Recherche fondamentale
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Déterminants cellulaires et moléculaires des activités pathologiques dans un modèle expérimental murin d’épilepsie.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à six injections pour déclencher une épilepsie, une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau, puis des enregistrements dix heures par jour pendant vingt et un jours et jusqu'à quarante-deux injections: 846 souris vont être utilisées, dont 621 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À partir de la chirurgie, elles sont hébergées seules jusqu'à sept semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress pour une espèce vivant normalement en groupe. Le projet vise à identifier les cellules cérébrales actives pendant les crises pour les cibler ensuite par optogénétique ou chémogénétique. Le bien-être des animaux non-humains est présenté comme la "priorité" de l'équipe, laquelle indique aussi qu'il arrive que des crises très sévères leur soient fatales.
Objectifs
L'épilepsie est une maladie neurologique courante qui touche près de 1 pourcent de la population mondiale. L'une de ses formes les plus fréquentes chez l'adulte est l'épilepsie du lobe temporal mésial, souvent causée par la sclérose hippocampique, une cicatrice dans une partie du cerveau appelée hippocampe. Pour environ 30 pourcents de ces patients, les médicaments actuels ne parviennent pas à contrôler les crises. On parle alors d'épilepsie pharmacorésistante. Dans ces cas, une chirurgie pour enlever la zone cérébrale responsable des crises est souvent la seule solution. Notre objectif est d'améliorer la compréhension de cette forme d'épilepsie afin de trouver de nouveaux traitements. Pour cela, nous utilisons un modèle expérimental de l'épilepsie chez la souris, qui reproduit les caractéristiques de la maladie humaine. Notre recherche se déroule en plusieurs étapes. Nous allons tout d'abord essayer d’identifier les types de cellules cérébrales qui sont actives pendant les crises d'épilepsie. Puis nous les étudierons ensuite pour comprendre leurs caractéristiques (leur forme, leur activité et les gènes qu'elles expriment). Une fois ces cellules bien identifiées, nous pourrons essayer de moduler spécifiquement leur activité pour voir si cela permet de réduire la fréquence des crises. De plus, en nous basant sur les mécanismes que nous aurons identifiés, nous allons rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques et tester l'efficacité de molécules agissant sur ces mécanismes. Notre but est de trouver de nouveaux médicaments qui pourraient aider les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les traitements actuels. Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de l'épilepsie du lobe temporal pour développer de nouvelles thérapies. Notre travail, effectué sur un modèle de souris, vise à identifier les cellules à l'origine des crises pour pouvoir les cibler de manière plus précise et ainsi offrir de nouvelles options aux patients dont les crises ne peuvent pas être contrôlées par les médicaments.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à combler un manque de connaissances important : la compréhension précise des réseaux de neurones responsables du déclenchement et de l'évolution des crises d'épilepsie. Les informations que nous allons récolter pourraient aider à identifier avec plus de précision les cellules spécifiques impliquées dans l'activité épileptique. Ce projet pourrait permettre de découvrir de nouvelles pistes pour développer des médicaments plus efficaces, en ciblant directement les mécanismes responsables des crises. Par ailleurs il permettra également d'évaluer des techniques de pointe, comme l'optogénétique et la chémogénétique. Ces méthodes utilisent la lumière ou des molécules pour contrôler l'activité de cellules spécifiques. Elles pourraient, à terme, ouvrir la voie à des thérapies totalement nouvelles pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. En résumé, ce projet a pour objectif d'améliorer de manière significative notre compréhension de l'épilepsie, avec l'espoir de développer à plus long terme de nouvelles options de traitement pour les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les médicaments.
Procédures
Une partie des animaux recevra des injections de molécules pour induire la pathologie (vigile, 6 injections maximum, quelques secondes par injection). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Pour une partie de ces animaux leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur 1 journée pendant 10h environ et ils recevront une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, 1 fois, quelques secondes pour l’injection). Pour les autres l’enregistrement sera réalisé en continu pendant 21 jours et ils recevront 1 à 2 injections de composés chaque jour pour évaluer leur effet thérapeutique (vigile, quelques secondes par injection, 42 injections maximum). Une autre partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour injecter une molécule au niveau du cerveau afin d’induire la pathologie (1 fois, 1h maximum). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer et stimuler l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur une journée pendant 10h environ au cours de laquelle ils reçoivent une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, durée quelques secondes). 1 semaine après, les enregistrements (vigile) sont réitérés 10h par jour pendant 21 jours consécutifs. Au cours de ces enregistrements certains recevront une stimulation cérébrale (vigile, durée quelques secondes), les autres recevront une molécule modulant l’activité cérébrale dans leur eau de boisson (20 jours). A partir de la chirurgie d’implantation du dispositif tous les animaux seront hébergés seuls jusqu’à la fin de l’étude (7 semaines maximum). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure. Une partie d’entre eux sera euthanasiée au cours d’une chirurgie sans réveil, sous anesthésie générale et analgésie adaptée (durée inférieure à 10 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'épilepsie pourra entraîner des effets secondaires comme une perte de poids et une réduction de la mobilité. La survenue des crises engendre un stress et une fatigue significatifs pour l’animal. L’injection des molécules pour mettre en place le modèle peut induire des effets périphériques (accélération du pouls, sudation, saignements). Il arrive que des crises très sévères soient fatales pour les animaux. Les chirurgies seront associées à un risque de douleur et d’inconfort pendant quelques jours, de plus il existe un risque de légère perte de poids, rapidement réversible. Le dispositif d’enregistrement implanté pourra générer un inconfort pour l’animal. Les souris implantées avec ce dispositif seront hébergées seules jusqu’à la fin de la procédure, s’agissant d’animaux vivant normalement en groupe cela génèrera un stress. L’anesthésie générale pour les chirurgies sera associée à un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque rare de difficultés cardiorespiratoires. Les différentes injections pourront induire une légère et brève douleur au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de prélever puis analyser leur cerveau dans le but de répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Pour comprendre l'épilepsie et trouver de nouveaux traitements, la recherche sur des modèles vivants est essentielle. Les mécanismes complexes d'une crise d'épilepsie ne peuvent pas être reproduits fidèlement en laboratoire sur des cellules isolées ou à l'aide de simulations informatiques. Nous utilisons déjà des modèles plus simples, comme des cultures de cellules ou des tissus humains obtenus après une chirurgie. Ces méthodes sont utiles pour tester des molécules, mais elles ne permettent pas d'étudier l'impact direct d'un traitement sur l'ensemble du cerveau et sur la survenue d'une crise. C'est pourquoi l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire. Il est le seul à pouvoir nous donner des informations sur la manière dont les crises se déclenchent et se propagent dans un cerveau vivant. Cela nous permet de tester l'efficacité de nouvelles thérapies de manière réaliste et de progresser vers des traitements pour les patients.
Réduction
Le nombre d'animaux que nous utilisons dans notre projet a été défini avec soin pour être le plus juste possible, en se basant sur nos expériences passées et les données de la littérature scientifique. Nous avons travaillé à améliorer notre modèle expérimental. Par exemple, nous avons réduit les doses des substances utilisées pour déclencher les crises, ce qui a permis de diminuer la mortalité et le nombre d'échecs. Cela nous permet d'obtenir les informations nécessaires avec moins d'animaux. Le chiffre total de 846 animaux a été calculé en tenant compte de plusieurs facteurs clés : Nombre de groupes : Chaque expérience nécessite des groupes d'animaux suffisants (entre 5 et 10 animaux par groupe) pour garantir la fiabilité des résultats. Nous avons des groupes de contrôle et des groupes qui reçoivent différents traitements ou sont soumis à des conditions variées (épilepsie vs. non épileptiques, différents médicaments, etc.). Taux d'échec et de perte : Nous devons prévoir les animaux qui ne développeront pas l'épilepsie, ceux qui ne survivront pas au déclenchement des crises, et ceux pour lesquels les données collectées seront inexploitables. Ces taux sont essentiels à prendre en compte pour s'assurer que nous aurons au final un nombre suffisant d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement valables. Pour valider nos résultats, nous utiliserons des tests statistiques reconnus afin de nous assurer que nos conclusions sont solides et ne sont pas dues au hasard.
Raffinement
Le bien-être des animaux est notre priorité. Nous nous engageons à respecter des règles très strictes pour garantir qu'ils soient dans les meilleures conditions possibles tout au long de notre étude. Les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation. Elles ont de l'eau et de la nourriture à volonté et bénéficient d’un enrichissement dans leur cage (carré de coton pour faire un nid, bâton de bois à ronger). Pour celles qui auront un dispositif implanté, un hébergement individuel est nécessaire pour éviter toute blessure, dans ce cas une maisonnette sera ajoutée dans leur cage et nous vérifierons que ces animaux ne présentent pas de signes de stress lié à cet hébergement. Les animaux seront observés quotidiennement. Ils sont pesés régulièrement et leur état général est contrôlé. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. Nous avons perfectionné notre méthode pour déclencher l'épilepsie, nous permettant d’améliorer la récupération et la survie des animaux. Les opérations chirurgies se déroulent sous anesthésie générale et locale, avec des antidouleurs. Nous surveillons la température des animaux et protégeons leurs yeux. Après l'opération, ils sont placés dans une zone de réveil chauffée jusqu'à ce qu'ils soient complètement remis. Pendant leur récupération, nous les surveillons de près, en vérifiant leur poids et leur comportement. Nous leur donnons une nourriture liquide spéciale et veillons à ce qu'ils soient bien hydratés, surtout après le déclenchement des crises. Les animaux sont habitués progressivement à l’enregistrement de l’activité cérébrale. Lors de ces enregistrements nous les surveillons à distance, limitant ainsi les interventions humaines directes. Lors de l’administration de composés nous alternons les zones d'injection pour éviter les risques d’irritation locale. Des critères d'arrêt clairs et éthiques ont été établis pour garantir qu'aucune souffrance inutile ne soit infligée aux animaux. Ces mesures strictes témoignent de notre engagement à mener cette recherche de manière responsable, tout en cherchant à faire progresser la connaissance pour le bien des patients humains.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour notre recherche est le résultat d'une démarche scientifique rigoureuse. C'est un modèle animal standard pour l'étude de l'épilepsie, pour plusieurs raisons clés. Procédures standardisées : Les méthodes d'anesthésie et d'analgésie (gestion de la douleur) chez la souris sont très bien établies et maîtrisées. Cela nous permet de garantir le bien-être des animaux tout au long des expériences. Modèles d'épilepsie bien connus : Les techniques pour déclencher des crises d'épilepsie chez la souris ont été largement étudiées et validées par la communauté scientifique. Cela assure la fiabilité de notre modèle. Outils génétiques uniques : Certaines de nos expériences les plus avancées nécessitent l'utilisation de souris génétiquement modifiées. Ces souris sont conçues pour permettre de marquer ou de contrôler l'activité de cellules spécifiques du cerveau, une méthode impossible à réaliser chez d'autres espèces. Stade de développement pertinent : Nous utiliserons des souris de 8 semaines, un stade de développement qui correspond à l'âge adulte. Cela est important car la forme d'épilepsie que nous étudions est la plus courante chez l'adulte humain. En résumé, la souris est le meilleur modèle pour cette étude car elle nous offre les outils nécessaires pour répondre à nos questions de recherche de manière précise, fiable et en minimisant les procédures invasives.
