Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Exploration fonctionnelle de la contribution des fibres C-LTMRs dans la modulation de la douleur post lésionnelle – Étude pilote par IRM du manganèse
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
232 souris passent chacune une à cinq séances d'IRM sous anesthésie, de deux heures au maximum, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par gavage puis par injection dans l'abdomen des composés activant certains neurones sensitifs, plus un produit de contraste, et une partie d'entre elles une injection inflammatoire dans la patte qui provoque une hypersensibilité. Cette étude pilote cherche à voir si ces neurones du toucher affectif modulent la douleur, le porteur reconnaissant qu'aucune donnée antérieure ne permet de fixer l'effectif, calculé "en nous basant sur notre expérience passée". Toutes sont tuées à l'issue, leur mise en liberté étant jugée "inconcevable" du fait de leur modification génétique.
Objectifs
Il s'agit ici d'une étude dont l’objectif est d’explorer la biologie d’une classe particulière de neurones capables de convertir la stimulation mécanique du toucher affectif en message nerveux. Typiquement, chez l’humain, ces neurones interviennent dans la détection du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes suggèrent que ces neurones pourraient également moduler la douleur ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Toutefois, ces conclusions reposent sur des approches indirectes, et à ce jour, aucune étude ne fournit de démonstration directe de leur fonction chez l’être vivant, tant à l’état basal que dans la modulation de la douleur après une lésion. C’est précisément l’objectif de notre projet. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées chez lesquelles ces neurones peuvent être activés de manière sélective. Nous vérifierons s’il est possible de suivre par IRM fonctionnelle la réponse cérébrale induite par l’activation de ces neurones. Ensuite le projet vise à étudier par IRM fonctionnelle l’effet de la stimulation de ces neurones sur la réponse cérébrale induite par la douleur dans le but de trouver une stratégie thérapeutique de la douleur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude pilote seront la prise en charge de la douleur qui est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones sensitifs, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cérébraux impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques visant la modulation de ces fibres, qui pourraient avoir une application chez les patients souffrants de douleur chronique.
Procédures
Administration par gavage, puis par injection intrapéritonéale des composées activant des gènes. Administration d'un composé ciblant l'activation des neurones étudiés et injection d’un produit de contraste IRM chez toutes les souris, injection d'un produit inflammatoire chez une partie des animaux La durée de chaque intervention est 30 secondes. Toutes les souris subiront 1 à 5 sessions IRM sous anesthésie, ne pas dépassant 2 h chacune.
Impact sur les animaux
Nos données préliminaires indiquent que les doses des composés utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris. Toutefois, l’administration par gavage peut induire un stress chez l'animal, tandis que l’injection de ces substances par voie abdominale peut occasionnellement entraîner une réaction inflammatoire locale, et l’utilisation spécifique du composé C21 provoque des mictions fréquentes durant l’heure suivant son administration. Certaines souris recevront une injection localisée d’un agent inflammatoire dans la patte; celle-ci génère une hypersensibilité susceptible d'entraîner une gêne transitoire. Les animaux seront examinés par IRM, l’IRM étant une procédure non invasive et réalisée sous anesthésie. Les effets indésirables possibles chez les animaux au cours de l'IRM sont le risque rare de défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, cet événement étant peu fréquent lorsque l’anesthésie est à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l’IRM permet de détecter rapidement les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie, assurant ainsi un réveil rapide des animaux.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des procédures. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
Notre projet de recherche vise à mieux comprendre le fonctionnement d'un certain type de nerfs responsables des sensations, comme le toucher ou la douleur. Pour cette étude, nous devons avoir recours à des animaux. Le projet respecte scrupuleusement les règles éthiques visant à limiter l'impact sur les animaux (la règle des "3R" : Remplacer, Réduire, Raffiner). L'utilisation d'animaux est indispensable ici, car nous voulons identifier les zones du cerveau qui réagissent à une substance capable d’activer certains neurones. Les méthodes alternatives ne sont pas possibles pour l'instant : Les cultures de cellules en laboratoire (organoïdes), bien qu'utiles, ne peuvent pas reproduire l'infinie complexité des connexions nerveuses, ni la structure du cerveau avec ses différentes régions et leurs spécialisations, ni modéliser les connexions entre les différentes parties du corps et le cerveau. Les simulations par ordinateur ne sont pas encore réalisables, car pour construire un modèle informatique fiable, nous avons besoin des données réelles que cette étude va nous permettre d'obtenir.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser le moins d'animaux possible pour cette expérience. Pour cela, nous procéderons par étapes. Par exemple, pour tester la substance nécessaire à l'imagerie (le produit de contraste), nous commencerons par de faibles doses, jusqu’à ce que nous ayons trouvé la plus faible dose qui convienne. Cette stratégie évitera d'utiliser des doses inutilement élevées et de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés. Comme il n’existe pas de données antérieures sur lesquelles nous appuyer, il est difficile de prévoir exactement combien de souris inclure. Nous avons calculé ce nombre en nous basant sur notre expérience passée en imagerie cérébrale (IRM) et sur celle de nos collaborateurs spécialistes de ces souris génétiquement modifiées afin de garantir que nos résultats soient fiables tout en utilisant le minimum de souris.
Raffinement
Nous faisons tout notre possible pour améliorer le bien-être des animaux et minimiser le stress et la douleur à chaque étape du projet. Les animaux bénéficieront d’un temps d'adaptation. À leur arrivée, nous laisserons les souris s'habituer tranquillement à leur nouvel environnement pendant 14 jours. Les chercheurs passeront également du temps avec elles pour qu'elles ne le perçoivent pas comme une menace. Les animaux bénéficieront d’un suivi clinique régulier. Après chaque intervention, nous surveillerons les animaux au minimum une fois par jour. Nous utiliserons une grille d'évaluation permettant de déceler des signes de de souffrance et d’intervenir rapidement. Toutes les séances d'imagerie (IRM) se feront sous anesthésie, ce qui évitera le stress et l’anxiété chez les souris. L'état physiologique de l'animal (respiration, rythme cardiaque) sera surveillé en continu via un monitoring pour garantir sa sécurité et son confort. Enfin, nous avons défini des points limites pour ne jamais laisser un animal souffrir inutilement. Si l'un de ces seuils est atteint, nous procéderons à une euthanasie.
Choix des espèces
Chez la souris, la population de neurones sensitifs ciblée dans ce projet est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées entre 12 et 24 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.
Effets de la nutrition sur l’homéostasie de l’épithélium intestinal chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs intestins et leurs fèces, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, cinq jours d'injections quotidiennes d'une molécule bloquant un gène, une irradiation de cinq minutes et un prélèvement de sang sous anesthésie. Les souris nées dans l'élevage et non retenues pour les procédures sont tuées elles aussi. Le porteur attend de ce travail sur les cellules souches de l'intestin des traitements nutritionnels "à plus long terme" et justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur le maintien et l’autorenouvellement des cellules souches intestinales. Ces cellules permettent un renouvellement permanent de l’épithélium intestinal, essentiel pour maintenir l’équilibre du tissu intestinal et réparer les lésions causées par divers stress. Au cours du projet, l’irradiation provoque une accélération du renouvellement des cellules souches intestinales. Ainsi, il devient possible d’explorer comment les modifications du métabolisme des lipides entrainées par des changements alimentaires jouent sur cet équilibre. La flore intestinale joue également un rôle important dans le maintien de ce tissu. Un traitement antibiotique permet également d’évaluer la contribution de cette flore au phénotype observé.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur l'intestin. Ces recherches devraient enrichir la compréhension de la biologie des cellules intestinales mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives de traitements utilisant des approches nutritionnelles.
Procédures
1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 contention pour injection de de molécule bloquant l’expression d’un gène: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours). 1 irradiation : 5min. 1 contention pour injection d’anesthésique: 20 secondes. 1 prélèvement sanguin : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une douleur légère et de courte durée lors de la biopsie et un stress lors de la contention et des injections. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire. L’irradiation peut provoquer une perte de poids et un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus l’expérimentation, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.
Remplacement
L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établies. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.
Etude de la régénération cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une résection de 20 % du ventricule cardiaque, pratiquée hors de l'eau sous anesthésie en cinq minutes au plus : 2 700 poissons zèbres vont être utilisés dans ce projet, 1 800 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour analyse du cœur. Une partie reçoit en plus une injection quotidienne sous anesthésie hors de l'eau, sept jours de suite. Le porteur indique qu'aucune méthode d'analgésie connue ne semble compatible avec l'étude de la régénération cardiaque, les poissons ressentant après l'opération un inconfort et une douleur liés à la cicatrisation. Le poisson zèbre est retenu précisément parce qu'il régénère entièrement son cœur, capacité que les mammifères adultes n'ont pas, l'objectif étant de tester ensuite les gènes identifiés chez la souris.
