Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de la régulation du pH cérébral par le flux sanguin dans un contexte sain et pathologique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à quinze séances d'imagerie de trois heures par animal, précédées pour une partie d'entre eux de deux chirurgies de quarante-cinq minutes et d'une heure : 548 souris vont être utilisées, dont 404 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur inclut dans son calcul d'effectif environ 20 % de mortalité par groupe. L'objet est de comprendre comment le flux sanguin cérébral évacue le CO2 et régule le pH du cerveau, chez des souris saines, vieillissantes, puis porteuses d'une angiopathie amyloïde, avec un prolongement vers la rétine pour tester si l'œil pourrait servir de fenêtre de diagnostic. Les souris du modèle pathologique sont utilisées entre six et dix-huit mois, âge auquel les plaques amyloïdes sont installées, et leur état en fin de procédure, avec une implantation crânienne lourde, exclut selon le porteur tout replacement.
Objectifs
L’objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle du flux sanguin dans la régulation du pH et du CO2 cérébral dans un contexte sain et pathologique. Le CO2 est un déchet métabolique produit par l’activité cellulaire. Il doit être éliminé du cerveau via la circulation sanguine pour préserver l’homéostasie du pH tissulaire, car une accumulation de CO2 conduit à une acidose, qui perturbe le fonctionnement neuronal. Le CO2 est donc un régulateur majeur du débit sanguin cérébral. Toutefois, la façon dont le CO2 est échangé à travers la paroi des différents types de vaisseaux du cerveau et le rôle des cellules de l’unité neurovasculaire dans cette régulation demeurent non élucidé car les techniques pour étudier ces phénomènes manquaient jusqu’à présent. De récents travaux ont permis de développer des biosenseurs ou colorants fluorescents sensibles au pH ainsi que des approches méthodologiques pour étudier le rôle de la vascularisation cérébrale dans l’élimination du CO2. Ce phénomène sera étudié chez des souris saines, au cours du vieillissement, et dans un modèle murin d’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), une pathologie cérébrovasculaire fréquemment observée chez les individus atteints de la maladie d’Alzheimer, qui se caractérise par une accumulation de plaques amyloïdes au niveau des vaisseaux du cerveau. En effet, il semblerait que la régulation du pH cérébral soit altérée dans la maladie d’Alzheimer et l’AAC pourrait en être une des causes en perturbant l’intégrité et la fonction vasculaire. Les astrocytes sont des cellules de l’unité neurovasculaire impliquées dans la régulation du pH cérébral. Nous étudierons leur rôle dans la régulation des échanges de CO2 et de pH à travers la barrière hémato-encéphalique en modulant de manière génétique (souris transgéniques spécifiques) ou pharmacologique des transporteurs ou canaux de ces cellules impliqués dans le transport d’ions. Finalement, les résultats obtenus dans le cerveau seront également étendus à la rétine afin de vérifier si l’imagerie de l’œil pourrait être utilisé comme biomarqueur des pathologies cérébrovasculaires.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pourraient avoir un impact majeur sur la compréhension de la neurophysiologie et la neuropathologie. Il est en effet fondamental de caractériser comment le cerveau régule son pH tissulaire, élimine le CO2 et réagit aux changements de pH et de CO2, et quelle est la contribution du flux sanguin cérébral et des astrocytes dans ce phénomène d’homéostasie. Cette caractérisation permettra ensuite de mieux comprendre les processus neuropathologiques des maladies cérébrovasculaires, plus particulièrement de l’angiopathie amyloïde vasculaire qui touchent les petites artères cérébrales par l’accumulation de dépôts de protéines. Enfin, les résultats sont concluants, ils pourraient mettre en lumière un nouveau biomarqueur pour ces pathologies qui pourraient être évaluées de manière non invasive avec l’imagerie rétinienne.
Procédures
Une partie des animaux recevra un traitement par injection (sans anesthésie) durant 3 jours consécutifs durant moins d’une minute. Une partie des animaux sera soumis à deux interventions chirurgicales (d’environ 45 minutes et 1 heure) à 5 jours d’intervalle minimum, sous anesthésiesie générale et analgésie. Tous les animaux seront observés au microscope biphotonique ou en imagerie ultrasonore sous anesthésiesie ou sous sédation durant 3 heures maximum ou éveillé durant 1 heure maximum et ce, au total 15 fois maximum durant le projet, toute imagerie et tout état confondu. Une partie des animaux recevra une injection de colorant (sans anesthésie) la veille de l’expérience d’imagerie durant moins d’une minute (une fois toutes les deux semaines maximum). Une partie des animaux pourra recevoir une injection de colorant juste avant l’imagerie, sous anesthésie durant moins de 10 minutes, maximum 4 fois, avec un intervalle de minimum 1 mois entre chaque injection. Durant les expériences d’imagerie, les animaux pourront recevoir une injection unique (durant moins d’une minute) ou une perfusion lente de colorants ou agent de contraste (durant le temps de l’expérience soit au maximum 3 heures), sous anesthésie. Les animaux observés éveillés suivront au préalable une habituation de deux semaines au poste d’imagerie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront régulièrement manipulés par les expérimentateurs, ce qui pourra provoquer un stress. Les animaux recevront des injections pouvant provoquer un stress et une légère douleur chez l'animal éveillé au moment de l’introduction de l’aiguille. Les expériences d’imagerie de la rétine peuvent dans des cas très rares causer une lésion oculaire. Certaines injections pourront provoquer une douleur locale et transitoire au site d’injection et dans de rares cas des lésions locales. Les animaux sont exposés à un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie ou d’hypoventilation durant les expérimentations sous anesthésie ou sédation. Une partie des animaux subiront des procédures chirurgicales, sous anesthésie générale, qui peuvent provoquer une douleur transitoire et une perte de poids les 3 jours suivants. Les animaux pourront être observés éveillés sous le microscope après une période d’habituation qui peut être stressante au début de l’apprentissage. Une partie des animaux recevra une perfusion de colorant (sous anesthésie ou sous sédation), durant l’expérience d’imagerie, ce qui peut provoquer parfois provoquer une douleur et un saignement transitoire.
Devenir
La condition des animaux en fin de procédure (âgés et avec une implantation chirurgicale importante) ne nous permettant pas de procéder à un replacement, ces derniers seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire. Le cerveau sera prélevé post-mortem sur 100 animaux pour des analyses histochimiques complémentaires.
Remplacement
Notre étude porte sur l’étude du cerveau, un organe très complexe, composé de nombreux types cellulaires, encore mal connu, et dont il n’existe pour le moment aucun modèle de remplacement fiable et pertinent pour répondre à notre question précise, qui est la régulation du pH cérébral. Par ailleurs nous étudions le flux sanguin cérébral, qui est absent dans tous les modèles in vitro et ex vivo. Finalement, notre étude de neurophysiologie nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme entier afin de préserver la communication entre les différents organes et le système cardio-respiratoire (cerveau, cœur, poumons, …).
Réduction
Pour ce projet, nous utiliserons 548 animaux. Nous avons réduit le nombre d'animaux au maximum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes d'après nos expériences passées sur ces modèles et en prenant en compte une certaine marge d’erreur inhérente aux aléas expérimentaux, dont environ 20% de mortalité par groupe Notre expertise d’imagerie fonctionnelle in vivo a un avantage considérable : elle permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos études car nous réalisons nos expériences d’imagerie sur des animaux vivants et en bonne condition physiologique. Nous pouvons ainsi réutiliser le même animal plusieurs fois au cours de l’étude. Aussi, nous pouvons étudier le cerveau et la rétine au sein du même animal, ce qui permet non seulement de réduire le nombre d’animaux, mais aussi d’augmenter considérablement la puissance statistique (analyses pairées) de nos observations et de nos corrélations en analysant des données de ces deux organes différents au sein du même animal.