Rôle du circuit de Papez dans la consolidation de la mémoire en sommeil paradoxal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après une biopsie de génotypage sur animal conscient, elles subissent une chirurgie d'une à deux heures pour l'injection d'un vecteur dans le cerveau et la pose d'implants d'enregistrement, parfois de fibres lumineuses, puis des tests de mémoire spatiale et une privation ciblée de sommeil paradoxal de quarante-huit heures. Le porteur ramène les effets de cette privation à une "légère fatigue, sans signe de stress objectivable" et conclut qu'aucun effet secondaire majeur n'est attendu. Environ 35 souris sont tuées avant toute expérience, leur génotype ne correspondant pas à celui recherché.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une petite région du cerveau appelée noyau mamillaire médian dans deux fonctions importantes : le sommeil paradoxal (la phase de sommeil liée aux rêves) et la mémoire. Des études récentes suggèrent que cette zone pourrait être active pendant le sommeil paradoxal et participer à la consolidation des souvenirs. Pour explorer cette idée, nous allons manipuler l’activité de certains neurones spécifiques dans cette région chez la souris, en les activant ou en les inhibant grâce à deux techniques modernes : la chémogénétique (une molécule donnée à la souris active ou bloque les neurones ciblés) et l’optogénétique (de la lumière déclenche ou arrête l’activité des neurones à des moments précis). Les souris seront observées pendant leur sommeil et soumises à des tests de mémoire, afin de comprendre si ces neurones jouent un rôle dans l’architecture du sommeil paradoxal et dans le stockage des souvenirs.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment le sommeil paradoxal (REM) – la phase du sommeil où se produisent le plus de rêves – joue un rôle actif dans la consolidation de la mémoire. En identifiant la fonction exacte des neurones du mammilaire médians et de leurs connexions, ce projet pourrait faire émerger de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies touchant la mémoire ou le sommeil. Cela concerne notamment des maladies comme la dépression, les troubles du stress post-traumatique, ou encore les affections neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, où les circuits de la mémoire sont perturbés. Enfin, ce projet s’appuie sur des outils de pointe (stimulation cérébrale ciblée, enregistrements du sommeil, suivi comportemental) permettant une analyse fine, réversible et non douloureuse de ces fonctions chez l’animal.
Procédures
Les animaux feront d’abord l’objet d’un petit prélèvement de tissu afin de déterminer leur génotype. Ce prélèvement est réalisé une seule fois et dure quelques secondes, chez des animaux conscients. Les animaux subiront ensuite une intervention chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale. Cette chirurgie comprend l’injection d’un vecteur dans une zone précise du cerveau ainsi que la pose de dispositifs permettant d’enregistrer l’activité cérébrale et musculaire et, selon les groupes, de délivrer une stimulation lumineuse. Cette intervention dure environ 1 à 2 heures. Après leur récupération, les animaux participeront à plusieurs sessions d’enregistrement de l’activité cérébrale et musculaire, réparties sur toute la durée du protocole. Ils seront également soumis à des tests de mémoire spatiale comprenant une phase de découverte, une phase d’apprentissage et une phase de test. Enfin, les animaux seront soumis une seule fois à une privation ciblée du sommeil paradoxal pendant 48 heures, suivie d’une période de récupération.
Impact sur les animaux
Le prélèvement tissulaire réalisé pour le génotypage peut entraîner un inconfort léger et de courte durée au moment de la biopsie. Les animaux peuvent présenter une douleur postopératoire transitoire après la chirurgie, accompagnée éventuellement d’une baisse temporaire de l’appétit ou de l’activité. Une gêne locale temporaire liée aux implants utilisés pour l’enregistrement ou, selon les groupes, à l’implantation de dispositifs lumineux, peut survenir sans altérer la mobilité ni les comportements spontanés. La privation ciblée d’un stade de sommeil peut entraîner une légère fatigue, sans signe de stress objectivable. Aucun effet secondaire majeur n’est attendu durant l’ensemble du protocole. Les animaux font l’objet d’un suivi quotidien permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou de détresse, avec mise en place immédiate des mesures de prise en charge adaptées.
Devenir
À la fin des expérimentations, les animaux 105 seront mise à mort pour permettre le prélèvement des cerveaux pour les analyses nécessaires au projet. Les animaux ne présentant pas le génotype requis (environ 35 animaux) seront également euthanasiés, leur génotype ne permettant pas leur inclusion dans les procédures expérimentales.
Remplacement
Les mécanismes étudiés dans ce projet, à savoir la modulation du sommeil paradoxal et la consolidation mnésique nécessitent un modèle intact, vivant, et capable de dormir. À ce jour, les alternatives in vitro (cultures neuronales, organoïdes) ou in silico (modélisation informatique) ne permettent pas de reproduire la complexité des cycles veille-sommeil ni l'interaction entre les différentes structures du circuit de Papez. Ainsi, aucune méthode de remplacement ne peut actuellement se substituer à l’utilisation de la souris pour répondre aux objectifs de ce projet. L’animal utilisé est le plus pertinent au regard des données disponibles, des outils génétiques existants, et des connaissances déjà acquises dans ce modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, indiquant qu’un minimum de 15 souris par groupe est nécessaire pour détecter un effet biologique significatif avec une puissance suffisante. Ce nombre garantit une interprétation fiable des résultats tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction. Ce nombre permet également de réaliser l’étude sur des souris mâles et femelles.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, certains traitements sont administrés sans injection, par ingestion volontaire sous forme de gelée, une méthode simple et bien acceptée. Les animaux sont observés chaque jour par l’expérimentateur afin de vérifier leur état général, y compris lorsqu’ils sont hébergés individuellement. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, ce qui permet d’endormir complètement les animaux pendant l’opération. Des traitements contre la douleur sont systématiquement administrés avant et après la chirurgie afin de réduire l’inconfort lié aux interventions. L’état de santé des animaux est évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de suivi prenant en compte leur comportement, leur apparence et leur état général. Des critères précis ont été définis pour identifier toute situation anormale. Si l’un de ces critères est atteint, l’animal est immédiatement retiré de l’étude et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Notre projet repose sur l’utilisation de souris transgéniques associée à un modèle expérimental reconnu permettant d’étudier les liens entre le sommeil et la mémoire. La souris est largement utilisée en neurosciences pour l’étude du sommeil, de la mémoire et des comportements, car son fonctionnement cérébral et ses rythmes veille-sommeil présentent de nombreuses similitudes avec ceux de l’être humain. Ce modèle permet d’étudier des phénomènes complexes tels que la consolidation de la mémoire pendant le sommeil paradoxal. Les régions cérébrales impliquées dans la mémoire et les émotions sont bien conservées entre la souris et l’homme, ce qui rend les résultats pertinents pour une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux du cerveau humain. De plus, la souris offre un large éventail d’outils expérimentaux permettant d’observer et de moduler l’activité cérébrale de manière précise et fiable, ce qui est indispensable pour tester notre hypothèse sur le rôle du sommeil paradoxal dans la mémoire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), période à laquelle le cerveau est mature et les cycles de sommeil sont stabilisés, condition nécessaire à l’étude du sommeil et des fonctions de mémoire.
Implantation d’organoïdes de peau sur un modèle de souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
660 souris vont être utilisées, chacune recevant deux implants sous la peau du dos avant qu'ils ne soient retirés en deux temps, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les interventions sont brèves: deux injections de vingt secondes sous anesthésie générale, puis un à cinq minutes pour chaque retrait. Toutes les souris sont tuées après récupération des implants, chaque greffon partant en analyse histologique. Le bénéfice annoncé, une "avancée significative" vers de nouveaux bio-pansements pour les grands brûlés, est renvoyé à plus tard, l'objectif immédiat restant de vérifier que le greffon se vascularise.
Objectifs
La restauration permanente de large surface de peau par une greffe cutanée représente une application thérapeutique d’enjeu vital, qui constitue un fer de lance pour le domaine des biothérapies tissulaires notamment dans la prise de greffe des bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés). Des études en culture cellulaire ont permis de valider différentes cellules, leur potentiel de croissance à court et long terme et leur capacité à former un bio-pansement cutané. Suite à ces résultats très favorables, il est crucial de valider le potentiel régénératif des cellules cultivées dans ce milieu à savoir leur capacité à reformer une peau fonctionnelle. L’objectif du projet est donc de valider la fonctionnalité de notre bio-pansement cutané.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de la néo-vascularisation d’un greffon cutané, permettant l’obtention d’une bonne prise de greffe, ainsi que la maturation de la peau humaine reconstruite et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux bio-pansements cutanés vascularisés pouvant faciliter la prise de greffes de peaux chez l’homme (ex : grands brulés).