Objectifs
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, les maladies cardiovasculaires sont responsables de près de 18 millions de morts dans le monde chaque année, soit 31% des décès. Alors que les mammifères adultes sont incapables de régénérer leur cœur suite à un infarctus, un certain nombre d’espèces vertébrées possèdent quant à elles cette propriété. En particulier, le poisson zèbre est capable, suite à l’ablation d’une portion du muscle cardiaque, de totalement régénérer son cœur. Nous avons précédemment développé des systèmes d’ingénierie génétique chez le poisson zèbre permettant d’étudier la fonction des gènes impliqués dans les processus régénératifs, plus précisément les gènes exprimés dans les cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes). Notre principal objectif est d’identifier les différents gènes qui régulent la régénération du muscle cardiaque chez le poisson zèbre pour ensuite les tester chez les mammifères
Bénéfices attendus
Inscrit dans un cadre de recherche globale en santé humaine, l’identification des gènes/processus nécessaires à la régénération cardiaque chez le poisson zèbre, pourrait potentiellement participer au développement d’approches thérapeutiques visant à induire la régénération cardiaque chez l'homme. L’objectif de notre projet à court terme vise à identifier des nouveaux gènes impliqués dans les mécanismes de la régénération des tissus, plus particulièrement du cœur. À moyen terme, nous collaborerons avec nos collègues pour tester le rôle de ces gènes chez les mammifères adultes tels que les souris, ce qui pourrait ouvrir à long terme une transposition de ces découvertes chez l’homme.
Procédures
L’ensemble des interventions sera réalisé sous anesthésie. Les poissons-zèbres subiront une chirurgie du muscle cardiaque, une résection de l’apex du ventricule du coeur de l’ordre de 20%, durant laquelle ils seront maintenus sous anesthésie hors de l’eau pour une durée de 5 minutes maximum. Un groupe de poissons-zèbres impliqués dans le suivi de la prolifération des cardiomyocytes subira des injections quotidiennes d'un faible volume, sous anesthésie hors de l’eau pour une durée d’une minute maximum, chaque jour durant 7 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les poissons-zèbres subiront un stress léger au cours de la pêche à l’aide d’une épuisette à maille fine. Suite à la chirurgie, les poissons ressentiront un inconfort lié à une diminution de la mobilité et une douleur conséquente au processus de cicatrisation. Les poissons pourront présenter une légère inflammation au niveau du site d’injection et un inconfort lié à la répétition des anesthésies hors de l’eau.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des études histologiques et evaluer la régénération cardiaque.
Remplacement
Les mécanismes de régénération du myocarde sont très complexes, impliquant la participation de nombreux types cellulaires différents. Le développement des techniques alternatives d’organoïdes actuelles s’attache aux modèles mammifères qui ne présentent malheureusement pas cette capacité régénérative. Il n’y a pas aujourd’hui à notre connaissance d’alternative à l’utilisation de poisson-zèbre pour la mise en œuvre de ce projet
Réduction
L’évaluation du nombre d’animaux s’appuie sur nos précédants travaux publiés qui nous ont permis de réduire efficacement le nombre d’animaux necessaires. Nous avons également fait appel à des tests et calculs de puissance statistiques qui nous ont permis de réduire efficacement le nombre d'animaux nécessaire tout en permettant d'obtenir des résultats scientifiques robustes
Raffinement
Actuellement aucune méthode d'analgésie connue ne semble compatible avec les recherches sur la régénération cardiaque. Dans notre équipe, un projet en cours de réalisation a pour objectif d’identifier des molécules analgésiques n’interférant pas avec les mécanismes de régénération du coeur, si de telles molécules sont identifiées elles seront alors appliquées à ce projet également. Dès lors nous apportons un soin particulier à déterminer précisément les stades d’anesthésie chirurgicale adaptés (immobilité, perte de conscience, mouvements respiratoires lents et absence de réaction aux stimuli). Nous apportons un soin particulier à l’étape post-opératoire, les animaux sont placés dans un aquarium contenant de l'eau préalablement stérilisée pendant 30 minutes. Pendant cette période, les animaux sont observés d'abord constamment pendant la phase de réveil (2 à 5 min), puis toutes les 5 minutes, en s’appuyant sur les éléments établis sur la feuille d’évaluation. Si les poissons ne présentent pas de signes d'inconfort, c’est-à-dire que nous observons un comportement de nage normal et la reprise d’un comportement exploratoire, ils sont replacés dans l'aquarium avec leurs congénères au bout de la période initiale de 30 minutes post-opératoires. Si les poissons montrent des signes d'inconfort ou de souffrance (immobilité, nage erratique), ils sont surveillés pendant une heure supplémentaire. Si les poissons semblent toujours mal à l'aise après cette période, ils sont mis à mort. Pendant les jours suivants la chirurgie, une attention particulière est apportée aux poissons, tous les matins, midis et soirs lors des nourrissages. Nous portons une attention particulière aux comportements suivants : nage continue au milieu de l'aquarium (ni au fond, ni à la surface), absence de mouvements erratiques, prise de nourriture. Enfin une attention maximale sera portée aux conditions environnementales (maitrise de l’asepsie, des paramètres physicochimique), à la prise en charge efficace de la douleur post-opératoire, et l’observation des animaux avec la mise en place d’une grille d’évaluation de la douleur étudiée spécifiquement pour ce projet, nous permettant d’estimer l’atteinte d’un point limite de manière précoce, et nous permettant de mettre en œuvre les mesures adaptées à la prise en charge de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le recours au poisson zèbre s'explique d'un part car il s'agit d'une éspèce domestique modèle élevée en captivité depuis plus d'un siècle, mais également par son extraordinaire capacité à régénérer son cœur. Le génome du poisson-zèbre présente 70% d’homologie avec le génome humain (estimé à 85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines). Notre projet portant sur la régénération d'un organe en contexte physiologique, l'approche sur animal vivant (poisson) est nécessaire. Nous travaillons uniquement sur des aniamaux ayant atteint le stade adulte, les phénomènes de régénaration d'un organe suite à une lésion ne pouvant être observés sur des individus encore en cours de developpement.
Rôle de la production de novo de glucose par l’intestin dans le contrôle du comportement alimentaire dans le développement de l’anorexie mentale. [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Privée de 30 % puis de 50 % de sa ration pendant dix-huit jours au maximum, la moitié des 500 souris de ce projet perd jusqu'à un quart de son poids. 304 subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever le sang, les tissus et le cerveau. Il s'agit de savoir si l'intestin fabrique du glucose lors d'une restriction alimentaire et si ce signal explique certains traits de l'anorexie mentale. Le porteur annonce que ces souris "ne devraient pas souffrir d'hypoglycémie" et décrit dans le même document une restriction capable d'induire agitation, déshydratation, anxiété importante voire dépression, suivie de six heures de jeûne supplémentaires juste avant la mise à mort.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment le corps envoie des signaux de satiété, qui conduisent à une disparition des sensations de faim et laissent place à une sensation de bien-être, dans l’anorexie mentale. Normalement, notre poids dépend de l’équilibre entre ce que nous mangeons et ce que nous dépensons en énergie. L’anorexie mentale est une maladie où cet équilibre est rompu à cause d’une forte réduction de l’apport alimentaire, entraînant une perte de poids importante. Cette restriction alimentaire s’accompagne souvent d’une forte activité physique et d’une préférence pour les aliments riches en protéines [et en fibres] mais faibles en calories. Pourtant, malgré ces privations, les personnes atteintes arrivent à maintenir un niveau de sucre dans le sang relativement stable et un poids minimum, ce qui suggère que leur corps s’adapte en ajustant sa consommation d’énergie et en produisant du glucose par lui-même. Le glucose est une source d’énergie essentielle, et le corps peut en produire même en dehors des repas, notamment grâce au foie, aux reins et à l’intestin. On sait aujourd’hui que l’intestin peut produire du glucose en réponse à des régimes riches en protéines ou en fibres, ce qui envoie un signal de satiété au cerveau et aide à réguler la prise alimentaire. Les chercheurs pensent que, dans l’anorexie, la restriction alimentaire pourrait stimuler la production de glucose par l’intestin, ce qui activerait un signal de satiété et aiderait à supporter le manque de nourriture. Cette production serait renforcée par la consommation préférentielle de protéines [et de fibres] et pourrait aussi expliquer pourquoi ces patients privilégient ce type d’aliments. Modification du 17-11-25 [Les premiers résultats obtenus jusqu’à maintenant avec une alimentation riche en protéines, sont en accord avec notre hypothèse. Ainsi, ils renforcent l’intérêt pour un autre nutriment largement consommé dans l’anorexie mentale et qui est aussi connu pour activer la production de sucre par l’intestin : les fibres.] Pour tester cette hypothèse, l’étude va comparer deux groupes de souris : certaines capables de produire du glucose par l’intestin et d’autres qui en sont incapables. Les chercheurs vont observer comment la restriction alimentaire influence la production de glucose, l’activation du système de récompense lié à l’alimentation et la préférence pour les aliments riches en protéines [et en fibres].