Raffinement
Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec divers enrichissements (bâtons en bois à ronger, cotons pour nidation, et igloo et roue), avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure du bien-être animal (SBEA) pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. Durant les procédures, les animaux bénéficieront d’anesthésie ou sédation et d’analgésie adaptée à chaque acte réalisé. Durant l’anesthésie et la sédation, un gel ophtalmique est déposé sur les yeux, un suivi de température est réalisé et l’animal reçoit un apport d’air oxygéné. La chirurgie sera effectuée en condition stérile, sous anesthésie générale, analgésie et anti-inflammatoire ainsi que des anesthésies locales adaptés. Après la chirurgie et l’imagerie, les animaux recevront un antidote de l’anesthésique pour leur permettre de retrouver rapidement leurs capacités physiologiques et seront placés dans une cage de réveil chauffée et oxygénée jusqu’à leur réveil complet. Ils recevront une gelée nutritive après la chirurgie et un suivi postopératoire méticuleux de 3 jours avec pesée quotidienne sera mis en place. Les animaux observés éveillés suivront avant toute expérience un protocole d’habituation au poste d’imagerie et à l’expérimentateur pour diminuer le stress lié à cette procédure.
Choix des espèces
La souris est une espèce de mammifère dont la génétique et la physiologie est relativement proche de l’Homme, et chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Pour étudier l’impact de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser des animaux âgés, chez lesquels la pathologie amyloïde est bien installée. Aussi, pour la lignée transgénique pathologique et les contrôles, nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 18 mois afin de suivre l’évolution de la maladie dans le cerveau et la rétine et d’analyser les paramètres physiologiques à différents stades de la maladie (stade précoce, modéré et avancé). Pour les autres lignées, les souris seront utilisées à l’âge adulte, soit entre 2 mois et 12 mois maximum, car il est nécessaire d’observer des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.
Validation d’implants neuronaux, neurophysiologie, comportement et neuroanatomie fonctionnelle cérébrale de la vocalisation chez le mini-porc
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Vingt-cinq des 60 mini-porcs de ce projet sont destinés à l'adoption, parfois avec des morceaux d'implants laissés au contact de leur cortex parce que les retirer mettrait leur vie en danger. Vingt-sept autres sont tués pour que soit examinée la réaction de leur cerveau aux électrodes, et huit sont opérés puis stimulés sous anesthésie sans être réveillés. Les animaux gardés vivants subissent jusqu'à dix anesthésies en vingt-quatre mois, des séances d'IRM d'une à deux heures, une chirurgie d'implantation crânienne suivie d'un isolement d'au moins vingt-quatre heures, et portent un capot fixé sur la tête, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente le mini-porc comme une "alternative éthique aux Primates Non Humains" et retient son cerveau parce qu'il bouge beaucoup, ce qui permet de tester la stabilité d'implants destinés à des personnes privées de parole.
Objectifs
Cinq millions de personnes dans le monde ont un déficit sévère de la parole suite à des traumatismes, lésions vasculaires, ou des maladies neurodégénératives. L’objectif des interfaces cerveau-machine pour la parole (BCI parole), est de permettre à certaines personnes de communiquer à nouveau grâce au contrôle d’une synthèse vocal à partir de leur activité cérébrale enregistrée à l’aide d’implants cérébraux. Afin d'optimiser les BCIs parole, ce projet vise à comprendre la dynamique cérébrale de la production de vocalisations et à valider de nouveaux implants corticaux capables d’enregistrer et de stimuler de façon stable et précise l’activité cérébrale sur le long terme avant leur utilisation chez l’homme. Le premier objectif est l’étude des bases corticales de la vocalisation chez le miniporc. Les BCIs parole chez l’homme utilisent des algorithmes nécessitant l’identification de caractéristiques pertinentes des signaux cérébraux liés à la production vocale et des zones cérébrales impliquées. Des implants à haute densité couvrant de manière extensive le cortex permettront de préciser finement la dynamique spatio-temporelles corticale spécifique du contrôle volontaire de vocalisations chez le miniporc libre de ses mouvements et en interaction avec ses congénères. Ces données serviront de références pour le décodage de la parole chez l’homme. Des méthodes d’imagerie préciseront les voies anatomo-fonctionnelles impliquées. Le second objectif est de valider sur plusieurs mois la performance d’enregistrement/stimulation et la biocompatibilité de nouveaux implants cérébraux. Après validation in-vitro et chez le rat, des tests chez le miniporc viseront à déterminer leur performance et leur acceptabilité par le tissu cérébral dans une situation proche de l’homme. Contrairement au rat, le porc est très sensible aux infections, permettant de valider l’efficacité et la compatibilité des protocoles de stérilisation. De plus, la taille du cerveau permet de valider des dispositifs similaires à ceux qui seront utilisés chez l’humain. Enfin, les mouvements importants du cerveau de miniporc permettront de valider la stabilité des implants.
Bénéfices attendus
À court terme, cette étude servira à vérifier que les nouveaux types d’électrodes implantées dans le cerveau n’occasionnent pas de lésions ou d’effets indésirables, garantissant ainsi la sécurité et la tolérance des dispositifs implantés chez l’homme. Elle apportera également des connaissances nouvelles sur le cerveau du miniporc, dont la structure reste encore mal connue. Elle permettra enfin d’observer comment ces animaux communiquent et interagissent entre eux à travers leurs vocalisations et comportements sociaux. À long terme, ce projet de recherche s’inscrit dans un projet plus vaste destinés à développer des interfaces cerveau-machine pour redonner la capacité de communication à des personnes présentant un déficit sévère de la parole. Pour y parvenir, il est essentiel de mieux comprendre comment le cerveau produit la parole et d’identifier les zones précises impliquées dans ce processus. Cela permettra de savoir où placer les électrodes afin d’enregistrer les signaux électriques liés à la production de sons et de mots. Des premiers résultats préliminaires ont déjà montré que certaines régions du cerveau activées lors de vocalisations chez le miniporc sont similaires à celles activées lors de la production de la parole chez l’humain, ce qui rend le miniporc particulièrement intéressant comme modèle d’étude.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Avant la chirurgie, des séances d’imagerie IRM (environ 1 à 2h) et scanner (environ 30 minutes en plus du transport) seront réalisées sous anesthésie après injection. Pour le transport entre la zone d’hébergement (stabulation) et le service d’imagerie, les animaux seront anesthésiés par injection. La chirurgie d’implantation sera effectuée sous anesthésie gazeuse ou fixe. L’induction sera réalisée par 2 injections préalables d’anesthésiques, les animaux seront ensuite intubés ou maintenus au masque. Une perfusion sera également mise en place. Des traitements antalgiques et analgésiques seront administrés pendant la chirurgie ainsi qu’en période post-opératoire pendant une semaine. Après l’opération, si certains soins nécessitent une immobilité totale, des anesthésies de courte durée (2 heures) pourront être réalisées par injection. Les animaux subiront au maximum 10 anesthésies pour l’ensemble des procédures sur 24 mois. Des substances fluorescentes seront également injectées chez 4 mini-porcs. Pendant les anesthésie, des stimulations pourront être délivrées au niveau du cortex pour localiser les zones impliquées dans le contrôle des muscles impliqués lors des vocalisations.
Impact sur les animaux
Nuisances associées : - au transport : les animaux seront transportés dans des véhicules réglementaires pour les IRM et scanner. La durée de chaque transport n’excèdera pas 30 minutes. - à la chirurgie d’implantation : o hypothermie, douleurs si l’anesthésie et l’analgésie sont mal dosées pendant la chirurgie et les stimulations électriques o des douleurs, un inconfort du fait de la présence d’un capot sur leur tête, un risque d’infection au niveau de la zone d’implantation pendant quelques jours après la chirurgie. o l’isolement physique de l’animal durant environ 24h pourra également générer un stress après l’intervention chirurgicale - Au rejet ou un mauvais positionnement des implants
Devenir
Nous ferons en sorte que le maximum d’animaux puisse bénéficier d’une adoption (notamment lorsqu’un animal sera utilisé seulement pour évaluer la performance et la longévité des implants et non leur biocompatibilité). En pratique nous estimons que cela concernera au maxium 25 animaux sur les 60 prévus dans l’étude. Avant adoption, les connecteurs des implants seront retirés, ainsi que la chambre de protection et le ciment de fixation. Il est possible que certaines parties des implants (zones des électrodes au contact du cortex) ne puissent pas être retirées sans mettre en danger la vie de l’animal ou nécessiter une chirurgie lourde. Dans ce cas, nous chercherons à faire adopter l’animal avec les résidus d’implants non retirés si ceux-ci ne risquent pas de mettre en danger sa santé, et ce une fois que la peau recouvrant le crâne aura cicatrisé (environ 3 semaines). En général les animaux seront adoptés à un âge allant de 12 à 24 mois. Une partie importante de l’étude concerne la biocompatibilité des implants. Afin d’étudier la structure du cerveau de cochons qui ont été implantés de façon chronique ainsi que le comportement des implants, ces animaux devront donc être mis à mort (soit 27 animaux). 8 animaux serviront à des études de stimulation électrique sous anesthésie. Ces animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie.