Procédures
Les souris sous anesthésie générale vont subir : - Une injection 2 fois 20 secondes - Le retrait des implants 2 fois, 1 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent avoir une douleur légère et de courte durée au point j'injection et lors du retrait des implants. Elles peuvent avoir un stress lors de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après la récupération des implants., une étude histologique est prévue pour chaque implant.
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée en culture cellulaire, les processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Les modèles de cicatrisation en culture cellulaire ne peuvent pas reproduire les mécanismes de coagulation, d’inflammation, et de néo-vascularisation. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire à la suite d’une greffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études en culture cellulaire ont été effectuées pour valider le modele de notre bio-pansement cutané. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi . De plus, l’injection et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale et nous donnons un analgésiques adaptés avant le retrait de l'implant. Les animaux seront surveillés trois fois par semaine avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance.
Choix des espèces
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée in vitro, les processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Les modèles de cicatrisation ex vivo ne peuvent pas reproduire les mécanismes physiologiques. Ici seul un modèle animal permet de reproduire ces effets physiologiques à la suite d’une greffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet. Nous utiliserons des souris de 6-9 semaines pour que les animaux aient une taille suffisante pour permettre l'injection de deux implants sur le dos.
greffe d’organoide de peau vascularisé sur un modèle de souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
426 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour que les greffons soient récupérés et analysés. Chacune subit une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale puis reçoit neuf injections d'analgésiques, certaines étant hébergées seules. Il s'agit de vérifier qu'un organoïde de peau humaine cultivé en laboratoire reforme une peau fonctionnelle sur le dos d'une souris, avant d'envisager des bio-pansements pour les grands brûlés. Le porteur ramène les atteintes attendues à une douleur modérée de moyenne durée et affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité de la réparation tissulaire.
Objectifs
En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base sur l’utilisation de substituts cutanés préparé avec les cellules du patient. Des études en cultures cellulaires ont permis de valider différentes cellules, leur potentiel de croissance à court et long terme et leur capacité à former un organoïde cutané. Suite à ces résultats très favorables, il est crucial de valider le potentiel régénératif de cet organoide cutané à savoir sa capacité à reformer une peau fonctionnelle sur un modèle animal. L’objectif du projet est donc de valider la fonctionnalité d’un organoïde cutané humain, issu d’une culture cellulaire pouvant servir de bio-pansements lors de greffe de peau.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’une part, de sélectionner un milieu de culture chimiquement défini répondant aux exigences règlementaires d’un médicament et d'autre part de valider la capacité d'un organoide de peau à favoriser d’une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés).
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à 1 chirurgie de 15 minutes à 20 minutes par souris avec 3 injections d'analgésique. Les jours suivant la chirurgie, les animaux recevront 6 injections d'analgésiques.
Impact sur les animaux
L’anesthésie peut provoquer chez les animaux un stress. La chirurgie peut provoquer une douleur modérée de moyenne durée. L'animal peut subir un stress lié à son hébergement individuel.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort, les greffons sont récupérés pour analyse histologique et immunohistochimique
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée en culture cellulaire les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe ne peuvent être répliqués en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation in vitro sont limités par l’absence de mécanismes de coagulation, d’inflammation, de vascularisation et de réponse métabolique. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi. Les animaux seront surveillés avec mise en place de points limites stricts et spécifiques au projet. La greffe sera faite sous anesthesie général avec des analgésiques adaptés.
Choix des espèces
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts cutanés en 3D, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe, de sa maturation et des processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Nous avons donc choisit comme modèle la souris qui est un modèle connu nous garantissant des résultats homogènes et rapides. Nous avons choisit le modèle d'une souris adulte afin que les animaux aient une taille suffisante pour permettre de faire une greffe de l'organoide cutanée.
Impact de la température corporelle sur la réponse inflammatoire dans des modèles stériles d’infection dans un modèle murin 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection dans l'abdomen déclenche une réaction inflammatoire, puis les souris sont placées dans des environnements froids ou chauds pour reproduire une hypothermie ou une fièvre, avec échographies du cœur et prélèvements de sang sous anesthésie à 6, 24 et 48 heures. 500 souris vont être utilisées, dont 428 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'ensemble des interventions est pourtant décrit comme "conçu pour être le moins stressant possible", et les atteintes annoncées se limitent à une baisse d'activité, une perte d'appétit, un amaigrissement et des poils hérissés. Toutes sont tuées à la fin, cœur, poumons, foie, reins et cerveau étant prélevés immédiatement après la mise à mort.
Objectifs
Quand une personne est gravement malade, comme lors d’une infection sévère, son corps peut réagir par une forte inflammation et un changement de température (fièvre ou hypothermie). Ce projet cherche à comprendre si le fait d’avoir trop chaud ou trop froid influence la façon dont le corps réagit à cette situation critique. Pour cela, nous allons provoquer une inflammation contrôlée chez des souris, puis les placer dans des environnements plus ou moins chauds. Nous suivrons leur état général, leur température corporelle, et la santé de leur cœur. L’objectif est de savoir si la température du corps aggrave ou améliore la réaction du corps à l’inflammation, pour aider à mieux soigner les patients à l’hôpital. Le projet se déroule dans les 2 établissements utilisateurs: EU570 et EU0543 (uniquement les échographies).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la température du corps influence la réaction du système immunitaire lors d’une inflammation sévère, comme on en observe chez les patients en réanimation. En identifiant si le fait d’avoir de la fièvre ou au contraire d’être en hypothermie aggrave ou améliore l’état général, nous pourrons mieux adapter les soins, en particulier le contrôle de la température corporelle dans les situations critiques. À long terme, ces résultats pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints d'infections graves ou de chocs inflammatoires, en évitant des traitements inutiles ou contre-productifs, et en guidant des stratégies plus ciblées.
Procédures
Les souris reçoivent une injection au niveau de l’abdomen pour déclencher une réaction inflammatoire contrôlée (5 secondes). Elles sont ensuite placées dans des environnements plus ou moins chauds, pour simuler différents états : hypothermie (corps froid), température normale, ou fièvre. Elles portent une petite puce sous la peau permettant de suivre leur température corporelle sans les manipuler. À plusieurs moments (6h, 24h, 48h), leur état général est suivi, une échographie du cœur est réalisée sous anesthésie, et un petit prélèvement de sang est effectué sous anesthésie pour analyser leur réaction (10 secondes). L’ensemble des interventions est conçu pour être le moins stressant possible, avec des soins attentifs, des médicaments contre la douleur, et un hébergement adapté à leur confort. L'ensemble de ces interventions se déroulera dans l'unité du chercheur, sauf les échographies qui auront lieu dans une unité voisine (durée 5 minute par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de malaise temporaire à la suite de l’injection et de la réaction inflammatoire : baisse d’activité, perte d’appétit, amaigrissement, respiration ralentie, ou poils hérissés. Ces effets sont attendus et suivis de près. Ils varient selon la température ambiante et la sensibilité individuelle de chaque animal. Tous les signes sont évalués plusieurs fois par jour, à l’aide d’une grille d’observation clinique standardisée. Les procédures (injection, prélèvements, examens) sont conçues pour minimiser le stress et la douleur, grâce à l’anesthésie et à des soins de soutien adaptés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas de signes de souffrance dépassant les seuils définis. Un prélèvement sanguin ainsi que des organes (cœur, poumons, foie, reins, cerveau) seront réalisés immédiatement après l’euthanasie, à des fins d’analyse.
Remplacement
Des expériences sur cellules isolées en laboratoire (par exemple des cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins, appelées cellules endothéliales) sont réalisées en parallèle pour mieux comprendre certaines réactions inflammatoires. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier ce qui se passe dans un organisme vivant entier, où plusieurs organes interagissent en permanence. Ils ne reproduisent pas la complexité du fonctionnement global du corps (appelé homéostasie), en particulier la régulation de la température, les réactions immunitaires, ou les effets sur le cœur et les autres organes. C’est pourquoi le recours à l’animal reste nécessaire dans ce projet pour étudier ces mécanismes de manière intégrée.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict nécessaire. Les expériences sont conçues pour recueillir un maximum d’informations sur chaque souris (par exemple : température, sang, échographie, organes), ce qui évite de multiplier les groupes. Les conditions expérimentales sont réparties dans le temps pour permettre la réutilisation des équipements et limiter les pertes. Si les résultats sont clairs avant d’avoir utilisé tous les animaux prévus, les expériences seront arrêtées plus tôt. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique
Raffinement
Tout est mis en œuvre pour limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long de l’expérience. Les souris reçoivent des médicaments contre la douleur de manière préventive et régulière. Elles sont surveillées plusieurs fois par jour avec une grille d’observation précise (état général, comportement, respiration, apparence). Si une souris montre des signes de souffrance trop importants, elle est immédiatement retirée de l’étude. Les souris vivent en groupe, dans des cages enrichies avec de la nourriture adaptée, du matériel pour faire leur nid, et des conditions de température contrôlées. Les manipulations sont faites par du personnel formé et expérimenté, avec un souci constant du bien-être animal. Les animaux seront transportés entre les deux unités (5 minutes) dans une cage de transport homologuée.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris adultes, car elles permettent d'étudier de façon fiable les effets de l’inflammation et de la température sur l’organisme. Elles sont de taille adaptée pour réaliser les examens (température, échographie du cœur, prise de sang) de manière précise, sans stress inutile. De plus, la souris est une espèce bien connue en recherche médicale : on dispose de beaucoup de connaissances et d’outils pour analyser ce qu’il se passe dans son corps, ce qui facilite la compréhension des résultats. Enfin, notre équipe a une solide expérience avec ce modèle, ce qui garantit des manipulations maîtrisées et respectueuses du bien-être animal.
