Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
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- Système nerveux
- Système respiratoire
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Evaluation de l’efficacité de composés antiépileptiques sur un modèle rongeur d’épilepsie EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pesées tous les jours pendant dix semaines, injectées environ dix-huit fois, opérées une première fois pour déclencher un état de mal épileptique puis une seconde pendant deux heures pour implanter des électrodes crâniennes, 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur activité cérébrale est enregistrée en continu, jour et nuit, pendant qu'elles font trois à quatre crises par jour et vivent seules en cage. Vient ensuite un transport de huit heures en camion entre les deux établissements, puis une anesthésie gazeuse de cinq minutes. Toutes sont tuées pour découper leur cerveau en tranches et y mesurer l'effet de molécules antiépileptiques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mesurer l’efficacité de molécules antiépileptiques dans un modèle d’épilepsie chez la souris. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs différents pour la création du modèle (EU1/2) et la collection de datas (EU1/2) et (EU2/2). Des données récentes de la littérature scientifique indiquent que certains récepteurs neuronaux de l’hippocampe sont impliqués dans les mécanismes d’épilepsie temporale. L’hypothèse est que ces molécules anti-épileptiques que nous testerons vont alors cibler ces récepteurs afin de diminuer la fréquence et la sévérité des crises.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments antiépileptiques dans ce modèle. Nos techniques mise en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation des effets pharmacologiques sur le système nerveux central et sur ces explants de tissus vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie une analyse des crises focales partielles ; - D’obtenir des enregistrements sur animal vigile lors des crises et du repos, des crises épileptiques ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.
Procédures
Les animaux sont manipulés tous les jours pendant 10 semaines pour les pesées. (EU1/2) Ils sont injectés tous les quatre jours en SC soit environs 18 injections sur 10 semaines (EU1/2) et (EU2/2) Ils subissent deux chirurgies : *Induction d’épilepsies de 15 à 20 min et une heure post opératoire (EU1/2) *Implantation des électrodes d’enregistrement environ deux heures (EU1/2) Une période d’enregistrement de l’activité électrique cérébrale (sans fil) synchronisée à un enregistrement vidéo 24h/24, 7j/7. (EU1/2) Un transport entre les deux sites (camion spécialisé, 8h de trajet en une seule journée) Et enfin une anesthésie gazeuse durant 5 min maximum. (EU2/2)
Impact sur les animaux
Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables : La procédure peut par : *-l’hébergement individuel des animaux génère du stress ; *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables de types inflammation induration au site d’injection, *- des conséquences des chirurgies avec des déshydrations, des infections possibles ; *- L’implantation des électrodes peut provoquer de l’inconfort*- l’état épileptique provoques des crises épileptiques à une fréquence de 3 à 4 par jour, de courte durée inférieure à 2 minutes en temps cumulé et par jour.
Devenir
Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des antiépileptiques sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle..
Remplacement
Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car les modèles informatiques actuels ne nous permettent pas d’appréhender la complexité de ces connexions anormales observées lors des crises épileptiques.
Réduction
Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole. Pour la partie ex vivo, nous réalisons des enregistrements multiples sur tranches de cerveau après mise à mort des animaux. Le même tissu étant utilisé pour plusieurs expériences d'électrophysiologie sur tranche, cela réduit le nombre d'animaux total nécessaire.
Raffinement
Les animaux utilisés au cours de la Procédure seront habitués, dès le départ aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Les sites d’injection seront légèrement modifiés pour éviter tout problème d’inflammation lors des traitements répétés. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à ces doubles chirurgies. Des traitements analgésiques permettant une gestion de la douleur post-opératoire seront appliqués. Le système d’enregistrement de l’activité cérébrale utilise un dispositif sans fil permettant à l’animal de se déplacer librement.
Choix des espèces
Le développement de ce modèle inductible d’épilepsie et la grande quantité d’informations scientifiques disponibles sur le fonctionnement du cerveau des souris, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de techniques d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour la préparation de tissu nerveux et l’évaluation pharmacologique de molécules. Pour ces raisons, nous n’utilisons que ces rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés de notre partenaire.
Évaluation Préclinique d’une Thérapie Anti-Asthme chez la Souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Sensibilisées deux fois à un allergène sur animal éveillé, puis traitées trois jours de suite sous anesthésie gazeuse pour déclencher un asthme, 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 120 d'entre elles et modéré pour les 360 autres, avec difficultés respiratoires, toux et perte de poids attendues. L'objet est de tester des molécules anti-asthme et de situer les premières fenêtres thérapeutiques, dans un modèle que le porteur qualifie lui-même d'imparfait. Il écrit que les cultures cellulaires et les organoïdes permettent de simuler l'inflammation et de tester des traitements "sans recours animal", avant de conclure qu'ils ne reproduisent pas l'hyperréactivité bronchique d'un "organisme entier".
Objectifs
L'asthme est une maladie respiratoire chronique fréquente, touchant des millions de personnes dans le monde et en France. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estimait à environ 262 millions le nombre de personnes atteintes dans le monde en 2019, avec environ 455 000 décès liés à l'asthme cette année-là. En France, l'asthme toucherait environ 4 millions de personnes. Il est très fréquent chez les enfants, touchant entre 6 à 10 % des enfants en âge scolaire (voire 15 % pour les 13-14 ans selon certaines études). La prévalence chez les adultes est souvent estimée autour de 5 à 7 %. Le traitement de l'asthme vise principalement à contrôler la maladie sur le long terme (traitement de fond) pour prévenir les crises, et à traiter les crises quand elles surviennent. Les traitements médicamenteux sont généralement administrés par inhalation pour une action directe sur les bronches. Il existe un besoin pressant de nouveaux traitements et d'une meilleure élucidation des mécanismes moléculaires de l'asthme, en particulier pour les formes sévères et difficiles à contrôler (environ 5% des patients). Ce projet a pour objectif de tester l'efficacité de nouvelles molécules anti-asthme, et de définir les premières fenêtres thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'utilisation de ce modèle d'asthme permettra d'étudier la maladie in vivo de manière contrôlée. À court terme, il permettra la caractérisation in vivo des mécanismes de l'inflammation et l'évaluation préliminaire de nouvelles cibles moléculaires. À moyen terme, ce modèle contribuera au développement préclinique des thérapies ciblées. Enfin, à long terme, il rendra possible la découverte de nouveaux traitements potentiels, y compris pour l'asthme sévère, faisant progresser la prise en charge clinique.
Procédures
Tous les animaux expérimenteront 2 administrations d'agent sensibilisateur d'asthme (animaux vigiles). Pour l'induction de l'asthme les animaux seront traités 3 jours consécutifs sous anesthésie gazeuse. Le candidat médicament sera administré au maximum une fois par jour pendant 3 jours consécutifs. Un prélèvement sanguin par semaine, sur animaux anesthésiés pendant 2 semaines consécutives pourra être réalisé.
Impact sur les animaux
La nuisance dans ce modèle est directement liée à l'induction des symptômes de l'asthme et aux procédures expérimentales. Cela peut causer des difficultés respiratoires, une toux, et un inconfort général pour la souris. Les traitements administrés par différentes voies peuvent également causer de l'inconfort ou de la douleur. Les injections peuvent être douloureuses au point d'injection, et le gavage peut être stressant. La perte de poids est un indicateur clé de la dégradation de l'état de santé de l'animal et est une nuisance en soi, reflétant la maladie et le stress métabolique. Les prélèvements sanguins hebdomadaires, même sous anesthésie, sont invasifs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements de sang et d'organes à des fins analytiques, avec pour objectif de quantifier les effets protecteurs des molécules administrées pendant l'étude.
Remplacement
Pour étudier l'asthme, des méthodes alternatives comme les cultures cellulaires et les organoïdes permettent de simuler l'inflammation et de tester des traitements sans recours animal. Bien qu'efficaces pour le criblage moléculaire, ces modèles in vitro ne peuvent pas encore reproduire la complexité des interactions nerveuses et cardiovasculaires, ni l'hyperréactivité bronchique d'un organisme entier.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux sera mise en oeuvre par l’estimation du nombre minimal d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats, par un calcul de puissance statistique. Étant donné la variabilité inhérente aux modèles animaux d'asthme, les études décrites dans la littérature utilisent entre 5 et 10 souris par groupe pour les critères d'évaluation. Nous choisissons d’inclure 8 animaux par groupe.
Raffinement
La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que perte de poids, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés, et quantifiés selon une grille de scoring qui comprend aussi les critères d'arrêt. Si des signes de stress apparaissent, nous ajusterons l'environnement pour améliorer le bien-être des souris et notamment stimuler leurs sens et leurs comportements naturels. Nous augmenterons l’enrichissement physique par l’apport de cachettes (boîtes, tunnels) et de matériaux pour la construction de nids (papier déchiqueté, fibres) ainsi que l’enrichissement sensoriel par la modification régulière de la disposition de leur cage et des éléments à l’intérieur de la cage pour offrir de la nouveauté. L'introduction de nouveaux enrichissements se fera progressivement pour éviter un stress supplémentaire. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux et conduiront à l’interruption immédiate de l’expérience. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux à chaque fois que cela sera nécessaire.