Remplacement
Avant tout test chez l’animal, les performances des implants seront d’abord évaluées in vitro dans des solutions tampon. Cela permettra de vérifier les propriétés électriques et électrochimiques des électrodes afin d’en optimiser le mode de fabrication. Une fois leur fabrication optimisée, des dispositifs seront alors testés chez l’animal pour évaluer leur performance in vivo dans le temps. Ce projet trouve 3 justifications à l’utilisation d’animaux : 1) Tester de nouveaux types d’implants avant leur utilisation chez l’homme nécessite une validation préclinique in-vivo. 2) L’étude des bases corticales de la vocalisation chez le miniporc est un sujet complètement inexploré et présente donc par lui-même un intérêt de recherche fondamentale important. 3) Les « BCIs parole » chez l’homme utilisent des algorithmes décodant les signaux corticaux afin de prédire la parole produite. Analyser ces signaux directement chez l’homme est possible chez des patients implantés pour des raisons médicales (épilepsie) mais le nombre et l’étendue de la couverture corticale des implants n’est pas contrôlable. Ici nous préciserons finement cette dynamique en couvrant de manière extensive le cortex avec plusieurs implants dans des zones spécifiques afin d’identifier les meilleurs signaux pertinents au décodage des vocalisations, ce qui pourra s’étendre au décodage de la parole chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux utilisés à chaque étape permettra d’obtenir des résultats utiles et reproductibles. Afin de réduire le nombre d’animaux, le même animal sera utilisé pour plusieurs protocoles à chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Durant leur séjour à l’animalerie, tout sera mis en œuvre pour que les animaux préservent au maximum une interaction sociale afin de diminuer leur stress. Pour tous les mini-porcs, une période d’acclimatation, essentielle pour réduire le stress lié au transport et à l’introduction dans un nouvel environnement, et ainsi améliorer leur bien-être durera au minimum 2 semaines. Au cours de cette période, les animaux seront habitués au personnel et aux routines et préparés aux procédures expérimentales en utilisant des jeux et un renforcement positif. Toutefois, après la chirurgie d’implantation, les animaux devront être isolés au moins 24h. Pour améliorer leur bien-être, ils cohabiteront dans la même pièce que leurs congénères mais dans un box différent avec des séparations transparentes ; cela leur permettra quand même d’interagir visuellement et auditivement quand ils sont séparés. Des jeux et/ou animations seront mis à disposition des animaux afin de leur créer un milieu enrichi (ballons, sons, etc.). Pour le bien-être des animaux, un traitement post-opératoire (antibiothérapie et antalgiques / analgésiques) sera administré systématiquement. Les animaux seront observés quotidiennement ou plus fréquemment si apparition de signes cliniques. Des points limites spécifiques découlant de l’utilisation d’une grille de scoring et d’un arbre décisionnel ont été définis afin d’éviter toute souffrance inutile. Pour la réalisation des examens d’imagerie, les animaux seront anesthésiés. Ils seront transportés dans un véhicule climatisé, à l’intérieur de cages de transport adaptées et conformes aux autorisations sanitaires en vigueur. L’anesthésie sera maintenue en continu depuis le départ de l’animalerie jusqu’au retour.
Choix des espèces
Outre son alternative éthique aux Primates Non Humains, le modèle porcin est beaucoup plus pertinent que le rat pour plusieurs raisons 1) Le mini-porc produit un nombre important de vocalisations différentes de manière spontanée, ce qui permettra de faciliter l’étude des zones corticales de la vocalisation. Par ailleurs, le porc est un animal social permettant d’étudier ces activités lorsque plusieurs animaux interagissent. 2) Le mini-porc est pertinent pour évaluer la biocompatibilité des implants et leur capacité à enregistrer l’activité neuronale et la stimuler électriquement de manière stable sur le long terme. Le miniporc est plus pertinent que le modèle rat car son cerveau est plus grand permettant de valider des dispositifs semblables à ceux qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Par ailleurs, le cerveau de miniporc produit des mouvements importants, sources principales de l’instabilité des signaux chez l’homme et des contraintes d’implantation. Enfin, il présente les mêmes contraintes en termes d’asepsie, de stérilité et de chirurgie que pour l’homme. La chirurgie sera effectuée préférentiellement sur des animaux âgés de 3 à 6 mois à cause de contraintes anatomiques empêchant une implantation à des stades plus tardifs.
Étude d’un gène, facteur de protection de la maladie d’Alzheimer, chez la souris EU2/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
226 souris vont être utilisées, dont 202 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, les reproductrices et reproducteurs âgés étant réformés et tués eux aussi. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, puis une injection dans le cerveau sous anesthésie, dont le porteur écrit qu'elle provoque une douleur aiguë "modérée à sévère" liée à l'incision, au forage et à l'inflammation locale, alors qu'aucune procédure du projet n'est déclarée sévère. À sept et dix mois, les animaux passent un test de reconnaissance d'objet et un test de mémoire en labyrinthe, les mâles le matin pour que la présence des femelles ne biaise pas les résultats. L'objet est de tester si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de la protéine Tau, et le porteur compte parmi ses mesures de réduction le fait que la lignée soit déjà disponible sur place.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.
Procédures
Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau
Réduction
Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.
Choix des espèces
Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.
Etude préclinique des déficits fonctionnels et de l’inflammation cérébrale dans différents modèles de traumatismes crâniens et dans une pathologie neurovasculaire associée : l’accident vasculaire cérébral (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un traumatisme crânien de quarante-cinq minutes, pour une partie des animaux suivi d'une ischémie cérébrale d'une heure trente, puis des séances d'IRM à sept jours, vingt et un jours, deux mois et trois mois : 760 souris vont être utilisées, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées par une chirurgie sans réveil qui permet le prélèvement des organes. Le porteur affirme que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Il annonce quatre tests comportementaux, en donne les durées à la seconde près, et ne dit pas lesquels.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un trouble neurologique majeur à l’échelle mondiale, encore mal pris en charge sur le plan clinique. Ils sont divisés en trois catégories selon leur gravité : léger, modéré et grave. Le TC induit une lésion émise par le choc initial qui peut provoquer ischémies et hémorragies, un dysfonctionnement immunitaire, une rupture de la barrière hémato-encéphalique ou encore une coagulopathie. Suite à un TC, une coagulation anormale est fréquemment observée chez les personnes touchées, menant à une aggravation des symptômes et du pronostic lors de la survenue de coagulopathies et pathologies neurovasculaires tel que l’accident vasculaire cérébral (AVC). Ce projet permettra d’étudier les déficits fonctionnels et inflammatoires dans différents modèles de TC chez un modèle murin et d’explorer a posteriori les modulations physiologiques potentielles qu’ils entraînent. Dans un second temps, cette étude se focalisera sur la caractérisation de l’inflammation cérébrale et des déficits fonctionnels chroniques sur des souris touchées par un AVC ischémique après un TC afin d'en analyser les mécanismes sous-jacents. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU).
Bénéfices attendus
Cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et des accidents vasculaires cérébraux qui peuvent en découler, et présentent un potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de possibles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Traumatisme crânien (45 minutes), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes ; 5 fois 15 minutes (deux tests joints) ; 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique et moléculaire (7 jours, 21 jours, 2 mois, 3 mois post-TC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. - Traumatisme crânien (45 minutes), modèle d’ischémie cérébrale (1h30), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes, 5 fois 90 minutes, 3 fois 15 minutes, 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’un traitement et/ou agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique (24h pré-AVC ; 8 minutes) et moléculaire (24h, 7 jours post-AVC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. L'ensemble des procédures chirurgicales, d'anesthésie et d'imagerie seront effectuées dans l'EU 1/2, et les tests comportementaux dans l'EU 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage et n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et des points limites ont été établis pour permettre un arrêt de protocole si nécessaire. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation, réactivité et comportement de l'animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l’intervention, les 48h après chirurgie étant les plus critiques pour l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.