Bénéfices attendus
Modification du 17-11-25 entre crochets. L'anorexie mentale touche environ 1,4 % des femmes et 0,2 % des hommes en France. Son traitement coûte cher aux systèmes de santé européens, entre 5 et 65 millions d’euros par an, notamment parce qu’il s’agit d’une maladie longue et difficile à soigner. De plus, il n’existe pas encore de traitement réellement efficace, et près de 40 % des patients rechutent après une amélioration. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre cette maladie en étudiant plusieurs aspects clés : 1. Comment l’anorexie affecte la régulation du sucre dans le sang. 2. Quelles zones du cerveau sont impliquées dans cette maladie. 3. Pourquoi certaines personnes développent une préférence pour les protéines [et fibres] alimentaires. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements et aider à changer notre regard sur l’anorexie mentale. Plutôt que de la considérer uniquement comme une maladie mentale, elle pourrait être vue comme un trouble du métabolisme, causé par un déséquilibre énergétique qui influence aussi le comportement et l’état psychologique.
Procédures
-Pour sélectionner les souris génétiquement modifiées nécessaires à l’étude, un petit bout du pavillon de l’oreille (1mm) sera prélevé pour analyser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. -Ces souris recevront une injection quotidienne pendant 5 jours. Chaque injection dure quelques secondes par souris. -La moitié des animaux auront moins de nourriture pendant un maximum de 18 jours. Elles recevront d’abord 70% de leur ration pendant 3 jours, puis elles passeront à 50% à partir du 4ème jour. -Les souris en restriction alimentaire ne devraient pas souffrir d’hypoglycémie ; mais leur taux de sucre dans le sang sera contrôlé tous les 3 jours (au total entre 3 et 6 fois) à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue, après une légère incision. -En fin de procédure, les souris seront mises à jeun pendant 6h. Une prélèvement sanguin rapide (15 secondes) sera effectué juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Modification du 17-11-25 entre crochets. - A l’âge de 7 jours, on prélève un petit morceau du pavillon de l’oreille pour analyser l’ADN des souris génétiquement modifiée. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés mais le geste est rapide (quelques secondes). Vers 5-6 semaines, elles recevront une injection quotidienne (piqure sous-cutanée). L’injection est rapide mais peut entrainer une légère douleur et un léger stress. -Le phénotype des animaux génétiquement altérés comprend une incapacité de l’intestin à produire du glucose ainsi qu’une légère anxiété. - Réduire leur alimentation peut rendre les souris plus agitées et causer une perte de poids importante (jusqu’à 25% de leur poids initial), qui peut s’accompagner d’une légère déshydratation. Cette restriction alimentaire peut perturber le comportement des souris génétiquement modifiées, pouvant mener à l’induction d’une anxiété importante (voire de la dépression). - Lorsque l’on mesure [la] glycémie des souris, l’extrémité de la queue doit être incisée ce qui peut induire une légère douleur. -A la fin de l’expérience, les souris seront mises à jeun pendant 6h, ce qui peut affecter leur bien-être et augmenter leur un stress. La prise de sang, qui nécessite une piqûre et une contention, cause aussi une légère douleur et du stress. [A noter que, lors des premiers protocoles, les souris en restriction alimentaire ont perdu en moyenne 20% de leur poids, et conservées une glycémie correcte et un comportement normal. 2 souris ont été écartées du protocole.]
Devenir
Afin de caractériser les effets de la restriction alimentaire, plusieurs tissus devront être récupérés pour des analyses moléculaires et histologiques. Pour cela, tous les animaux seront mis à mort selon une méthode respectant les règles éthiques pour prélèvement leur sang et certains tissus. Les cerveaux seront fixés puis prélevés après le décès des animaux pour des analyses au microscope.
Remplacement
L’anorexie commence souvent par une réduction de l’alimentation, volontaire ou non. Avec le temps, des modifications dans différentes zones du cerveau aggrave la maladie et la rendent persistante. Pour survire à une privation de nourriture, le corps s’adapte en modifiant sont métabolisme. Plusieurs organes, comme le foie, les reins, l’intestin, le muscle et la graisse, participent à ces ajustements. C’est pourquoi il est essentiel d’étudier l’organisme dans son ensemble pour mieux comprendre les mécanismes de l’anorexie mentale.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été calculé avec précision en fonction des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux utilisés et du métabolisme, ainsi que de données préliminaires. Le nombre de souris par groupe a été calculé à partir de logiciel informatique. Modification du 17-11-25 [Au total, ce projet nécessitera au maximum 308 souris transgéniques et 192 souris non transgéniques.] Le modèle génétique nécessaire à ce projet permet de produire à la fois des souris dont la production intestinale de glucose est réduite et des souris témoins. Ainsi, l’utilisation des souris témoins issues de ces reproductions limite le recours à d’autres animaux, non génétiquement modifiés. Les souris mâles obtenues lors de ces reproductions pourront être utilisés pour d’autres recherches. Enfin, certains tissus non directement nécessaires à ce projet seront placés dans une banque afin de s’en servir pour de futures analyses, évitant d’avoir recours à de nouveaux animaux.
Raffinement
L’étude débute chez des animaux âgés de 10 semaines ce qui nous permet de les acclimater et de les habituer longuement aux conditions de l’expérience. Le maintien des animaux en groupe et l’apport d’éléments d’enrichissement suffit à éliminer le phénotype anxieux des animaux génétiquement modifiés. Un suivi de poids des animaux sera réalisé de façon quotidienne et une habituation à l’expérimentateur sera systématique en prenant du temps avec chaque souris (caresse, contact avec l’expérimentateur, habituation à sa voix). Le personnel zootechniciens et expérimentateurs a été sensibilisé à la préhension des souris dans un tube pour limiter le stress. Pour habituer les souris à leur nouvelle alimentation, on ajoutera dans leur cage, un mois avant la restriction, 3 croquettes de régime classique et 3 croquettes riches en protéines. Cela permettra d’éviter qu’elles refusent la nouvelle nourriture par méfiance. Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. Les souris soumises à une restriction alimentaire peuvent devenir plus agitées et stressées si elles sont trop nombreuses dans une même cage. Pour éviter cela, les souris de poids similaires seront hébergées 2 par cage avec un enrichissement adapté. Concernant l’alimentation, chaque souris recevra une portion individuelle. La réduction de nourriture sera progressive : 30% les 3 premier jours, puis 50% à partir du 4ème jour. Une première étude pourrait permettre de réduire la durée de la restriction alimentaire de 18 jours à 10 jours si cela ne compromet pas le projet. Modification du 17-11-25 : Enfin une grille de suivi et des points limites adaptés ont été mis en place [et mises à jour pour surveiller plus précisément l’état des souris et interrompre l’expérience si nécessaire. Enfin, l’utilisation systématique d’une plaque chauffante (moitié de la cage seulement) permet de réduire la perte de poids et le stress infligés aux souris.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée et inductible. Enfin, le modèle de restriction alimentaire progressive développé chez la souris reproduit toutes les caractéristiques de l’anorexie mentale et est totalement approprié à ce projet. Les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Une biopsie de l’oreille pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Le reste de l’étude sera réalisé chez des souris jeunes de 10 semaines. En effet, chez l’Homme, l’anorexie mentale se déclare généralement au moment de la puberté/début de l’âge adulte.
Etude des défauts vasculaires du cerveau dans des modèles souris d’une maladie génétique rare, la maladie de Rendu-Osler
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
479 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection unique déclenche la modification génétique qui reproduit la maladie de Rendu-Osler, avant deux séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie générale, produit de contraste injecté dans la veine de la queue. Le porteur attend une réduction de l'activité et une altération de l'état général, sans en dire plus sur les malformations des vaisseaux du cerveau que le modèle est censé produire. Il écrit qu'aucun traitement n'existe pour cette maladie génétique rare et que la mise au point d'un modèle animal est "essentielle" pour améliorer la prise en charge des patients.
Objectifs
Nous étudions une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre- autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins et des déformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications graves sur différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Il s’agit d’une maladie génétique dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre le développement de la maladie pour proposer de nouvelles thérapies. Très peu d’études sont réalisées sur le cerveau et pourtant dans cet organe, les artères et les veines peuvent être déformées chez les patients. Les conséquences que cela peut avoir sur les cellules nerveuses ne sont pas bien décrites. Différents acteurs qui contrôlent l’organisation des vaisseaux sont impliqués dans le développement de cette maladie. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs vasculaires, on utilise des modèles de souris ne produisant pas l’un de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Nous allons dans ce projet étudier les effets de la perte d’un de ces acteurs sur les vaisseaux sanguins du cerveau avec des techniques d’analyse (IRM, cellulaires...). Cela nous permet de connaître les changements qui interviennent sur les vaisseaux et de voir leur mauvaise organisation dans les souris malades. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le diagnostic des problèmes cérébraux des patients atteints de cette maladie.