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle souris car : (i) la souris est aujourd'hui un modèle animal largement utilisé par la communauté scientifique internationale pour l'étude de l'asthme (ii) elles permettent de reproduire les caractéristiques physiopathologiques clés de l'asthme humain : Bien qu'imparfaits, ces modèles récapitulent les principaux signes de l'asthme allergique chez l'homme, notamment l'inflammation des voies aériennes médiée par les lymphocytes T auxiliaires de type 2, l'accumulation d'éosinophiles dans les poumons, et l'hyperréactivité bronchique, permettant ainsi d'étudier les mécanismes fondamentaux de la maladie. (iii) Il existe de nombreux outils génétiques, lignées transgéniques ou "humanisées" et réactifs spécifiques Les souris seront utilisées lorsqu'elles sont âgées de 6 à 10 semaines pour des raisons liées à la physiologie et aux objectifs de l'étude : 1. A cet âge, les souris ont atteint une maturité immunologique suffisante pour que leur système immunitaire réagisse de manière robuste et reproductible à la sensibilisation par l'allergène. Les souris trop jeunes peuvent avoir une réponse immunitaire encore en développement et donc plus variable. 2. Les procédures invasives comme les lavages broncho-alvéolaires sont plus faciles à réaliser sur des animaux dont la taille et le poids sont suffisants.
Capacité des vaches laitières à réaliser des choix alimentaires, entre des rations à teneurs contrastées en eau, en réponse à une restriction hydrique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
28 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrées au troupeau de l'établissement et réutilisables dans d'autres expérimentations. Elles sont privées d'eau deux fois quatre heures par jour, quinze jours d'affilée et jusqu'à trente jours pour la moitié d'entre elles, pendant que huit prises de sang à la veine de la queue mesurent leur déshydratation. Un capteur de dix centimètres et demi leur est introduit par voie gastro-œsophagienne jusqu'au rumen, un autre planté par microaiguilles dans l'oreille rasée pendant cinq jours. Le porteur reconnaît une compétition accrue aux abreuvoirs à leur réouverture, et présente l'ensemble comme un moyen de formuler des recommandations pour les fermes laitières, où la restriction d'accès à l'eau se pratique déjà.
Objectifs
La transition agroécologique des systèmes d’élevage de bovins laitiers est un levier possible pour garantir une production alimentaire durable dans le contexte du changement climatique. Ce dernier va induire des périodes plus fréquentes de concurrence sur les usages de l’eau. Ces périodes pourront coïncider avec des températures extérieures induisant des besoins d’abreuvement supplémentaires pour les animaux, alors que dans une partie importante des fermes laitières, les installations d’abreuvement ne sont pas optimales. En conséquence, les vaches pourront être plus fréquemment soumises à des périodes de restriction hydrique. Il est aussi probable qu’elles soient alimentées avec des rations à faible teneur en eau du fait de la rareté de l’herbe à ces périodes et du dessèchement des fourrages récoltés. La combinaison de ces phénomènes pourra avoir des répercussions négatives sur les comportements alimentaire et d’abreuvement des vaches et in fine, sur leur bien-être. Néanmoins, les effets négatifs d’une alimentation à faible teneur en eau pourraient être atténués en ajoutant de l’eau directement dans la ration. De plus, la mise en place de pratiques agroécologiques, telles que la diversification de l’alimentation et la possibilité pour les animaux de réaliser des choix alimentaires, pourrait favoriser leur bien-être et leur adaptation à des épisodes de fortes températures ou de moindre qualité des fourrages. Les outils de l’intelligence artificielle et les nouvelles technologies représentent une opportunité pour identifier et analyser en dynamique, en temps réel et de façon peu invasive des indicateurs des composantes comportementale et physiologique du bien-être animal. Ils pourraient permettre d’émettre des signaux d’alerte (déviations précoces) afin de prévenir d’éventuelles altérations du bien-être mais aussi d’identifier des pratiques le favorisant. Dans ce contexte, ce projet vise à combiner des indicateurs physiologiques et comportementaux mesurés à l’aide de dispositifs connectés et de capteurs afin de déterminer les impacts de périodes de restriction hydrique sur le bien-être de vaches laitières pouvant ou non réaliser des choix alimentaires entre des rations à teneurs contrastées en eau.
Bénéfices attendus
Actuellement, la pratique de diversification alimentaire et la possibilité de choix est peu mise en œuvre dans les fermes laitières commerciales. Ce projet va permettre d’acquérir des connaissances sur l’intérêt de procurer aux vaches laitières un choix alimentaire entre des rations à teneurs contrastées en eau pour leur permettre de s’adapter à une contrainte de restriction hydrique. Les restrictions hydriques temporelles, c’est-à-dire le fait d’imposer aux vaches des périodes de la journée pendant lesquelles elles ne peuvent pas boire, se rencontrent déjà en fermes commerciales, notamment lorsque les vaches sont bloquées au niveau de la zone d'alimentation après la traite en prévention des mammites ou quand les abreuvoirs sont utilisés pour inciter les vaches à passer par le robot de traite. Ces situations pourraient être accentuées dans le contexte du changement climatique. Les nouvelles connaissances apportées par ce projet permettront d’émettre des recommandations en termes de pratiques alimentaires afin de permettre aux vaches de s’adapter à ce type de challenge. Elles participeront aussi plus largement à déterminer si la pratique de diversification et de choix alimentaire permet d’améliorer le bien-être des vaches laitières, en prenant en compte le point de vue de l’animal grâce à l’analyse des données comportementales et physiologiques à l’échelle individuelle. Enfin, ce projet participera à l’identification d’indicateurs des composantes comportementale et physiologique permettant de caractériser le bien-être animal en réponse à des challenges et des pratiques en lien avec la transition agroécologique.
Procédures
Les vaches soumises à la modalité "Stress hydrique" seront soumises à une restriction temporelle d’accès à l’eau pendant 2 fois 4h dans la journée et ce quotidiennement pendant des périodes de 15 jours. Suivant le lot auquel la vache appartient et l’enchainement des traitements lors de l’expérimentation, la moitié des vaches enchaineront 2 périodes de 15 jours de restriction temporelle d’accès à l’eau (donc seront soumises à la restriction temporelle d’accès à l’eau quotidiennement pendant 30 jours) alors que l’autre moitié des vaches seront soumises à 2 périodes de restriction temporelle d’accès à l’eau de 15 jours entrecoupées d’une période sans restriction hydrique de 15 jours. Des prélèvements de sang seront réalisés à la veine caudale (2 prises de sang réalisées le 2ème jour de la 2ème semaine de chacune des périodes expérimentales, la première après la traite du matin et avant le repas et la 2ème 3h30 après le début du repas et de la restriction d’accès à l’eau) afin de mesurer des indicateurs de déshydratation (concentrations plasmatiques de sodium, chlore et urée). Au total, 8 prises de sang seront réalisées sur chacune des vaches au cours des 10 semaines d’expérimentation. Tout au long de l’expérimentation, des prélèvements de lait seront réalisés au cours de la traite trois fois par semaine matin et soir pour le suivi de routine de la composition du lait. Ces prélèvements seront réalisés à l’aide de préleveur prévus à cet effet et ne nécessitent pas d’intervention supplémentaire au cours de la traite. Un capteur de mesure de la température et de l'acidité du rumen (d’une taille de 10,5 cm de long sur 3,5 cm de large et spécialement conçu pour les bovins adultes en élevage) sera administré aux vaches par voie gastro-œsophagienne grâce à un outil spécialement conçu pour cela, une fois au début de la période pré-expérimentale. Un capteur intradermique de mesure de conductivité sera posé sur l’oreille des vaches le 1er jour de la 2ème semaine de chaque période expérimentale et sera maintenu pendant les 5 jours qui suivront au maximum avant d’être retiré. La zone de pose sera soigneusement rasée puis nettoyée. Les capteurs seront positionnés à l’aide d’un applicateur qui produira un léger choc par air comprimé. Le dispositif sera enfin stabilisé avec un sparadrap puis une bande élastomère sur le patch adhésif.
Impact sur les animaux
Pour les vaches soumises à la restriction hydrique, malgré un accès aux abreuvoirs leur permettant de couvrir leurs besoins quotidiens en eau, un risque faible de défaut d’abreuvement de certaines vaches est néanmoins présent car une compétition plus importante qu’habituellement aux abreuvoirs après les repas du matin et du soir au moment de la réouverture des abreuvoirs est attendue. Pour les vaches soumises à la fois à la restriction hydrique et alimentées avec la ration à faible teneur en eau (« ration sèche »), il est en plus attendu une modification de la dynamique d’ingestion avec un report du temps d’ingestion et des quantités ingérées sur le repas sans restriction d’accès à l’eau et le soir (plus de 4 heures après le repas du soir). Pour les vaches non soumises à la restriction hydrique et/ou ayant le choix entre la ration « sèche » et la « ration sèche humidifiée » par l’ajout d’eau, aucune nuisance spécifique n’est attendue. La présence de microaiguilles sur les capteurs intradermiques pourra entraîner une légère gêne (démangeaison) pour l’animal du fait d’une bande adhésive sur l’oreille (nuisance légère) pendant la durée de la pose de 5 jours maximum. La pose du capteur ruminal engendrera, une fois par vache pendant le projet, une nuisance légère en lien avec une courte contention et une intubation de moins de 30 secondes. Les prises de sang (8 par vaches réparties sur 10 semaines pendant l’essai) entraineront une douleur fugace liée à l’introduction de l’aiguille dans la veine de la queue.