Impact de l’inactivation d’un isoforme de PI3K sur les propriétés anti-thrombotique et anti-inflammatoire de l’endothelium -MODIFICATION2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectées la veille, anesthésiées profondément le lendemain, puis maintenues sous anesthésie quatre à sept heures pendant que leurs vaisseaux sanguins sont observés, une partie des 178 souris de ce projet porte une forme inactivée d'une protéine de la coagulation. D'autres subissent la ligature d'un vaisseau sanguin abdominal au cours d'une chirurgie de quarante minutes, d'autres encore une injection déclenchant une inflammation généralisée. 54 relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 124 d'un niveau modéré, le porteur signalant des risques de saignement important, de réveil difficile et de paralysie transitoire des pattes arrière. Toutes sont tuées, par excès d'anesthésique ou dans les quarante-huit heures suivant la chirurgie, le porteur indiquant qu'elles ne pourraient pas survivre à ces interventions.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt sur les propriétés antithrombotique (inhibant la formation de caillot ou amas plaquettaires) et anti-inflammatoire des vaisseaux sanguins autres que ceux du cerveau. L’inhibition d’une protéine d'intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité des vaisseaux dans le contexte de l'accident vasculaire cérébral. L’inhibition d’une protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme agissant sur la conservation d’un état protecteur des vaisseaux sanguins. En effet au niveau cérébral le sang contenu dans les vaisseaux n’est pas capable de s’en échapper et les amas de plaquettes sont plus petit chez ses animaux. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire des vaisseaux et sur les amas de plaquettes en temps reel. L’impact de cette molécule d’intérêt sera évalué grâce à des souris génétiquement modifiées et en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.
Bénéfices attendus
Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également le développement et la solidité du thrombus (amas plaquettaire) ainsi que sa capacité à emboliser (à se détacher du vaisseau). Ces amas plaquettaires circulants sont critiques car ils sont à l’origine des obturations des vaisseaux cérébraux ou pulmonaire.Mieux comprendre l’impact de cette molécule est indispensable pour clarifier les mécanismes impliqués dans la thrombose et pour évaluer son potentiel en tant que cible thérapeutique. Cette étape est également cruciale pour envisager, à terme, le développement de molécules inhibitrices spécifiques.
Procédures
Trois types d’interventions sont réalisées sur des lots différents d’animaux : 1-Une injection intraveineuse la veille de l'expérimentation sera réalisée sur certains lots. L’intervention dure moins de 5 minutes dans EU1. Dans EU 2 Le lendemain Les animaux sont, sous anesthésie profonde, préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins, afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. 2- Dans EU2 Des lots différents sont exposés à un prélèvement sanguin sous anesthésie (5 minutes), à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés. 3- DAns EU2 Les derniers lots d'animaux sont soumis à une inflammation généralisée par une injection intrapéritonéale. 24h après cette induction les animaux sont anesthésiés et préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins et la réponse inflammatoire grâce à la mobilité des globules blancs. Ces animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et euthanasié après une heure d'expérimentation.
Impact sur les animaux
Les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intérêt sont viables et ne présentent aucun défaut morphologique apparent ni de reproduction. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum7 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique. Concernant les procédures sévères : Lors de ces interventions, certains effets indésirables peuvent survenir. Par exemple, l’anesthésie peut parfois perturber la respiration des souris, la rendant irrégulière ou provoquant de courtes pauses. Il existe aussi un risque de saignement important au moment de l’intervention, notamment lorsqu’on sépare certains gros vaisseaux sanguins. Après l’opération, certaines souris peuvent avoir du mal à se réveiller ou ressentir de la douleur à l’endroit où l’incision a été faite. Dans certains cas, une faiblesse ou une paralysie transitoire des pattes arrière peut apparaître. L’induction du sepsis va entrainer une inflammation généralisée chez les souris. L’inflammation sera étudiée à 24h post induction puis les souris seront euthanasiées par excès d’anesthésique.
Devenir
Les procédures utilisées étant invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures car ils ne pourraient pas survivre aux interventions.
Remplacement
Le recours à l’espèce souris est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes et la nature des différentes cellules misent en jeu ne sont pas modélisables par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.
Réduction
Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas le lot en entier. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucune différence n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, nous ne réaliserons pas les expériences avec les molécules inhibitrices.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture à volonté. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçus par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant si un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié. Pour les procédures necessitant un suivi: les souris reçoivent un traitement antidouleur régulier, des aliments enrichis en analgésiques sont mis à leur disposition, et leur état est évalué quotidiennement. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle souris est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus (amas plaquettaire) et le développement d'une inflammation dans les souris est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Nos collaborateurs ont établi une lignée de souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt qui nous permet d’étudier spécifiquement son impact sur la thrombose et l’inflammation. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures
Pathologie hépatique et infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Dix semaines de régime gras, puis un infarctus provoqué par une chirurgie de trente minutes : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur. S'y ajoutent une échocardiographie et des injections répétées, toutes les quarante-huit heures pendant dix jours ou trois fois par semaine pendant deux semaines. L'objet est de comprendre comment une maladie du foie gras aggrave la réparation du cœur après un infarctus, sur des lignées modifiées pour porter l'atteinte hépatique. Parmi les nuisances attendues, le porteur ne mentionne que l'inconfort de la contention, le stress de l'anesthésie et des douleurs post-opératoires transitoires, sans un mot sur ce que représente l'infarctus lui-même pour l'animal.
Objectifs
La maladie du foie gras, qui touche plus de 127 millions d'Européens, est fortement liée à un risque accru de complications cardiovasculaires, notamment l'infarctus du myocarde. Les décès chez les patients atteints sont d'ailleurs plus souvent d'origine cardio-vasculaire qu'hépatique. Le remodelage cardiaque est un déterminant essentiel du résultat clinique après un infarctus du myocarde impliquant des réponses biologiques complexes, notamment un engagement du système immunitaire. Cependant, le rôle causal précis de l'atteinte hépatique sur la réparation cardiaque reste non établi. Le projet a donc pour but de caractériser les effets de différents types d'atteintes tissulaires qui caractérisent la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque aux niveaux cellulaires et moléculaires, avec un accent particulier sur la réponse inflammatoire. Une approche thérapeutique sera testée pour limiter les dommages cardiaques délétères observés. Les objectifs de ce projet sont : 1. Caractériser les effets de la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde chez la souris. 2. Étudier l’impact sur la réponse immunitaire, par l’analyse dans le sang, la rate, la moelle osseuse et enfin dans le coeur. 3. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’atteinte cardiaque exacerbée associée à l'atteinte hépatique. 4. Etudier la contribution directe d'un type de cellules inflammatoires délétères: les neutrophiles.
Bénéfices attendus
À terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de communication cellulaire qui contrôlent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde, ainsi que le rôle de l’atteinte hépatique dans le contrôle de l’homéostasie du cœur défaillant. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du cœur infarci, prévenir ou freiner les atteintes cardiaques, et ainsi améliorer la survie des patients.
Procédures
Exposition diète riche en matières grasses - durée 10 semaines //chirurgie - durée 30 minutes // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // Injection - durée 1 minute, soit chaque 48h pendant 10 jours posterieures a la chirurgie, soit 3 fois par semaine durant 2 semaines postérieures à la chirurgie.
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires.