Bénéfices attendus
Il n’y a actuellement aucune traitement pour la maladie génétique rare que nous étudions. Mieux comprendre comment se déforment les vaiseaux sanguins du cerveau et mettre au point un modèle animal pour tester de nouvreaux traittements sont essentiels pour améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Une injection unique est prévue pour induire la modification génétique mimant celle des patients. Deux imageries médicales maximum sont ensuite réalisées sur chaque animal au premier jour après cette première injection et au dernier jour de l'expérience. Pour procéder à l’imagerie médicale, les animaux sont anesthésiés et un agent de contraste est injecté dans la veine de la queue. Chaque imagerie dure environ 1h. Des injections de produits permettant de visualiser les vaisseaux et leur état nécessiteront une injection supplémentaire unique (quelques secondes) et la diffusion du produit de 10 min à 2heures maximum. Les animaux reçoivent le produit soit par injection dans l’abdomen soit en intraveineux (ils sont alors anesthésiés).
Impact sur les animaux
Les injections induisent une douleur de quelques secondes lors de la piqûre et un stress dû à la manipulation d’une durée inférieure à 30 secondes. Les imageries médicales nécessitent une anesthésie générale le temps de l’examen. Les nuisances attendues sur les animaux peuvent être une réduction de l'activité et une altération de l'état général de l'animal.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient mis à mort, afin de récupérer les organes.
Remplacement
Le développement de cette maladie impacte plusieurs organes et plusieurs cellules différentes interagissant entre elles. Il n’est actuellement pas possible de recréer un modèle aussi complexe in vitro car les interactions entre les cellules ne sont pas stables. Afin de comprendre les mécanismes précis qui conduisent aux déformations des vaisseaux du cerveau, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale. Le modèle souris est adapté car son réseau sanguin est proche de celui de l'homme.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel statistique, ainsi que les données de la littérature pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires permettant de faire les tests statistiques nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique.
Raffinement
Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. L’imagerie médicale est réalisée sous anesthésie générale, avec un enregistrement des paramètres vitaux des souris (respiration rythme cardiaque). Pendant toute l’expérience, une échelle de cotation de douleur basées sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. En cas de signe de douleur, des analgésiques seront administrés. Pour chaque procédure, les analgésies nécessaires et adéquates sont définies, ainsi que des points limites stricts et spécifiques.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques semblables aux mutations portées par les patients atteints de cette maladie. Elles constituent donc le meilleur modèle de la pathologie pour mieux comprendre les mécanismes de développement de cette pathologie et mieux développer des traitements. Les symptômes de cette maladie apparaissent à l’adolescence, nous allons étudier les défauts vasculaires à l’âge jeune adulte uniquement.
Prévoir l’efficacité de la radiothérapie dans les cancers ORL grâce à l’imagerie médicale et l’analyse biologique EU2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules de cancer humain de la bouche sont injectées dans la patte arrière gauche de 70 souris, qui reçoivent ensuite une séance de radiothérapie, une à deux IRM de quarante-cinq minutes sous anesthésie, ou les deux. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, tumeurs, ganglions, foie et poumons étant prélevés. Le porteur énumère les atteintes possibles, gêne fonctionnelle progressive, infection, ulcération, brûlures dans les 24 à 48 heures suivant l'irradiation, puis ajoute qu'il n'a "jamais observé ces nuisances à cette dose". Sur le remplacement, il écrit qu'aucun modèle informatique ni organoïde ne reproduit la réponse aux radiations et que l'animal reste "incontournable".
Objectifs
Les cancers de la tête et du cou (comme ceux de la bouche ou de la gorge) sont parmi les plus fréquents dans le monde. Chaque année, ils sont responsables de plus de 440 000 décès. L’un des traitements les plus utilisés est la radiothérapie, qui consiste à envoyer des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Mais ce traitement ne fonctionne pas toujours aussi bien : certaines parties de la tumeur résistent, ce qui complique la guérison. Pourquoi certaines cellules cancéreuses survivent-elles à la radiothérapie ? C’est la question à laquelle notre projet veut répondre. Pour cela, nous allons utiliser une nouvelle méthode appelée radiomique. Elle permet d’analyser très finement les images médicales (IRM) des tumeurs. Grâce à des outils informatiques, on peut extraire des informations que l’œil humain ne voit pas. Cela pourrait nous aider à repérer, à l’avance, les zones d’une tumeur qui risquent de ne pas bien réagir au traitement. Mais pour l’instant, on ne sait pas encore si ce que l’on voit sur les images correspond bien à la réalité des tissus malades. Notre étude va donc tester cette idée dans un modèle animal (des souris). Des cellules cancéreuses humaines seront implantées dans la patte des souris. Ensuite, elles recevront une radiothérapie, et passeront des examens IRM avant et après le traitement. On analysera ensuite les tumeurs pour comparer ce que montrent les images avec ce qu’on observe réellement dans les tissus. Ce projet se déroulera sur 3 EU différents : pour des fins d’hébergement, de radiothérapie et d’imagerie. Le projet se déroule en deux grandes étapes. La première servira à mettre au point les bonnes conditions expérimentales (taille des tumeurs, bons moments pour les IRM, méthode d’analyse des tissus, etc.). Dans la deuxième étape, nous comparerons deux groupes de souris (traitées ou non) pour vérifier si certaines caractéristiques visibles à l’IRM permettent de prédire la réponse à la radiothérapie. Si cette méthode fonctionne, elle sera testée ensuite chez l’humain. À long terme, l’objectif est de mieux personnaliser les traitements : si on sait à l’avance qu’une tumeur va mal réagir à la radiothérapie, on pourra adapter la stratégie, par exemple en augmentant la dose ou en ajoutant un autre traitement. Cela permettrait d’améliorer les chances de guérison tout en réduisant les effets secondaires.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique sur la souris sera suivi par la validation des résultats sur pièces chirurgicales de patients (biopsies), suivi d’une étude clinique de phase II de radiothérapie adaptative en fonction des résultats de ce projet.
Procédures
70 souris recevront une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche. Ces 70 souris recevront différentes interventions : 14 souris recevront 2 IRM (45 minutes chaque séance) espacées d’au moins 5 jours (EU imagerie). 28 souris recevront une séance unique de radiothérapie (5 minutes) (EU radiothérapie), dont 14 seulement recevront une IRM (EU hébergement et EU imagerie). 28 souris recevront une séance d’IRM de 45 minutes (EU imagerie), dont 14 souris recevront une séance unique de radiothérapie qui dure 5 minutes (EU radiothérapie). Avant toute injection de cellules tumorales, IRM, radiothérapie : les souris sont anesthésiées par un gaz volatile anesthésiant.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut générer une inconfort local léger et transitoire. La masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération. La radiothérapie peut causer des brûlures autour du site irradié 24 à 48 heures post-irradiation. Néanmoins, nous n’avons jamais observé ces nuisances à cette dose.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour analyses histologiques de la tumeur. De plus, d’autres organes comme les ganglions, le foie et les poumons seront prélever pour des expérimentations ultérieures afin d’étudier la dissémination tumorale.
