Recherche fondamentale

Une perte de poids trop importante ou une immobilité totale suffit à arrêter l'expérience, un score clinique supérieur à 8 pouvant y mettre fin. 4 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est provoquée par injection, puis des composés sont administrés jusqu'à deux fois par jour par gavage ou par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire ou intradermique, avec des prélèvements sanguins allant jusqu'à 12 % du volume sanguin total. Le porteur décrit œdèmes, difficultés locomotrices, posture prostrée et douleur, et précise que la fréquence des prélèvements relève de "l'appréciation du client".

Objectifs

Plus de 200 maladies rhumatismales sont recensées et se manifestent sous différentes formes avec des atteintes au niveau des os et des articulations, des ligaments, des cartilages, des muscles et des tendons des membres inférieurs et supérieurs. On distingue quatre principaux types de rhumatismes : les rhumatismes inflammatoires (arthrite rhumatoïde, spondylarthropathies...), les rhumatismes dégénératifs (arthrose...), les affections des parties molles (fibromyalgie...) et les affections osseuses (ostéoporose...). Parmi les rhumatismes inflammatoires, l’arthrite rhumatoïde (AR) fait partie des maladies articulaires inflammatoires chroniques de l'adulte les plus fréquentes. En effet, elle concerne plus de 300 000 personnes en France et peut réduire l’espérance de vie des personnes atteintes. Bien que l’AR puisse se manifester à tout âge, elle apparaît généralement à l’âge adulte entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans et une incidence deux à trois fois plus élevée chez les femmes. Les répercutions psychologiques, fonctionnelles, professionnelles et sociales, de la pathologie sont importantes et en font un enjeu économique de santé majeur. En effet, la douleur est souvent le symptôme le plus contraignant pour les patients car elle peut persister malgré la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. Ainsi, bien que certains traitements soient proposés aux patients, ils n’en restent pas moins uniquement symptomatiques et parfois peu efficaces sur l’évolution de la pathologie et la gestion de la douleur. A ce jour, il est donc impératif de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Depuis ces dernières années, le développement de traitements pour les maladies articulaires a permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Même si certaines de ces stratégies s’avèrent efficaces dans l’amélioration des symptômes et permettent parfois une rémission complète et prolongée, le pronostic d’évolution de la pathologie reste mauvais pour de nombreux patients. En effet, les déformations articulaires ainsi que la destruction des tendons contraignent parfois les médecins à avoir recours à la chirurgie orthopédique. Par ailleurs, de part leurs comorbidités, certains traitements ne peuvent être proposés à certains patients. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un suivi plus personnalisé et d’aboutir à une rémission complète de tous les patients. Ce projet permettra donc de tester l’efficacité et de mieux définir les fenêtres d’action thérapeutiques (doses, période optimale de traitement…) de différents candidats médicaments dans les maladies articulaires.

Procédures

1) Induction de la pathologie : les animaux pourront être soumis à une ou plusieurs injections afin de mettre en place le modèle (1 minute maximum). Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale (5min) ou non selon le mode d’injection décrit dans la procédure. 2) Administrations répétées de composés client (2 fois par jour au maximum): les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront environ une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Prélèvement de sang : A l’appréciation du client (maximum 2 fois par semaine pour des petits prélèvements inférieurs à 8% du volume sanguin total, 1 fois pour ceux supérieurs à 8%), un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal. Exemple de différents prélèvements qui pourront être effectués sur un animal de 25g. - Veine de la queue sur animal vigile : 10 μL – à la joue sur animal vigile : 135 μL - sinus retro-orbital sur animal anesthésie : 135 μL Les différents modes de prélèvements dureront maximum 1 minutes.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées à la pathologie pourront être observées sur les animaux telles que : - Perte de poids - Posture prostrée - Absence d’hygiène corporelle : poil hérissé - Difficultés locomotrices - Douleur - Œdèmes et atteintes des articulations - Stress lié à l’isolation des animaux en cages individuelles pendant 24 à 60h (activmètre) - Stress et douleur liés à l'utilisatuon d'un test de douleur. De plus, l’injection de certains inducteur de la maladie peut provoquer une inflammation au niveau de la queue. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra également générer un stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.