Devenir
À la fin de nos procédures, les animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Ces modèles d’animaux sont une étape indispensable pour étudier le dialogue pathogénique complexe entre le cœur et le foie, un phénomène qui implique de multiples types cellulaires et ne pourrait pas être entièrement reproduit par de simples modèles cellulaires. Le choix de modèles animaux qui permettent de modifier spécifiquement le foie repose sur des données préalablement observées, garantissant que les modèles reproduisent fidèlement les atteintes hépatiques souhaitées. De plus, l'utilisation de ces modèles pré-cliniques est un préalable nécessaire à la validation de toute stratégie thérapeutique future visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'un infarctus du myocarde dans un contexte de maladie du foie gras.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle préclinique privilégié pour l'étude de la relation entre la stéatose hépatique et les maladies cardiovasculaires, en particulier après un infarctus du myocarde. Ce modèle est idéal pour plusieurs raisons : 1. génétique et mécanismes : Il permet de générer les lignées génétiquement modifiées nécessaires pour induire spécifiquement l'atteinte hépatique. Ceci est crucial pour décortiquer les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires du dialogue cœur-foie. 2. reproductibilité et rurveillance : L'utilisation de la souris garantit une homogénéité et une robustesse des résultats expérimentaux. De plus, elle offre la possibilité de surveiller l'évolution des complications cardiaques et vasculaires associées à la maladie du foie dans un délai de temps pertinent. 3. complexité biologique : Contrairement aux modèles in vitro, la souris permet d'étudier l'intégralité des interactions inter-organes (cœur et foie) impliquées dans le remodelage cardiaque post-infarctus. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 10 semaines minimum. Ce choix est fait pour s'assurer que le système cardiovasculaire est arrivé à maturité. Utiliser des souris plus jeunes risquerait d'introduire un biais, car elles n'auraient pas systématiquement atteint la puberté, et les hormones sexuelles sont connues pour jouer un rôle dans le remodelage cardiaque post-infarctus.
Appétit hédonique : dimorphisme sexuel et rôle du microbiote chez la souris MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour comprendre pourquoi les souris mâles et femelles ne réagissent pas de la même façon à l'appauvrissement de leur microbiote intestinal, 1 032 souris vont être utilisées, dont 696 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Chacune peut recevoir cinquante-six injections sous-cutanées en quatre semaines, sept ponctions de la veine de la queue étalées sur deux heures et un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques destiné à vider son intestin de ses bactéries. Les mesures de prise alimentaire imposent un isolement qui peut durer quatre semaines. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids en une semaine sont mises à mort, et le porteur annonce des tests comportementaux adaptés à un modèle de dépression sans préciser lesquels.
Objectifs
L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que chez la souris, l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmentent la consommation d'aliments appétents tels qu'une solution de saccharose, des granulés de saccharose ou des aliments riches en lipides avec un effet potentiel du sexe. Dans cette étude, nous évaluerons l’effet de la déplétion du microbiote intestinal dans notre modèle sur les états émotionnels afin de comprendre les facteurs qui sous-tendent le dimorphisme sexuel observé ainsi que le rôle d'une hormone gastro-intestinale dans l’effet de la déplétion du microbiote intestinal sur la prise alimentaire hédonique.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal selon le sexe sur l’appétit hédonique et des mécanismes associés. Cette étude chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire par exemple ou chez l’Homme.
Procédures
Le test de tolérance au glucose sera mené sur des animaux vigiles, une seule fois par animal. Une administration intragastrique avec une solution de glucose sera réalisé. Cette intervention prendra de 10 à 15 secondes par animal. Sept prélèvements de sang au niveau de la queue seront réalisés par ponction de la veine caudale afin de recueillir une goutte de sang par prélèvement. La durée de l’intervention (contention, ponction, prélèvement) sera de 30 secondes par animal. Les prélèvements s’étaleront sur deux heures. Des administrations sous-cutanées bi-quotidiennes pendant 4 semaines seront réalisées sur des animaux vigiles, ce qui représente 56 injections par souris. L'injection prendra de 15 à 30 secondes par animal. Les mesures de prise alimentaire nécessitent un isolement des souris. Cet isolement pourra durer jusqu'à 4 semaines. Il n'excèdera pas 2 semaines pour la majorité des souris.
Impact sur les animaux
L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. Les tests de tolérance au glucose nécessitent une étape d'administration intragastrique et une ponction de sang au niveau de la veine caudale. Ces actions peuvent entraîner du stress ou de la douleur chez les souris. Les tests comportementaux adaptés au modèle de dépression peuvent être stressant pour les souris. Les autres interventions ne devraient pas entraîner d'autres souffrances ni d'angoisses.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus biologiques, indispensables pour mener les expérimentations en lien avec les questions de recherche du projet.
Remplacement
Cette étude comprenant des mesures neuro-comportementales ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature et des travaux antérieurs au sein de l’équipe. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de détecter des différences neurocomportementales ou de réponses physiologiques entre les groupes expérimentaux. La réalisation d’une expérience pilote permettra de choisir des doses d’agents pharmacologiques efficaces sur nos paramètres d’intérêt sur un nombre limité d’animaux afin de garantir le succès des procédures concernées. L’utilisation d’un plan d’étude croisé (administration consécutive des différentes doses du traitement au même sujet) permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l'expérience pilote.
Raffinement
Les souris seront logées en groupe de 4 par sexe, dans des cages enrichies offrant des zones où elles pourront se dissimuler. Un surenrichissement de la cage sera prévu lors des phases d'hébergement individuel (ajout de matériel de nidification supplémentaire et stimulant le comportement exploratoire). De même, les souris seront habituées à l'administration intragastrique et à la contention avant le test de tolérance au glucose. Les souris seront pesées régulièrement, et elles seront toutes observées chaque jour afin de prévenir la survenue d’un potentiel problème. Dès que nécessaire, des analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués, comme la perte de poids >20% du poids sur une semaine.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur des individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines à l’arrivage pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Rôle du microenvironnement dans le cancer et thérapies antitumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6 180 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à sept injections de cellules tumorales par semaine pendant deux semaines, 5 820 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 360 un niveau léger. S'y ajoutent des prélèvements sanguins hebdomadaires, des échographies de suivi tumoral et une biopsie de la queue à trois semaines. Le porteur écrit n'attendre aucune atteinte à la faim, à la peur, à la détresse ou à la douleur, puis énumère les poils hérissés, la perte de poids, la prostration et les difficultés respiratoires possibles. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure, le porteur indiquant qu'elles portent une pathologie chronique qui pèserait sur leur bien-être si elles restaient en vie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies tumorales. Malgré le succès de certains traitements, les tumeurs solides restent encore aujourd’hui très fréquentes et peu soignables, par exemple le cancer du pancréas. Ces pathologies ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de certaines pathologies et le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes biologiques du développement tumoral et plus particulièrement des mécanismes de résistance aux thérapies anti-tumorales (chimiothérapies, thérapies ciblées ou immunothérapies). Notre étude permettra de mieux comprendre les processus impliqués, dans le but de proposer des nouvelles cibles thérapeutiques visant à améliorer les traitements actuels des cancers à mauvais pronostics, comme le cancer du pancréas ou le cancer du sein agressif.
Procédures
Prélèvements sanguins : quelques secondes avec une semaine d’intervalles entre les prélèvements Injections de cellules tumorales: quelques secondes sur souris anesthésiée, 1x par souris, et 2-7x par semaine pendant la période analysée (max 14 jours) et 1x avant mise à mort sur souris anesthésiée. Biopsies de queue (
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu de nuisances ou effets indésirables des libertés individuelles de l’animal concernant la faim/soif, peur/détresse, stress physique/thermique, douleur/lésion/maladie, environnement (stabulation). Les actes et nuisances qui peuvent générer un inconfort léger et de courte durée sont les chirurgie (durée
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils ont une pathologie chronique qui peut avoir des répercussions sur leur bien-être si pas de mise à mort.
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction de certaines cellules avec leur microenvironnement qui infiltrent la tumeur. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui ont un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé après avis d’un biostatisticien avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, ou un modèle hiérarchique en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expérience le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Afin de limiter l’inconfort, nous pratiquerons des méthodes de raffinement en mettant en place des points limites spécifiques et précoces selon la procédure, chauffer les cages si besoin lors d’analgésie, renforcer l’enrichissement des cages, et assurer un traitement adéquat d’analgésie selon les procédures appliquées et points limites établis.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies tumorales car des modèles sont bien établis et récapitulent la pathologie chez l’homme. De plus, la souris comporte tous les composants du système immunitaire inné et acquis, qui jouent un rôle essentiel dans les processus de cancérisation et sont semblables dans les pathologies humaines, de ce fait ce sont des bons modèles pour notre étude. Les conditions d’expérimentation proposées sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants en soumettant les animaux au moins de souffrance possible. Les souris seront âgées de 6 à 40 semaines car nous étudierons ces pathologies chez le jeune adulte (après sevrage) et l’adulte
Utilisation de nouvelles nanoparticules dans deux modèles de cancer du pancréas chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Choisies pour leur immunité fortement réduite, qui facilite la prise de la tumeur greffée, 140 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, une injection intraveineuse de nanoparticules puis une séance d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Il s'agit d'une étude pilote, destinée à lever des verrous techniques avant un second dossier où le protocole thérapeutique sera détaillé. Le porteur qualifie la prise tumorale d'"indispensable" au projet et annonce, à la rubrique des bénéfices, une nanoparticule pour le traitement des glioblastomes, quand tout le reste du dossier porte sur le cancer du pancréas.