Remplacement
A l’heure actuelle, aucun modèle informatique, in vitro ou organoïde ne permet de reproduire fidèlement la complexité des zones résistantes et la réponse aux radiations ionisantes in vivo. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc incontournable pour garantir la pertinence des résultats avant une transposition à l’Homme.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été rigoureusement calculé afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux engagés dans l’étude. Chaque groupe expérimental comporte ainsi un effectif restreint, mais suffisant pour assurer la validité scientifique des conclusions. Selon l’expérience de l’équipe et les équipes qui travaillent en collaboration sur ce projet, 12 souris par groupe sont nécessaires afin de mener l’étude et de garantir une puissance statistique suffisante. Sur la base de l’expérience de l’équipe, un taux d’échec de pousse tumorale d’environ 15 % est observé, donc . Pour compenser ces pertes et disposer d’un nombre suffisant de données exploitables, 14 souris par groupe sont prévues.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, tout en garantissant la validité scientifique des données recueillies. Une habituation à la manipulation sera réalisée progressivement. Le choix du site d’injection des cellules tumorales (patte postérieure gauche, en sous-cutanée) a été réfléchi pour limiter la gêne fonctionnelle et éviter l’exposition des organes internes sensibles lors de la radiothérapie. Ce site permet également une croissance tumorale plus homogène et plus facilement mesurable, tout en étant bien maîtrisé par l’équipe. Le suivi des animaux est rigoureux : les animaux sont observés au minimum trois fois par semaine, et quotidiennement à partir de l’apparition de la tumeur. Toute altération de leur état de santé entraînera l’administration d’antalgiques : injection en sous-cutanée d’anti-inflammatoire. Si la douleur persiste plus que 24h, une injection d’analgésique sera effectuée. Si nécessaire, l’expérimentation sera arrêtée selon les points limites mis en place. Les anesthésies nécessaires aux injections de cellules, examens IRM et à l’irradiation sont réalisées avec un apport en oxygène, pour une induction et un réveil rapide. Un tapis chauffant est utilisé pour éviter l’hypothermie, et une surveillance post-anesthésique est assurée jusqu’au retour complet à l’état de veille. Le transport des animaux entre les sites d’hébergement et d’imagerie est limité au strict nécessaire (5 minutes sur un chariot adapté) et le transport entre le site de radiothérapie et d’imagerie sera effectué dans des véhicules à température contrôlée, avec des caisses ventilées adaptées (25 minutes). Les trajets sont courts et les animaux sont replacés rapidement dans un environnement familier.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été choisi pour sa pertinence biologique, sa robustesse et son large usage en recherche préclinique en oncologie. Son génome est entièrement connu, avec une forte similarité fonctionnelle avec celui de l’Homme. Ce modèle permet une vision intégrée de la tumeur et de son microenvironnement. Le modèle tumoral utilisé, basé sur l’injection de cellules tumorales issues de carcinomes oraux chimiquement induits, est bien documenté et reproduit les caractéristiques des cancers ORL humains. L’utilisation de souris immunocompétentes permet d’étudier les interactions entre tumeur, radiothérapie et système immunitaire. Leur petite taille les rend compatibles avec les plateformes d’IRM préclinique et d’irradiation ciblée. Ce choix favorise ainsi une cohérence entre les données d’imagerie et histologiques animales, et celles prévues chez l’Homme, renforçant la validité translationnelle du modèle. Les souris seront âgées de 7 semaines à la réception afin qu’elles aient atteint le stade adulte et un système immunitaire mature lors de la séquence thérapeutique.
Étude d’un gène, facteur de protection de la maladie d’Alzheimer, chez la souris EU3/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Vérifier si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de protéine Tau dans l'hippocampe : 226 souris sont utilisées pour cela dans le troisième des trois établissements de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris Tau22 développent des lésions cérébrales et des pertes de mémoire à partir de six à neuf mois, après une injection de vecteur de thérapie génique dans le cerveau et deux tests de mémoire passés à sept et dix mois. La mise à mort passe par une ouverture du thorax sous anesthésie profonde, le porteur écrivant qu'une perfusion réalisée après le décès abîmerait les mitochondries qu'il veut observer. Les reproducteurs âgés sont réformés et tués eux aussi, aucun animal génétiquement modifié ne pouvant être placé ni relâché.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.
Procédures
Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau
Réduction
Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.
Choix des espèces
Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.
Caractérisation des altérations comportementales et neuronales chez un modèle génétique murin d’encéphalopathie épileptique humaine.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent la mutation d'enfants atteints d'une encéphalopathie épileptique et font des crises d'épilepsie, avec hyperactivité et gestes répétés. 336 vont être utilisées, 192 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles passent un test comportemental par jour pendant dix jours, arène éclairée, enfouissement de billes, labyrinthe en Y, reconnaissance d'objets, labyrinthe en croix surélevé, interaction sociale à trois chambres, et une partie subit en plus une chirurgie de quarante à quatre-vingt-dix minutes pour implanter des électrodes dans le cerveau, suivie de quarante jours de logement séparé et de soixante jours d'enregistrement quotidien. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort, le porteur avançant que ces données alimenteront des "cerveaux virtuels" qui pourraient à terme réduire le recours aux animaux non-humains.
Objectifs
Ce projet étudie des souris porteuses d’une mutation génétique dans une composante des cellules du cerveau, essentiel pour transmettre les signaux électriques. Chez certaines personnes, une mutation dans ce gène provoque une maladie du cerveau. Les enfants touchés présentent souvent des crises d’épilepsie ainsi que des difficultés d’apprentissage et de concentration. Les souris étudiées portent la même mutation que ces enfants. Elles permettent donc de mieux comprendre la maladie. Elles montrent déjà certains signes similaires : crises d’épilepsie, hyperactivité, gestes répétés et un niveau de stress plus faible que les souris normales. Les chercheurs veulent maintenant vérifier si ces souris reproduisent bien l’ensemble des symptômes observés chez les patients. Pour cela, ils réaliseront cinq types d’expériences : • D’abord, ils confirmeront quelles souris portent la mutation (génotypage). • Ensuite, chaque souris participera à une seule des quatre autres expériences, qui serviront à : 1. Mieux comprendre comment et quand apparaissent les crises d’épilepsie. 2. Analyser le comportement des souris. 3. Observer ce qui se passe dans le cerveau, au niveau des cellules et de l’activité électrique, pendant les crises. Grâce à ces travaux, les chercheurs espèrent mieux comprendre cette maladie et, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements pour les enfants concernés.
Bénéfices attendus
Cette étude cherche à mieux comprendre pourquoi certaines maladies du cerveau provoquent de l’épilepsie. Ces maladies sont liées à des dysfonctionnements des certaines molécules présentes dans les cellules du cerveau, qui permettent de transmettre les signaux électriques. Les souris étudiées portent une mutation dans l’un de ces molécules, semblable à celle observée chez certaines personnes malades. En les observant, les chercheurs veulent comprendre comment cette mutation modifie le fonctionnement du cerveau. Ces connaissances pourraient, à terme, aider à développer de nouvelles méthodes de diagnostic et de traitement pour ces maladies, qui restent aujourd’hui sans solution. Une partie des données recueillies servira aussi à créer des modèles informatiques. Ces modèles, comparables à des « cerveaux virtuels », permettent de simuler les effets d’une mutation. À long terme, ce type d’outil pourrait réduire l’utilisation d’animaux dans la recherche, car certaines expériences pourraient être reproduites directement sur ordinateur.
Procédures
1. Prélèvement pour identifier les souris Un petit morceau (2mm) de queue sera retiré (durée environ 10 secondes). 2. Tests de comportement Les souris réaliseront un test par jour pendant 10jours, d’une durée de 5 à 30 minutes. Les procédures prévues sont : • Exploration d’une arène éclairée. • Enterrement de billes. • Parcours dans un labyrinthe en Y. • Test de reconnaissance d’objets. • Parcours dans un labyrinthe en croix surélevé. • Test d’interaction sociale à trois chambres. 3. Chirurgie pour poser des électrodes Certaines souris subiront une intervention de 40 à 90 minutes pour l’implantation de très fines électrodes dans le cerveau. Elles seront ensuite hébergées séparément pendant 40 jours. 4. Enregistrements cérébraux L’activité électrique du cerveau sera enregistrée chaque jour pendant 60 jours. Avant chaque enregistrement, la souris sera connectée à l’appareil par une manipulation de 30 à 60 secondes. Elles seront hébergées séparément pendant 60 jours.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées présentent des problèmes de santé : elles ont des crises d’épilepsie et un comportement différent de celui des autres souris. Pour certaines procédures, une opération chirurgicale d’implantation d’électrodes sera réalisée. Après l’opération, les souris peuvent ressentir une légère douleur pendant quelques jours et montrer des signes de stress. Elles seront hébergées séparément, mais resteront dans un environnement où elles pourront voir, entendre ou sentir les autres souris, sans être totalement isolées. Les test de comportement peuvent causer un stress léger lié à la manipulation et la nouveauté.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les cerveaux et réaliser des analyses.
Remplacement
Ce projet veut comprendre ce qui se passe dans le cerveau quand certaines maladies causent de l’épilepsie et des difficultés de développement. Pour cela, il est nécessaire de travailler sur un modèle intégré qui gardent toute la complexité du cerveau et du comportement. Les informations recueillies seront aussi utilisées pour créer des modèles informatiques du cerveau. Ces modèles aident à comprendre comment les erreurs dans les gènes changent le fonctionnement du cerveau, sans toujours avoir besoin de nouvelles expériences sur les animaux. À long terme, ces méthodes pourraient permettre de faire moins d’expériences sur les animaux, en aidant à remplacer ou réduire leur utilisation tout en continuant à apprendre sur le cerveau.
Réduction
On utilisera juste assez de souris pour obtenir des résultats fiables, mais pas plus que nécessaire (calcul effectué avec des approches statistiques). Les tests de comportement qu'on utilisera ont déjà été essayés avant sur des souris similaires, et ils ont déjà un plan précis. Cela veut dire qu’on n’aura pas besoin de refaire des tests préliminaires de perfectionnement.