Devenir
Dans le cadre de ce projet, seule une procédure légère qui n’est pas susceptible d’avoir d‘effets importants sur le bien-être et la santé des animaux sera réalisée. Les animaux seront donc conservés, réintégreront le troupeau d’élevage de l’établissement utilisateur et pourront être réutilisés dans de nouvelles expérimentations. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable de l’installation expérimentale. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est effectivement possible.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les capacités d’adaptation et les réponses comportementales et physiologiques de vaches, ayant ou non la possibilité de réaliser des choix alimentaires entre des rations à teneurs contrastées en eau, à des périodes de restriction hydrique. Les vaches laitières étant le sujet même de l'étude, il est donc impossible de se passer de l’utilisation de ces animaux pour atteindre l’objectif de ce projet.
Réduction
Le nombre de vaches laitières impliquées par lot dans cette expérimentation (n=6) a été calculé afin de garantir la possibilité de mettre en évidence des différences significatives entre les deux lots par les tests statistiques adéquats. Etant donné que le nombre de vaches par lot est limité à son minimum pour atteindre notre objectif, 4 vaches supplémentaires seront impliquées dans le projet afin d’être soumises aux traitements en cours d’expérimentation dans le cas où l’une ou plusieurs des 24 vaches initialement impliquées atteignent un point limite défini dans la présente demande d’autorisation de projet. De plus, le schéma expérimental en carré latin permet d’obtenir une puissance statistique importante pour un effectif modéré d’individus car chaque animal est soumis à chacune des combinaisons de traitement et constitue son propre témoin. Ce schéma expérimental nous permet par ailleurs de prendre en compte l’effet du lot et de la semaine expérimentale afin de mieux isoler la variabilité provenant des traitements. Chaque lot de vaches sera soumis alternativement à toutes les combinaisons de modalités d’accès à l’eau et de traitements alimentaires dans un ordre différent afin de prendre en compte les éventuels effets rémanents d’une modalité d’accès à l’eau ou d’un traitement alimentaire sur les réponses observées lors de la période suivante.
Raffinement
Les vaches seront manipulées par des personnes familières réduisant ainsi leur stress. Lors de l’expérimentation, les vaches seront maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux et sanitaires (notamment hébergement en groupe, matelas pour le couchage…). Une partie des mesures réalisées lors de cette expérimentation est non invasive (observation du comportement alimentaire et d’abreuvement à l’aide de dispositifs connectés, observation des comportements sociaux et d’anticipation et de frustration à l’aide de caméras, mesure du budget-temps à l’aide de colliers accéléromètres, prélèvements de lait à la traite). Les autres mesures restent peu invasives : mesure intradermique de la conductivité et de la température et l'acidité du rumen à l’aide de capteurs et prélèvements de sang. Elles seront réalisées par des personnes entrainées lors d’autres projets, en veillant à ce que les manipulations soient le plus rapides possible afin de n’induire que des douleurs fugaces dans des conditions aussi calmes que possibles pour ne pas induire des stress importants sur les animaux. Le capteur intradermique de mesure de la conductivité permet de se substituer à des prises de sang sériées nécessitant la pose de cathéters veineux ou des prises de sang à répétitions pour mesurer des indicateurs de déshydratation pouvant constituer une douleur pour l’animal. Les capteurs ruminaux permettront de mesurer en continu la température et l'acidité du rumen de chaque vache, et donc de détecter précocement l’apparition de troubles physiologiques et de suivre le comportement d’abreuvement (timing des buvées et quantités d’eau bue). Les prises de sang seront réalisées à la queue ; zone peu douloureuse pour les vaches et nécessitent une contention de courte durée par blocage (contention habituelle pour les vaches).
Choix des espèces
La question de l’intérêt des choix alimentaires pour améliorer le bien-être a été abordée chez les petits ruminants. Cependant, il existe peu d’études traitant de cette question chez la vache laitière, alors que ces dernières sont soumises aux systèmes d’alimentation parmi les plus monotones. La problématique de l’étude est donc spécifique aux vaches laitières et nécessitera de travailler avec cette espèce. De plus, très peu d’études ont été réalisées pour étudier les capacités d’adaptation des vaches à des challenges grâce à la possibilité de réaliser des choix alimentaires. Les seules études concernent la possibilité de choix alimentaires entre des aliments ayant différentes teneurs en fibres afin de s’adapter à des situations d’acidose ruminale. Il est cependant important de s’intéresser à des challenges auxquels pourront être soumis les vaches dans le cadre du changement climatique et de la transition agroécologique, tels que les restrictions hydriques et les rations à faible teneur en eau. Les vaches laitières impliquées dans cet essai seront des vaches adultes en milieu de lactation (à partir d’environ 2 mois et demi de lactation). Cela permettra d’étudier les effets des différents traitements alimentaires et modalités d’accès à l’eau sur la qualité du lait, principale production des vaches laitières. Les vaches seront en milieu de lactation au cours de l’expérimentation afin d’éviter la période du début de lactation lors de laquelle les niveaux d’ingestion des vaches ne sont pas stables, en lien avec l’augmentation de la production laitière jusqu’au pic de lactation qui intervient environ 2 mois après la mise-bas. Les besoins en eau des vaches en lactation sont aussi beaucoup plus élevés que ceux des vaches taries, ce qui rend d’autant plus nécessaire d’étudier des pratiques permettant aux vaches laitières de s’adapter à des périodes de restriction hydrique.
Suivi de la franchissabilité de la passe à poissons n° 3 aménagée dans un grand fleuve
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 400 poissons sauvages de treize espèces vont être capturés, anesthésiés trois à cinq minutes, incisés sur trois à cinq millimètres et maintenus hors de l'eau jusqu'à une minute, le temps qu'une puce leur soit implantée dans l'abdomen. Tous sont ensuite relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de vérifier qu'une passe à poissons construite sur un grand fleuve fonctionne, donc de contrôler sur ces animaux un aménagement humain qui les a d'abord empêchés de circuler. Sept individus sur dix seront pêchés en amont puis transportés en aval avant d'être relâchés, pour ne retenir que des poissons enclins à migrer, et le porteur prévient que certains perdront leur puce dans les semaines qui suivent, sans qu'aucun calcul ne vienne étayer le chiffre de 1 400.
Objectifs
Suite à différents aménagements au niveau des fleuves et des cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.
Procédures
Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 1400 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.
Impact sur les animaux
La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.
Devenir
Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.
Réduction
L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (70%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Les analyses porteront sur le nombre et le pourcentage de franchissement de la passe à poissons par espèce marquée.
Raffinement
Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. L’eau des bacs dans lesquels seront conservés les poissons le temps des différentes opérations fera l’objet d’attention pour le suivi de sa température et de son niveau d’oxygénation. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac d’eau de rivière oxygénée et refroidie. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 20 minutes, pour éviter que la température du bain augmente et permettre qu’elle soit toujours suffisamment fraiche pour ne pas stresser les poissons. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures (taille, poids) et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé sur la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus (couche protectrice recouvrant les écailles des poissons). Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application des mesures prises (retrait du poisson de l’expérimentation, mise en surveillance, mise à mort) en cas d’apparition de points-limites rigoureusement définis à l’avance (exemples : changement de position de l’animal dans l’eau, respiration irrégulière,…) limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.
Choix des espèces
13 espèces de poissons sont ciblées car elles sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine - Poissons d’eau calme : brème, gardon, spirlin, ablette - Carnassiers : Brochet, silure, perche - Migrateurs : alose, mulet porc, anguille 1 stade de développement est retenu pour la plupart des espèces (subadultes-adultes), excepté pour l’anguille dont la migration vers l’amont des cours d’eau s’effectue au stade juvénile. Les subadultes-adultes seront prioritairement marqués, la configuration de la passe étant inadaptée à la franchissabilité par les juvéniles (vitesse de courant d’attrait trop élevée). Les adultes migrent généralement avant ou après leur reproduction. Seules les anguilles juvéniles seront marquées du fait de leur écologie (montaison au stade juvénile).
Rôles de perturbateurs endocriniens dans le develloppement de maladies auto-immunes dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées portent une mutation déclenchée par gavage, sur une lignée déjà détenue par l'établissement. 2 496 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un perturbateur endocrinien par voie orale, puis deux injections sous anesthésie leur déclenchent une thyroïdite ou une myasthénie auto-immune, avant cinq prises de sang sur animal éveillé, cinq tests cliniques et une évaluation de la fonction musculaire. Le porteur indique que le gavage répété peut blesser l'œsophage et faire perdre du poids, et que ces modèles entraînent une perte de mobilité, les tissus étant prélevés après la mise à mort pour des analyses biochimiques et histologiques.
Objectifs
Dans les pays développés, les maladies auto-immunes touchent 5 à 10 pour cent de la population et représentent la troisième cause de morbidité. Elles sont dues à une déregulation du système immunitaire, qui ne discrimine plus le soi du non soi. L'exposition (via alimentation, air, eau) à des perturbateurs endocriniens s'accroit. Ce projet a pour but de comprendre le rôle joué par ces molécules dans le développement de pathologies auto-immunes. Ce projet va décrypter, au sein du thymus, les modulations cellulaires et moléculaires induites par ces molécules qui participeraient à altérer la tolérance immunitaire au soi et au développement de pathologies auto-immunes.