Objectifs
Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est : Hommes =environ 9% et Femmes = environ 10%. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lévera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement in fine de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des macrophages humains ou dans des cellules souches mésenchymateuses humaines qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisement, les NP particules utilisées seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour le projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement des glioblastomes. Cette partie courte nous aidera à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur en quantité suffisante pour une efficacité in vivo supplémentaire par activation par hyperthermie magnétique. Une deuxième étape sera ensuite réalisée, sur la base des résultats de l'étude pharmacocinétique/biodistribution pour planifier l'étude de l'efficacité thérapeutique, limitant les groupes expérimentaux.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions avec les durées moyenne - max : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales = 5-10 min /souris - injection IV molécule d'intérêt (véhicule, particule avec dose 1 ou dose 2 couplée aux macrophages ou cellules mesenchimateuse) = 10-15 min /souris - imagerie corps entier sous anesthésie gazeuse = 15-20 min / souris - mis à mort = 5-10 min / souris. Les souris suivront donc 1 intervention pour linoculation des tumeurs, 1 injection de la molécule et 1 imagerie suivie de la mise à mort.
Impact sur les animaux
D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Cette étude vise des tumeurs controlées et réduites. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des nanoparticules véhiculées dans les macrophages, cellules mesenchimateuses ou contrôle est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.
Devenir
Tous les animaux seront inclus dans cette procédure qui prévoit une mise à mort pour prélèvement d'organes à la suite de l'imagerie.
Remplacement
L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui même est une première étude pour valider la biodistribution de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers. Ayant eu cette validation, une suite est prévue une fois ces informations traitées pour l'étude des effets thérapeutiques avec la réduction des groupes expérimentaux.
Réduction
Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre l’évolution de la tumeur pour l’utilisation des nanoparticules dans les macrophages et les cellules mesecnhimateuses. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la litérature. Ces simulations ont été faites à l’aide d'un outil informatique.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de 4 individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite deux fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Cette surveillance inclut également un scoring avec des paramètres d’interaction sociale, associés à la perte de poids et motricité autour de l’évaluation du point limite. La procédure a été pensée de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés.
Choix des espèces
Concernant le choix des souris, nous nous intéressons aux souris qui sont immunodéficientes et fréquemment utilisées dans les modèles précliniques de cancérologie, en particulier pour greffes de cellules humaines. L'immunité de la souche utilisée est spécifique pour une réponse immunitaire très réduite et une très bonne tolérance, ce que améliore la prise tumorale, indispensable à ce projet. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.
1.2. Titre du Projet : Effets de nouveaux inihbiteurs de la voie SPAK sur la cognition, le sommeil et les crises d’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Environ 400 souris reçoivent une injection de PTZ pour déclencher des crises d'épilepsie, une partie devant atteindre un état de crise prolongée. 2 040 souris vont être utilisées en tout, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 240 un niveau modéré, avec des implantations d'électrodes de cinq heures et des injections quotidiennes pendant sept jours. Le porteur écrit que l'injection de PTZ "ne provoque pas de douleur particulière" et qualifie les crises qui suivent de stressantes et fatigantes, sans autre précision sur ce que subit l'animal pendant le status epilepticus. Après chaque procédure, le cerveau est prélevé, ce qui suppose la mise à mort de tous les animaux.
Objectifs
Dans le cerveau, l’inhibition agit comme un frein qui empêche les signaux nerveux de s’emballer. Quand ce frein fonctionne mal, cela peut contribuer à des maladies comme l’épilepsie ou certains troubles psychiatriques. Pour mieux comprendre ces problèmes et imaginer de nouveaux traitements, nous avons étudié une voie de communication entre neurones, appelée SPAK, qui est anormalement activée dans certaines de ces maladies. Nous avons découvert un nouveau mécanisme qui contrôle cette voie et, grâce à des modèles informatiques, nous avons conçu des molécules capables de la réguler. En les testant sur des neurones cultivés en laboratoire et observés avec des techniques de microscopie avancée, nous avons vu que certaines molécules parviennent à bien contrôler cette voie, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Cependant, leurs effets ne sont pas identiques selon qu’elles agissent sur des neurones « freins » (inhibiteurs) ou des neurones « accélérateurs » (excitateur), ce qui rend difficile de prédire précisément leur impact dans un vrai cerveau. La prochaine étape sera de tester ces molécules dans l’organisme pour comprendre comment le blocage de la voie SPAK influence l’activité des connexions entre neurones, le fonctionnement global du cerveau et différents comportements comme la mémoire, l’anxiété, le sommeil, les interactions sociales ou encore la sensibilité aux crises d’épilepsie chez la souris. Enfin, nous chercherons à comprendre plus en détail le rôle de cette voie dans les deux grands types de neurones.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment fonctionne une voie de communication encore peu étudiée dans le cerveau, appelée voie SPAK, et à tester l’efficacité de nouvelles molécules que nous avons développées (une invention déjà déposée et en cours de brevet). Nous espérons montrer que bloquer cette voie grâce à nos molécules pourrait protéger contre les crises d’épilepsie et améliorer des fonctions comme la mémoire, l’attention et les interactions sociales, tout en préservant un sommeil de bonne qualité. En étudiant des versions modifiées de cette voie dans différents types de cellules nerveuses, nous pourrons identifier plus précisément celles qui sont impliquées. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements contre certaines formes d’épilepsie, y compris celles associées à des troubles cognitifs ou du sommeil.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, plusieurs types de procédures seront réalisées sur les animaux expérimentaux. 1. Chirurgies sous anesthésie générale (1 à 2 fois par animal) o Injections cérébrales : administration de vecteurs viraux, d’une durée d’environ 1 heure par animal. Nombre total prévu : ~624 animaux. o Implantations d’électrodes : chaque intervention dure environ 5 heures. Nombre total prévu : ~800 animaux. 2. Évaluations comportementales (animaux vigiles) Des séances d’observation et d’évaluation comportementale sont planifiées, pour un total d’environ 260 souris. 3. Induction de crises d’épilepsie aiguës (animaux vigiles, 1 fois par animal) o Les crises seront induites par administration de PTZ. o Durée de chaque session : environ 1 heure. o Nombre total prévu : 400 souris. 4. Injections répétées (animaux vigiles) o Injections intrapéritonéales (IP) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour ~312 souris. o Injections intraveineuses (IV) : même protocole et durée que les injections IP, pour ~312 souris. o Injections IV ou IP (expériences principales) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour un total d’environ 792 souris, après détermination du mode d’injection le plus adapté sur la base des expériences de contrôle.
Impact sur les animaux
Les injections (sous la peau, dans l’abdomen ou dans une veine) ainsi que les différents tests comportementaux réalisés sur les souris adultes peuvent provoquer un léger stress. Celui-ci est lié à la manipulation nécessaire pour l’injection ou au fait de se retrouver dans un environnement nouveau. Pour l’induction de crises d’épilepsie, les souris reçoivent une seule injection sous la peau d’une molécule appelée PTZ. Cette injection ne provoque pas de douleur particulière, mais les crises qui suivent sont stressantes et fatigantes pour l’animal. Dans le cadre de certaines expériences, il est nécessaire que l’animal atteigne un état de crise prolongée (status epilepticus). L’implantation d’électrodes pour mesurer l’activité musculaire, cardiaque ou cérébrale, ainsi que les injections cérébrales de virus pour cibler certains types de cellules, nécessitent des chirurgies sous anesthésie générale. L’implantation d’électrodes pour l’enregistrement de l’électromyogramme (EMG) et de l’électrocardiogramme (ECG) et du potentiel de champ (LFP), ainsi que l’injection stéréotaxique de vecteurs viraux dans des types cellulaires spécifiques, impliquent une intervention chirurgicale susceptible d’induire une douleur résiduelle, considérée comme modérée après application des mesures de raffinement.