Raffinement
L’état de santé des souris sera régulièrement surveillé à l’aide d’une grille d’évaluation pour repérer d’éventuels signes de douleur ou d’inconfort. En cas de douleur, elles recevront de l’anti-douleur pour être soulagée. La surveillance sera renforcée durant la semaine suivant une intervention au niveau du cerveau. Cette intervention sera réalisé avec une prise en charge adaptée de la douleur (anesthésie et traitement antidouleur).
Choix des espèces
Même si la maladie est pédiatrique, on utilise des souris adultes car il est nécessaire qu’elles aient atteint un stade de développement stable pour réaliser certaines procédures en toute sécurité, comme les évaluations comportementales ou l’implantation d’électrodes. Chez des souris trop jeunes, ces interventions seraient moins fiables et pourraient présenter davantage de risques. On choisit les souris comme espèce parce qu’elles partagent de nombreux gènes et fonctions cérébrales avec l’humain, et qu’elles sont bien adaptées à des études en laboratoire. Leur taille, leur reproduction rapide et la possibilité de contrôler leur environnement en font un modèle pratique et fiable pour étudier les mécanismes de la maladie. Par ailleurs, à l’âge adulte, les effets de la mutation sont déjà clairement exprimés. On peut ainsi observer la maladie de manière stable et obtenir des données plus robustes et comparables.
Validation de nouvelles molécules pour le traitement local de l’inflammation cutanée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une souris dont le score combinant l'état de l'oreille et l'état général atteint le point limite est mise à mort. 978 souris vont être utilisées dans ce projet sur la dermatite atopique, 815 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse de la peau, des ganglions, de la rate et de la moelle. Une substance appliquée sur les oreilles y déclenche une inflammation et des démangeaisons pendant dix à douze jours, l'épaisseur de l'oreille étant mesurée chaque jour, avec un prélèvement de sang sous la mâchoire sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les démangeaisons seront "notamment très présentes" chez les souris recevant le seul véhicule, et situe le bénéfice attendu, une crème plus efficace, dans cinq à dix ans.
Objectifs
La dermatite atopique (DA) est l’inflammation cutanée chronique la plus courante. Les traitements actuels, comme les glucocorticoïdes topiques, ont des effets secondaires et perdent en efficacité avec le temps. De nouvelles thérapies soulageant les symptômes et ciblant les mécanismes de la DA avec moins d'effets indésirables sont requises. Nous avons identifié une cible thérapeutique dont le blocage permet de réduire l'inflammation cutanée dans différents modèles. Nos collaborateurs ont mis au point un inhibiteur de cette cible, qui peut être appliquée sur la peau directement. Son efficacité est toutefois limitée par sa dégradation rapide et son passage limité de la barrière cutanée. Nous avons créé et sélectionné 4 dérivés de cet inhibiteur, plus stables et très efficaces in vitro, et que nous souhaitonsà présent comparer in vivo pour identifier le plus efficace pour limiter l’inflammation cutanée dans des modèles de DA. Nous souhaitons également identifier les mécanismes qui expliquent l’efficacité de ces composés et les bénéfices possibles de leur utilisation conjointe avec une application cutanée de corticoïdes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise répond à un manque important de traitements locaux efficaces pour la DA. Il pourrait permettre de développer un nouveau traitement appliqué directement sur la peau, agissant sur une cible précise, avec des bénéfices attendus à moyen terme (d’ici 5 à 10 ans). Ce nouveau traitement pourrait aussi être utilisé en complément des crèmes à base de corticoïdes déjà existantes. Cette association pourrait renforcer l’effet anti-inflammatoire tout en permettant de réduire les doses de corticoïdes, et donc leurs effets indésirables et le recours à des traitements généraux plus lourds, souvent coûteux et associés à davantage d’effets secondaires. Notre approche repose sur des résultats scientifiques antérieurs montrant que notre cible joue un rôle dans l’inflammation de la peau et même si l’efficacité de notre stratégie de blocage n’est pas encore prouvée avec certitude, les données disponibles sont suffisamment encourageantes pour justifier des études précliniques.
Procédures
Nous effectuerons des applications cutanées de composés visant à induire la dermatite atopique (DA), puis des composés inhibiteurs à tester ainsi que de composés contrôles ou de leurs véhicules. Ces applications, qui prennent une à deux minutes seront quotidiennes pendant 12 jours ou réalisées certains jours (J0,1,5, 6,7,8,9) sur une période de 10 jours. Nous effectuerons des mesures quotidiennes de l’épaisseur des oreilles pendant la phase de suivi, et, dans certains protocoles, un prélèvement de sang sur animaux vigiles deux heures après la dernière application du traitement. Ce prélèvement implique une immunobilisation de l'animal pendant 20 à 40 secondes, pour un prélèvement qui dure de 10 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour ces animaux seront légères à modérées. En effet, l’application de MC903 et de DNFB engendre une inflammation avec un gonflement plus ou moins important de l’oreille et des démangeaisons qui seront notamment très présentes dans les groupes traités avec le véhicule : nuisance légère (groupes contrôles sans DA ou avec DA traitée de façon optimale) à modérée (groupes DA). Un prélèvement de sang sera réalisé au niveau sous-mandibulaire sur animal vigile par un expérimentateur aguerri : nuisance légère. La manipulation des animaux et la prise de mesure d’épaisseur de l’oreille quotidienne peut engendrer une nuisance légère . Pour limiter autant que possible l’éventuelle douleur à l’application des composés et le stress chez les animaux, l’administration des différents composés sera réalisée sous anesthésie gazeuse et nous serons très vigilants pour limiter tout désagrément additionnel pour les souris. Le prélèvement de sang sera réalisé sur animal vigile par une expérimentateur aguerri.
Devenir
Suite à la dernière mesure d’épaisseur des oreilles, les souris seront euthanasiées pour analyse post mortem de la peau et des organes lymphoïdes (ganglions drainant la peau, rate, moelle).
Remplacement
Dans l’état actuel des connaissances, reproduire in vitro les mécanismes immunologiques complexes et intégrés responsables de la dermatite atopique et de l’hypersensibilité retardée et explorer les bénéfices potentiels de traitements ciblés sur cette pathologie n’est pas possible. Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà réalisé de nombreux travaux in vitro pour pré-sélectionner les composés à tester et limiter leur nombre. A présent, nous disposons de quatre composés ayant un effet in vitro et avons pour objectif de sélectionner le meilleur d’entre eux puis de caractériser les mécanismes responsables de son efficacité, le cas échéant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire, en complément des autres approches déjà menées in vitro et in silico.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet, nous avons sélectionné les 4 composés à tester sur la base d’expériences réalisées in vitro et ex vivo sur des cellules primaires humaines. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini sur la base de travaux précédents, de sorte à assurer autant que possible l’identification de différences statistiques le cas échéant. Pour nous aider, nous avons utilisé des calculs de puissance. Nous avons de plus prévu des plans d'expériences qui permettront d'arrêter certains groupes rapidement si un composé ne fonctionnait pas, par exemple.
Raffinement
Dans le cadre de l’application des différents composés, nous limiterons le temps de contention et manipulerons les souris avec précaution pour réduire le stress, ce qui améliorera la reproductibilité des résultats. Ces applications seront réalisées sous anesthésie gazeuse, au niveau des oreilles Chaque protocole sera réalisé par les mêmes expérimentateurs, avec un expérimentateur qui appliquera les composés et prendra les mesures, et un second qui identifiera les souris et prendra les notes (mesures et toute observation utile pour chaque souris). La prise de mesure avec le micromètre étant très dépendante d’opérateur, nous privilégierons la prise de mesure par un même expérimentateur pour accroitre la robustesse de nos données. La surveillance quotidienne des animaux visera à vérifier des paramètres généraux révélateurs de l’état dénéral des souris (comportement, posture, allure de la fourrure, blessures éventuelles) au-delà des paramètres liés à l’expérience (léchage, grattage, oreille gonflée ou rouge). Une grille de scores combinés incluant des critères locaux et généraux sera utilisée pour grader l’éventuelle altération de l’état des animaux. Toute altération de l’état général d’une souris conduira à un suivi plus poussé avec pesées quotidiennes. Si le point limite, défini sur la base d'un score combinant les atteintes locales et l'état général, était atteint, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Les mécanismes cellulaires impliqués dans la DA et l’hypersensibilité retardée ne peuvent pas être complètement reproduits in vitro à l’heure actuelle. Les modèles de DA et d’hypersensibilité chez la souris présentent des similitudes importantes avec la physiopathologie de ces atteintes chez l’homme, et le récepteur cible des inhibiteurs testés est très conservé entre homme et souris. Ceci soutient la pertinence de la réalisation de nos expériences chez la souris. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, dont le système immunitaire est pleinement mature. Elle seront issues du commerce ou de nos élevages, et agées de 6 à 14 semaines lors de leur entrée en protocole, pour nous permettre de constituer des groupes de souris d'effectif suffisant sans amplifier de façon excessive nos élevages.
