Recherche fondamentale

Pour mettre au point une thérapie génique contre la dégénérescence maculaire liée à l'âge, 584 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin de chaque procédure. La maladie leur est provoquée aux deux yeux au laser sous anesthésie, après une injection du vecteur directement dans l'œil, puis les vaisseaux sont observés par angiographie jusqu'à cinq fois. Le porteur indique que ces injections et la photocoagulation induisent une douleur modérée, couverte selon lui par l'anesthésie générale et un anesthésique local. Il écrit ensuite qu'aucune procédure de la demande ne doit provoquer douleur, perte de poids ou de mobilité, ni modifier le comportement.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) concerne plus d’un million de personnes en France, sa fréquence d'apparition augmente avec l’âge ; elle est ainsi la première cause de cécité des personnes de plus de 50 ans. L’objectif de ce projet est de développer un meilleur traitement pour traiter la dégénérescence maculaire lie à l'âge (DMLA). Aujourd'hui, les traitements consistent en des injections intraoculaires de médicaments, chez les patients, qui doivent être renouveler, entre douze et 6 fois par ans, et ceci à perpétuité. Cette régularité et consistance de traitement est essentiel pour conserver le bénéfice du traitement et d'éviter la perte de vision qui est progressive chez ces patients. Dans les faits, la plupart des patients arrêtent ces traitements après 2 à 5 ans, et perdent le bénéfice en termes de vision. En plus d'être douloureuses pour les patients, ces injections intra oculaire présentent un risque mineur de complication à chacune de ces interventions. Chez ces patients qui sont généralement âgée de plus de 65 ans, il est aussi plus complexe logistiquement d'organise ces suivis répétés, pour une population qui est en croissance et déjà forte de plusieurs millions rien qu'en France. Nous souhaitons développer une thérapie génique qui permettrait en une seule injection chez le patient, de traiter la cause de la DMLA. Cette approche permettrait à l'œil de produire directement et en continue, les molécules thérapeutiques qui empêchent la progression de la DMLA. Ainsi, nous espérons améliorer la vision des patients a long terme, faciliter le traitement pour les patients, leurs aidants, ainsi que pour les services de santé. L'objectif de notre projet est donc d’évaluer l’efficacité de candidats thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de la DMLA humide sont administrés par injection intravitréenne tous les 1-2 mois afin de maintenir des niveaux efficaces du médicament dans l’œil. Néanmoins, le poids de ce type de traitement pour les patients, leurs familles et les organismes de soins est tel que la fréquence des injections nécessaires pour contrôler efficacement la maladie n’est souvent pas respectée. Le projet proposé vise à développer une approche thérapeutique nécessitant une injection oculaire unique chez les patients, qui pourront eux même produire les molécules thérapeutiques à un niveau optimal et sur le long terme. Cela a pour objectifs, une meilleure prise en charge clinique des patients et de leurs maladies, ainsi qu’une amélioration de leur qualité de vie.

Procédures

Pour recréer la maladie dans la rétine, nous utiliserons un laser pendant que l'animal est profondément endormi. Cette opération est réalisée une seule fois sur les deux yeux et dure 10 minutes au total. L'administration du traitement est faite en amont par une piqûre directement dans l'œil, toujours pendant que l'animal dort et ne ressent pas de douleur. Ce geste est également effectué une seule fois, dans les deux yeux, et ne prend que 5 à 10 minutes par animal. L'observation des vaisseaux sanguins (angiographie) se fera également pendant que l'animal dort. Cet examen sera réalisé sur les deux yeux (entre 1 et 5 fois maximum) et dure 15 minutes au total.

Impact sur les animaux

Toutes les procédures ont lieu sous anesthésie générale de l’animal. Dès l’injection de l’anesthésique, les animaux seront placés dans une cage séparée sur tapis chauffant en attendant la suite de la procédure pour un endormissement paisible de l’animal. Une application de gel ophtalmique sera réalisée afin d’éviter la sécheresse oculaire. Les différentes procédures sur l’œil telle que les injections intravitréennes (IVT), injections sous rétiniennes (SRI) ou la photo coagulation laser induisent une douleur modérée. L’anesthésie générale et l’analgésie suffisent à éviter la douleur. De plus, une anesthésie locale du globe sera réalisée. Elles seront également réalisées sur tapis chauffant pour éviter toute diminution de température de l’animal. A l'issue de ces étapes, une pommade ophtalmique sera appliquée afin de prévenir toute réaction inflammatoire ou infection de l'œil. La procédure d’angiographie est une technique d'imagerie exploratoire non invasive. Elle ne génère aucune douleur et l’anesthésie générale est utilisée pour éviter le stress de la contention et permettre un examen plus rapide en immobilisant l’animal. Pour leur réveil, les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant, chaque animal recevra un bolus de sérum physiologique en sous cutanée avant le réveil pour éviter toute déshydratation. Les animaux seront contrôlés jusqu’aux premiers signes de réveil (mouvements de tête par ex.) puis replacés dans leur cage. Aucune procédure de cette demande d’autorisation ne doit provoquer douleur, perte de poids ou de mobilité, ni modifier le comportement. Tout est mis en œuvre afin d’éviter ces nuisances ou effets indésirables