Devenir
Après chaque procédure, le cerveau des animaux est prélevé pour permettre des analyses scientifiques.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules de l’hippocampe, une région du cerveau, et ces tests montrent que nos molécules pourraient agir sur la voie de signalisation SPAK. Pour vérifier leur potentiel thérapeutique, nous devons maintenant les tester chez l’animal éveillé. Cela nous permettra de mieux comprendre comment ces molécules agissent sur les cellules du cerveau, sur les circuits impliqués dans l’épilepsie et sur les comportements qui sont affectés par cette maladie. L’utilisation d’un modèle animal est essentielle, car elle permet de conserver les interactions naturelles entre les différents organes, ce qui n’est pas possible dans des études uniquement sur des cellules en laboratoire.
Réduction
Nous avons conçu ce projet pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en gardant un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été déterminé à partir des données de nos études précédentes et de calculs statistiques précis. En pratique, nous utiliserons 10 animaux par groupe. Les deux sexes, mâles et femelles, seront inclus dans nos expériences. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour tous les tests comportementaux, en commençant toujours par les tests les moins stressants afin de limiter leur inconfort. Enfin, les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques adaptées pour garantir la fiabilité des conclusions.
Raffinement
Toutes les procédures chirurgicales de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale ou locale, sur un tapis chauffant, et avec l’utilisation d’antalgiques pour limiter la douleur. Les injections et prélèvements seront faits en suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Les souris seront hébergées par petits groupes, avec un maximum de 5 animaux par cage, et observées régulièrement pour vérifier leur état de santé. Avant chaque intervention, le poids et l’état général de chaque animal seront contrôlés. Si un signe de douleur ou de malaise est détecté, l’animal sera retiré immédiatement du protocole. Nous faisons tout pour réduire au maximum le stress et la douleur, en mettant en place des périodes d’habituation et en utilisant des anesthésiants et antalgiques adaptés. Le suivi quotidien de l’état des animaux (attitude, aspect du pelage, poids) permettra d’administrer un traitement supplémentaire si nécessaire ou, si un seuil critique est atteint, de retirer l’animal de l’étude. Enfin, lorsque l’euthanasie est nécessaire, elle sera réalisée dans une pièce séparée, pour éviter tout stress aux autres animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé en recherche en neurosciences. Elle permet d’étudier le comportement, de modifier certaines cellules du cerveau grâce à des techniques génétiques, et de reproduire des modèles d’épilepsie qui sont bien établis pour comprendre cette maladie chez l’humain. Nos expériences seront réalisées sur des souris adultes, car les changements dans le fonctionnement des molécules que nous étudions apparaissent après la naissance, dans des maladies comme l’épilepsie, certains troubles psychiatriques ou encore des troubles du sommeil.
étude de l’activité électrique de l’hippocampe chez le rat dans des environnements complexes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 rats vont être utilisés, cinquante d'entre eux portant sur le crâne un implant d'enregistrement de 10 à 25 grammes et vivant seuls en cage pendant toute l'étude, jusqu'à six mois. Une chirurgie d'une heure trente à trois heures ouvre le crâne pour implanter les électrodes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour ces cinquante animaux et léger pour les dix autres. Tous sont soumis à un contrôle alimentaire continu pour être motivés à explorer une arène circulaire, une arène à quatre compartiments et à passer un test d'appariement différé, une à deux fois par jour, cinq jours par semaine. Les cinquante rats opérés sont tués pour vérifier la position des électrodes dans le tissu cérébral, les dix autres pouvant être affectés à d'autres projets ou proposés à l'adoption.
Objectifs
L’objectif principal de ces expériences est de comprendre comment les neurones de l’hippocampe du rat s'activent lorsque le sujet s'oriente dans un espace complexe, constitué de plusieurs compartiments connectés par des portes. L’hippocampe est une structure cérébrale fortement impliquée dans l’orientation spatiale et la mémoire. De plus, la dégénérescence de cette structure a lieu dans les phases précoces de la maladie d’Alzheimer, caractérisée dans ses premiers stades par des déficits d’orientation spatiale et de mémoire. L’hippocampe possède des neurones appelés cellules de lieu, qui s’activent spécifiquement lorsque le rat se trouve à un endroit précis de l’espace. L’ensemble de ces neurones fournit une représentation de l’espace, dite aussi carte cognitive, qui permet à l’animal de s’orienter et de mémoriser des lieux. Ces cellules de lieu, initialement découvertes chez le rongeur, existent aussi chez d’autres espèces de mammifères, comme la chauve-souris et l’humain, ce qui suggère que les mécanismes cérébraux à la base de l’orientation et de la mémoire spatiale sont très conservés au cours de l’évolution. Toutefois, la grande majorité des travaux déjà effectués ont étudié les propriétés de ces neurones dans des espaces très simples et uniformes, tels que des pièces uniques et vides. Or, la plupart des espaces dans lesquels les animaux (mais aussi les humains) se déplacent sont généralement plus complexes, puisqu’ils sont constitués de plusieurs lieux connectés entre eux. Comprendre comment l’hippocampe représente ce type d’espace est essentiel pour identifier la véritable nature de cette représentation neuronale. Cela pourrait également contribuer à mieux caractériser les déficits des personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer dans ses phases précoces, et fournir ainsi des pistes pour un diagnostic plus précoce de la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la nature de la représentation spatiale des cellules de lieu hippocampiques, grâce à l’utilisation d’environnements complexes et connectés, plus proches des espaces naturels. La compréhension fine des mécanismes neuronaux sous-tendant cette représentation est essentielle pour appréhender non seulement son fonctionnement, mais aussi son dysfonctionnement dans le cadre de pathologies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Un total de 60 rats est utilisé dans cette étude. 10 rats réalisent une procédure comportementale seule (Procédure 1). Ils sont d'abord habitués à l'expérimentateur par une manipulation quotidienne pendant 10 jours, afin de diminuer leur stress. Après cette période, ils sont testés dans une tâche comportementale dans une arène. Chaque session a une durée de 20 minutes et est effectuée 1-2 fois par jour, à raison de 5 jours par semaine. Afin de motiver les animaux à effectuer cette tâche, ils sont soumis à un contrôle alimentaire durant toute la procédure. Le but de ce contrôle alimentaire est que l’animal puisse consommer une ration alimentaire journalière qui couvre l’ensemble de ses besoins (donc sans déprivation alimentaire), mais que cette ration se répartisse entre des croquettes standard (celles-ci sont fournies en quantité limitée dans la cage de vie) et des récompenses alimentaires (granulés sucrés) obtenues lors des tâches comportementales. Le poids corporel des animaux est mesuré régulièrement (1 à 3 pesées hebdomadaires) pour s’assurer que les animaux consomment assez de nourriture pour couvrir leurs besoins. Une consommation insuffisante se traduit par un poids inférieur à celui attendu pour l’animal compte tenu de son âge, son sexe et de sa souche. Si nécessaire, un supplément de croquettes et/ou granulés sucrés est fourni à l’animal. Les 50 animaux restants sont soumis à deux interventions (Procédure 2) : une procédure chirurgicale et la même procédure comportementale que pour la procédure 1, couplée cette fois-ci à l'enregistrement de cellules nerveuses. La procédure chirurgicale, d’une durée comprise entre 1h30 et 3h environ, permet l'implantation du plot d'enregistrement. Pour la procédure comportementale couplée à l'enregistrement des cellules nerveuses, les animaux sont également soumis à un contrôle alimentaire durant toute la période. Lors des enregistrements des cellules nerveuses, les animaux sont d'abord maintenus doucement par l’expérimentateur pour permettre le branchement du câble d'enregistrement sur le plot. Cette étape a une durée de 30-60 secondes. Afin de minimiser le stress des animaux, ils sont habitués à cette légère contention avant et après la chirurgie, au cours de séances quotidiennes de manipulation. Puis ils sont introduits dans le dispositif comportemental. La durée totale de l'étude est de 6 mois au maximum.