Stratégies innovantes et mécanismes moléculaires pour une action antidépressive renforcée dans des modèles murins de stress social
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 400 sans même être prélevées une fois écoulée la période maximale de maintien, 6 856 souris vont être utilisées dans ce projet sur la dépression. 984 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 5 472 un niveau modéré. Le protocole associe dix jours de stress social répété face à des souris agresseuses, une chirurgie du cerveau de trois à cinq heures pour une partie des animaux, des injections quotidiennes pouvant courir sur un mois, des restrictions alimentaires et des batteries de tests comportementaux répétées quatre fois. Le porteur écrit que ce stress psychologique intense provoque anhédonie, anxiété et retrait social, et présente le projet comme une réponse à un "besoin urgent" de meilleures thérapies pour les 300 millions de personnes concernées.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin urgent de meilleures thérapies pour le trouble dépressif majeur. Il repose sur la récente découverte d'un facteur de transcription en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la dépression, ce qui permet de développer des stratégies d'appoint innovantes répondant aux critères suivants : (i) elles offrent une action antidépressive plus rapide et une efficacité accrue, (ii) elles se basent sur des mécanismes biologiques solides et plausibles, (iii) elles sont applicables à la physiopathologie humaine, ainsi qu'aux phases de Recherche et Développement et aux futurs essais cliniques. Les antidépresseurs occupent une place centrale dans la prise en charge de la dépression, grâce à leur accessibilité étendue et à leur efficacité prouvée, qui s'avère similaire d'un médicament à l'autre. La monothérapie est privilégiée en première ligne de traitement, alors qu'une combinaison d'antidépresseurs n'est considérée qu'en cas d'échec de la monothérapie initiale, un scénario survenant dans environ la moitié des situations. Nous formulons l'hypothèse qu'une association d'antidépresseurs classiques avec des approches pharmacologiques visant à inhiber le facteur de transcription identifié accroîtrait l'efficacité du traitement, en accélérant son onset d'action et en augmentant la proportion de patients répondeurs. Nous voulons vérifier comment le mécanisme d'action de notre combinaison synergique, (i) dépend des propriétés spécifiques de l'antidépresseur, comme sa capacité à bloquer la recapture d’un neurotransmetteur en particulier, (ii) modifie les fonctions cérébrales impactés par le trouble dépressif majeur, (iii) modifie l’expression génétique permettant l’identification de biomarqueurs de la réponse au traitement. Pour mieux refléter la complexité des situations cliniques, nous proposons d’évaluer ces traitements dans un modèle murin de traumatisme combiné, intégrant des dimensions physiques, psychologiques et sociales. Ce modèle nous permettra d’étudier les effets du traitement prophylactique, ainsi que ses effets à long terme.
Bénéfices attendus
Nous déploierons ensuite des efforts de Recherche et Développement auprès des acteurs cliniques, institutionnels et privés. Les résultats à long terme créeraient idéalement une valeur supplémentaire par rapport aux stratégies thérapeutiques existantes avec des approches complémentaires, un potentiel d'amélioration majeur dans la pharmacologie du trouble dépressif majeur (action rapide, meilleure efficacité). Une prise en charge pharmacologique plus abordable de la dépression signifie (i) une guérison plus précoce réduisant les souffrances et les effets secondaires inutiles, (ii) une amélioration de la qualité de vie des 300 millions de personnes souffrant de dépression dans le monde et de leurs familles, (iii) réduction du fardeau social et des coûts de santé publique.
Procédures
Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 3-5 heures par souris, accompagnée d’infusion d’anesthésiques gazeux et d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront soumises à une procédure de stress social répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 5-10 minutes pendant 10 jours. Les animaux stressés recevront une injection quotidienne de l’antidépresseur ou de combinaison de composés ayant des effets antidépresseurs allant de 1 injection à 1 mois de traitement (animal vigile à raison de quelques secondes par animal). Leur état émotionnel d’anxiété/dépression, de nociception et de cognition sera suivi avec tâches comportementales sur animaux vigiles. Ce suivi se fera avec une batterie hebdomadaire de 3 tests répétés 4 fois. La dernière batterie comportementale sera plus complète, elle comportera de 4 à 10 tests et s’étalera sur 1 à deux semaines. Les animaux ayant subis une intervention chirurgicale seront suivis avec une batterie comportementale de 5-7 tests répétés en 4 temporalités (avant stress, après stress, après traitement et après rémission). Leur activité cérébrale sera mesurée en vigile pendant les taches comportementales. La durée d’un test sera de 10 minutes à 1 heure et l’animal effectuera jusqu’à deux tests par jour. Certains tests cognitifs nécessiteront une diminution de la prise de nourriture pendant 5-15 jours. Jusqu’à trois prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, avec une intervention de moins d’une minute. Chaque prélèvement sanguin sera espacé d’au moins 10-15 jours.
Impact sur les animaux
Dans le protocole de stress social, plus du stress physique les souris seront soumises de façon répétée à un stress psychologique intense susceptible de causer symptôme de dépression, anhédonie, anxiété et un retrait social chez un sous-groupe d’individus. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé. Les injections intrapéritonéales chroniques peuvent provoquer des effets secondaires mineurs, ou inconfort comme une douleur légère et transitoire, voir une irritation locale autour du site d’injection. La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’éventuellement une anxiété. Cependant, dans nos conditions expérimentales, l’hébergement individuel n’induit ni stéréotypies ni modifications du comportement émotionnel. Les tests de comportement ne montrent pas de changements notables. Les tests cognitifs nécessitent une restriction alimentaire pouvant entraîner une sensation de faim. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.
Devenir
L'euthanasie de l'ensemble des animaux est requise. Pour une grande partie des animaux du sang, leurs cerveaux et des organes périphériques seront récoltés en vue de procéder à des analyses de biologie moléculaire ou d'anatomie/imagerie et, où chaque animal représente un individu unique. Une partie des animaux (400) ne seront pas prélevés mais euthanasié à la fin de la période maximal de maintien. Ces animaux sont mutualisés (utilisation continue) sur plusieurs projets où ils ne seront pas comptabilisés contribuant à la réduction.
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro avec des modèles cellulaires, les effets de la dépression, du stress, et des antidépresseurs se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures d’expérimentations animales décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress ou les drogues sur des circuits neuronaux intacts. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Nous essayons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux pour pouvoir effectuer des études invasives qui ne sont pas faisables chez les sujets humains. Avec l’approche translationelle que nous avons adopté, les résultats obtenus au sein de notre laboratoire sont complémentaires de ceux obtenus chez l’homme.
Réduction
Les études prévues nécessiteront l’utilisation de 6856 animaux. Cet effectif représente un maximum. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par un calcul de puissance afin de s'assurer qu'il soit suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux impliqués. Les effectifs sont déterminés de manière à fournir des résultats analysables par des méthodes statistiques scientifiquement adaptées. Cette approche nous permet de répondre à la question principale du projet et en optimisant l'effectif, nous garantissons non seulement des résultats fiables, mais aussi une minimisation de l'impact sur les animaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 2-6 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal et supplémenté avec un morceau de bois ou un tube en carton pour les animaux placés hébergement individuel pour traitement pharmacologique. Les cages utilisées sont transparentes, fermées par une grille et placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ainsi les informations visuelles, auditives et les odeurs peuvent circuler entre les souris. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée (voire quotidienne en post-opératoire ou lors des restrictions alimentaires pour les tâches cognitives). Des points limites spécifiques ont été établis pour permettre d’évaluer l’état de douleur de l’animal agir en conséquence afin d’éviter toute souffrance supplémentaire, soit par un renforcement du traitement antalgique/analgésique, soit par une euthanasie. Pour le suivi post opératoire, une grille de scoring sera mise en place pour garantir le bien-être des animaux. De plus, un anesthésique local sous forme de crème est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au début et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de détérioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront en hébergement individuel pendant environ 4 mois.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de la dépression clairement établis chez la souris. En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude des gènes dans le cerveau permettant l’identification de biomarqueurs de la réponse au traitement. Expériences chez des animaux adultes : Les souris tests seront réceptionnés à l'âge de 6-7 semaines puis utilisés en procédure à l'âge adultes (âge entre 8 et 16 semaines). Les agresseurs seront des anciens reproducteurs ou des réformés âgées de 6-10 mois à réception puis utilisé pendant environ 1 an. Cette partie du projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des troubles affectifs à l’âge adulte en prenant en compte la variabilité individuelle et le dimorphisme sexuel.