Remplacement

Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux ne pourra pas être évitée. En effet, comme vu précédemment, les maladies articulaires telles que l’arthrite rhumatoïde présentent des origines diverses (facteurs immunologiques, environnementaux, hormonaux, génétiques). Les modifications physiopathologiques liées à ces pathologies sont très complexes et nécessitent la mobilisation de nombreux effecteurs cellulaires et moléculaires ainsi que la rupture dans la coordination de leur intervention au niveau systémique. Il s’agit de maladies évolutives qui, une fois déclenchées, s’aggravent progressivement et s’étendent à d’autres articulations. La douleur est un problème majeur chez les patients car elle persiste bien après la prise en charge thérapeutique par des anti-inflammatoires par exemple. Il est donc inévitable d’utiliser les modèles animaux dans l’étude de l’efficacité de nouvelles thérapies qui doivent impérativement prendre en compte le paramètre de la douleur. Par ailleurs, l’analyse de l’efficacité d’un candidat médicament nécessite de prendre en compte le caractère systémique afin d’appréhender son action sur les différentes complications dont la contribution dans la pathologie peut influencer positivement ou négativement l’impact thérapeutique. Nous devons être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, lorsque cela est possible, l’impact in-vitro ou ex-vivo des candidats médicaments sera initialement évalué en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux minimum seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63 en unités individuelles ventilées avec enrichissement de l’environnement (igloo et carrés de ouate). L'état de santé des animaux sera évalué selon des critères en accord avec le comité́ de suivi du bien - être animal de notre établissement. L’expérimentateur sera alors prévenu et une dégradation trop importante de l'état de santé (au-delà d'un score de 8 selon les critères détaillés dans les procédures, score 1) pourra entrainer l'arrêt immédiat de l'expérimentation. Par ailleurs, dès lors que la pathologie sera induite, les expérimentateurs procéderont à un suivi quotidien des animaux (le suivi du week-end sera effectué par le personnel de la zone d'expérimentation) afin d’identifier les atteintes spécifiques à la pathologie (grilles de score spécifiques permettant de définir les points limites). Certains critères suffiront à eux seuls pour acter l'arrêt de l'expérience, tels qu'une perte de poids trop importante ou une immobilité totale. Par ailleurs, dès lors qu’une inflammation d’une articulation et/ou une difficulté de mobilité seront observées, de la nourriture humidifiée et de l’eau gélifiée seront ajoutés dans la cage.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement d’arthrite rhumatoïde compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la réponse inflammatoire. L’ensemble des modèles décrits dans ce projet nécessite l’utilisation de souris adultes car l’arthrite rhumatoïde apparaît généralement entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans. Le modèle de développement de l’arthrite rhumatoïde nécessite l’utilisation d’animaux âgés de 6 semaines, c’est-à-dire un âge auquel la sensibilité au développement de la pathologie est optimale. Le modèle d’induction de l’arthrite rhumatoïde par transfert de sérum nécessite d’une part, des souris présentant les premiers signes de développement de la pathologie à partir de 8 semaines et permettant de fournir le sérum nécessaire à l’injection et, d’autre part, des souris âgées de 6 à 10 semaines qui recevront le sérum. Les autres modes d’induction nécessiteront l’utilisation d’animaux âgés de 6 à 10 semaines.

40 souris porteuses de la mutation Fmr1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies du cerveau sous anesthésie générale, l'une d'environ une heure pour une injection intracérébrale, l'autre pour implanter une canule et une fibre optique, puis reçoit des injections répétées et passe trois tests d'interaction sociale de dix minutes dans une arène. Le porteur cherche à savoir laquelle de deux voies nerveuses porte l'amélioration du comportement social observée quand une région du cerveau est stimulée. Il écrit que la mise à mort "constitue la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques", après avoir précisé que les canules et les modifications cérébrales interdisent toute réutilisation des animaux.