Photomodulation de la douleur par la lumière dans un contexte de migraine induite par un neuropeptide (1/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Cinq injections sous-cutanées d'un neuropeptide déclenchant la migraine, un jour sur deux, puis des mesures du seuil de douleur à la patte et à la face, une sensation de brûlure provoquée sur la queue, l'implantation d'électrodes sur la cornée et d'une caméra vissée sur le crâne: 3 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique attendre une hypersensibilité sensorielle et une hypersensibilité à la douleur, ainsi qu'un inconfort lié au surpoids de l'endoscope fixé sur la tête. L'objectif déclaré est d'évaluer l'effet analgésique de la lumière verte dans un modèle de migraine, une piste qu'il présente comme non invasive et peu coûteuse. Toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leur vieillissement au cours de l'expérience.
Objectifs
Il est estimé qu’une personne sur 7 dans le monde souffre de migraine représentant plus de 1 milliard d’individus. La prévalence de la migraine a augmenté de 732,56 millions à 1,16 milliard de cas entre 1990 et 2021. En France, 12 millions de personnes sont concernées. La migraine affecte environ 15 % de la population. Alors que les femmes ont une incidence et prévalence globale plus élevée que les hommes, les hommes présentent une augmentation 4 à 5 fois plus. La migraine est plus courante chez les individus âgés de 20 à 50 ans qui correspond à la population active. Elle représente la 6ème cause de handicap dans le monde. Alors que la lumière bleue peut aggraver ou déclencher la migraine, la lumière verte présenterait un effet bénéfique (analgésique). Dans un contexte de nécessité de développement de nouvelle approches thérapeutiques sans effet secondaire, la thérapie par la lumière apparait comme une option intéressante, non invasive et peu couteuse. L’exposition à des lumière de longueur d’onde spécifique ont déjà montré des effets bénéfiques dans différentes conditions pathologique tels que les cancers, les maladies de peau, les perturbations du sommeil et de l’humeur. Récemment, la thérapie utilisant de la lumière LASER ou de faible intensité a été utilisée dans le cadre de la douleur incluant des douleurs dorsales, fibromyalgies, neuropathique ou migraineuse. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les mécanismes impliqués dans l’analgésie induite par une exposition à la lumière verte dans un modèle de migraine et définir la meilleure stratégie d’exposition pour un efficacité optimale. Le projet se déroulera sur 2 EU (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau de la rétine, des noyaux thalamiques et du cortex. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence la capacité de la lumière à moduler la sensibilité à la douleur. L'objectif étant en particulier de mettre en évidence la capacité analgéqiue de la lumière verte qui pourrait alors être évaluer en clinique et apporter une approches compémentaires du traitment de la douleur.
Procédures
injections sous cutanées de neuropeptides une fois par jour tous les 2 jours avec au total 5 injections par animal; durée de l'injection
Impact sur les animaux
hypersensibilité sensorielle; hypersensbilité à la douleur; la pose de l'électrode sur la cornée peut entrainer des irritations post-enregistrement (très rarement observé par expérience car l'éectrode est légèrement posée sur la cornée sans déplacement; Inconfort lié à la présence de l'endoscope sur la tête de l'animal qui génère un léger surpoids; Normalement le neuropeptide n'induit pas de stress et d'anxiété mais certaines souris peuvent avoir une réaction différente à la généralité; Douleur légère (piqûre) lors des injections; Inconfort lié à la présence des vis pour les VEP et de l'endoscope.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés du fait de leur vieillissement au cours de la procédure.
Remplacement
Le projet prend en compte les interactions complexes entre la rétine (la lumière) et le cerveau, impliquées dans la migraine et ses symptômes associés. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal afin d’avoir une vision générale du système et de pouvoir étudier les mécanismes de régulation et d’intégration de la douleur migraineuse.
Réduction
Notre expertise dans les domaines techniques utilisés dans ce projet nous permet d’établir le nombre d’animaux par groupe de manière fiable pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre indiqué dans les différentes procédures correspond au maximum d’animaux mais nous procédons par série de manière à ce que si tout se passe de manière optimale nous puissions réduire le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux tout au long des procédures, les souris seront surveillées par les personnes compétentes et manipulées tous les jours par l’expérimentateur pour permettre une habituation optimale. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération suite à une anesthésie, elles auront un environnement enrichi avec accès libre à la nourriture et l’eau. Pour les stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), elles sont limitées en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour le test de sensibilité thermique, pour limiter le ressenti d'une sensation de brulure par les animaux, la température est augmentée le plus progressivement possible pour atteindre le seuil le plus précis et limiter cette sensation sans compromettre le test. Après les enregistrements électrorétinographiques, l'oeil est réhydraté. La nourriture est placée dans la cage pour faciliter l'accès en particulier pour les animaux avec l'endoscope et ceux avec les vis pour les enregistrements. Lors de l'implantation des électrodes, les animaux seront placés sous médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) utilisé pour traiter la douleur et l'inflammation, pendant 3 jours (jours de la chirurgie + 2 jours). Avant chaque test les animaux suivront une phase d'habituation. Pour le transport, les animaux seront préalablement habitués aux conditions de transport à savoir placés dans leur cage dans un carton de transport ventillé qui sera soulevé et légèrement manipuler quotidiennement. Les animaux seront placés dans des cages propres la veille du transport et auront des croquettes humidifiées dans la cages. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur ou la souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez le rat. Le choix de travailler chez l'adulte vient du fait que la migraine est plus fréquente chez l'adulte que chez l'enfant. De plus les symptômes et les mécanismes chez l'enfant peuvent être différents. Aussi dans le cadre de ce projet nous nous limiterons à l'étude chez l'adulte.
Rôles d’éléments régulateurs dans le remodelage et la régénération cardiaque post-infarctus chez la souris adulte et le nouveau-né
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Deux âges servent à la même opération, des nouveau-nées de 1 à 3 jours dont le cœur se régénère et des adultes de plus de huit semaines dont le cœur ne se régénère pas : 3 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit le blocage d'une artère du cœur pour provoquer un infarctus, opération de quinze à vingt minutes, plus une injection dans le cœur ou dans l'abdomen et une échocardiographie. Le porteur décrit une douleur modérée de courte durée après l'infarctus provoqué, avec baisse d'activité ou d'appétit possible. Il écrit que les souris dont l'état ne s'améliore pas sont "endormies de manière définitive" pour éviter une souffrance prolongée, formule qui désigne leur mise à mort.
Objectifs
Ce projet vise à développer une thérapie génique pour aider le cœur à se réparer après un infarctus. L’objectif est de stimuler la multiplication des cellules cardiaques afin d’améliorer la régénération du tissu endommagé. Des outils de thérapie génique sont injectés dans le cœur de souris pour tester leur capacité à réactiver des mécanismes de réparation. Des modèles génétiques innovants permettent de suivre la division des cellules cardiaques et d’évaluer l’efficacité des traitements. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour restaurer la fonction cardiaque après un infarctus.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait avoir plusieurs retombées majeures dans le domaine de la santé cardiovasculaire : - Progrès thérapeutiques : En testant des vecteurs de thérapie génique ciblant les cellules du cœur, le projet explore des pistes innovantes pour stimuler la régénération cardiaque après un infarctus, une pathologie très fréquente et actuellement incurable sur le plan tissulaire. Ces approches pourraient à terme compléter ou améliorer les traitements existants (médicaments, chirurgie, dispositifs médicaux). - Application à d'autres pathologies : Les stratégies développées ici, telles que la modulation de séquences régulatrices, pourraient également être transposables à d’autres organes ou maladies dégénératives, ouvrant la voie à des approches plus larges en médecine régénérative. - Réduction de la charge socio-économique : L’infarctus du myocarde est l’une des principales causes de décès et d’invalidité dans le monde. Améliorer la capacité du cœur à se réparer permettrait de réduire les séquelles, les ré-hospitalisations et le recours à des traitements lourds, avec un impact significatif pour les patients et les systèmes de santé
Procédures
Injection ciblée dans le cœur ou injection intrapéritonéale, durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chirurgie cardiaque simulant un infarctus du myocarde, durée approximative 15 à 20 minutes par animal. Échocardiographie : durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chaque intervention est réalisée une seule fois par animal. Après l’intervention, les animaux sont surveillés et maintenus avec leurs congénères dans des conditions adaptées.
Impact sur les animaux
Ce projet implique des interventions cardiaques qui peuvent provoquer : • Une gêne légère et passagère au point d’injection. • Un stress temporaire lié à la manipulation. • Une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. • Une gêne très brève lors des échographies. Les animaux sont observés attentivement après chaque intervention. Si leur état ne s’améliore pas rapidement, ils sont retirés de l’étude et endormis de manière définitive pour éviter toute souffrance prolongée.
Devenir
L'ensemble des souris de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été́ réalisées soit au court des procédures soit seront réalisées en post mortem.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle in vitro (organoïdes, culture de cardiomyocytes, co-cultures) ne permet de reproduire la complexité de la réponse tissulaire et systémique à un infarctus du myocarde. Des modèles cellulaires sont utilisés en complément pour l’étude de mécanismes spécifiques, mais ne peuvent remplacer l’expérimentation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Des comparaisons intra-individuelles et des suivis longitudinaux (imagerie non-invasive, mesures répétées) seront privilégiés autant que possible pour réduire le nombre de souris par groupe.