Evaluation des altérations comportementales et neurobiologiques chez un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des composés pharmacologiques sont administrés à des souris porteuses de mutations humaines, avant des tests de mémoire et d'état émotionnel et jusqu'à deux prélèvements sanguins sous anesthésie. 990 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à relier les troubles du comportement de ces animaux aux marqueurs biologiques de la maladie d'Alzheimer et à évaluer l'effet thérapeutique des composés testés. Le résumé annonce des tests comportementaux et un effectif de quinze souris par groupe sans nommer un seul de ces tests, tout en concluant qu'aucun effet durable n'est attendu.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une affection neurodégénérative qui se manifeste par une perte progressive de la mémoire et des capacités cognitives, ainsi que par des troubles émotionnels tels que l’anxiété ou la dépression. Sur le plan biologique, elle est caractérisée par l’accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Cette pathologie peut être modélisée chez la souris grâce à certaines modifications génétiques. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris portant des mutations humaines sur des gènes impliqués dans les processus physiopathologiques aboutissant à l'apparition d'une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer. Les objectifs de ce projet sont (i) d’étudier les altérations comportementales et neurobiologiques à différents stades de la pathologie, (ii) de voir si ces altérations ont un lien entre elles et (iii) d’évaluer l’effet thérapeutique de certains composés pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des altérations comportementales et neurobiologiques associées à la maladie d’Alzheimer, en s’appuyant sur un modèle murin transgénique pertinent et largement utilisé par la communauté scientifique internationale. L’évaluation combinée de dimensions émotionnelles et cognitives, associée à l’administration de composés d’intérêt, fournira des données intégrées sur l’évolution des symptômes et leur régression potentielle. Les prélèvements biologiques permettront de relier les observations comportementales à des marqueurs neurobiologiques. Les résultats attendus contribueront à l’identification de mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la maladie et à l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques, avec un impact potentiel à moyen et long terme pour la recherche translationnelle sur les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions au cours du projet. Des composés thérapeutique seront administrées puis des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer la mémoire et l'état émotionnel des animaux. Chaque animal subira uniquement le nombre nécessaire de tests pour répondre aux objectifs expérimentaux. Des prélèvements sanguins sur animal analgésié et anesthésié sera réalisé au cours des expérimentations.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en œuvre sont susceptibles d’induire des nuisances transitoires, légères à modérées. L’administration de composés peut entraîner un inconfort local bref. Les tests comportementaux peuvent générer un stress variable selon les tests, mais toujours de courte durée. Les prélèvements sanguins (deux par animal maximum) réalisés sur des souris anesthésiées peuvent provoquer un inconfort transitoire. Ces effets sont strictement limités par le raffinement des procédures (habituation, manipulation douce, limitation du nombre de tests et de prélèvements, surveillance comportementale continue et critères d’arrêt précoces). Aucun effet durable n’est attendu, et l’ensemble du projet est conçu pour limiter la douleur et la souffrance au strict minimum compatible avec les objectifs scientifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus.
Remplacement
La nature de ce projet, qui modélise une pathologie neurologique complexe afin d’étudier les interactions entre neurobiologie et altérations comportementales, nécessite l’utilisation d’un organisme entier. Les phénomènes étudiés (comportements émotionnels, régulations neurobiologiques) résultent d’interactions dynamiques entre différents organes et réseaux neuronaux, impossibles à reproduire de manière pertinente sur des modèles in vitro, ex vivo ou in silico. Le recours à la souris s’impose comme le modèle mammifère le plus approprié en raison de la richesse des outils génétiques (permettant d’induire la maladie d’Alzheimer dans ce projet).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé à l'aide d'outils statistiques. Pour chaque groupe expérimental, un effectif minimum de 15 souris est nécessaire afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter les différences attendues entre groupes, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Cette approche garantit que le nombre d’animaux est le plus faible possible pour atteindre les objectifs scientifiques tout en respectant les principes des 3R.
Raffinement
Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé et qualifié, dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en fratries dans des cages enrichies, avec des dômes en carton et des cotons pour la confection de nids. Nous contrôlerons quotidiennement et au cours des différentes expériences leur état général et l’absence de signes généraux de souffrance. Les souris seront habituées aux expérimentateurs par une période de handling (manipulation douce des souris) et un minimum de personnel interviendra pour chaque procédure. Des composés analgésiques et anesthésiques seront utilisés pour réaliser les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle pour ce projet pour plusieurs raisons : •Validité expérimentale : le modèlede souris utilisé permet de modéliser la maladie d’Alzheimer. Un grand nombre d’études permet une utilisation pertinente de ce modèle. •Disponibilité des tests comportementaux : les tests permettant d’évaluer les comportements émotionnels et cognitifs pertinents pour caractériser l’état comportemental associé à la maladie d’Alzheimer sont disponibles au laboratoire et standardisés pour cette espèce. •Expertise du personnel : les expérimentateurs du laboratoire possèdent une expérience confirmée dans l’utilisation de ces souris et de ces tests, ce qui permet de réaliser les manipulations de manière optimale tout en limitant le stress des animaux. Ainsi, la souris constitue le modèle mammifère le plus adapté pour répondre aux objectifs scientifiques du projet, en combinant validité scientifique, faisabilité technique et respect du bien-être animal.
(MODIFICATION) Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules stellaires hépatiques dans les maladies chroniques du foie dont les maladies stéatosiques du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Gavées à l'aide d'une sonde rigide après quatre heures de jeûne, puis saignées à la queue, 1 380 souris vont être utilisées dans ce projet sur la fibrose du foie, toutes tuées à l'issue. 1 320 subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont jusqu'à seize injections dans l'abdomen à raison de deux par semaine pour déclencher la fibrose, et jusqu'à trente-deux semaines d'un régime gras et sucré qui les alourdit au point de gêner leurs déplacements. Soixante autres sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil pour une perfusion du foie. Le porteur signale que le gavage peut envoyer le liquide dans la trachée ou les poumons et provoquer une détresse respiratoire, et retient dix animaux par groupe au motif que ce nombre est "communément admis" dans les publications du domaine.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’à la fibrose/cirrhose puis au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, les traitements pharmacologiques restent très limités et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, et également à la surface des cellules stellaires hépatiques qui jouent un rôle clé dans la mise en place de la fibrose. La fibrose hépatique résulte d'une réponse de cicatrisation à une lésion hépatique chronique due aux hépatites virales, à l'alcool ou encore aux maladies hépatiques non alcooliques (maladies concernées dans cette DAP). Ce sont les cellules stellaires hépatiques qui sont les cellules majoritairement responsables de la production du tissu cicatriciel (production excessive de collagène). Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de cette protéine est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas cette protéine, et soumis à des régimes alimentaires ou des agents chimiques favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la validation in vivo du rôle d’une protéine à la surface des cellules qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans un contexte de maladie stéatosique du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.
Procédures
Dans la procédure 1 : Pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris seront mises à jeun pendant 4h puis recevront des solutions aqueuses par gavage à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge suivi de 2 prélèvements sanguins à la veine de la queue. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées et le sang sera alors prélevé au niveau de la veine de la queue. Enfin à la fin du régime, un dernier prélèvement sanguin sera effectué. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Un à deux prélèvements sanguins à la veine de la queue seront effectués (en milieu et en fin de traitement avec l’agent chimique. AJOUT : Dans la procédure 3 : les souris non traitées, obèses ou traitées avec l’agent chimique induisant de la fibrose hépatique recevront une injection sous cutanée suivie d'une injection intra-péritonéale afin de réaliser l'analgésie et l'anesthésie avant de réaliser la perfusion de foie.
Impact sur les animaux
Dans la procédure 1 : pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris prendront du poids pouvant occasionner une gêne pour se déplacer. Lors des gavages des solutions aqueuses à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge, l’introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées. À la suite de ces injections une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pouvant entraîner une inflammation au niveau des sites d’injection. AJOUT : Dans la procédure 3 : les souris non traitées, obèses ou traitées avec l’agent chimique induisant de la fibrose hépatique recevront une injection sous cutanée suivie d'une injection intra-péritonéale afin de réaliser l'analgésie et l'anesthésie avant de réaliser la perfusion de foie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées 3 fois au maximum pour atteindre la significativité statistique.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) pour chacune nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter leur sévérité. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances lors des pesées et/ou injections bi-hebdomadaires nous permettront de repérer précocement l’apparition de points limites qui imposent une action pour soulager l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles et femelles), la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles et femelles), le traitement chimique induisant de la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. AJOUT : Pour la procédure 3 (souris mâles et femelles), l'isolation des cellules après perfusion de foie sera effectuée à partir de 8-10 semaines d’âge lorsque le poids des souris se stabilise (pour les souris non traitées) ou après la fin des traitements (régime riche en graisses et traitement chimique induisant de la fibrose hépatique).