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de mesurer la performance des molécules testées, et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Afin de réduire le nombre de candidats thérapeutiques évalués in vivo, un criblage et une validation a d’abord été réalisée in vitro. Cela a permis de sélectionner parmi plusieurs dizaines de candidats thérapeutiques, ceux dont l’expression et l’activité biologique étaient la meilleure. En bref, ce criblage a été réalisé sur lignées cellulaires humaines, puis sur explants de rétine porcine. Cela nous a aussi permis d’optimiser les séquences des candidats. Par ailleurs, il n'existe pas de modèle in vitro représentatif de la DMLA exsudative, c’est pourquoi, avoir recours à un œil sur animal vivant est indispensable afin d’évaluer l’effet thérapeutique de nos candidats optimisés sur un organisme entier et fonctionnel.

Réduction

Des études pilotes sont prévues afin de standardiser au mieux les différentes procédures expérimentales et réduire de façon importante le nombre d'animaux à utiliser et obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les études longitudinales d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux utilisés en gardant le même animal pour plusieurs temps après l’induction de la maladie.

Raffinement

Les rats seront par ailleurs stabulés 2 par cage avec un environnement enrichi afin de réduire le stress. Les animaux seront anesthésiés et analgésie lors des procédures, afin de limiter le stress de la manipulation et de la contention ainsi qu'une douleur éventuelle. En cas d’observation de signes de douleurs, au moment des procédures, une administration supplémentaire d'anesthésiques et/ou d’analgésique, sera réalisée. En complément, un analgésique sera instillé localement, dans le sac conjonctival inférieur pour éviter toute douleur au niveau du globe. De plus, un gel ophtalmique sera appliqué pendant chaque anesthésie pour éviter la sécheresse oculaire. Afin de limiter le risque d’hypothermie, les animaux seront endormis dans une cage séparée sur tapis chauffant, conserve sur celui-ci lors des procédures d’injection oculaire et lors du réveil. Afin de limiter le risque de déshydratation, chaque animal recevra un bolus de sérum physiologique en sous cutanée avant le réveil. En cas de blessure ou de souffrance non liées à la procédure (type blessures corporelles), un avis vétérinaire sera demandé afin de définir le devenir de l'animal.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très largement utilise et reconnu pour l’évaluation et le développement préclinique de nouveaux médicaments contre la DMLA. Les conditions d'inductions du modèle sont largement décrites dans la littérature, la mise en place du modèle a donc nécessité l'utilisation d'un nombre réduit d'animaux. En l’absence de modèle in vitro, c’est le modèle animal le plus adapté pour notre développement pré-clinique, afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de notre approche thérapeutique.

Irradiées puis greffées, à trois jours de vie, avec des cellules souches prélevées sur des patients atteints de mastocytose, ces souris développent un système immunitaire humain et des tumeurs de mastocytes. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une anémie possible, des ulcérations sur les tumeurs sous-cutanées, un rejet des nouveau-nés par leur mère après manipulation et des chocs anaphylactiques faisant chuter la température corporelle de plus de huit degrés. Il écrit que "100 %" des animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs organes.