Impact sur les animaux
- Chirurgie : réalisée sous anesthésie générale profonde, d’une durée comprise entre 1h30 et 3h, elle entraîne une lésion au niveau du crâne, ainsi qu’un certain stress. Cette intervention comporte des risques de détresse respiratoire, d’infection et de douleur post-opératoire. Elle permet l’implantation d’électrodes dans l’hippocampe du rat. - Enregistrements neuronaux et tests comportementaux : - Le plot d’enregistrement auquel sont connectées les électrodes intracérébrales est implanté de manière chronique et entraîne une gêne modérée, liée à son encombrement et à son poids (10-25 g). Il nécessite un hébergement individuel afin d’éviter toute détérioration du matériel d’enregistrement par un congénère. Cet hébergement isolé entraîne une restriction des interactions sociales pendant toute la durée de l’étude. - Manipulations expérimentales : le branchement du câble d’enregistrement requiert une légère contention de l’animal afin d’assurer la stabilité du dispositif et la sécurité de la manipulation. Afin de motiver les animaux à l'apprentissage des tâches comportementales, un contrôle alimentaire est imposé en continu à l'animal et des récompenses alimentaires sont délivrées durant les tâches comportementales. Les animaux subissent donc un stress et un inconfort causé par ce contrôle alimentaire tout au long de l’étude. Les tests comportementaux utilisés sont : le test d’exploration libre dans une arène circulaire, effectué 2 à 3 fois par semaine (durée : 10 à 15 minutes) ; le test d’exploration libre dans une arène à quatre compartiments, effectué 1 à 2 fois par jour (durée : 20-30 minutes) à raison de 5 fois par semaine ; le test d’appariement différé, effectué 1 à 2 fois par jour (durée : environ 20 minutes), 5 jours par semaine. Les animaux subissent également une douleur liée à l’injection d’anesthésique lors de la mise à mort.
Devenir
A la fin des expériences les 50 animaux ayant subi une chirurgie seront mis à mort. Cette décision découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir la vérification du bon placement des électrodes d’enregistrement intracérébral, qui requiert une analyse du tissu cérébral. Les 10 animaux restants n’ayant subi que des tests comportementaux (procédure de degré de sévérité légère), il n’est pas nécessaire de les mettre à mort en fin de procédure. Après avis du vétérinaire désigné, ces animaux peuvent éventuellement être affectés à d’autres projets, ou bien mis à l’adoption.
Remplacement
La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, les méthodes alternatives existantes, comme les études sur des réseaux de neurones artificiels, ne permettent pas de répondre à l'ensemble de questions posées puisque ces dernières nécessitent l'analyse de la relation entre les activités neuronales et le comportement.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux utilisés reflète la recherche d’un juste équilibre entre la nécessité de répliquer les observations afin d’obtenir des résultats statistiquement valables, et celle de réduire au minimum la taille des effectifs. Le nombre d’animaux ici présenté a été estimé sur la base de nos expériences antérieures à la fois sur le comportement et l'enregistrement de l'activité neuronale, et sur un test de puissance statistique permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide. Nous mettrons en place deux stratégies pour réduire le plus possible le nombre d'animaux utilisés. D'une part, nous allons tout d’abord caractériser l’activité neuronale des rats dans une tâche d’exploration libre dans une arène simple, ce qui nous permet de mieux idéntifier les cellules d'intêret selon des critères standard. Puis, nous commencerons à utiliser des systèmes d’enregistrement à haute densité (probes en silicone), qui permettent d’augmenter le nombre de contacts d’enregistrement et, par conséquent, le nombre de neurones enregistrés. Cette approche contribue ainsi à réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole afin de diminuer leur stress. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré en préopératoire, permettant ainsi de couvrir la phase postopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire et de la solution physiologique sont administrés en début d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal. Des points limites spécifiques ont été définis et seront appliqués tout le long de l'expérience. Leurs conditions de stabulation sont conçues pour attenuer le stress du aux procédures. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier. Ils sont hébergés dans des cages rehausées afin de permettre aux animaux de bouger aisément dans leur cage et de se rehausser sur les pattes arrières sans qu'ils soient gênés par le plot d'enregistrement.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude qui se situe dans le prolongement des travaux effectués précédemment dans l’équipe. Il est donc impératif de maintenir les mêmes conditions expérimentales, ce qui inclus l’utilisation de la même espèce. De plus, la majorité des études portant sur la caractérisation des cellules de lieux ont été réalisés chez le rat. On pourra se baser des connaissances bien établies pour poursuivre ce projet et ainsi éviter de multiplier les expériences et l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les animaux seront testés à l'âge adulte. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour caractériser l'activité de l'hippocampe chez des animaux en comportement. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature.
Effet des hormones sexuelles sur la cornée
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une partie des souris utilisées est privée d'ovaires ou de testicules avant de recevoir de la testostérone ou de l'œstrogène sous la peau de la nuque. Elles sont 186, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La cornée est abrasée pour reproduire une blessure, atteinte dont le porteur écrit qu'elle peut causer pendant 72 heures une douleur comparable à celle d'un grain de sable dans l'œil. Les yeux sont prélevés après la mise à mort pour examiner la cornée et ses annexes, seule façon selon lui d'évaluer l'effet des hormones sur la cicatrisation.
Objectifs
L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neuro-dégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de connaissances sur le fonctionnement de la cornée et son environnement constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. Une étude préliminaire menée par notre équipe a mis en évidence une différence significative de sensibilité cornéenne entre souris mâles et femelles. Notre projet vise donc à explorer cette différence de la cornée due au sexe et à en évaluer les conséquences sur la fonctionnalité cornéenne, en particulier sur les mécanismes de cicatrisation. L’objectif à long terme est de mieux comprendre les interactions neurones/hormones dans la cornée afin de contribuer au développement de nouveaux traitements plausibles.
Bénéfices attendus
La kératite neurotrophique étant en impasse thérapeutique, comme d’autres pathologies de la cornée, notre projet a pour but de déterminer et mettre en place de nouvelles thérapies innovantes. La première étape de cet objectif est de mieux comprendre et détailler le fonctionnement de la cornée, notamment dans les différents sexes. En étudiant l’impact des hormones sur la cicatrisation de la cornée, le projet permet alors de développer des nouvelles thérapies en médecine personnalisée. On s’adapterait ainsi au patient et à ses conditions (sexe, grossesse, variations hormonales).
Procédures
Manipulées par nos soins, les souris, même si aucune douleur n’est causée lorsqu’elles sont simplement tenues, risquent d’éprouver du stress. Seront limitées au maximum les anesthésies, les durées et le nombre des manipulations. La testostérone (hormone masculine) et l’oestrogène (hormone féminine) seront injectées juste sous la peau de la nuque chez des souris endormies à l’aide d’un gaz. C'est une intervention très rapide qui prend moins d'une minute par souris. Celle-ci peut légèrement influencer le comportement des animaux : agressivité mineure, hyperactivité faible.
Impact sur les animaux
La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’effet de la maladie sur les structures de l’œil : la cornée et ses annexes.
Remplacement
Les systèmes de cellules isolées ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organe entier qui dépend des hormones, ce qui rend indispensable l’utilisation d’un modèle animal, en particulier la souris, notamment grâce à l’utilisation de souris sans organes génitaux primaires : ovaires et testicules +/- traitées à la testostérone et l’oestrogène.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.
Raffinement
Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Pendant le traitement à la testostérone, les souris ne sont pas maintenues entre nos mains. Elles sont simplement anesthésiées à l’aide d’un gaz, ce qui permet de réaliser l’injection sans induire de stress important. L’administration sous-cutanée permet une libération prolongée, limitant les pics hormonaux et les manipulations répétées. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute anomalie. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance ou d’effet secondaire sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’abrasion cornéenne, avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. L’animal est suivi les heures et jours suivant la procédure ainsi en cas de signes de douleur, il sera pris en charge immédiatement. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée.
Choix des espèces
La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des lignées sauvages. Elle permet ainsi d’étudier l’impact des hormones sur le microenvironnement cornéen en étant un modèle très satisfaisant pour la reproductibilité chez l’Homme. Nous débutons nos traitements hormonaux sur des souris âgées 6 et 9 semaines, car c’est à cet âge que la cornée est mature ce qui permet d’éviter des fluctuations hormonales susceptibles de fausser les résultats.