Bénéfices attendus
Les maladies auto immunes telle que la myasthénie sont des maladies chroniques invalidantes. Les causes de développement de ces pathologies demeurent inconnues. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un facteur de l’environnement peut induire des perturbations au niveau de la mise en place de la tolérance immunitaire et par conséquence serait à l’origine de dysfonctionnement thymique conduisant au développement d'une pathologie auto-immune. Aussi, la compréhension des mécanismes étiologiques est donc importante pour proposer des mesures de prévention et adapter les traitements des personnes affectées par une pathologie auto-immune.
Procédures
Des animaux seront soumis à une induction de la mutation génique par voie orale (3 fois, 1 minute sur 5 jours). Des animaux seront exposés à l’état vigile au perturbateur endocrinien ou une solution contrôle par voie orale (1 fois, 1 minute). Les animaux seront soumis à une induction de la pathologie par des injections sur animal anesthésié (2 fois par animal sur 21 à 30 jours, 10-15 minutes pour les injections). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (5 fois pendant le projet, moins d’une minute). Les tests cliniques de suivi des pathologies seront réalisés sur animal vigile (5 fois -15 minutes). L’évaluation de la fonction musculaire se fera sur animal anesthésié (1 fois-15 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : Premièrement, pour le gavage, a- une possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. b- Une perte de poids pour les animaux recevant le perturbateur endocrinien. Deuxièmement : Les animaux incluent dans le modèle de pathologie auto-immune pourraient subir a-Un risque d’hypothermie ou de détresse respiratoire suite à l’anesthésie générale pour l’immunisation. b-sensation d’irritation ou la gêne induite par le produit immunisant. c-un risque de douleur et un inconfort post-immunisation. d-Un stress lié à l’analyse comportementale et une perte de mobilité inhérente aux modèles. Troisièmement : une légère et brève douleur lors du prélèvement sanguin et une perte de sang ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention des animaux.
Devenir
A l’issue de l’expérience, les animaux sont euthanasiés par une euthanasie réglementaire et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques, histologiques et moléculaires.
Remplacement
Des etudes, au préalable, sur des modèles cellulaires ont été ménées. Nous souhaitons valider nos observations avec des modèles in vivo, afin de démontrer l’impact d’une exposition aux molécules identifiées comme perturbateurs endocriniens sur la physiologie thymique et les conséquences sur la susceptibilité au développement de pathologie auto-immunes.
Réduction
Le nombre total d'animaux dans ce projet est 2496. Pour chaque procédure 1248 animaux seront utilisés pour permettre une analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous analyserons les variances et différences entre les groupes testés.
Raffinement
Les animaux obtenus par le fournisseur agrée observeront une période d’acclimatation/adaptation de 7 jours. Tous les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton, bâton en bois) et un accès à l’alimentation et un abreuvement à volonté. Une litière en aoute pour limiter l’inconfort des animaux au niveau des coussinets plantaires. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles, d'aller chercher la nourriture en hauteur. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie et d'une analgésie pré et post immunisation. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers. Les souris sont pesées 2 à 3 fois par semaine et regardées attentivement par la personne menant le projet. Les points limites ont été préalablement définis pour limiter la contrainte et permettre une prise de décision rapide en cas de nécessité.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin car il est bien caractérisé pour les maladies auto-immunes. Il permet d’étudier dans un organisme global, les effets de composés sur les différentes populations cellulaires immunes et leur interaction et conséquence sur la physiologie globale de manière fiable. Ces observations sur organisme entier ne sont pas possibles sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, une lignée murine pour le gène d’intérêt est disponible à l'établissement. Les modèles de thyroïdite et myasthénie auto-immune sont maitrisés par l’équipe et reconnus par la communauté scientifique. Ces modèles sont comparables sur certains points avec la pathologie humaine. Les expériences seront effectuées sur des souris ayant 4 à 7 semaines et 10 à 12 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence et au stade adulte, périodes d’apparition des maladies auto-immunes chez l’homme.
Identification des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la mise en place des réponses anticorps
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injectées jusqu'à trois fois par semaine, saignées une fois par semaine et irradiées à deux reprises, 8 344 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, leur cerveau et leurs poumons. L'objet déclaré est de comprendre comment se mettent en place les réponses anticorps, pour améliorer des vaccins et bloquer des réactions auto-immunes. Les atteintes annoncées dépassent largement ces trois gestes : une encéphalomyélite qui imite la sclérose en plaques, avec une douleur tardive décrite comme modérée à importante, des tumeurs pouvant se nécroser et métastaser au poumon, de la léthargie, un dos arqué, une perte de poids. Le porteur écarte les analgésiques au motif qu'ils pourraient "interférer avec le cours de notre expérimentation", sans décrire nulle part comment la tumeur est greffée ni comment l'encéphalomyélite est déclenchée.
Objectifs
Une des caractéristiques du système immunitaire est sa remarquable capacité à développer des réponses appropriées à des stimuli très divers tout en préservant une intégrité tissulaire. Ce fin calibrage des réponses immunitaires est essentiel car une réponse éffectrice inappropriée ne permet pas un contrôle efficace des pathogènes et inversement, une réponse incontrôlée peut conduire à l’auto-immunité ou à certains types de cancers comme les lymphomes. Une population de lymphocyte T CD4 particulière, les lymphocytes T Folliculaires, contrôlent les réponses anticorps en interagissant et régulant les cellules productrices de ces anticorps que sont les lymphocytes B (LB). L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les interactions cellulaires in vivo entre les différentes sous-populations du système immunitaire qui participent à la réponse immunitaire. Cette étude sera réalisée dans différents contextes pour: 1) promouvoir les réponses immunologiques physiologiques pour obtenir des réponses protectrices et durables dans un contexte vaccinal contre des pathogènes infectieux (virus, parasite...) ou dans le but de développer des réponses anti-tumorales efficaces. 2) bloquer ces réponses immunologiques lorsqu'elles sont déregulées et deviennent pathogènes comme dans le cas de certaines maladies autoimmunes. Ces interactions cellulaires se mettent en place dans des zones précises des organes lymphoides et à des temps précis après vaccination, infection ou lors du développement des maladies autoimmunes. De ce fait, il est possible de mimer la différenciation des cellules effectrices in vitro mais pas d'étudier les interactions de ces cellules avec les lymphocytes B ni le développement de ces cellules mémoires. Des études in vivo caractérisant les dynamiques de ces interactions sont donc nécessaires. Les objectifs sont : Comprendre les mécanismes de différenciation de ces cellules après vaccination ; Améliorer la réponse immunitaire en modifiant les adjuvants vaccinaux, afin d’induire une protection efficace contre différents pathogènes ; Étudier les dérèglements des interactions cellulaires dans des contextes autoimmuns ; Étudier le rôle des cellules effectrices en immunothérapie anti-cancéreuse.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine d'une réponse humorale de qualité pour la promouvoir dans des contextes vaccinaux ou l'inhiber dans des contextes pathologiques. Ces mécanismes pourraient être exploités pour les thérapies de nouvelle génération.
Procédures
Les animaux pourront subir des injections (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine, des prélèvements veineux de sang (durée moins de 1 min) au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure et deux irradiations de moins de 4 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Les lignées génétiquement modifiées que nous utiliserons, et dont nous disposons d’ores et déjà au laboratoire dans ce projet n’ont pas de phénotype dommageable hormis les souris immunodéficientes qui seront utilisées dans la procédure 3. Ces souris dépourvues de système immunitaire sont plus sujettes aux infections. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. Après induction d'une encéphalomyélite qui mime la maldie de la sclérose en plaque, la douleur est absente ou faible initialement et modérée/importante plus tardivement. Une grille de score quotidien d’état clinique est mis en place et à partir d'un score élevé, de la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée sont placées dans la cage pour permettre aux souris qui se déplacent plus difficilement de se nourrir. L’utilisation d’analgésiques, d’antalgiques ou d’anti-inflammatoires pourrait interférer avec le cours de notre expérimentation. La croissance des tumeurs primaires peut induire des difficultés de déplacement. La croissance tumorale peut aussi être associée au développement de nécrose caractérisée par une invagination au centre de la tumeur s’accompagnant parfois de légers saignements et de rougeur sur le pourtour de la tumeur. Le lieu préférentiel de métastase de la tumeur utilisée est le poumon et peut donc être accompagnée de troubles respiratoires. Globalement, la pousse tumorale et le développement de métastases peuvent être associés à une altération de l’état général (absence de nidification, absence de toilettage, asthénie, léthargie, tremblement, dos arqué) et à une perte de poids. Ces effets indésirables apparaissent généralement en fin d'expérience, autour de J20-30. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors de la mesure du volume tumoral).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer différents tissus (les organes lymphoïdes, rate, cerveau, poumon) pour des analyses cytométriques, transcriptomiques et histologiques.
Remplacement
Les réponses humorales misent en place sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (ganglions lymphatiques drainant, non drainants, tissus cibles). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées/reproduites in vitro.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons aussi interrogé des chercheurs maitrisant ces modèles et leur robustesse. Nous en avons conclu que le nombre minimal d’animaux est de 10 par groupe. Le calcul d'effectif a été déterminé par une approche statistique. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal : étude longitudinale de mesure de la pousse tumorale ou suivi d'encephalomyelite autoimmune et étude cytométrique/transcriptomique/histologique sur les tissus post-mortem
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite. Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, en particulier les animaux immunodéficients, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloos, sizzelnest pour la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du serum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les acteurs de la réponse immunitaire et, plus précisméent, humorale chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse humorale qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée (DC), plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative (Lymphocytes B et T)) et dans l'espace (dans les organes lymphoïdes et les tissus cibles). Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux agés de 8-30 semaines. Le système immunitaire atteint sa maturité fonctionnelle aux alentours de 8 semaines, puis commence à décliner à partir d’environ 30 semaines. Ces éléments justifient le choix de l’âge des animaux utilisés pour les expérimentations.
Identification des séquences régulatrices dans la régénération chez le poisson zèbre
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
12 720 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 7 020 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un infarctus est provoqué chirurgicalement sur le cœur, suivi de biopsies et de six prises d'image par animal sous anesthésie, le porteur annonçant une baisse d'activité ou d'appétit après l'opération. L'espoir de stratégies pour régénérer les tissus humains est renvoyé au long terme, l'objet immédiat étant d'identifier les séquences d'ADN qui activent la régénération du cœur du poisson, une partie des animaux étant aussi utilisée pour la formation de personnels. Le porteur affirme que les cultures de cellules et les modèles informatiques ne reproduisent pas ce qui se passe dans un cœur vivant, et justifie l'effectif par des stratégies d'accouplement calculées d'après des expériences antérieures, sans donner de chiffre.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certains tissus peuvent se régénérer après une lésion chez le poisson zèbre. Ce petit poisson est utilisé comme modèle scientifique car il possède une capacité naturelle à reconstruire des organes endommagés, comme la nageoire ou le cœur. Pour atteindre cet objectif, les approches suivantes seront adaptées : 1. Identifier les séquences d'ADN responsables de l'activation des programmes de régénération cardiaque. 2. Évaluer l’impact de l’inhibition pharmacologique ou de la délétion génique de ces éléments sur la régénération cardiaque. En étudiant ces mécanismes, nous espérons identifier des processus biologiques communs qui pourraient, à long terme, aider la recherche médicale à développer de nouvelles stratégies pour favoriser la régénération des tissus chez l’être humain, par exemple après un accident ou une maladie.
Bénéfices attendus
Le poisson zèbre permet d’étudier comment le cœur peut se réparer après un infarctus. En comprenant comment les gènes s’activent pour régénérer le cœur chez le poisson, nous pourrons mieux comprendre pourquoi le cœur humain a plus de difficultés à se réparer. Ces connaissances pourraient ensuite aider à développer de nouvelles stratégies pour améliorer la récupération du cœur après une attaque cardiaque.
Procédures
Biopsie: réalisée une seule fois sous anesthésie générale et analgésie, durée
Impact sur les animaux
LLes effets indésirables prévus sur les animaux : • Biopsie: sous anesthésie générale et analgésique peut induire une gêne très brève de quelques secondes. • Chirurgie cardiaque : sous anesthésie générale et analgésique peut induire une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. •Imagerie : réalisée sur animaux anesthésiés, 6 photos par animal, chaque photo prenant environ 1 minute.
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été́ réalisées soit au court des procédures soit seront réalisées en post mortem.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation d'animaux est nécessaire pour comprendre comment le cœur peut se réparer naturellement après une blessure. Ce phénomène de régénération implique des mécanismes très complexes qui concernent l’ensemble du corps, comme la circulation du sang, les réactions du système immunitaire ou encore les échanges entre différents types de tissus. Aujourd’hui, les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ou des modèles informatiques ne permettent pas de reproduire avec précision ce qui se passe dans un cœur vivant. Le poisson zèbre, un petit poisson dont le cœur a une grande capacité naturelle de régénération, est utilisé dans ce projet. Il constitue un modèle reconnu et précieux pour mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour aider à réparer un cœur humain malade.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statistiques nécessaires à l'analyses des données.
Raffinement
Les poissons utilisés dans ce projet sont élevés dans de bonnes conditions (eau propre, température adaptée, éclairage approprié) et leur comportement est observé chaque jour. Toutes les interventions sont réalisées avec le plus grand soin et sous anesthésie, avec des traitements pour limiter la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués afin de réduire au maximum tout inconfort pour les animaux. Après chaque intervention, les poissons sont surveillés et, si leur état se dégrade, une mise à mort sans douleur est pratiquée immédiatement.
Choix des espèces
Le poisson zèbre (zebrafish) est un animal largement utilisé en recherche biomédicale car il partage environ 70 % de son génome avec l’être humain, et son système cardiovasculaire fonctionne de manière très similaire au nôtre. Pendant le développement, ses embryons se forment à l’extérieur de la mère et sont transparents, ce qui permet d’observer en détail la formation du cœur et des vaisseaux, sans chirurgie ni extraction. Notre étude se fera chez l’adulte, ce poisson possède une capacité remarquable de régénération : il peut réparer entièrement une partie de son cœur après une blessure. Cette aptitude exceptionnelle en fait un modèle idéal pour étudier la régénération des organes et mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour inspirer la médecine humaine.
Caractérisation anatomique et fonctionnelle de la comorbidité entre la douleur chronique et les problèmes moteurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 330
Le nerf sciatique est lésé chirurgicalement pour installer une douleur mécanique persistante que le porteur reconnaît ne pas pouvoir soulager par des analgésiques sans compromettre ses objectifs. 960 souris et rats vont être utilisés, par groupes d'au plus quinze, tous tués pour que leur système nerveux central soit prélevé, dont 450 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après l'opération, les animaux se déplacent difficilement pendant deux à trois jours. L'objet est de cartographier les circuits reliant la perception de la douleur au contrôle du mouvement, et le porteur situe l'enjeu dans une douleur chronique qui touche 20 à 30 % de la population humaine, sans avancer de retombée clinique plus précise.
Objectifs
La douleur chronique peut résulter d’une inflammation persistante ou d’une lésion du système nerveux, impliquant des mécanismes périphériques et/ou centraux. Elle constitue un problème majeur de santé publique, affectant environ 20 à 30 % de la population mondiale. De plus, elle s’accompagne très fréquemment d’un risque accru de développement de troubles moteurs, ce qui représente un enjeu majeur en santé publique. Les mécanismes neuronaux sous-jacents à cette comorbidité douleur–troubles moteurs restent encore largement inconnus, d’où la nécessité d’études précliniques approfondies. De nombreuses recherches se sont concentrées sur changements induits par la douleur dans les neurones de la moelle épinière, mais peu d'attention a été accordée aux composantes cérébrales. Pourtant les mêmes régions du cerveau et les mêmes composants neurochimies sont impliquées dans le mouvement et la perception de la douleur. Le but de ce projet est de caractériser les circuits neuronaux impliqués dans la perception de la douleur et le contrôle du mouvement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude concernent la caractérisation d'un circuit impliqué dans la douleur et les troubles moteurs associés, qui peut être traité et surveillé par des techniques non invasives telles que la stimulation magnétique transcrânienne. À court terme, ce projet chez la souris et le rat est mené parallèlement à une étude chez l’humain utilisant la stimulation magnétique transcrânienne. Dès que les expériences sur les rongeurs apportent des réponses sur l'anatomie et la fonctionnalité du circuit d'intérêt, il sera possible d’adapter les protocoles de stimulation chez l'homme de manière plus fine et plus sûre. L'objectif final de ce projet est donc de caractériser les circuits responsables de l’effet de la stimulation magnétique transcrânienne chez les rongeurs, afin d’améliorer cette technique pour le traitement de la douleur chez l’humain. L’innovation réside dans le ciblage de circuits ou de systèmes de médiateurs chimiques intervenant simultanément dans ces pathologies douloureuses et leurs comorbidités motrices. Ces douleurs comprennent non seulement une composante sensorielle, mais aussi émotionnelle et cognitive, qui peuvent entraîner le développement de pathologies graves lorsqu’elles persistent. La sensibilisation à la douleur provoque ainsi une dégradation générale de la qualité de vie et un coût économique important (arrêts de travail, consultations médicales, prise en charge complexe des patients). Notre projet vise à décrire les mécanismes précis de ces interactions dans les régions corticales et le locus coeruleus, voie de sortie qui régule la transmission sensorielle dans et vers la moelle épinière. Ce sont ces mécanismes, partiellement communs aux douleurs et aux troubles psychomoteurs associés, qui seront la cible de traitements tels que la stimulation magnétique transcrânienne.
Procédures
Un premier ensemble d’animaux sera utilisé pour des études visant à décrire l’organisation et le fonctionnement général des circuits nerveux impliqués. Les animaux recevront des injections ciblées (d’une durée d’environ 30 minutes par animal), puis seront euthanasiés dans les 30 à 60 minutes suivantes afin de réaliser des analyses sur des tissus cérébraux. Un deuxième ensemble d’animaux sera consacré à l’étude de situations de douleur persistante. Après l’induction de la douleur (durée 10 à 20 minutes), les animaux feront l’objet d’une évaluation comportementale (10 à 30 minutes), suivie de mesures réalisées sous anesthésie générale (2-4 heures). Un troisième ensemble suivra un protocole similaire, avec une intervention supplémentaire préalable visant à moduler l’activité d’une structure cérébrale impliquée dans la régulation de la douleur et du mouvement. Cette manipulation permettra d’analyser les effets de cette modulation sur les réponses observées chez les animaux dans la demi-heure à l’heure suivante. Enfin, un dernier ensemble d’animaux sera utilisé pour étudier les effets de cette modulation sur l’activité du système nerveux au niveau de la moelle épinière, après réalisation des procédures prévues (durée de 1 a 4 heures selon la procédure).
Impact sur les animaux
Le modèle de douleur neuropathique par lésion du nerf sciatique est particulièrement adapté à ce projet, car il induit une allodynie mécanique persistante, caractéristique des douleurs neuropathiques chroniques. Ce modèle est classé en sévérité sévère, en raison de la douleur persistante induite, qui ne peut être soulagée par des traitements analgésiques sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. À la suite de la chirurgie, une altération transitoire des déplacements des animaux peut être observée. Cette difficulté est attendue et disparaît généralement dans un délai de 48 à 72 heures après l’intervention. Les effets indésirables potentiels associés à ce modèle sont les suivants : 1) une douleur liée à l’acte chirurgical et à la phase de récupération post-opératoire immédiate, prise en charge par une analgésie adaptée ; 2) un risque infectieux associé à la chirurgie, limité par le respect strict des règles d’asepsie et une surveillance quotidienne des animaux ; 3) un risque de perte de poids et d’hypothermie consécutif à l’intervention chirurgicale, faisant l’objet d’un suivi régulier et de mesures correctives si nécessaire..
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque intervention expérimentale. Leur système nerveux central sera prélevé et utilisé pour l’une des études suivantes, en lien avec les objectifs scientifiques du projet : – des études anatomiques visant à caractériser les connexions entre les zones d’intérêt ; – des analyses de l’activité neuronale des zones d’intérêt ; – des contrôles histologiques permettant de vérifier les sites d’enregistrement électrophysiologique ou de stimulation électrique.
Remplacement
La souris et le rat sont les espèces de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. L’utilisation combinée de rats et de souris dans nos protocoles se justifie par les différences anatomiques et fonctionnelles existant entre ces deux espèces, notamment au niveau des régions corticales d’intérêt. Cette approche comparative permet une meilleure compréhension de l’organisation et du rôle fonctionnel de ces structures chez l’humain, en particulier dans le cadre des troubles moteurs associés à la douleur. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches ex vivo et in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre des animaux utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par condition expérimentale. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
Tous les protocoles sont optimisés afin de réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie gazeuse, conformément aux procédures décrites. Les animaux sont surveillés quotidiennement par l’expérimentateur, avec une attention renforcée après les interventions chirurgicales et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Cette surveillance inclut notamment la réhydratation, le maintien de la température corporelle et la mise en place de soins vétérinaires si nécessaire. Les animaux naissent dans l’animalerie de l’établissement, qui bénéficie d’un haut statut sanitaire. Ils sont hébergés en cages collectives sur racks ventilés, équipées d’une litière permettant l’expression de comportements naturels de fouissage, ainsi que d’un enrichissement environnemental composé de nids végétaux et de tubes en carton favorisant le jeu et le comportement de rongement. Leur bien-être est contrôlé par la cellule dédiée au bien-être animal de l’animalerie. Les soins et la surveillance quotidienne sont assurés par un personnel qualifié et expérimenté, avec une vigilance particulière lors des phases de récupération suivant les procédures invasives. Des points limites sont définis pour chaque intervention afin de prévenir toute souffrance inutile. Des mesures précoces et spécifiques sont mises en place en cas d’apparition de signes de souffrance ou d’altération de l’état général. En l’absence d’amélioration malgré ces mesures, une euthanasie est réalisée afin d’interrompre toute souffrance. Dans toutes les procédures où cela est possible, des mesures analgésiques appropriées sont appliquées. Pour les procédures ne permettant pas l’administration d’analgésiques, une surveillance renforcée est assurée et les points limites définis garantissent une prise en charge rapide de la douleur.
Choix des espèces
La souris et le rat adultes sont les espèces choisies pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de ces deux espèces présente de fortes similitudes avec celle de l’homme, ce qui permet d’extrapoler les résultats obtenus afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et comportementaux. Les propriétés neuroanatomiques et physiologiques de la souris et du rat sont comparables à celles d’autres mammifères, dont l’être humain, rendant les enseignements tirés de leur étude largement transférables. L’utilisation conjointe de ces deux modèles est essentielle, car certaines différences anatomiques et fonctionnelles permettent d’explorer de manière complémentaire les circuits neuronaux d’intérêt. La souris est particulièrement adaptée aux études optogénétiques et à la possibilité de cibler précisément des populations neuronales spécifiques. Le rat, quant à lui, est souvent privilégié pour certains enregistrements moteurs périphériques, sa taille plus importante facilitant l’accès et la manipulation des structures nerveuses. Ainsi, la combinaison des deux espèces offre une approche plus complète et robuste pour l’étude du système nerveux.
Suivi de l’expression du collagène dans la matrice extracellulaire chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une lignée est créée porteuse d'une mutation du collagène qui provoque une myopathie dégénérative, avec des difficultés à se déplacer ou à respirer. 1 800 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 900 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une biopsie de nageoire et un isolement de sept à dix jours le temps du génotypage, que le porteur reconnaît stressant, pour que les différences de structure du muscle soient observées de la naissance à un an. Aucun ne sortira vivant du laboratoire, le porteur indiquant que l'adoption d'animaux génétiquement modifiés est interdite par la loi.
Objectifs
Les myopathies dégénératives sont des maladies incapacitantes dont les symptômes s'aggravent avec l'âge. Diverses pathologies ont été répertoriées chez l'homme. Ces myopathies sont généralement des maladies génétiques et nombre de ces pathologies sont liées à des mutations du collagène identifiées chez les humains. Une grande partie de ces pathologies sont des maladies dites 'orphelines' pour lesquelles il n'existe aucun traitement à l'heure actuelle. Les atteintes musculaires sont généralement multiples et couvrent un champ étendu de la physiologie musculaire qui mènent à la dégénérescence musculaire. Chez les malades, la progression de la maladie reste relativement imprédictible. Une même modification génétique peut aboutir à une évolution des symptômes très différents d'un individu à l'autre. Cette diversité est due au contexte génétique et physiologique propre à chaque individu et certainement à des causes environnementales ou comportementales, lié au parcours personnel des malades. L'étude de la mécanistique de progression de ces maladies chez les humains est impossible car elle nécessiterait de réaliser des analyses invasives et incapacitantes. Aussi, afin de mieux appréhender ces pathologies, les symptômes des myopathie nécessitent d'être étudiés à l'échelle physiologique. L'objet de cette étude implique de créer deux lignées de poissons-zèbres porteuses d'un marqueur fluorescent observable in vivo. L'une de ces lignées reproduit une myopathie dégénérative due à une mutation génétique et l'autre est normale. Le but du projet est d'observer les différences structurelles du muscle apparaissant chez la lignée mutante au cours du temps (entre la naissance et un an) par des techniques d'imageries in vivo chez la larve et sur des muscles fixés chez les adultes.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre le mécanisme de dépôt du collagène dans le muscle dans un contexte normal et pathologique et améliorera la compréhension des mécanismes en jeux dans les myopathies dégénératives, ouvrant éventuellement la voie à de nouvelles pistes pour le développement de traitement.
Procédures
Une partie des animaux seront soumis à une unique biopsie de nageoire caudale réalisée sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes. Il n'y a pas d'autre intervention prévue sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de la mutation du collagène sont susceptibles de développer une myopathie dégénérative qui peut entraîner des difficultés de déplacement ou respiratoires. Certains animaux subiront une biopsie de nageoire qui peut entrainer une douleur temporaire. La recherche des modifications génétiques implique de conserver les animaux testés en isolement pendant 7 à 10 jours ce qui peut entrainer du stress.
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront mis à mort. Les animaux utilisés dans toutes les procédures sont des animaux génétiquement modifiés dont l'adoption est interdite par la loi.
Remplacement
Pour comprendre la mise en place de la pathologie étudiée, il est nécessaire d'étudier sa mise en place dans l'organisme entier et par conséquent nécessite le recours à l'animal.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum nécessaire afin d'assurer la pérennité de chaque lignée. Le faible taux de succès attendu lors du protocole de création de lignées génétiquement modifiées impose d'utiliser un nombre important d'animaux pour générer la modification désirée. Les étapes de sélection des animaux sont réalisées sur les stades embryo-larvaires transparents ce qui permet de réduire le nombre d'animaux mis en élevage. Le nombre d'animaux mis en élevage est calculé à partir des constantes d'élevage de l'animalerie (taux de survie à l'issue de l'alevinage, ratio mâle/femelle, ...). L'ensemble des analyses in vivo sont réalisées sur des formes embryo-larvaires afin de limiter le nombre d'animaux mis en élevage.
Raffinement
Les lignées sont maintenue en bac de 20 à 30 poissons ce qui permet de maintenir une sociabilisation adéquat. Des artémies vivantes sont utilisées de manière journalière comme nourriture afin de solliciter l'instinct de prédation des poissons. Les accouplements sont réalisés dans un environnement d'image de flore aquatique pour limiter au maximum le stress. Une minorité des poissons élevés sera génétiquement testée. Des points limites adaptés ont été définis pour permettre le suivi des animaux soumis à ces tests. Chez les animaux porteurs de la mutation, nous rechercherons avec attention l'apparition de signes annonciateurs de myopathie afin d'éviter toute souffrance inutile. Lorsqu'il sera nécessaire d'isoler des animaux, ceux-ci seront placés dans des bacs aux cloisons transparents qui permettent de maintenir un contact visuel et olfactif avec leurs congénères afin de permettre une poursuite des interactions sociales et limiter le stress. Des points limites prédictifs adaptés au modèle utilisé ont été établis et seront utilisés pour évaluer le bien-être des animaux en expérimentation.
Choix des espèces
L'utilisation du poisson-zèbre facilite l'observation des stades les plus précoces de la pathologie en permettant un accès aux embryons sans avoir recours à des protocoles invasifs. De plus, si les muscles des poissons zèbres porteurs de mutation dans le gène collagène montrent des atteintes cellulaires similaires à celles observées chez les mammifères, les conséquences en terme de comportement sont réduites, la nage étant moins impactée que la marche par les atteintes musculaires. Ainsi lorsque l'on observe la nage spontanée, les poissons porteurs de la mutation sont capables de se déplacer de façon normale. Certains animaux seront soumis à un test génétique entre 3 et 6 mois, les animaux plus jeunes étant plus fragiles. Les animaux porteurs de mutations seront suivis tout au long de la vie pour surveiller l'éventuelle apparition de symptômes.
Bioaccessibilité orale de contaminants (tels que les métaux lourds) présents dans les sols, en utilisant un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour valider un test in vitro normalisé, 1 410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 290 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent dix jours en cage à diurèse, sur grille, sans litière ni coton de nidification, ce que le porteur décrit comme un "inconfort constant". Leurs croquettes sont élaborées avec des échantillons de sols contaminés au chrome et au nickel, ce qui réduit la prise alimentaire et empêche l'usure normale des dents, et leurs reins sont prélevés après la mise à mort. Le test ainsi validé est une norme ISO d'évaluation des risques liés aux sols pollués, le porteur présentant le passage du porcelet à la souris comme un gain d'information.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de valider le test in vitro "Unified Barge Method" (Norme International Organization for Standardization 17924:2019) pour l’évaluation de la bioaccessibilité des métaux lourds, tels que le chrome et le nickel, en s’appuyant sur le modèle souris, en établissant des corrélations in vitro-in vivo fiables au regard des critères de validation entre bioaccessibilité et biodisponibilité relative, afin d’améliorer l’évaluation des risques sanitaires liés à l’exposition aux sols contaminés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de confirmer les résultats obtenus sur le modèle porcelet, mais également d’apporter de nouveaux résultats, tels que la mesure des métaux dans les urines sur le modèle murin. L’établissement de relations dose-réponse linéaires pour les matrices de référence de métaux lourds (Nickel, Chrome II et Chrome VI) constitue une étape fondamentale pour évaluer la biodisponibilité relative des sols contaminés. Cette linéarité, qui suppose une proportionnalité entre la dose administrée et l’accumulation dans les matrices biologiques cibles, est essentielle pour comparer de manière fiable les sols aux références. Il s’agira plus spécifiquement de surmonter les limites rencontrées avec le modèle porcelet, notamment la difficulté de collecter les urines, en utilisant la souris pour faciliter la collecte des matrices biologiques, en particulier des urines et des reins (organes principaux d’accumulation pour Chrome et Nickel). Les bénéfices attendus de la troisième procédure sont également une confirmation des résultats déjà obtenus in vitro.
Procédures
Mesure de l'acceptation de la nourriture supplémentée avec de la terre. Les animaux seront placées en cages à diurèse pendant 10 jours consécutifs
Impact sur les animaux
L'utilisation des cages à diurèse sur une durée prolongée (10 jours) entraîne un inconfort constant (grille, absence de litière, de coton de nidification). L'alimentation AIN-93G peut induire une diminution de la prise alimentaire et limite l'usure de dents réalisée avec les croquettes classiques.
Devenir
À la fin de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Cette étape est nécessaire afin de prélever différents organes, notamment les reins, afin de mesurer la biodisponibilité des métaux lourds et d’effectuer les analyses biologiques prévues dans le protocole expérimental.
Remplacement
L'objectif est de valider le test in vitro "Unified Barge Method" (Norme International Organization for Standardization 17924:2019) pour l’évaluation de la biodisponibilité relative des métaux lourds, tels que le chrome et le nickel, des sols contaminés. Le remplacement du modèle porcelet par la souris permettra d'obtenir des informations supplémentaires, notamment grâce à la collecte des urines en cages à diurèse. L'utilisation d'un modèle animal pour déterminer la bioaccumulation dans les tissus reste, à ce jour, indispensable.
Réduction
La réalisation des tests sur un seul des deux sexes, en fonction des résultats obtenus, permet de diviser le nombre d’animaux par deux. Dans la littérature, les expérimentations étant généralement réalisées sur des souris femelles, cependant, elle sera réalisée afin de considérer les deux sexes pour justement les comparer (car pas ou peu fait dans la littérature) et voir quel sexe serait le plus pertinent pour n’en sélectionner qu’un (et donc réduire le nombre d’animaux). La mesure de l'acceptation de l'alimentation ne sera réalisée qu'une seule fois si les matrices testées sont identiques, ce qui limite les répétitions inutiles. De plus, le nombre de souris sera réduit si une même matrice est testée lors d’une deuxième session. Enfin, si des animaux issus de procédures non invasives sont disponibles, le choix se portera sur l'utilisation de ces animaux afin d’éviter la commande de nouveaux animaux. Le principe de réduction a été appliqué dans la définition des effectifs, avec un minimum de 6 animaux par groupe , ce qui représente le seuil nécessaire pour garantir la robustesse des analyses statistiques, tout en tenant compte des éventuelles variations individuelles de croissance. Enfin, après euthanasie, les prélèvements collectés seront divisés en aliquotes pour réaliser plusieurs analyses sur un même individu. Cette approche maximise l’exploitation des données et contribue à une réduction significative du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur réception, les animaux seront placés par 6 dans les cages durant les phases (acclimatation, la mesure de l'acceptation de l'alimentation et avant la mise dans les cages à diurèse). Les souris ne seront pas isolées, elles seront hébergées par deux dans les cages à diurèse pour ne pas induire de stress lié à l’isolement. Toutes les cages seront équipées d’éléments d’enrichissement environnemental : tunnels ou maisons rouges, litière, coton de nidification et rondins de bois. Les urines, fèces et reins des 2 animaux seront donc respectivement poolées par cage et il est prévu d’avoir pour chaque condition 3 cages, ce qui permettra d’évaluer la répétabilité. Afin de diminuer le stress induit par les différentes procédures, un entraînement préalable sera mis en place pour habituer les animaux à la contention et aux cages à diurèse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne lors des phases d’acclimatation et de l’étude préliminaire et seront observés attentivement. Pour les souris hébergées en cages à diurèse, une évaluation systématique de l’état de santé sera réalisée deux fois par jour à l’aide d'une grille de score. Un arbre décisionnel sera également appliqué pour garantir une prise de décision rapide et appropriée en cas de signes de détresse. Pour améliorer le confort des souris, les grilles des cages à diurèse, seront remplacées par des plaques avec des trous, et des maisons rouges ou tunnels y seront installés afin d’offrir aux animaux un espace où se cacher. Un rondin de bois suspendu sur le côté des cages (afin d’éviter que les souris urinent dessus) sera également ajouté. Il permettra de compenser le fait que les croquettes (élaborées avec les différents échantillons de sol) seront proposées sous forme de pâtée, en offrant aux souris la possibilité d’exprimer leur comportement de rongeur. La conception des plaques perforées a été pensée dans un objectif d’amélioration du bien-être animal. Toutefois, afin d’éviter ou de limiter la stagnation des selles et des urines, les plaques seront légèrement inclinées vers le centre. Les plaques seront fabriquées à façon (fabricarium, Polytech) et des essais seront réalisés pour vérifier l’absence de stagnation avant que la totalité des plaques ne soit fabriquée. Une alternative serait, en cas d’observation d’une stagnation, un remplacement quotidien des plaques perforées, permettant ainsi leur nettoyage et leur séchage.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour compléter les résultats obtenus lors d'une première étude réalisée sur le porcelet. En effet, la collecte des urines n'avait pas été possible chez le porcelet, alors que les métaux lourds, tels que le nickel et le chrome se retrouvent en partie dans les urines. Le choix de la souris se justifie également par la disponibilité des cages à diurèse adaptées à cette espèce, permettant la collecte optimale des urines nécessaires à l’analyse de la biodisponibilité des métaux. Les animaux utilisés seront adultes (âgés de plus de 9 semaines). À ce stade, leur poids est stabilisé et le facteur croissance n’impactera pas la prise alimentaire.