Objectifs

La mastocytose est une maladie rare due le plus souvent à des mutations activantes d’un récepteur entraînant une différentiation et une prolifération aberrante de cellules immunitaires appelées mastocytes. La mastocytose est classée en trois types principaux selon le degré de sévérité et les organes atteints: la mastocytose cutanée (MC), qui affecte uniquement la peau ; la mastocytose systémique (MS), allant des formes indolentes aux formes sévères ou agressives, dans lesquelles au moins un organe extra-cutané est atteint ; et le sarcome mastocytaire, caractérisé par la présence d'une tumeur solide composée de mastocytes malins présentant une capacité d’infiltration destructrice et un potentiel métastatique. Selon la localisation tissulaire et la sévérité de la maladie, les symptômes peuvent inclure une irritation cutanée, des symptômes allergiques tels que l’anaphylaxie, ainsi que des déficits cellulaires, organomégalies (augmentation du volume des organes), et de l’ostéoporose. La forme la plus grave de mastocytose est la mastocytose agressive, dans laquelle il y a formation de tumeurs de mastocytes dans de nombreux tissus et dans la moelle osseuse et, dans la majorité des cas la survie des patients atteints de mastocytose agressive n’excède pas 3 à 5 ans après le diagnostic. Au-delà des traitements mis en place permettant de réduire les symptômes associés tel que les réactions allergiques, l’ostéoporose ou les atteintes cutanées, les thérapies visant à la destruction des mastocytes tumoraux induisent de nombreux effets secondaires et présentent un manque de spécificité, ce qui limite leur utilisation aux formes les plus graves de la mastocytose. Il n’existe pas à l’heure actuelle de solution thérapeutique satisfaisante dans cette pathologie. Ce programme de recherche a pour but de développer de nouvelles approches d’immunothérapie dans la mastocytose. Les résultats attendus des expériences que nous projetons de réaliser contribueront à mieux comprendre le développement de cette pathologie grave et à identifier de nouvelles approches d’immunothérapie pour soigner cette maladie.

Bénéfices attendus

La preuve de l’efficacité des anticorps déplétant les mastocytes in vivo dans les modèles murins décrits ci-dessous représente une étape essentielle pour la validation thérapeutique dans le traitement de la mastocytose et la justification du démarrage d’essais précliniques.

Procédures

L’irradiation n’aura lieu qu’une fois par animal (25 sec). Chaque injection des traitements (de 2 à 4 ; une fois par semaine) se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que d'autres ainsi que le rasage de la zone d’injection se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; injection : 30 sec). L’imagerie non-invasive se fera sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; prise de l'image : 5 min). Les prélèvements de sang seront réalisés également sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées : L’irradiation peut entrainer une perte de poids transitoire, une léthargie et/ou alopécie. Le développement d’un système immunitaire humain chez la souris peut entrainer une anémie. Les données existantes suggèrent que ces effets apparaissent plus de 20 semaines après ce développementet se manifestent par des symptômes d’anémie, incluant pâleur des extrémités, baisse importante de l’activité et perte de poids rapide. Outre les effets indésirables décrits ci-dessus qui s’appliquent également dans le cas de souris humanisées à partir de nouveaux nés, la manipulation de ces animaux avant sevrage peut entrainer un rejet de la part de la mère. De plus, il est impossible d’évaluer le développement des cellules souches hématopoïétiques dérivées de patients mastocytose in vivo et on ne peut exclure la survenue de symptômes liés à une prolifération anormale des mastocytes et des atteintes comparables aux symptômes observés chez l’Homme. Les traitements ciblant les mastocytes peuvent induire des réactions allergiques de type choc anaphylactique se traduisant par une perte de température corporelle rapide et transitoire, supérieure à 8°C. Le développement de tumeurs solides sous cutanées dans les souris humanisées peut mener à l’apparition d’ulcérations cutanées et une potentielle perte de poids. Une perte de température corporelle rapide, transitoire et supérieure à 8°C peut survenir lors d’in modèle d’anaphylaxie systémique passive

Devenir

100% des animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes post mortem.

Remplacement

Devant la complexité de cette pathologie, due notamment à l’implication de différents organes, le recours aux modèles animaux est indispensable. Toutes les études préliminaires visant à sélectionner les anticorps déplétant les mastocytes ont été réalisés in vitro dans des modèles de cultures de mastocytes humains. De ce fait, seuls les anticorps présentant le meilleur potentiel thérapeutique seront testés dans ce projet dans des modèles murins. De plus, l’utilisation d’un modèle in vivo pour tester les effets thérapeutiques d’anticorps déplétant les mastocytes nous permettra d’évaluer leur efficacité dans les différents tissues (bio-distribution), et leur capacite à induire la déplétion des mastocytes médiée par les cellules du système immunitaire inné.