Objectifs

Une petite région du cerveau joue un rôle important dans la régulation des interactions sociales chez la souris. Chez certaines souris qui présentent des difficultés sociales similaires à celles observées dans l’autisme, stimuler cette zone du cerveau améliore nettement leurs interactions. Cette zone reçoit des informations venant de deux endroits différents du cerveau. Nous voulons comprendre lequel de ces deux endroits est responsable de cette amélioration. Pour le savoir, nous allons d’abord empêcher l’un de ces deux chemins de fonctionner. Ensuite, nous activerons très précisément l’autre chemin grâce à une petite molécule qui peut être contrôlée par la lumière. Si l’amélioration disparaît lorsque le premier chemin est bloqué, cela voudra dire que c’est le plus important. Si l’amélioration est toujours là, alors c’est l’autre chemin qui joue le rôle principal. Nous réalisons cette expérience uniquement sur les souris présentant des difficultés sociales, car ce sont les seules qui permettent de répondre clairement à cette question.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à comprendre comment le cerveau contrôle les comportements sociaux chez des souris qui présentent des difficultés proches de celles observées dans certains troubles du développement. Deux zones du cerveau pourraient être responsables de ces difficultés, et notre objectif est d’identifier laquelle joue le rôle principal. Pour cela, nous comparerons l’influence de deux chemins différents du cerveau et déterminerons lequel est indispensable pour améliorer le comportement social lorsque nous stimulons une région précise. Les résultats de ce travail permettront de mieux comprendre ce qui, dans le cerveau, contribue aux difficultés sociales observées dans ce modèle de trouble du développement. À long terme, ces connaissances pourraient aider à orienter des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour les personnes présentant des troubles du spectre autistique.

Procédures

Les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première consiste en une chirurgie (environs 1h) d’injection dans le cerveau. La seconde consiste en une chirurgie d’implantation d’un dispositif permettant des injections et des stimulations ultérieures. Au cours du protocole, les animaux recevront plusieurs injections de médicaments. Certaines injections seront réalisées par voie intrapéritonéale, d’autres seront effectuées localement dans le cerveau à l’aide du dispositif implanté. Les animaux seront également manipulés pour être connectés à un dispositif optique et participer à des tests de comportement social réalisés dans une arène dédiée. Les animaux réaliseront trois tests de comportement de 10 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont globalement modérés et transitoires. Après les chirurgies, les animaux peuvent présenter une douleur légère, une diminution d’activité ou de l’appétit pendant 3 à 4 jours, ainsi qu’un faible risque d’inflammation locale ou d’infection au niveau de la plaie. La présence de la canule peut entraîner une gêne mécanique durant quelques jours. Les injections intracérébrales peuvent théoriquement provoquer une réaction inflammatoire limitée, bien que jamais observée dans nos travaux précédents. Les manipulations (contention, connexion à la fibre optique, injections) peuvent générer un stress ponctuel, de très courte durée. Les injections intrapéritonéales peuvent causer une petite gêne immédiate au point d’injection. Les anesthésies comportent un risque faible d’hypothermie ou de ralentissement respiratoire, maîtrisé par une surveillance adaptée. L’ensemble de ces effets est généralement réversible en moins d’une semaine.

Devenir

À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés conformément aux méthodes réglementaires en vigueur. Cette étape est indispensable car les analyses finales nécessitent l’examen du cerveau pour vérifier la bonne localisation des injections, l’efficacité du knock-down et l’implantation correcte du matériel. Ces vérifications histologiques sont essentielles pour interpréter correctement les résultats et garantir la validité scientifique du projet. Par ailleurs, la présence des canules et les modifications cérébrales induites ne permettent pas de réutiliser les animaux dans un autre protocole. L’euthanasie constitue donc la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques.

Remplacement

Pour mieux comprendre l’autisme et trouver de nouvelles pistes de traitement, les chercheurs ont besoin de modèles qui permettent de reproduire certains aspects de cette condition. Les souris utilisées dans ce type d’étude présentent des difficultés sociales qui ressemblent à celles observées chez certaines personnes autistes. Observer leur comportement est la seule façon de savoir si ces modèles sont fiables et s’ils peuvent réellement aider la recherche. C’est aussi la seule manière de tester si un traitement potentiel fonctionne : pour l’autisme, il n’existe pas de prise de sang, d’analyse ou de mesure biologique permettant d’évaluer l’amélioration. Tout repose sur le comportement. C’est pour cette raison que l’étude doit être faite sur l’animal entier, qui peut montrer toute la palette de ses comportements sociaux, d’exploration et d’interaction. Ces observations sont indispensables pour faire avancer la compréhension de l’autisme et le développement futur de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été choisi pour être le plus faible possible, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables, conformément aux recommandations éthiques. De plus, toutes les manipulations seront réalisées exclusivement sur des souris mutantes, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés en évitant l’inclusion de groupes supplémentaires non nécessaires.