Raffinement
Deux protocoles d’anesthésie/analgésie (Xylazine/Kétamine ou Isoflurane/Buprénorphine) sont proposés, permettant une adaptation aux besoins expérimentaux et au confort animal. La chirurgie est réalisée par un personnel formé et expérimenté, avec un protocole stéréotypé et rigoureux. Le contrôle de la douleur est assuré pendant et après l’intervention, avec une surveillance étroite post-opératoire. Les conditions d’hébergement sont optimisées : cages chauffées, enrichies, récupération en groupe. Des points limites sont définis et des critères de mise à mort sont appliqués en cas de souffrance non contrôlable
Choix des espèces
Ce projet utilise la souris comme modèle, car elle est aujourd’hui l’animal de référence pour l’étude de l’infarctus du myocarde. La technique employée consiste à bloquer une petite artère du cœur afin de reproduire les principales étapes observées chez l’humain : destruction d’une partie du muscle cardiaque, réaction inflammatoire, formation de cicatrice et perte partielle de fonction. La souris a été choisie car : • Elle permet d’observer et de suivre précisément les cellules du cœur. • Sa petite taille facilite l’étude du cœur avec des méthodes d’imagerie et d’analyse détaillées. • Les réactions de son système cardiovasculaire sont bien connues et stables. • L’équipe possède une grande expérience dans la réalisation de ce type de chirurgie. • Il n’existe pas de méthode en laboratoire permettant de reproduire l’ensemble des réactions de l’organisme après un infarctus. Deux âges sont étudiés : • Les nouveau-nés (1 à 3 jours) : leur cœur se régénère naturellement. • Les adultes (plus de 8 semaines) : leur cœur ne se régénère pas, ce qui correspond mieux à la situation humaine.
Résolution de l’inflammation dans un modèle de lésion endovasculaire fémorale
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
88 souris vont subir une chirurgie unique de vingt minutes, ouverture de la peau, insertion puis retrait d'un guide dans l'artère de la patte gauche, suture : 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, quatre opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Le porteur chiffre à environ 10 % la mortalité liée à cette opération, et signale que l'artère peut se déchirer et provoquer une hémorragie au moment où le guide y pénètre. Le geste reproduit la lésion que laisse un cathéter ou un ressort chez les patients dont les artères se rebouchent, l'équipe voulant montrer que l'épaississement de la paroi vient en partie d'un défaut de résolution de l'inflammation. Toutes sont tuées pour prélever les artères fémorales, le porteur notant que ce prélèvement risque d'induire une mort des tissus.
Objectifs
Les lésions internes des artères causées par le débouchage des artères malades avec un ballonnet et l'implantation d'un ressort gardant les parois artérielles dilatées, contribuent souvent à l'épaississement de la paroi artérielle altérant le passage de sang. Dans ces cas, cela nécessite la ré-opération des patients par d’autres interventions plus lourdes comme les pontages. En mimant le phénomène dans des souris normales et dépourvues d'un système impliqué dans la résolution de l’inflammation, nous souhaitons montrer que l'épaississement de la paroi artérielle est dû en partie à un défaut de résolution de l'inflammation. Nous voulons également décortiquer les mécanismes mis en jeux dans le rebouchage des artères après une première intervention.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettrons de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans le rebouchage des artères après intervention. Il permettront également d’utiliser le nouveau concept d’activation de la résolution de l'inflammation pour l’amélioration de la prise en charge après le débouchage des artères ou la pose d'un ressort gardant les parois artérielles ouvertes. Si ces résultats sont concluants, de nouveaux traitements pourraient être développés pour limiter l'épaissement de la paroi artérielle et favoriser la cicatrisation vasculaire lors du débouchage des artères ou la pose de ressorts. Les essais chez l'animal se font le plus souvent chez les mâles, nous proposons de compléter ces données chez la femelle pour voir si il faut adapter les traitements différemment chez l'homme et la femme.
Procédures
les 88 animaux seront soumis à un anti-douleur pré-opératoire et post-opératoire par injection sous cutanée et une procédure chirurgicale (ouverture de la peau, insertion et enlèvement d'un guide dans l'artère de la patte gauche et suture de la peau) qui durent 20 minutes en tout.
Impact sur les animaux
L’injection d'antidouleur sous la peau induit une légère douleur de quelques secondes ; L’anesthésie pour la chirurgie, de 20 minutes; La mortalité due à la chirurgie est possible. Basée sur l’expérience, celle-ci est d’environ 10%. Au moment de l’entrée du guide dans l’artère, celle-ci peut se déchirer et provoquer une hémorragie. La zone d’intervention peut provoquer un gonflement ou une ecchymose dans les premières heures suivant l'intervention.
Devenir
A la fin de la procédure unique, tous les animaux sont mis à mort puisque les artères femorales seront prélevées. Ceci risque d'induire une mort des tissus.
Remplacement
Des études in vitro sur les cellules musculaires d’artère issues de souris dépourvues d’un système impliqué dans la résolution de l’inflammation ont montré qu’elles avaient une capacité de migration in vitro plus importante que les cellules issues de souris sauvages. Ce phénomène est observée après le débouchage d’un d’une artère par un cathéter. De plus, le rôle de ce système de résolution de l’inflammation dans les maladies qui induisent le retrécissement voir l'obstruction des artères par des plaques de gras (athérosclérose) a été montré in vitro et in vivo au laboratoire. Cependant, nous ne pouvons pas reproduire la lésion engendrée par la pose d’un ressort ou le débouchage de l’artère par un cathéter in vitro car cela nécessite une composante inflammatoire apportant d’autres types cellulaires comme les globules blancs ainsi que plusieurs couches de l’artère, non modélisable actuellement. Nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo rendant le remplacement impossible pour l’heure.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, l'effectif du nombre d'animaux requis pour la procédure a été calculée avec un logiciel de statistique adapté sur la base d'une étude préliminaire menée par nos collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront surveillées étroitement pendant l’heure suivant l’opération. Un anti-douleur pré- et post-opératoire et une anesthésie pendant la chirurgie seront réalisées. Du gel ophtalmique sera déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement lors de l’anesthésie. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étape de la procédure. Après l’étape de réveil, les souris sont replacées avec leurs congénères initiaux.
Choix des espèces
Les données préliminaires et connaissances de la biologie vasculaires ont été obtenues sur des souris. Les mécanismes moléculaires d'épaississement de la paroi artérielle après le passage d'un cathéter pour déboucher l'artère malade ou la pose d'un ressort chez la souris sont très proches de ceux observés chez l’homme. D’autre part, le modèle génétiquement modifié n’est disponible que chez la souris. Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet. Il s’agit de l’âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Prévoir l’efficacité de la radiothérapie dans les cancers ORL grâce à l’imagerie médicale et l’analyse biologique EU1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toute altération de l'état de santé déclenche une injection anti-inflammatoire, et une injection d'analgésique si la douleur dure plus de 24 heures. 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour l'analyse des tumeurs, des ganglions, du foie et des poumons. Une tumeur ORL est implantée dans leur patte arrière gauche, puis viennent une ou deux IRM de 45 minutes et, pour la moitié d'entre elles, une séance de radiothérapie de cinq minutes, chaque acte sous anesthésie gazeuse. Le porteur annonce que l'irradiation peut brûler la peau 24 à 48 heures après la séance, puis ajoute n'avoir jamais observé ces nuisances à cette dose, sans indiquer sur combien d'animaux.
Objectifs
Les cancers de la tête et du cou (comme ceux de la bouche ou de la gorge) sont parmi les plus fréquents dans le monde. Chaque année, ils sont responsables de plus de 440 000 décès. L’un des traitements les plus utilisés est la radiothérapie, qui consiste à envoyer des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Mais ce traitement ne fonctionne pas toujours aussi bien : certaines parties de la tumeur résistent, ce qui complique la guérison. Pourquoi certaines cellules cancéreuses survivent-elles à la radiothérapie ? C’est la question à laquelle notre projet veut répondre. Pour cela, nous allons utiliser une nouvelle méthode appelée radiomique. Elle permet d’analyser très finement les images médicales (IRM) des tumeurs. Grâce à des outils informatiques, on peut extraire des informations que l’œil humain ne voit pas. Cela pourrait nous aider à repérer, à l’avance, les zones d’une tumeur qui risquent de ne pas bien réagir au traitement. Mais pour l’instant, on ne sait pas encore si ce que l’on voit sur les images correspond bien à la réalité des tissus malades. Notre étude va donc tester cette idée dans un modèle animal (des souris). Des cellules cancéreuses humaines seront implantées dans la patte des souris. Ensuite, elles recevront une radiothérapie, et passeront des examens IRM avant et après le traitement. On analysera ensuite les tumeurs pour comparer ce que montrent les images avec ce qu’on observe réellement dans les tissus. Ce projet se déroulera sur 3 EU différents : pour des fins d’hébergement, de radiothérapie et d’imagerie. Le projet se déroule en deux grandes étapes. La première servira à mettre au point les bonnes conditions expérimentales (taille des tumeurs, bons moments pour les IRM, méthode d’analyse des tissus, etc.). Dans la deuxième étape, nous comparerons deux groupes de souris (traitées ou non) pour vérifier si certaines caractéristiques visibles à l’IRM permettent de prédire la réponse à la radiothérapie. Si cette méthode fonctionne, elle sera testée ensuite chez l’humain. À long terme, l’objectif est de mieux personnaliser les traitements : si on sait à l’avance qu’une tumeur va mal réagir à la radiothérapie, on pourra adapter la stratégie, par exemple en augmentant la dose ou en ajoutant un autre traitement. Cela permettrait d’améliorer les chances de guérison tout en réduisant les effets secondaires.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique sur la souris sera suivi par la validation des résultats sur pièces chirurgicales de patients (biopsies), suivi d’une étude clinique de phase II de radiothérapie adaptative en fonction des résultats de ce projet.
Procédures
70 souris recevront une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche. Ces 70 souris recevront différentes interventions : 14 souris recevront 2 IRM (45 minutes chaque séance) espacées d’au moins 5 jours (EU imagerie). 28 souris recevront une séance unique de radiothérapie (5 minutes) (EU radiothérapie), dont 14 seulement recevront une IRM (EU hébergement et EU imagerie). 28 souris recevront une séance d’IRM de 45 minutes (EU imagerie), dont 14 souris recevront une séance unique de radiothérapie qui dure 5 minutes (EU radiothérapie). Avant toute injection de cellules tumorales, IRM, radiothérapie : les souris sont anesthésiées par un gaz volatile anesthésiant.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut générer une inconfort local léger et transitoire. La masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération. La radiothérapie peut causer des brûlures autour du site irradié 24 à 48 heures post-irradiation. Néanmoins, nous n’avons jamais observé ces nuisances à cette dose.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour analyses histologiques de la tumeur. De plus, d’autres organes comme les ganglions, le foie et les poumons seront prélever pour des expérimentations ultérieures afin d’étudier la dissémination tumorale.
Remplacement
A l’heure actuelle, aucun modèle informatique, in vitro ou organoïde ne permet de reproduire fidèlement la complexité des zones résistantes et la réponse aux radiations ionisantes in vivo. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc incontournable pour garantir la pertinence des résultats avant une transposition à l’Homme.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été rigoureusement calculé afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux engagés dans l’étude. Chaque groupe expérimental comporte ainsi un effectif restreint, mais suffisant pour assurer la validité scientifique des conclusions. Selon l’expérience de l’équipe et les équipes qui travaillent en collaboration sur ce projet, 12 souris par groupe sont nécessaires afin de mener l’étude et de garantir une puissance statistique suffisante. Sur la base de l’expérience de l’équipe, un taux d’échec de pousse tumorale d’environ 15 % est observé, donc . Pour compenser ces pertes et disposer d’un nombre suffisant de données exploitables, 14 souris par groupe sont prévues.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, tout en garantissant la validité scientifique des données recueillies. Une habituation à la manipulation sera réalisée progressivement. Le choix du site d’injection des cellules tumorales (patte postérieure gauche, en sous-cutanée) a été réfléchi pour limiter la gêne fonctionnelle et éviter l’exposition des organes internes sensibles lors de la radiothérapie. Ce site permet également une croissance tumorale plus homogène et plus facilement mesurable, tout en étant bien maîtrisé par l’équipe. Le suivi des animaux est rigoureux : les animaux sont observés au minimum trois fois par semaine, et quotidiennement à partir de l’apparition de la tumeur. Toute altération de leur état de santé entraînera l’administration d’antalgiques : injection en sous-cutanée d’anti-inflammatoire. Si la douleur persiste plus que 24h, une injection d’analgésique sera effectuée. Si nécessaire, l’expérimentation sera arrêtée selon les points limites mis en place. Les anesthésies nécessaires aux injections de cellules, examens IRM et à l’irradiation sont réalisées avec un apport en oxygène, pour une induction et un réveil rapide. Un tapis chauffant est utilisé pour éviter l’hypothermie, et une surveillance post-anesthésique est assurée jusqu’au retour complet à l’état de veille. Le transport des animaux entre les sites d’hébergement et d’imagerie est limité au strict nécessaire (5 minutes sur un chariot adapté) et le transport entre le site de radiothérapie et d’imagerie sera effectué dans des véhicules à température contrôlée, avec des caisses ventilées adaptées (25 minutes). Les trajets sont courts et les animaux sont replacés rapidement dans un environnement familier.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été choisi pour sa pertinence biologique, sa robustesse et son large usage en recherche préclinique en oncologie. Son génome est entièrement connu, avec une forte similarité fonctionnelle avec celui de l’Homme. Ce modèle permet une vision intégrée de la tumeur et de son microenvironnement. Le modèle tumoral utilisé, basé sur l’injection de cellules tumorales issues de carcinomes oraux chimiquement induits, est bien documenté et reproduit les caractéristiques des cancers ORL humains. L’utilisation de souris immunocompétentes permet d’étudier les interactions entre tumeur, radiothérapie et système immunitaire. Leur petite taille les rend compatibles avec les plateformes d’IRM préclinique et d’irradiation ciblée. Ce choix favorise ainsi une cohérence entre les données d’imagerie et histologiques animales, et celles prévues chez l’Homme, renforçant la validité translationnelle du modèle. Les souris seront âgées de 7 semaines à la réception afin qu’elles aient atteint le stade adulte et un système immunitaire mature lors de la séquence thérapeutique.
Prévoir l’efficacité de la radiothérapie dans les cancers ORL grâce à l’imagerie médicale et l’analyse biologique EU3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Déplacées entre trois établissements, l'un pour l'hébergement, l'un pour la radiothérapie, l'un pour l'imagerie, 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche, puis selon les groupes une ou deux IRM de 45 minutes et une séance unique de radiothérapie de cinq minutes, sous anesthésie gazeuse chaque fois. Le porteur signale que la masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération, et que l'irradiation peut brûler la peau dans les 24 à 48 heures. Il retient 12 souris par groupe pour la puissance statistique et en prévoit 14, pour compenser environ 15 % d'échecs de pousse tumorale.
Objectifs
Les cancers de la tête et du cou (comme ceux de la bouche ou de la gorge) sont parmi les plus fréquents dans le monde. Chaque année, ils sont responsables de plus de 440 000 décès. L’un des traitements les plus utilisés est la radiothérapie, qui consiste à envoyer des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Mais ce traitement ne fonctionne pas toujours aussi bien : certaines parties de la tumeur résistent, ce qui complique la guérison. Pourquoi certaines cellules cancéreuses survivent-elles à la radiothérapie ? C’est la question à laquelle notre projet veut répondre. Pour cela, nous allons utiliser une nouvelle méthode appelée radiomique. Elle permet d’analyser très finement les images médicales (IRM) des tumeurs. Grâce à des outils informatiques, on peut extraire des informations que l’œil humain ne voit pas. Cela pourrait nous aider à repérer, à l’avance, les zones d’une tumeur qui risquent de ne pas bien réagir au traitement. Mais pour l’instant, on ne sait pas encore si ce que l’on voit sur les images correspond bien à la réalité des tissus malades. Notre étude va donc tester cette idée dans un modèle animal (des souris). Des cellules cancéreuses humaines seront implantées dans la patte des souris. Ensuite, elles recevront une radiothérapie, et passeront des examens IRM avant et après le traitement. On analysera ensuite les tumeurs pour comparer ce que montrent les images avec ce qu’on observe réellement dans les tissus. Ce projet se déroulera sur 3 EU différents : pour des fins d’hébergement, de radiothérapie et d’imagerie. Le projet se déroule en deux grandes étapes. La première servira à mettre au point les bonnes conditions expérimentales (taille des tumeurs, bons moments pour les IRM, méthode d’analyse des tissus, etc.). Dans la deuxième étape, nous comparerons deux groupes de souris (traitées ou non) pour vérifier si certaines caractéristiques visibles à l’IRM permettent de prédire la réponse à la radiothérapie. Si cette méthode fonctionne, elle sera testée ensuite chez l’humain. À long terme, l’objectif est de mieux personnaliser les traitements : si on sait à l’avance qu’une tumeur va mal réagir à la radiothérapie, on pourra adapter la stratégie, par exemple en augmentant la dose ou en ajoutant un autre traitement. Cela permettrait d’améliorer les chances de guérison tout en réduisant les effets secondaires.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique sur la souris sera suivi par la validation des résultats sur pièces chirurgicales de patients (biopsies), suivi d’une étude clinique de phase II de radiothérapie adaptative en fonction des résultats de ce projet.
Procédures
70 souris recevront une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche. Ces 70 souris recevront différentes interventions : 14 souris recevront 2 IRM (45 minutes chaque séance) espacées d’au moins 5 jours (EU imagerie). 28 souris recevront une séance unique de radiothérapie (5 minutes) (EU radiothérapie), dont 14 seulement recevront une IRM (EU hébergement et EU imagerie). 28 souris recevront une séance d’IRM de 45 minutes (EU imagerie), dont 14 souris recevront une séance unique de radiothérapie qui dure 5 minutes (EU radiothérapie). Avant toute injection de cellules tumorales, IRM, radiothérapie : les souris sont anesthésiées par un gaz volatile anesthésiant.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut générer une inconfort local léger et transitoire. La masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération. La radiothérapie peut causer des brûlures autour du site irradié 24 à 48 heures post-irradiation. Néanmoins, nous n’avons jamais observé ces nuisances à cette dose.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour analyses histologiques de la tumeur. De plus, d’autres organes comme les ganglions, le foie et les poumons seront prélever pour des expérimentations ultérieures afin d’étudier la dissémination tumorale.
Remplacement
A l’heure actuelle, aucun modèle informatique, in vitro ou organoïde ne permet de reproduire fidèlement la complexité des zones résistantes et la réponse aux radiations ionisantes in vivo. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc incontournable pour garantir la pertinence des résultats avant une transposition à l’Homme.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été rigoureusement calculé afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux engagés dans l’étude. Chaque groupe expérimental comporte ainsi un effectif restreint, mais suffisant pour assurer la validité scientifique des conclusions. Selon l’expérience de l’équipe et les équipes qui travaillent en collaboration sur ce projet, 12 souris par groupe sont nécessaires afin de mener l’étude et de garantir une puissance statistique suffisante. Sur la base de l’expérience de l’équipe, un taux d’échec de pousse tumorale d’environ 15 % est observé, donc . Pour compenser ces pertes et disposer d’un nombre suffisant de données exploitables, 14 souris par groupe sont prévues.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, tout en garantissant la validité scientifique des données recueillies. Une habituation à la manipulation sera réalisée progressivement. Le choix du site d’injection des cellules tumorales (patte postérieure gauche, en sous-cutanée) a été réfléchi pour limiter la gêne fonctionnelle et éviter l’exposition des organes internes sensibles lors de la radiothérapie. Ce site permet également une croissance tumorale plus homogène et plus facilement mesurable, tout en étant bien maîtrisé par l’équipe. Le suivi des animaux est rigoureux : les animaux sont observés au minimum trois fois par semaine, et quotidiennement à partir de l’apparition de la tumeur. Toute altération de leur état de santé entraînera l’administration d’antalgiques : injection en sous-cutanée d’anti-inflammatoire. Si la douleur persiste plus que 24h, une injection d’analgésique sera effectuée. Si nécessaire, l’expérimentation sera arrêtée selon les points limites mis en place. Les anesthésies nécessaires aux injections de cellules, examens IRM et à l’irradiation sont réalisées avec un apport en oxygène, pour une induction et un réveil rapide. Un tapis chauffant est utilisé pour éviter l’hypothermie, et une surveillance post-anesthésique est assurée jusqu’au retour complet à l’état de veille. Le transport des animaux entre les sites d’hébergement et d’imagerie est limité au strict nécessaire (5 minutes sur un chariot adapté) et le transport entre le site de radiothérapie et d’imagerie sera effectué dans des véhicules à température contrôlée, avec des caisses ventilées adaptées (25 minutes). Les trajets sont courts et les animaux sont replacés rapidement dans un environnement familier.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été choisi pour sa pertinence biologique, sa robustesse et son large usage en recherche préclinique en oncologie. Son génome est entièrement connu, avec une forte similarité fonctionnelle avec celui de l’Homme. Ce modèle permet une vision intégrée de la tumeur et de son microenvironnement. Le modèle tumoral utilisé, basé sur l’injection de cellules tumorales issues de carcinomes oraux chimiquement induits, est bien documenté et reproduit les caractéristiques des cancers ORL humains. L’utilisation de souris immunocompétentes permet d’étudier les interactions entre tumeur, radiothérapie et système immunitaire. Leur petite taille les rend compatibles avec les plateformes d’IRM préclinique et d’irradiation ciblée. Ce choix favorise ainsi une cohérence entre les données d’imagerie et histologiques animales, et celles prévues chez l’Homme, renforçant la validité translationnelle du modèle. Les souris seront âgées de 7 semaines à la réception afin qu’elles aient atteint le stade adulte et un système immunitaire mature lors de la séquence thérapeutique.
CONSEQUENCE DU VIEILLISSEMENT HEPATIQUE SUR LES MALADIES LIEES A L’AGE – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
6 435 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le foie et les autres organes. Selon les lots, elles subissent une chirurgie hépatique, une injection de bactéries à doses croissantes, un régime gras de quatre à douze semaines, ou deux injections abdominales par semaine d'un agent qui provoque une fibrose du foie, presque toutes recevant en plus un prélèvement de 500 microlitres de sang sous anesthésie. Le porteur écrit que la fibrose et la cirrhose provoquées sont indolores et n'affectent pas l'état général, tout en admettant que les fortes doses de bactéries peuvent tuer une partie des souris. Il utilise des souris de 20 à 24 mois pour représenter des patients de plus de 75 ans, et des souris génétiquement modifiées dont le vieillissement est accéléré dès 6 mois.
Objectifs
Le vieillissement de la population mondiale est un problème de santé publique majeur. À mesure que les gens vieillissent, de nombreux organes de leur corps commencent à fonctionner moins bien, ce qui augmente le risque de maladies liées à l'âge. Une des choses qui se passe lorsque nous vieillissons, c'est que la paroi de notre intestin devient plus perméable, ce qui provoque une inflammation dans tout notre corps, un phénomène que l'on appelle "inflammaging". Cette inflammation est impliquée dans de nombreuses maladies qui surviennent avec l'âge, notamment les problèmes de foie et les infections. Le foie joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité, car il filtre le sang provenant de l'intestin et contient des cellules spéciales qui combattent l'inflammation. Cependant, le foie lui-même peut être affecté par le vieillissement, ce qui peut contribuer à l'inflammation générale dans le corps et au développement de maladies liées à l'âge. Des recherches récentes ont montré que, chez la souris, le foie est l'organe qui accumule le plus de cellules "vieillissantes" au fil du temps. Parmi les cellules du foie, les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins semblent être particulièrement touchées par ce processus de vieillissement. L'objectif de ce projet de recherche est d'étudier comment le vieillissement des cellules du foie affecte les maladies liées à l'âge, en mettant l'accent sur les infections et les problèmes de foie comme la stéatohépatite non alcoolique (NASH, maladie du foie gras) et la fibrose. À terme, cette recherche pourrait aider à développer de nouvelles thérapies qui ciblent spécifiquement le foie pour lutter contre l'inflammation liée à l'âge et prévenir certaines maladies liées au vieillissement.
Bénéfices attendus
L’impact du vieillissement du foie, en particulier des cellules endothéliales et des hépatocytes (cellules majoritaire du foie), sur les maladies liées à l’âge, n'a pas encore été étudié. Les maladies chroniques du foie sont très courantes, avec environ 700 000 cas de maladie hépatique sévère (cirrhose) estimés en France. La stéatohépatite non alcoolique (maladie du foie gras) est l'une des principales causes de ces maladies, mais il n'existe actuellement aucun traitement efficace. De manière plus générale, les mécanismes sous-jacents à l'évolution des maladies du foie vers la cirrhose et ses complications, notamment le cancer du foie, demeurent mal compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques. Ce travail se distingue par son choix de se concentrer sur les deux populations cellulaires les plus touchées par le vieillissement dans le foie. Le foie joue un rôle clé dans la gestion des agents pathogènes circulants du système digestif, les interactions avec le système immunitaire et la régulation de l'inflammation générale. En identifiant les altérations des processus immunitaires résultant du vieillissement et susceptibles d'augmenter la vulnérabilité aux infections et aux maladies du foie, il devient possible d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, le foie étant un organe facilement accessible, cela ouvre des perspectives prometteuses en termes de futurs traitements.
Procédures
Les procédures seront réalisées sur des lots d’animaux : - Un lot d’animaux subira une chirurgie sans réveil avec anesthésie générale afin de récupérer les cellules du foie et de les analyser. (15 minutes). - Un lot d’animaux subira une chirurgie avec anesthésie générale et réveil afin d'injecter des cellules dans un vaisseau (20minutes). - Un autre lot d’animaux subira une inoculation de virus afin de rétablir l'expression d’un gène (10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris recevra une injection de bactéries afin d'étudier l'effet du vieillissement du foie sur la lutte contre l’infection.(10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris sera soumis à un régime gras pendant 4 ou 12 semaines. - Un lot de souris subira des injections 2 fois par semaine dans le ventre d’un agent induisant une fibrose hépatique (10 secondes avec contention de la souris). Pour presque toutes les procédures, les animaux auront un prélèvement de sang (500 µl) sous anesthésie générale. (10 minutes avec ouverture de la souris et prélévement de sang) (MODIFICATION) - plusieurs lot de souris recevront des doses croissantes de bactéries afin de trouver la dose optimale pour induire une infection non léthal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : * (MODIFICATION) Pour les modèles d'infections bactériennes, les fortes doses peuvent entrainer une mortalité chez une partie des souris. Mais nous avons mis en place un suivi afin de veiller au bien-être animal. * Dans le modèle de régime riche en graisses (modèle de la maladie du foie gras), les effets sur les souris incluent une prise de poids importante, ce qui peut limiter leur mobilité, ainsi qu'une croissance accrue des dents. De plus, le changement initial de régime alimentaire peut causer du stress aux souris pendant les premiers jours. * En ce qui concerne le traitement avec un agent agressant le foie, il peut initialement entraîner une perte de poids chez les souris, suivie d'une reprise de poids. Parmi les autres effets indésirables possibles, on peut citer des douleurs temporaires lors de l'injection intrapéritonéale (dans le ventre) et un éventuel stress initial lié à la nouveauté de la procédure, qui devrait diminuer avec le temps. * Il est essentiel de noter que la fibrose hépatique ou la cirrhose induite par l'agent agressant le foie et la maladie du foie gras induite par le régime riche en graisses sont indolores et n'affectent pas l'état général des souris, comme cela a été confirmé dans d'autres études, en accord avec notre propre expérience.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'étudier les organes et notamment le foie.
Remplacement
Nous souhaitons étudier l'impact du vieillissement du foie sur l'ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui touchent les personnes âgées, qui sont plus sensibles que les personnes jeunes (infections virales telles que la COVID-19 ou la grippe, ou infections bactériennes telles qu'E. Coli). Des expériences in vitro (sur des cellules) seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. En revanche, pour étudier l'effet du foie sur le développement des infections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal. Les modèles animaux permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, comme celles que nous proposons.
Réduction
Malheureusement, il n'existe pas de cellules saines commerciales à prolifération illimitée (cellules immortalisées) permettant de se passer du modèle animal. Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables grâce à des outils statistiques. Les groupes seront mixtes (autant de mâles que de femelles). Travailler sur des souris provenant d'une même lignée permettra d'éviter les différences de réaction dues à la variation entre chaque individu et ainsi permettra de limiter le nombre de souris.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par le personnel technique de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (bâtonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien-être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. Des points limites représentant un seuil de douleur inacceptable adapté à chaque procédure ont également été définis.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce (ici, la souris) permet d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence le rôle ou l'implication d'un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l'âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps...) nécessaires à cette étude. Enfin, les infections bactériennes et les maladies hépatiques étant des maladies multifactorielles, la proximité de la souris vis-à-vis de l'Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables inhérentes à l'espèce animale utilisée. S’agissant d’un projet sur le vieillissement, les souris non mutées seront utilisés à deux âges : - entre 20-24 mois pour être représentatif de patients de plus de 75 ans = « âgés » - des souris de 3 mois pour les controles « jeunes ». Pour les modèles génétiquement modifiés, ils reflétent un vieillisement accélérés seulement dans les cellules que l'ont souhaite étudier et le début des protocoles se fera à partir de 6 mois car il a été montré dans la littérature que ces souris montrent un vieillissement acceleré à partir de 6 mois.
Analyse des mécanismes moléculaires de la myopathie de Duchenne dans un modèle de poisson zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour comprendre comment l'absence de dystrophine dérègle le calcium dans le muscle, 1 794 poissons zèbres vont être utilisés sur cinq ans, dont 234 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes de 4 mois sont anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour analyse génétique, puis isolés jusqu'à 24 heures derrière un séparateur transparent. Le porteur affirme que ce prélèvement n'entraîne pas de douleur et que la nageoire se reforme en deux semaines, sans dire sur quoi il fonde l'absence de douleur. Les alevins porteurs de la mutation à l'état homozygote sont tués entre 6 et 8 jours pour prélever leurs muscles, les géniteurs à 12 mois quand leur reproduction faiblit, et les surnuméraires issus des croisements annuels le sont aussi.
Objectifs
La contraction du muscle squelettique dépend d’un signal envoyé par un neurone moteur. Ce signal provoque une hausse du calcium dans les cellules musculaires, ce qui déclenche la contraction. Dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique grave, il manque une protéine appelée dystrophine, essentielle au bon fonctionnement des muscles. L’absence de cette protéine perturberait la régulation du calcium, entraînant progressivement la dégradation des fibres musculaires. Des recherches menées chez différents modèles animaux ont montré que les poissons zèbres dépourvus de dystrophine présentent des atteintes musculaires proches de celles observées chez les patients atteints de DMD. Chez ces poissons, les premiers signes de dégradation apparaissent dès 3 jours de vie, et leur survie diminue après 8 jours. Notre projet utilise ce modèle pour étudier la contraction musculaire entre 6 et 8 jours de vie. L’objectif est de mieux comprendre comment l’absence de dystrophine altère la régulation du calcium dans le muscle et provoque la dégénérescence musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment l'absence de dystrophine, une protéine essentielle pour les muscles, perturbe le processus qui permet aux muscles de se contracter. Cela pourrait aider à mieux cerner les problèmes musculaires des personnes atteintes de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le poisson zèbre sapje présente des symptômes très similaires à ceux des patients atteints de DMD, et constitue ainsi un modèle fiable pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Les résultats de cette étude pourront contribuer au développement de nouveaux traitements, notamment des médicaments permettant de corriger les perturbations de l’excitation musculaire et la dégénérescence musculaire, afin de traiter cette maladie grave et incurable qui touche environ un garçon sur 3500.
Procédures
Les poissons adultes subiront une procédure pour sélectionner les poissons portant une seule copie mutée du gène de la dystrophine (hétérozygotes), grâce à une analyse de leur ADN. Pour cela, Les poissons âgés de 4 mois sont transférés dans un bac contenant de l’anesthésique qui induit leur perte de conscience en 20-40 secondes. De petits échantillons de nageoires qui serviront à l’analyse ADN sont ensuite prélevées à l'extrémité de la queue : ce prélèvement est rapide (
Impact sur les animaux
- Elevage des poissons hétérozygotes sur 5 ans : aucun effet indésirable dû à la mutation chez les poissons hétérozygotes mais présence d’un stress dû à la capture et la manipulation nécessaire pour anesthésier les poissons et faire le prélèvement d’une petite portion de nageoire - Prélèvement de petits échantillons de nageoire à l’extrémité de la queue - Isolement partiel des individus pendant une période courte (en moyenne 6 h et 24h au maximum) - Pour l'analyse moléculaire de la mutation conduisant à la myopathie: faible perte de mobilité à partir de l’âge de 3 jours et jusqu'à 8 jours (âge maximal des individus utilisé pour l'analyse)
Devenir
La lignée de poissons zèbres est maintenue à l’état hétérozygote pour la mutation du gène de la dystrophine. Les animaux âgés auront une capacité de reproduction affaiblie et peuvent également présenter une dégénérescence liée à l’âge. Ainsi ils seront mis à mort à l'âge de 12 mois. Afin de renouveler la population de géniteurs pour maintenir la lignée sur 5 ans, des accouplements et une analyse du génome des poissons produits seront réalisés tous les ans : les éventuels animaux en excédent seront également mis à mort. Les alevins issus de l’accouplement des hétérozygotes entre eux seront mis à mort entre 6 et 8 jours pour analyser leur génome et à prélever leurs muscles afin d’effectuer l’analyse moléculaire de l’excitation musculaire.
Remplacement
Les alternatives à l’utilisation de l’animal disponibles consisteraient à utiliser des cultures de cellules musculaires. Notre laboratoire a déjà expérimenté sur des cellules musculaires de souris en culture et a constaté que leurs propriétés étaient très immatures, rendant les résultats obtenus peu exploitables et difficilement transposables au muscle humain adulte. La caractérisation détaillée du processus de contraction musculaire ne peut donc se faire que sur des cellules prélevées chez l’animal qui présentent une maturité suffisante.
Réduction
La lignée de poissons sera maintenue sous forme hétérozygote, c’est-à-dire que les animaux porteront la mutation sans être malades. Seul le nombre minimal de reproducteurs nécessaire au maintien de la lignée sera conservé, soit 30 mâles et 30 femelles. Un renouvellement annuel des géniteurs sera effectué. Pour cela, des croisements contrôlés seront réalisés et la descendance sera élevée jusqu’à l’âge de 4 mois. Le nombre total d’alevins produits chaque année est limité à 312 poissons, ce qui correspond au minimum nécessaire pour 1/garantir un équilibre entre mâles et femelles, 2/ assurer la transmission stable de la mutation, et 3/compenser la présence éventuelle de mauvais reproducteurs. À l’âge de 4 mois, un petit fragment de nageoire sera prélevé au niveau de la queue afin d’effectuer une analyse génétique. Le nombre d’animaux prélevés sera strictement limité : les prélèvements seront interrompus dès que le nombre requis de poissons porteurs aura été identifié. Pour l’étude de la fonction musculaire, des croisements entre hétérozygotes seront effectués, produisant une descendance composée de 25 % d’animaux homozygotes mutants, 25 % de type sauvage et 50 % d’hétérozygotes. Les analyses seront menées sur les cellules musculaires de poissons mutants homozygotes et sauvages issus des mêmes croisements, ce qui permet d’éviter la production de poissons contrôles supplémentaires. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude a été calculé statistiquement afin de garantir la puissance nécessaire tout en minimisant le nombre d’animaux, soit 234 poissons âgés de 6 à 8 jours. Enfin, si des résultats concluants sont obtenus avec un nombre d’animaux inférieur, la taille des élevages sera révisée à la baisse.
Raffinement
Le prélèvement de l'extrémité de nageoire des poissons zèbres adultes sera réalisé sous anesthésie générale après 12h de jeûne afin de limiter régurgitation et contamination fécale. Le prélèvement se fera rapidement et sans saignement et concernera la plus petite portion de nageoire possible. A l’issue du prélèvement, le poisson sera transféré dans un bac de « réveil » où il sera surveillé pendant 10 min. Le réveil doit survenir en quelques minutes et si l’activité des branchies ne revient pas rapidement à la normale, une pipette sera utilisée pour aider au passage de l’eau dans les branchies. Le temps de l'analyse génétique, les poissons zèbres seront maintenus isolés en les plaçant 2 par aquarium de part et d’autre d’un séparateur transparent, afin de limiter le stress de l'isolement. Ils seront maintenus ainsi pendant une durée maximale de 24 h. Concernant les alevins comportant la mutation sapje à l’état homozygote, les défauts de motricité restent très faibles avant l'âge de 8 jours. Ainsi, afin de réduire au maximum les atteintes au bien-être tout en s’assurant que les muscles squelettiques soient suffisamment matures pour permettre l’étude de l’excitation des cellules musculaires, tous les alevins seront mis à mort entre 6 et 8 jours. Les alevins seront observés à chaque nourrissage, 4 fois par jour, et tout alevin présentant des signes d’altération du bien-être sera mis à mort. Le nourrissage se fera avec de la poudre de nourrissage très fine qui sera déposée à la surface et qui, une fois dissoute dans l’eau, permettra aux alevins de se nourrir facilement.
Choix des espèces
Nous avons déjà étudié le processus moléculaire de l'excitation dans des cellules musculaires de poisson zèbre sain et celui-ci présente de nombreuses similitudes avec celui du muscle humain. Cette étude préliminaire nous a permis aussi de développer une expertise spécifique à cette espèce et aux cellules musculaires de cette espèce . Par ailleurs, le modèle poisson zèbre, en reproduisant plus fidèlement les symptômes de la dystrophie musculaire de Duchenne en l’absence de la dystrophine, c'est à dire une perte de mobilité progressive, constitue un modèle animal susceptible de fournir des données plus pertinentes que le modèle souris (souris mdx) pour élucider les conséquences de la maladie au niveau de la cellule musculaire. L’entretien de la lignée nécessite des animaux en âge de procréer (agés de 4 à 12 mois) qui seront régulièrement renouvelés grâce à des accouplements réalisées tous les ans. La caractérisation détaillée du processus d’excitation des cellules musculaires sera réalisée sur des cellules obtenues à partir des muscles de poissons de type homozygotes et de type sauvage âgés entre de 6 et 8 jours. A ce stade, les cellules musculaires sont suffisamment matures pour pouvoir étudier de façon fiable le processus de la contraction au niveau cellulaire.