Réduction

Les expériences décrites dans ce projet de recherche (incluant le nombre d’animaux par groupe) ont été élaborées sur les bases de travaux antérieurs et sur la base de notre expérience et de nos données préliminaires dans le domaine des mastocytes et des souris humanisées. Ceci dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de données statistiques robustes permettant de répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons une moyenne de 5 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet sont maintenus dans un département de zootechnie dédié (environnement stérile), et soumis à une surveillance journalière. Les soins sont prodigués par des personnels spécialisés, avec une connaissance des procédures animales et des projets scientifiques que nous menons, dont la priorité est le bien être animale et le respect des lois bioéthiques en vigueur. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour, permettant une détection précoce de toute altération de l’état de santé et une adaptation rapide des mesures nécessaires, contribuant ainsi à la réduction de la souffrance animale. Pour chaque procédure, des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera mis à mort s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif, nécessite peu de place, et il existe de nombreux modèles bien établis grâce aux progrès scientifiques réalisés ces dernières années. Les lignées transgéniques nécessaires pour ce projet sont d’ailleurs principalement disponibles chez la souris, avec un contrôle précis de leur fond génétique. De plus, la physiologie de la souris, en particulier dans les modèles « humanisés » que nous utiliserons, présente de fortes similarités avec celle de l’être humain. Cela permet de reproduire de manière fiable des maladies proches de celles observées chez les patients. Les animaux seront utilisés entre 0 (injection des cellules souches hématopoïétiques dérivés de patients mastocytose) et 20 semaines (immunisation vaccin à ARNm, regreffe de lignées de cellules tumorale, traitement avec des anticorps déplétant) après la naissance. Pour maximiser le succès de la regreffe des souris avec des cellules souches humaines, des souris nouveaux-nés (jour 3 après la naissance) seront regreffées, avant que le système immunitaire murin ne soit trop développé. Les souris sont dites « humanisées » lorsque leur système immunitaire humain est composé de plus de 25% de cellules immunitaires humaines (dans la circulation) entre 12 et 16 semaines après l’injection des cellules souches hématopoïétiques ; c’est pourquoi, les animaux seront utilisés entre 0 et 20 semaines.

Flanc rasé sous anesthésie, injection de cellules de mélanome sous la peau, puis deux à trois injections de traitement dans l'abdomen et des mesures de la tumeur trois fois par semaine: 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la croissance de la tumeur sur le flanc peut provoquer une douleur modérée et que les tumeurs peuvent, rarement, nécroser. Le projet cible deux protéines soupçonnées de soutenir la progression du mélanome et la résistance aux immunothérapies, près de la moitié des patients développant de telles résistances. Toutes les souris sont tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques.

Objectifs

Le mélanome, cancer de la peau le plus agressif, a causé la mort de plus de 60.000 patients dans le monde en 2022. Malgré les progrès récents dans le domaine des immunothérapies du cancer, près de la moitié des patients développent des résistances, dont les mécanismes sont encore mal compris. Nous avons identifié deux protéines susceptibles de soutenir la progression du mélanome et de la résistance aux immunothérapies. Les objectifs de ce projet sont de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires médiés par ces deux protéines, d’évaluer l’impact de leur inhibition sur la pousse tumorale, et de valider nos observations dans un second modèle de mélanome cutané.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouveaux mécanismes permettant la progression du mélanome, et l’échappement au système immunitaire, constituant de fait des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc de cellules tumorales, sous anesthésie (1x 2 minute/souris) – Injections intrapéritonéales de médicaments (2 ou 3x 5 secondes/souris) – Pesées (30 secondes, une fois par semaine) – Mesure des volumes tumoraux (30 secondes, 3 fois par semaine)

Impact sur les animaux

L’évaluation des volumes tumoraux et les pesées nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. -La progression des tumeurs sur le flanc des souris peut induire une douleur modérée. Dans de très rares cas, les tumeurs peuvent nécroser.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué une série d’expériences in vitro et d’analyses in silico pour établir le rôle des deux protéines d’intérêt dans la croissance tumorale et l’échappement immunitaire, et pour dresser des hypothèses de mécanisme. Néanmoins à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de l’informatique, les interactions entre les cellules tumorales, immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le rasage et les injections sous-cutanées seront faites sous anesthésie gazeuse. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide, de l’eau gélifiée et une solution de réhydratation, pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes, de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure. Les animaux seront distribués à 50/50 entre mâles et femelles, sauf dans une procédure où seules des femelles seront utilisées.

Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.