Raffinement

«Nous mettrons en œuvre des mesures de raffinement visant à limiter au maximum la douleur, l’inconfort et le stress des animaux tout au long du protocole. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie adaptée, et une analgésie sera mise en place afin de réduire la douleur péri- et post-procédurale. Une surveillance clinique renforcée sera assurée après les interventions et au cours des manipulations, avec l’application de points limites adaptés permettant d’interrompre la procédure ou de mettre en œuvre les mesures appropriées si l’état de l’animal le nécessite. Après la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (quatre souris par cage) et bénéficieront d’un enrichissement du milieu (matériel de nidification, cabane en carton). Les animaux seront habitués et manipulés quotidiennement par le même expérimentateur afin de réduire le stress lié aux manipulations. Comme l’autisme touche aussi bien les hommes que les femmes, nous utiliserons des animaux des deux sexes. Enfin, l’optopharmacologie constitue un raffinement supplémentaire, car elle permet d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle grâce à l’activation et l’inactivation réversibles du composé par la lumière, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, ce qui permet d’étudier facilement les difficultés d’interaction, un symptôme important observé dans l’autisme. Elles disposent aussi d’un répertoire de comportements variés, ce qui permet d’évaluer d’autres aspects liés à cette pathologie. Les troubles observés chez les souris utilisées comme modèle d’autisme sont suffisamment marqués pour vérifier que le modèle est pertinent et pour tester si certains traitements peuvent améliorer leur comportement. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), moment où leurs comportements sont pleinement développés et où les difficultés sociales sont bien établies.

Capturées, anesthésiées, ouvertes pour recevoir un émetteur acoustique ou un capteur enregistreur, puis remises à l'eau après moins de quinze minutes d'opération : 200 jeunes truites de mer sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le suivi porte sur leurs trajectoires en mer et sur leur passage dans les parcs éoliens en mer. Le porteur retient cet effectif en tenant compte d'une mortalité naturelle de plus de 90 % entre le départ vers la mer et le retour en rivière, sur une population de smolts estimée entre 8 000 et 10 000 individus. Les truites recapturées porteuses d'un capteur enregistreur sont tuées, le tissu cicatriciel formé autour du matériel rendant son extraction incompatible avec leur survie.

Objectifs

Les poissons migrateurs sont pour la plupart en déclin en raison notamment de l’impact des activités anthropiques qui interviennent sur l’ensemble des habitats du continuum terre/mer. Dans les eaux côtières, les captures accidentelles et la présence des parcs éoliens offshores sont autant de pressions qui sont susceptibles de fragiliser un peu plus ces espèces en causant des mortalités et/ou modifications de leurs parcours migratoires. La connaissance de l’utilisation des eaux marines côtières par ces espèces est cruciale pour déterminer les zones et périodes où elles sont susceptibles d’être en interaction avec ces pressions, mais elle reste à ce jour très incomplète. Un précédent programme de recherche a toutefois permis des avancées notables dans la compréhension des trajets migratoires des salmonidés en mer. Entre 2018 et 2019, 105 truites de mer au stade juvénile ont été équipées d’émetteurs acoustiques. En parallèle l’estuaire du fleuve étudié avait été équipé de récepteurs qui a permis d’analyser la dynamique de dévalaison des individus et d’évaluer la mortalité estuarienne. Depuis lors, de nombreux autres récepteurs ont été déployés au sein des parcs éoliens offshores et au niveau d’autres infrastructures, l’ensemble étant intégré dans le cadre d'un réseau européen de récepteurs. Ce réseau offre l’opportunité de mettre en place un suivi par télémétrie acoustique au-delà de la zone estuarienne afin de fournir des informations sur les trajectoires marines des individus et d’identifier des zones de mortalité. De plus, pour les individus les plus grands, un double marquage émetteur acoustique et capteurs-enregistreurs (température et de pression) permettent de reconstruire plus finement les trajectoires marines. L’objectif est double : 1- produire des connaissances sur l’écologie des truites de mer au stade juvénile et 2- évaluer le niveau de fréquentation des parcs éoliens offshores.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : Les phase marines des populations de poissons migrateurs effectuant des migrations entre milieu marin et eau douce, populations globalement menacées par différentes pressions d’origine anthropique, restent très mal connues. Cette méconnaissance complique leur gestion. Ce projet vise à produire des connaissances sur les trajectoires de migration marine des juvéniles de truites de mer à large échelle en mer et il viendra compléter d’autres projets concernant les adultes. Par ailleurs, dans le contexte de développement des énergies marines renouvelables (parcs éoliens offshore), les données permettront une première évaluation du recouvrement des trajectoires des truites de mer et des parcs éoliens. Compte-tenu de sa dépendance au milieu côtier, la truite de mer pourrait être fortement exposée aux nombreuses pressions (bruit, modification des champs électro-magnétiques, etc.) exercées des parcs éoliens offshore. Les impacts de ces pressions récentes, qui s’additionnent aux autres, doivent être évaluées dans le cadre des politiques publiques.