Rôle des cellules B dans le développement de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou atteignent le score clinique maximal sont mises à mort. 1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient prélevés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'encéphalomyélite auto-immune induite fait perdre la tonicité de la queue dès le septième jour, puis affaiblit et paralyse les membres postérieurs, les membres antérieurs pouvant être touchés au point de compromettre l'alimentation et l'hydratation, avec des nécroses au site d'immunisation. Chaque expérience est répétée trois fois sur des groupes de sept, pour comprendre comment une protéine régule les lymphocytes B, le porteur affirmant que le système immunitaire de la souris est semblable à celui de l'être humain.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC). Elle est généralement diagnostiquée entre 20 et 40 ans, touche environ 80 000 personnes en France et affecte deux fois plus de femmes que d'hommes. La SEP est la première cause de handicap non traumatique chez les jeunes adultes et à de lourdes conséquences sociales et économiques. Elle se caractérise par l'infiltration de cellules immunitaires dans le SNC et la destruction des fibres nerveuses. Les traitements qui éliminent les cellules B peuvent être bénéfiques, mais leurs mécanismes d'action sont mal compris et le risque d'infections accru a été observé. Les cellules B jouent en effet un rôle complexe : elles peuvent soit aggraver l’inflammation en produisant des anticorps et des cytokines pro-inflammatoires, soit la réguler grâce à des cytokines anti-inflammatoires. Dans le cadre de ce projet, nous utilisons un modèle expérimental d'inflammation du système nerveux central (SNC) chez la souris, appelé encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), qui constitue le modèle de référence pour étudier la SEP. Notre objectif est de comprendre comment la protéine HuR régule l’activité des lymphocytes B en contrôlant la production de cytokines. Une meilleure compréhension de ce mécanisme pourrait permettre de mettre au point de nouveaux traitements plus sûrs pour la SEP et d’autres maladies auto-immunes.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à mieux comprendre comment certaines cellules du système immunitaire peuvent influencer l’inflammation chronique du cerveau et de la moelle épinière au cours de l’EAE. Alors que de nombreux travaux se sont concentrés sur d’autres aspects de la maladie, le rôle précis des cellules immunitaires reste encore mal connu. À plus long terme, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension des maladies auto-immunes et pourrait contribuer au développement de nouvelles stratégies pour mieux contrôler l’inflammation du système nerveux central et ralentir la progression de la sclérose en plaques.
Procédures
Au totale, une souris pourrait être soumise à entre 4 et 10 interventions (si elle est immunisée), chacune durant entre 2 et 10 minutes. En détail, premièrement, tous les animaux sont soumis à un prélèvement de tissu ou du sang pour le génotypage. Après, l'induction d'un modèle expérimental d'inflammation du système nerveux central (SNC) chez la souris, appelé encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), sera réalisée en administrant un traitement spécifique par voie sous-cutanée (une fois) et voie intraveineuse (deux fois) pendant deux jours. Dans certains cas, les animaux recevront le jour avant l’induction de la maladie des cellules immunitaires, soit par voie intraveineuse, soit par voie intrapéritonéale. Finalement, Certains animaux seront vaccinés par voie intrapéritonéale toutes les semaines pendant 4 semaines avant l'induction de la maladie et une fois après. Toutes les souris seront euthanasiées avant le prélèvement des organes le jour du point d’analyse.
Impact sur les animaux
L’induction de l’EAE entraîne une série de signes cliniques progressifs liés à la démyélinisation et à l’inflammation du système nerveux central. Les premiers symptômes apparaissent généralement entre J7 et J9, avec une perte de tonicité de la queue, suivie d’une faiblesse des membres postérieurs pouvant évoluer vers une paralysie partielle ou complète. Ces atteintes s’accompagnent de troubles locomoteurs, d’une réduction de la mobilité, de problèmes d’équilibre et d’une perte de poids modérée à sévère au cours des phases aiguës. Dans les cas les plus avancés, les membres antérieurs peuvent également être touchés, ce qui compromet l’alimentation et l’hydratation. Des nécroses localisées au site d’immunisation (base de la queue) peuvent également apparaître. Le suivi clinique sera assuré tous les jours au moyen d’une grille de score EAE validée. Pour limiter les nuisances liées à la maladie, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place : mise à disposition de nourriture et d’eau au sol en cas de paralysie, accès facilité à de la pâtée humide, et définition de points limites stricts. Les animaux atteignant d’une perte de poids supérieure à 20 %, score clinique maximal atteint ou avec un autre signe de souffrance évidente seront examiné par le vétérinaire et immédiatement euthanasiés conformément aux recommandations éthiques. Enfin, les autres procédures expérimentales comportent également des nuisances : les injections de substances ou de cellules, les prélèvements sanguins et les biopsies pour le génotypage entraînent des désagréments légers. Toutes ces interventions seront réalisées exclusivement par du personnel formé et qualifié afin de réduire au minimum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux.
Devenir
Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés à la fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Les réponses immunitaires au cours de l’EAE sont des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains et permettent l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents pour étudier la maladie chez l’humain.
Réduction
Nous suivons des directrices reconnues afin de garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d’animaux. La stratégie d’élevage produit des souris tests et contrôles à un rythme mendélien, si possible. Les souris sont classées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d’animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistique. Sur la base de nos données préliminaires, avec un niveau de signification bilatérale de 0,05, pour une différence de 2 fois entre les groupes et une puissance de 0,85, nous aurons besoin de 7 souris par groupe. Pour la reproductibilité de résultats concluants, nous répéterons chaque expérience 3 fois pour permettre un test statistique et une bonne reproductibilité.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 maximum dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. Les souris ne seront jamais laissées seules dans leur cage. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. De l’essuie-tout, des copeaux et du rouleau en carton et une maison en plastique rouge sont rajoutés en tant qu’enrichissements pour permettre aux souris de se détendre. Les animaux sont suivis au quotidien par les zootechniciens dès leur naissance. Les animaux disposent d'une semaine d'acclimatation avant le début du protocole. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Dans chaque procédure, nous avons mis en place des points limites (perte de poids supérieure à 20 %, score clinique maximal, signes de souffrance manifestant par une activité, posture, aspect et/ou respiration anormale). Si l’un de ces critères est atteint, et en consultation avec les zootechniciens ou le SBEA, les souris seront euthanasiées. Les utilisateurs ont reçu des formations spécialisées et officielles qui leur permettent l’évaluation des souris et le raffinement des procédures. Les zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que les grimaces, l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage. L’anesthésie sera utilisée pendant l’injection des substances ou cellules pour réduire le stress et la douleur.
Choix des espèces
Les mécanismes immunitaires étudiés dans ce projet sont conservés chez la souris et chez l'humain. Grâce à des modèles murins, nous pouvons comprendre comment la réponse immunitaire est régulée dans le contexte d'une inflammation du système nerveux. Plus précisément, nous pouvons observer le maintien et la fonction des cellules immunitaires dans le cerveau, un environnement complexe et difficile à reproduire en laboratoire. Toutes les expériences seront réalisées sur des souris âgées de 3 à 20 semaines, présentant un système immunitaire encore jeune et fonctionnel.
ROLE DU MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Aucun antalgique ni analgésique systématique n'est administré, parce qu'il fausserait la mesure de la douleur étudiée. 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, par groupes de vingt. Elles reçoivent le microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, subissent une arthrite induite avec gonflements et rougeurs des pattes, puis des tests de sensibilité au toucher et au froid et des tests d'anxiété et de dépression, avant que leur cerveau et leur intestin soient prélevés. Le porteur écrit vouloir "éviter toute douleur inutile" et annonce qu'il n'interviendra pas tant que les niveaux de douleur observés resteront dans les seuils attendus.
Objectifs
Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions pathologiques, c’est à dire chez des souris avec de l’arthrite pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois prouvé le rôle du microbiote, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression pour permettre le mieux les soigner. Une fois prouvé rôle de la flore intestinale, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites pourraient expliquer l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.
Procédures
Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Dans certains cas, nous examinons aussi si le microbiote modifie la perméabilité de l’intestin ou le passage de substances vers le cerveau, en administrant des traceurs fluorescents par voie orale ou par injection. Ces expériences sont menées chez des souris saines mais aussi dans différents modèles d’inflammation (polyarthrite aiguë ou chronique, inflammation locale de la patte). Les inflammations sont induites par l’injection de molécules inflammatoires, toujours sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées (comme des dérivés du tryptophane, de la sérotonine, des métabolites de fibres ou des acides biliaires), nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.
Impact sur les animaux
La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne peuvent être appliquées car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés aux modèles inflammatoires utilisés pour induire l’arthrite ou l’inflammation locale. Ces inflammations provoqueront des douleurs articulaires, des gonflements et des rougeurs au niveau des pattes. L’arthrite aiguë sera de courte durée (maximum 2 semaines), avec retour à un état normal. L’arthrite chronique durera plus longtemps, mais la durée de suivi sera limitée à 5 semaines après l’apparition des premiers symptômes d’arthrite pour éviter des souffrances prolongées. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.
Devenir
La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio dépressifs.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans la détermination du seuil de sensibilité tactile. Le nombre de de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécéssaire pour observer une différence statistique et biologique. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.
Raffinement
Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien être des animaux. Cela passe par une étape d’habitation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée pour réduire l’exposition aux modèles inflammatoires et minimiser la souffrance.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.