, les animaux seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires afin de permettre la collecte des organes destinés aux analyses histologiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale, impliquant l’ouverture puis la fermeture de la cage thoracique, est susceptible d’entraîner une douleur post-opératoire au réveil des animaux, ainsi qu’une perte de poids légère et transitoire et une augmentation temporaire du stress. L’anévrysme de l’aorte thoracique correspond à une dilatation anormale de la principale artère du corps. Cette anomalie ne provoque généralement pas de symptômes. Elle peut toutefois entraîner des douleurs ou une gêne lorsqu’elle compresse les organes voisins. Dans les cas les plus graves, l’anévrysme peut se rompre et provoquer une hémorragie interne. Le suivi par imagerie échographique constitue une approche non invasive et non douloureuse ; le stress associé à cet examen est limité à une courte phase de manipulation par l’expérimentateur, suivie d’une anesthésie, pour une durée totale d’environ 20 minutes par animal. Les injections réalisées chez des animaux vigiles peuvent entraîner une gêne ou une douleur légère et transitoire au niveau du site d’injection.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de procéder au prélèvement du coeur pour des analyses histologiques et moléculaire
Remplacement
Le développement de modèles murins de pathologies cardiovasculaires, telles que l’anévrisme de l’aorte, joue un rôle essentiel en recherche préclinique pour la compréhension des fonctions physiologiques intégrées, en particulier lorsque les méthodes substitutives ne permettent pas d’obtenir des informations équivalentes. Le suivi de processus physiologiques tels que le métabolisme, la perfusion tissulaire, la fonction d’organes complexes ou les effets des médicaments sur l’organisme fournit des informations précieuses sur le fonctionnement global des systèmes biologiques, qui ne peuvent être reproduits fidèlement par des modèles cellulaires. Par ailleurs, les données fonctionnelles issues de l’imagerie échographique seront utilisées et partagées afin de développer, à terme, des jumeaux numériques de souris. Ces modèles informatiques, combinant les données d’imagerie et les informations biologiques, permettront de simuler les perturbations du flux sanguin avant, pendant et après traitement, offrant ainsi un outil prédictif avancé pour optimiser les stratégies thérapeutiques et améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents.
Réduction
La procédure chirurgicale induisant l’anévrisme de l’aorte sera guidée, en amont, par des données échographiques précises, permettant ainsi de réduire la mortalité opératoire et périopératoire, ce qui contribue à diminuer le nombre d’animaux nécessaires. L’imagerie non invasive en temps réel permettra d’évaluer l’apparition des premiers signes de dysfonction aortique, évitant ainsi l’euthanasie prématurée des animaux pour confirmer le succès de la procédure. Chaque animal servira de témoin à lui-même, ce qui optimise le nombre total d’animaux requis grâce à des mesures répétées sur le même individu.
Raffinement
La procédure chirurgicale destinée à induire un anévrisme de l’aorte sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie appropriée, et guidée par des données échographiques précises afin de limiter la durée et le caractère invasif de l’intervention. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne assurée par du personnel formé, avec une évaluation rigoureuse de leur bien-être fondée sur des grilles standardisées de points limites. Les mesures d’analgésie seront adaptées en fonction de cette évaluation, en étroite collaboration avec l’équipe de zootechnie.
Choix des espèces
Le modèle d’anévrisme de l’aorte thoracique chez la souris jeune adulte (mâles et femelles) est un modèle de référence largement utilisé dans de nombreuses études précliniques. La souris représente un organisme particulièrement pertinent pour l’étude de cette pathologie en raison de la forte conservation des mécanismes moléculaires, cellulaires et physiopathologiques impliqués dans les maladies vasculaires entre la souris et l’Homme, ainsi que de la disponibilité de nombreux outils génétiques permettant un ciblage cellulaire précis.
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées de cellules humaines par injection dans la veine de la queue, ou dans le cœur pour les souriceaux de deux jours, 450 souris immunodéficientes subissent ensuite des prises de sang toutes les deux semaines, des greffes de tumeurs et parfois des traitements anti-lymphocytaires. Quatre cents d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, cinquante d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélever rate et ganglions. L'objectif est de faire fabriquer un anticorps antitumoral par des lymphocytes B humains, dans des souris dépourvues de défenses immunitaires et donc exposées à tout pathogène de leur environnement. Le porteur annonce que peu de nuisances sont à attendre, tout en listant la maladie du greffon contre l'hôte, la fièvre, les vomissements, les diarrhées et les tremblements liés aux traitements.
Objectifs
L'objectif de ce projet est la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B humains ou leurs précurseurs puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer la capacité antitumorale de nos anticorps.
Bénéfices attendus
L'utilisation des souris immunodéficientes est un excellent modèle pour notre projet. En effet, ces souris ne possèdent plus de lymphocytes et ne peuvent alors plus détruire les cellules étrangères injectées. Elles sont donc capables de recevoir différentes cellules humaines, comme des lymphocytes B qui produiront des anticorps ou même des cellules précurseuses des lymphocytes, qui pourront alors produire des lymphocytes B humains dans les souris. Avec ce projet, nous testerons donc la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé (essai clinique de phase I) et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
La greffe des cellules sera unique et se fera soit par injection intraveineuse dans la veine de la queue chez les souris adultes soit par injection intracardiaque chez les souriceaux nouveau-nés. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Ensuite, des immunisations et des greffes de cellules tumorales pourront être appliquées sur les animaux si la reconstitution immunitaire a été jugé optimale. Des Lipid NanoParticules pourront également être injectés aux souris reconstituées afin d'explorer la possibilité de modifier le génome de nos cellules d'intérêt directement in vivo. Enfin, des traitements anti-lymphocytaire pourront être administrés aux animaux en cas d'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse de cellules. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les autres nuisances attendues viendront de l'injection intracardiaque du nouveau-né. En effet, la mère pourrait ne pas vouloir récupérer son souriceau si celui a été trop manipulé. Des efforts afin de masquer les odeurs liées à la manipulation seront réalisés pour favoriser la réadoption des souriceaux par leur mère. Des effets indésirables pourront également survenir après les greffes de tumeurs, des points limites concernant la taille des tumeurs seront mis en place afin d'éviter trop d'inconfort et de souffrance aux souris. Des nuisances pourraient aussi survenir après l'injection de LNP par voie intraveineuse (perte de poid essentiellement) mais aussi après l'administration de traitements anti-lymphocytaires (fièvre, frissons, vomissements, flush, diarrhées et tremblements).
Devenir
A l'issue de chaque expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution du système immunitaire humain dans la souris ainsi que sur le développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules précurseuses du système immunitaire. Ces dernières sont en effet capables de se différencier dans la moelle osseuse de la souris après injection et de fabriquer dans ces souris diverses populations immunitaires humaines, dont les lymphocytes B. Il est actuellement possible de différencier ces précurseurs in vitro mais uniquement vers quelques voies données, et non vers la différenciation en lymphocyte. Aucun modèle in vitro ne permet une différenciation complète vers toutes les lignées du système immunitaire. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon des critères généraux permettant de quantifier le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes, ce qui permet donc d'éviter le rejet des cellules humaines. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé de prise de xénogreffes, que ce soit des lymphocytes B humains ou leurs précurseurs. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de contamination par divers pathogènes car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Dans un premier temps, l’expérimentation sera commencée chez des animaux de 4 à 6 semaines. En effet, une meilleure prise de greffe des cellules humaines a lieu chez les animaux jeunes, en particulier pour les lymphocytes. Dans un second temps, l’expérimentation sera commencée chez les souriceaux nouveau-nés de 2 jours. En effet, il est maintenant démontré que la prise de greffe des cellules humaines est meilleure quand les cellules sont injectées chez les nouveau-nés, ceci rendant nos expérimentations plus faciles à réaliser et nos résultats plus faciles à analyser (plus de cellules humaines dans la souris donc des effets plus facilement monitorables).