Procédures

1- procédure chirurgicale : Insertion par chirurgie de capteurs-enregistreurs ou d'émetteur (réalisée sous anesthésie). Durée inférieure à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Insertion par chirurgie du matériel scientifique est réalisée sous anesthésie : les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme « modérée ». Les individus sélectionnés auront une gamme de poids (min-max) qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique selon les recommandations de la littérature en termes de ratio masse du matériel/masse de l’individu.

Devenir

Après la procédure chirurgicale, tous les individus sont relâchés dans leur milieu naturel pour être suivi. En cas de recapture d’individus marqués avec des émetteurs acoustiques, ceux-ci seront relâchés après contrôle de leur état et mesure (taille, masse). En cas de recapture d’individus équipés de capteurs-enregistreurs contenant des données à récupérer, ceux-ci seront mis à mort. Les individus développent un tissu conjonctif autour du matériel lors du processus de cicatrisation, leur extraction n’est pas compatible avec la survie de l’animal.

Remplacement

L'objectif de l'étude est de produire des connaissances sur l’écologie de la truite de mer (comportement dans le milieu naturel). Le modèle biologique ne peut être substitué par des alternatives non animales.

Réduction

L’effectif de truites de mer au stade jvénile à marquer (200) est choisi en fonction des connaissances actuelles sur la mortalité naturelle de ces individus entre leur départ et leur retour de mer (>90-95%). Les données de géolocalisation des poissons par les hydrophones permettront de retracer les trajectoires et l’histoire de l’ensemble des poissons marqués qui pourront être analysées seules ou en combinaison avec les données issues des capteurs-enregistreurs quand les poissons auront les deux types de marques, et ce, même en cas de mortalité avant le retour en rivière. La taille d’échantillon résulte ainsi d’un équilibre entre minimisation de l’impact sur la population de smolts de truite de mer (estimée entre 8000 et 10000 individus lors de la saison 2023/2024 dans le fleuve étudié) et qualité et quantité de données acquises. L’échantillon recueilli au final sera de taille modeste, mais les données haute-fréquence acquises seront très informatives et permettront de produire des connaissances nouvelles notamment évaluer les habitats utilisés par les smolts, les trajectoires en mer et les zones de mortalité.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection postopératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Pendant l’opération, un tube alimenté en eau sera introduit dans la bouche des poissons pour maintenir un bon niveau d’oxygénation des branchies. L’eau utilisée sera celle du milieu naturel et sa température sera contrôlée pendant toute la durée de l’opération. Après l’opération, les individus seront gardés en observation en vivier alimenté en eau de rivière le temps de contrôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage). Les volumes des viviers permettent aux individus d'évoluer confortablement.

Choix des espèces

La truite de mer et plus précisément son comportement dans le milieu naturel, est l’objet même de l’étude, il ne s’agit pas d’un modèle biologique utilisé pour tester une hypothèse. Compte-tenu de sa dépendance au milieu côtier, la truite de mer pourrait être fortement exposée aux nombreuses pressions (bruit, modification des champs électro-magnétiques, etc.) exercées des parcs éoliens offshore. Les impacts de ces pressions récentes, qui s’accumulent aux autres, doivent être évaluées dans le cadre des politiques publiques. Les individus concernés sont des juvéniles en cours de migration vers la mer, appelés smolt, dont on veut étudier la migration marine. La taille de ces juvéniles, dans la population étudiée, varie entre 100 et plus de 300mm.

Irradiées puis soumises à une lymphodéplétion chimique pour accepter la greffe, les souris de ce projet portent un lymphome B implanté. Elles sont 1 152, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales, une irradiation, une injection de cellules CAR-T, des injections d'inducteur et d'anticorps, puis une prise de sang. Le porteur indique que les souris traitées contrôlent d'abord la tumeur avant de rechuter, ce qu'il présente comme une bonne reproduction de l'échec observé chez la moitié des patients, et conclut à la mise à mort de tous les animaux pour analyser leurs tumeurs.