Jusqu'à vingt-sept injections dans le ventre et neuf prélèvements de sang par animal après une greffe de cœur cousue au niveau du cou: 1 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Près de la moitié sont utilisées comme donneuses, infectées par un cytomégalovirus, l'autre moitié recevant leur cœur sous traitement anti-rejet. Donneuses et receveuses sont génétiquement différentes pour reproduire l'incompatibilité entre un donneur d'organe et son receveur, et le porteur indique qu'amplifier le virus dans les glandes salivaires de souris vivantes reste "nécessaire", la culture cellulaire l'affaiblissant. Toutes sont tuées pour prélever poumons, foie, cœur, reins, rate et glandes salivaires.

Objectifs

Lorsqu’un patient subit une transplantation d’organe et qu’il reçoit un organe provenant d’un donneur, son système immunitaire peut alors reconnaître cet organe comme étranger et provoque son rejet. Pour l’éviter, les patients doivent prendre des traitements immnosuppresseurs (anti-rejet). Ces médicaments visent à réduire l’activité de l’ensemble du système immunitaire et protègent l’organe transplanté mais ils rendent aussi les patients plus vulnérables aux infections. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est celle causée par le cytomégalovirus. Ce virus est très répandu dans la population générale. Chez une personne en bonne santé qui s’infecte pour la première fois, les symptômes sont souvent légers voire absents, car le système immunitaire contrôle rapidement l’infection. Le virus reste ensuite dormant, en « latence », dans différents organes (les reins, le foie, le cœur, les poumons…). Le problème apparaît lorsqu’un patient receveur, n’ayant jamais été en contact avec ce virus, reçoit un organe provenant d’un donneur porteur du virus. Sous traitements anti-rejet, le receveur ne peut pas développer une réponse immunitaire efficace contre le virus. L’infection peut alors se réactiver et entraîner des complications graves, compromettant la santé du patient et la survie de l’organe transplanté. L’objectif de ce projet est d’étudier la manière dont le système immunitaire réagit contre le cytomégalovirus après transplantation, en particulier sous traitement anti-rejet. Nous analyserons aussi l’impact des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental de transplantation cardiaque chez la souris dans lequel le cœur de souris donneuses infectées de manière latente au cytomégalovirus sera transplanté à des souris receveuses n’ayant jamais été en contact avec le virus et traitées avec différents médicaments anti-rejet. Le choix du modèle de transplantation cardiaque se justifie par la taille plus importante des vaisseaux, rendant la procédure chirurgicale plus simple que pour d’autres organes. Les souris donneuses et receveuses seront génétiquement différentes afin de reproduire ce qui se passe lorsqu’un patient reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la propagation du virus seront analysés dans les différents organes des souris receveuses, ainsi que la réponse immunitaire développée par ces souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organe, ainsi que le rôle des principales cellules immunitaires impliquées dans le contrôle et la résolution de cette infection chez les patients transplantés. Les résultats obtenus permettront de également de préciser l’impact des traitements anti-rejet sur la réactivation et la dissémination du cytomégalovirus et de savoir comment moduler la réponse immunitaire du receveur afin de la rendre efficace contre le cytomégalovirus tout en limitant le risque de rejet, avec pour objectif de réduire la morbi-mortalité liée à ce virus et de prolonger la durée de vie des greffons.

Procédures

Toutes les souris donneuses de greffon cardiaque (soit près de la moitié du nombre total des animaux prévue pour ce projet) recevront une injection (du virus) dans le ventre sur animal vigile en début de procédure. 3 prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés sur les souris donneuses (avant infection, une semaine après infection et quelques jours avant la chirurgie pour confirmer l’état de latence du virus). En fin de procédure, les souris donneuses recevront une injection d’anesthésiques (anesthésie générale profonde) dans le ventre et une injection d’analgésique morphinique dans le ventre avant la chirurgie. La peau sera désinfectée et incisée afin de prélever le cœur des souris donneuses. Durée de l’opération chirurgicale : 1h. Toutes les souris receveuses de greffon cardiaque (l’autre moitié des animaux de ce projet) seront anesthésiées profondément via une injection d’anesthésiques dans le ventre et recevront au total 4 injections sous la peau d’analgésique morphinique sur une période de 2 jours. Ainsi, sous anesthésie profonde générale et analgésie, la peau sera désinfectée et incisée afin de greffer le cœur de la souris donneuse au niveau du cou, puis suturée. L’opération chirurgicale durera 2h maximum. De plus, elles seront également soumises à des injections dans le ventre répétées 3 fois par semaine sur animal vigile (soit au maximum 27 injections sur 63 jours maximum), et à des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit jusqu’à 9 prélèvements maximum). Les injections dans le ventre et les prélèvements sanguins dureront 30 secondes (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang répétés sont susceptibles d’entrainer un stress (lors de la contention) et une légère douleur lors de l’acte. La greffe de cœur correspond à une procédure bien documentée, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. L’intervention chirurgicale entrainera une gêne lors du réveil et une douleur malgré les analgésiques et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. L'infection à cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c’est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Pour les souris traitées avec le traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation hépatique non douloureuse), ou une colite (associée à des diarrhées). L’infection durera 4 mois (pour les souris donneuses immunocompétentes) ou 2 mois (pour les souris receveuses sous traitement anti-rejet) au maximum. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux. Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Les points limites propres à chaque procédure ont été décrits pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, rate et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe et les interactions cellulaires aboutissant à la réponse dirigée contre le cytomégalovirus font intervenir de multiples acteurs immunitaires présents dans différents tissus ou organes lymphoïdes, ce qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, le phénomène d’ischémie-reperfusion (lésions dues à l’arrêt puis retour du flux sanguin) est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés, nous avons donc besoin de toute la complexité vasculaire et inflammatoire de l’organisme vivant pour reproduire ce phénomène observé en transplantation d’organe. Dans certains cas, la génération du stock de virus peut être réalisée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de dimiuner la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir de glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous devons utiliser la souche non modifiée et peu virulente afin d’étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n’est pas possible avec les autres souches de virus modifiées plus virulentes), et que le virus doit être suffisamment virulent afin d’infecter des hôtes immunocompétents et d’obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe afin d’assurer la robustesse des analyses. Afin d’atteindre un effectif de 5-6 animaux par expérience, sachant que 2 types de protocoles expérimentaux incompatibles seront réalisés (soit 10-12 animaux par groupe), en prenant en compte le taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques, nous prévoyons 14 animaux par groupe. Au total, le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 1226 souris (mus musculus). Néanmoins, ce nombre est suceptible d’être revu à la baisse au cours du projet. L’étape de génération du stock de virus in vivo étant redondante avec un autre projet (déjà validé par le ministère), si la quantité de virus générée dans ce premier projet est également suffisante pour ce nouveau projet, nous ne réaliserons pas cette procédure. De même, le nombre d’animaux prévus pour l’entrainement technique à la greffe cardique correspond à un nombre maximal : ainsi, dès validation de la technique, nous passerons à l’étape suivante. Les différentes étapes de ce projet se feront séquentiellement afin de sélectionner au mieux les groupes les plus pertinents au fur et à mesure de l’avancée du projet, et ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le maximum d’échantillons biologiques sera extrait de chaque animal, et plusieurs expériences seront réalisées sur les mêmes échantillons, afin d’éviter d’avoir à reproduire ultérieurement l’expérience par manque de matériel biologique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque acte ont été définis afin d’assurer une prise en charge adaptée. Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection et les sites de prélèvement. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Bien que la douleur lors des injections ou des prélèvements dans ce protocole sera réduite grâce à l'administration d'analgésiques/anesthésiques, des points limites ont tout de même été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité et de limiter la souffrance de l'animal. Après chaque chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et un suivi rapproché sera effectué. Le protocole chirurgical a été établi de façon à ce que le cœur de la souris receveuse est conservé et fonctionnel, ainsi, la perte du greffon cardiaque (issu de la souris donneuse) ne peut entrainer la mort et la souffrance de l’animal en soi. L'infection au cytomégalovirus des animaux traités sous traitement anti-rejet est susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du côlon. Un suivi quotidien de leur état général sera effectué, et la survenue de diarrhées sera contrôlée. À cela s'ajoute un monitoring spécifique permettant de doser les enzymes du foie grâce aux prélèvement sanguins réalisés de façon hebdomadaire. Ces prélèvements sanguins réguliers sont donc nécessaires afin de suivre l’état de santé des animaux et de réagir plus précocément en cas de résultats insatisfaisants. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Pour les expériences de transplantation, des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin de garantir un système immunitaire pleinement mature capable de répondre à l’infection. Pour la production virale in vivo, des souris immunocompétentes agées de 6 semaines, déjà sevrées, seront utilisées afin d’optimiser le rendement, tout en préservant leur bien-être.