Objectifs

Les lymphomes B représentent le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde occidental et le 9ème cancer le plus mortel. Il touche environ 15 000 personnes par an en France. Malgré les progrès des traitements conventionnels (chimiothérapie, immunothérapie), une part significative des patients ne répond pas aux traitements ou rechute quelques mois après. La première ligne de traitement repose sur de la chimiothérapie. En cas de non-réponse à ce traitement, la deuxième ligne de traitement repose sur une immunothérapie dite de thérapie cellulaire génique : les cellules CAR-T : des lymphocytes T du patient reprogrammés au laboratoire puis réinjectés. Ce protocole a pour but d’aider le système immunitaire du patient à reconnaître et tuer les cellules tumorales . Ce traitement à été révolutionnaire, mais encore 50% de ces patients ne répondent pas ou rechutent rapidement. Il a été démontré un épuisement rapide de ces cellules CAR-T après l’injection chez le patient, qui peut être expliqué par un microenvironnement tumorale très immunosuppressif notamment causée par un certain compartiment du système immunitaire, les cellules myloides. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser l’efficacité des cellules CAR-T afin d’augmenter le taux de succès qui est actuellement de 50%.

Bénéfices attendus

Modification : Pour le lymphome (1) , nous avons réalisé différents protocoles incluant différentes concentrations de CAR-T cells. Nous avons démontré que 6x10^5 CAR-T était la concentration la plus adéquate afin d’avoir un contrôle tumoral maximal. Cependant, certaines souris répondent de manière partielle avec une rechute systématique de la tumeur. Ainsi notre modèle murin actuel reproduit bien ce qui se passe chez l’homme, le traitement par cellules CAR-T est efficace initialement, mais les souris vont présenter une rechute. Pour le lymphome (2) la quantité de CAR-T cells injectée se base la littérature. Ces modèles permettent donc d’évaluer des stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la réponse au traitement des Lymphome Diffus à Grandes Cellules B indépendemment de leur origine génétique. L’idée d’une partie de ce projet est ainsi de modifier ces CAR-T et d’étudier cette nouvelle dynamique de contrôle tumorale. Le bénéfice sera de trouver la nouvelle version du CAR-T permettant un contrôle tumoral maximal et ainsi obtenir une meilleure survie chez l’animal, sans rechute. Fin de modification

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux incluront : Injection unique de cellules tumorales (durée : 1 minute, anesthésie locale). Irradiation (durée : 5 minutes, vigile sans anesthésie car non douloureuse). Injection de cellules CAR-T (durée : 2 minutes).sous anesthésie générale . Injection de l'inducteur (Durée 1 min sous anesthésie anesthésie locale). Injection des Anticorps ( Durée 1 min, anesthésie locale). Prise de sang unique (durée : 2 minutes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Modification Les animaux auront un type de cancer appelé lymphome, ce qui peut entraîner fatigue, perte de poids modérées. L'irradiation à faible dose et la lymphodépletion avec injection de cyclophosphamide sont bien tolérée et ne provoque pas d’augmentation des infections. Le syndrome de libération de cytokines a été jugé modéré dans les études précédentes et sera surveillé attentivement. Fin de modification

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en raison de la présence de tumeurs et afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour : •Étudier l’interaction entre la totalité du microenvironnement tumoral et les cellules CAR T. •Il est également intéressant d’étudier les différentes populations immunitaires (notamment compartiment myéloide) dans la moelle osseuse et leur dynamisme après l’injection des CAR-T •Observer l’impact de la modulation du compartiment myéloïde sur la réponse tumorale. Ces différentes études cruciales ne peuvent pas être réalisées par des modèles in vitro ou ex vivo. Il faut pour cela un organisme entier. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro ou d’organoïdes associant cellules tumorales, cellules myéloïdes et cellules CAR-T. L’ensemble des publications dans ce domaine repose sur de l’expérimentation animale. Des modèles organoïdes sont effectivement importants à développer, mais ne sont actuellement pas du tout disponibles.

Réduction

Le nombre de souris est limité au minimum possible. Un calcul de puissance a permis de déterminer ce nombre. L’utilisation de logiciels d'aide à la conception et de statistiques nous ont permis d’optimiser ces données. Des méthodes statistiques seront également utilisées pour exploiter les résultats.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes) des procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections simples seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des points limites stricts ont été définis et seront appliqués. La surveillance des animaux en procédure sera faite par un examen clinique quotidien.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines.