Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude du comportement de la réponse des cellules immunes face aux tumeurs
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une injection au niveau de l'œil sous anesthésie, une autre dans la veine de la queue sans anesthésie parce que la veine devient inaccessible une fois l'animal endormi, une troisième dans l'abdomen : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle de lymphome T diffus installe des tumeurs dans la rate, la moelle osseuse et le foie, ce qui peut provoquer douleur et inconfort. Toutes seront tuées pour prélever des organes et analyser les cellules immunitaires modifiées. Le porteur écrit que la croissance des tumeurs solides ne provoque aucune gêne locomotrice, en précisant dans la même phrase que les souris sont tuées avant l'apparition de ces gênes.
Objectifs
Les cellules du système immunitaire sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Elles ont besoin d’énergie pour remplir efficacement leur rôle, et plusieurs mécanismes à l’intérieur de la cellule régulent cette utilisation d’énergie. Ce projet cherche à comprendre comment ces mécanismes influencent l’activité de ces cellules, leur activation, leur déplacement et leur capacité à combattre les tumeurs, qu’elles soient localisées (dans la peau) ou diffuses dans l’organisme. Pour des raisons éthiques et de praticité, il est impossible de réaliser ce type d’expérimentation chez l’Homme. C’est pourquoi nous utilisons la souris comme modèle pour étudier le lymphome T, un cancer touchant le système immunitaire, ce qui permet de recréer un environnement biologique complet avec des organes et des interactions cellulaires similaires à celles d’un organisme vivant. Cela offre un cadre pertinent pour étudier l’activité des cellules immunitaires contre les tumeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’énergie disponible dans les cellules immunitaires influe sur leur capacité à agir contre les cellules cancéreuses. Le rôle des cellules immunitaires étant primordial, les résultats pourraient aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à renforcer la réponse immunitaire anti-tumorale.
Procédures
Chaque souris sera soumise à plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux. Chaque animal recevra : • Une injection sous la peau, effectuée sous anesthésie volatile, d’une durée d’environ une minute ou une injection dans la veine de la queue sans anesthésie (inaccessible avec anesthésie), d’une durée d’une minute. • Une injection au niveau de l’œil sous anesthésie volatile (durée : 1 minute) • Une injection dans l’abdomen ne nécessitant pas d’anesthésie et d’une durée d’environ cinq minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures peuvent provoquer une douleur légère et temporaire lors des injections. Le développement des tumeurs, notamment dans le modèle de tumeur diffuse, peut entraîner une douleur ou un inconfort modéré en raison de la présence des tumeurs dans différents organes (rate, moelle osseuse, foie). En revanche, la croissance des tumeurs solides n’affecte pas les mouvements ni ne provoque de gênes locomotrices, car les animaux seront euthanasiés avant l’apparition de ces gênes. Tout animal présentant une réaction anormale ou une souffrance non contrôlable sera immédiatement euthanasié conformément aux critères de fin d’expérience établis.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes post mortem pour des analyses fonctionnelles et phénotypiques sur les cellules immunitaires modifiées.
Remplacement
Les cellules du système immunitaire modifiées ont été testées in vitro notamment face à des cellules tumorales. Cependant, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité de la réponse anti-tumorale. De ce fait, la mise en place d’expériences in vivo sur un modèle animal nous paraît pertinent. Pour des raisons éthiques et de praticité, les tests ne peuvent être effectués chez des patients concernés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été défini au strict minimum nécessaire pour permettre une analyse fiable des résultats. Des calculs statistiques simples montrent qu’il faut au moins cinq animaux par groupe pour pouvoir détecter des différences réelles et solides entre les conditions testées, sans augmenter inutilement le nombre d’animaux. De plus, des expériences préliminaires déjà réalisées nous confortent dans ce choix et confirment que cet effectif est suffisant pour obtenir des données solides. La procédure a été conçue pour obtenir le plus de données possibles à partir d’un seul individu, en réalisant plusieurs analyses sur les mêmes animaux. Enfin, la co-injection dans un même animal permet une comparaison directe et limite la variabilité inter-expérimentale, réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. Cette organisation permet de réduire la répétition d’expériences indépendantes et donc de limiter l’utilisation d’animaux tout en garantissant la qualité scientifique du projet.
Raffinement
L’équipe possède une expertise solide se traduisant par la mise en place de plusieurs mesures visant à garantir au maximum le bien-être des animaux : • Réduire la douleur et le stress lors des manipulations, en utilisant des techniques d’injection parfaitement maîtrisées et en appliquant des anesthésiants locaux • Faciliter l’alimentation grâce à la mise à disposition de croquettes mouillées, réduisant les efforts des animaux • Contrôler précisément le nombre de cellules injectées, afin d’éviter une croissance tumorale trop rapide ou imprévisible • Assurer une surveillance régulière, tous les deux jours, en observant notamment la motricité, le comportement, la posture et la réponse aux stimulations • Définir des points limites stricts (perte de motricité, perte de réponse aux stimulations) et précoces : si l’un de ces seuils est approché, la fréquence de surveillance est immédiatement augmentée pour intervenir au bon moment et éviter toute souffrance inutile. • En cas d’apparition de signes d’irritation ou d’inflammation une pommade vétérinaire anti-inflammatoire sera appliquée afin de prévenir toute complication locale. Les conditions d’hébergement respectent les normes de bien-être animal avec un environnement adapté pour réduire le stress (température, hygrométrie, enrichissement du milieu).
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 7-28 semaines le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Photomodulation de la douleur par la lumière dans un contexte de migraine induite par un neuropeptide (2/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Cinq injections d'un neuropeptide déclencheur de migraine, des filaments appliqués sur la patte et la face pour mesurer le seuil de douleur, une sensation de brûlure induite sur la queue : 3 984 souris vont être utilisées, dont 2 692 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit des vis crâniennes pour l'enregistrement des potentiels évoqués visuels, ou un endoscope fixé sur la tête pour l'imagerie calcique, dont le porteur reconnaît qu'il génère un léger surpoids et de l'inconfort. Le projet cherche à établir si la lumière verte a un effet analgésique, option qu'il présente comme non invasive et peu coûteuse pour les personnes migraineuses. La mise à mort est justifiée par le vieillissement des souris au cours de la procédure, qui interdit de les réutiliser, et des points limites sont annoncés sans être précisés.
Objectifs
Il est estimé qu’une personne sur 7 dans le monde souffre de migraine représentant plus de 1 milliard d’individus. La prévalence de la migraine a augmenté de 732,56 millions à 1,16 milliard de cas entre 1990 et 2021. En France, 12 millions de personnes sont concernées. La migraine affecte environ 15 % de la population. Alors que les femmes ont une incidence et prévalence globale plus élevée que les hommes, les hommes présentent une augmentation 4 à 5 fois plus. La migraine est plus courante chez les individus âgés de 20 à 50 ans qui correspond à la population active. Elle représente la 6ème cause de handicap dans le monde. Alors que la lumière bleue peut aggraver ou déclencher la migraine, la lumière verte présenterait un effet bénéfique (analgésique). Dans un contexte de nécessité de développement de nouvelle approches thérapeutiques sans effet secondaire, la thérapie par la lumière apparait comme une option intéressante, non invasive et peu couteuse. L’exposition à des lumière de longueur d’onde spécifique ont déjà montré des effets bénéfiques dans différentes conditions pathologique tels que les cancers, les maladies de peau, les perturbations du sommeil et de l’humeur. Récemment, la thérapie utilisant de la lumière LASER ou de faible intensité a été utilisée dans le cadre de la douleur incluant des douleurs dorsales, fibromyalgies, neuropathique ou migraineuse. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les mécanismes impliqués dans l’analgésie induite par une exposition à la lumière verte dans un modèle de migraine et définir la meilleure stratégie d’exposition pour un efficacité optimale. Le projet se déroulera sur 2 EU (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau de la rétine, des noyaux thalamiques et du cortex. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence la capacité de la lumière à moduler la sensibilité à la douleur. L'objectif étant en particulier de mettre en évidence la capacité analgéqiue de la lumière verte qui pourrait alors être évaluer en clinique et apporter une approches compémentaires du traitment de la douleur.
Procédures
injections sous cutanées de neuropeptides une fois par jour tous les 2 jours avec au total 5 injections par animal; durée de l'injection
Impact sur les animaux
hypersensibilité sensorielle; hypersensbilité à la douleur; la pose de l'électrode sur la cornée peut entrainer des irritations post-enregistrement (très rarement observé par expérience car l'éectrode est légèrement posée sur la cornée sans déplacement; Inconfort lié à la présence de l'endoscope sur la tête de l'animal qui génère un léger surpoids; Normalement le neuropeptide n'induit pas de stress et d'anxiété mais certaines souris peuvent avoir une réaction différente à la généralité; Douleur légère (piqûre) lors des injections; Inconfort lié à la présence des vis pour les VEP et de l'endoscope.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés du fait de leur vieillissement au cours de la procédure.
Remplacement
Le projet prend en compte les interactions complexes entre la rétine (la lumière) et le cerveau, impliquées dans la migraine et ses symptômes associés. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal afin d’avoir une vision générale du système et de pouvoir étudier les mécanismes de régulation et d’intégration de la douleur migraineuse.
Réduction
Notre expertise dans les domaines techniques utilisés dans ce projet nous permet d’établir le nombre d’animaux par groupe de manière fiable pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre indiqué dans les différentes procédures correspond au maximum d’animaux mais nous procédons par série de manière à ce que si tout se passe de manière optimale nous puissions réduire le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux tout au long des procédures, les souris seront surveillées par les personnes compétentes et manipulées tous les jours par l’expérimentateur pour permettre une habituation optimale. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération suite à une anesthésie, elles auront un environnement enrichi avec accès libre à la nourriture et l’eau. Pour les stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), elles sont limitées en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour le test de sensibilité thermiques, afin de limiter la sensation de brulure ressentie par les animaux, la température est augmentée le plus progressivement possible pour atteindre le seuil le plus précis et limiter cette sensation sans compromettre le test. Après les enregistrements électrorétinographiques, l'oeil est réhydraté. La nourriture est placée dans la cage pour faciliter l'accès en particulier pour les animaux avec l'endoscope et ceux avec les vis pour les enregistrements. Lors de l'implantation des électrodes, les animaux seront placés sous médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) utilisé pour traiter la douleur et l'inflammation. pendant 3 jours (jours de la chirurgie + 2 jours). Avant chaque test les animaux suivront une phase d'habituation. Pour le transport, les animaux seront préalablement habitués aux conditions de transport à savoir placés dans leur cage dans un carton de transport ventillé qui sera soulevé et légèrement manipuler quotidiennement. Les animaux seront placés dans des cages propres la veille du transport. Pendant le transport des croquettes imbibées d'eau seront placées dans la cage. Le transport dure 15-20 min. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur ou la souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souche est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de la souris permet d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles spécifiques comme c'est la cas dans ce projet. Le choix de travailler chez l'adulte vient du fait que la migraine est plus fréquente chez l'adulte que chez l'enfant. De plus les symptômes et les mécanismes chez l'enfant peuvent être différents. Aussi dans le cadre de ce projet nous nous limiterons à l'étude chez l'adulte. Les injections seront réalisés à l'âge de 8-10 semaines, par conséquent suivant les procédures les animaux seront conditionnés dès l'âge de 6 semaines ou 4 semaines (microendoscopie)
Étude de la compulsion pour le sucre et pour la cocaïne chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trente-cinq sessions de six heures d'auto-administration de cocaïne, cinq sessions supplémentaires où appuyer sur le levier déclenche une décharge électrique au sol : 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leur cerveau. Un cathéter leur est implanté par chirurgie, et leur poids est maintenu à 90 % du poids habituel pendant 56 jours au maximum, pour les motiver à chercher la nourriture. Le porteur qualifie les décharges de légères et évitables, et la restriction alimentaire de stress léger "sans effet nocif". Il retient cette souche parce que sa variabilité de comportement se rapproche de celle observée chez l'humain, ce qui permet de trier les individus sensibles et résistants à la punition.
Objectifs
L’addiction se caractérise notamment par l’incapacité à contrôler la consommation d’une substance, malgré ses conséquences négatives. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes comportementaux et cérébraux impliqués dans ce phénomène, en particulier dans le cas de la consommation de cocaïne. Nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat pour étudier si la tendance à développer une addiction est un trait stable, et si elle dépend du type de récompense. Les animaux seront exposés à deux types de renforcement : une récompense naturelle (le sucre) et une drogue (la cocaïne). Nous mesurerons jusqu’à quel point chaque rat est prêt à tolérer un désagrément pour obtenir ces récompenses, afin d’évaluer son niveau de vulnérabilité à l’addiction. Ce modèle permet de distinguer les individus capables de contrôler leur consommation de ceux qui développent un comportement compulsif. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre pourquoi certains individus développent une addiction à la cocaïne, et d’ouvrir la voie à une meilleure prise en charge.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale vise à identifier les mécanismes comportementaux et neurobiologiques impliqués dans la perte de contrôle caractéristique des addictions. À partir de modèles d’auto-administration volontaire de récompenses naturelles (sucre) ou pharmacologiques (cocaïne), combinés à des tests de résistance à la punition, ce travail permet de distinguer des profils d’individus sensibles ou résistants aux conséquences négatives de leur comportement, reproduisant des dynamiques observées chez l’humain. Ce modèle innovant offre un cadre pertinent pour étudier la vulnérabilité à l’addiction. Sur le plan fondamental, cette recherche permettra de déterminer si des similarités ou des différences existent entre compulsion au sucre et à la cocaïne. Ces informations sont importantes pour comprendre si on peut prédire les risques d’addiction à une substance sur la base de l’addiction à une autre substance.
Procédures
Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection d'antalgiques et 1 injection d’analgésique - après la chirurgie, 2 injections d’antalgiques par animaux - Restriction alimentaire pendant 56 jours maximum - 35 sessions d’auto-administration de sucre (1 session / jour, 1 heure par session,). - 5 sessions de mesure de compulsion au sucre (1 session / jour, 1 heure par session,) - 35 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session / jour, 6 heures par session,). - 5 sessions de mesure de compulsion à la cocaïne (1 session / jour, 6 heures par session).
Impact sur les animaux
Ce projet peut entraîner certains effets indésirables modérés chez les animaux. Les rats participeront à des expériences comportementales où ils apprendront à obtenir volontairement une récompense (du sucre ou de la cocaïne). Dans certains tests, une légère stimulation électrique est appliquée au sol lorsque l’animal appuie sur un levier. Cette stimulation, qui reste évitable par l’animal, peut provoquer un léger inconfort ou du stress. Un régime alimentaire temporaire sera appliqué pour motiver les animaux à rechercher la nourriture, en maintenant leur poids à 90 % de leur poids habituel. Cette restriction, bien encadrée, peut causer un stress léger, sans effet nocif sur leur santé ou leur bien-être. Une intervention chirurgicale est prévue : l’implantation d’un cathéter pour permettre l’administration contrôlée de cocaïne. Elle est réalisées sous anesthésie générale, avec des médicaments contre la douleur et un suivi post-opératoire rigoureux. La consommation de cocaïne peut induire des comportements inhabituels (excitation, mouvements répétitifs), mais aucun effet nocif durable n’est attendu à court terme.
Devenir
Tous les animaux, à l’issue des procédures seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour étudier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la compulsion à consommer de la drogue.
Remplacement
L’étude des mécanismes neurobiologiques et comportementaux de la compulsion nécessite un modèle vivant intégrant à la fois les dimensions motivationnelles, la réponse à la punition, et l’auto-administration volontaire d’une substance addictive. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire la complexité des interactions entre circuits neuronaux, pharmacologie, et comportements d’addiction. Le recours au rat est justifié car c’est une espèce dont les capacités d’apprentissage, la structure cérébrale, et les comportements d’auto-administration sont bien caractérisés, et transposables aux situations humaines. Des approches alternatives (organoïdes, cultures cellulaires, modélisation computationnelle) ne permettent pas d’explorer les dynamiques comportementales complexes impliquées dans la perte de contrôle.
Réduction
Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle. Le nombre d’animaux a été rigoureusement déterminé à partir d’analyses statistiques de puissance, réalisées a priori avec un logiciel. Chaque animal est valorisé : il participe à des mesures comportementales, et son cerveau est analysé à l’issue de l’étude, ce qui permet de combiner données fonctionnelles et biologiques sans duplication des effectifs. Ces estimations assurent une utilisation raisonnée des animaux tout en maintenant la validité statistique et la reproductibilité des résultats. Aucune répétition expérimentale inutile n’est prévue.
Raffinement
Le bien-être animal est pris en compte à chaque étape du protocole, avec une attention particulière portée à la limitation du stress, de la douleur et de toute souffrance inutile. Les rats seront hébergés par deux en cages ventilées avec contrôle de la température et de l’humidité, et bénéficieront d’un enrichissement standard (objets à ronger) ainsi que d’une période d’acclimatation minimale de 7 jours, durant laquelle les animaux seront manipulés à partir du cinquième jour. L’eau sera disponible ad libitum, et la restriction alimentaire, limitée dans le temps, sera calibrée pour maintenir un poids stable sans altérer l’état de santé. Les animaux soumis à une restriction alimentaire seront pesés au moins trois fois par semaine afin d’assurer un suivi rapproché de l’évolution de leur poids, tandis que les rats en auto-administration de drogue seront pesés au moins une fois par semaine. Dans tous les cas, les animaux sont manipulés quotidiennement, ce qui permet une évaluation continue de leur état général ; des pesées supplémentaires pourront être réalisées en cas de doute pour garantir une surveillance optimale du bien-être. Les chirurgies (implantation de cathéter) seront réalisées sous anesthésie générale, complétée par une anesthésie locale, avec maintien de la température corporelle par tapis chauffant. Une analgésie systématique sera administrée en pré- et post-opératoire pendant au moins 72 heures. Une surveillance clinique rigoureuse est prévue, avec l’utilisation d’une grille de score, de points limites adaptés et d’un arbre décisionnel permettant des interventions précoces ou l’arrêt de la procédure si nécessaire. Les stimulations électriques utilisées pour mesurer la résistance à la punition sont légères, progressives et évitables par l’animal, ce qui permet d’en limiter l’impact et d’éviter toute douleur inévitable. En cas d’isolement d’un animal, nous fournirons l’enrichissement standard conforme aux règles de l’animalerie, ainsi qu’une manipulation de quelques dizaines de secondes (prise en main, dépôt sur l’expérimentateur et caresses) au moins deux fois par semaine, comme pour les autres animaux.
Choix des espèces
Le rat est l’une des espèces les plus pertinentes et les plus utilisées pour l’étude des mécanismes d’addiction et de compulsion. Il présente une pharmacosensibilité aux substances addictives proche de celle observée chez l’humain, et consomme spontanément la plupart des drogues d’abus, dont la cocaïne. Contrairement à d'autres espèces, le rat apprend facilement des tâches opérantes complexes et développe des comportements compulsifs reproductibles, ce qui en fait un modèle de choix pour étudier la perte de contrôle et les profils de vulnérabilité. La souche a été choisie car elle présente une variabilité phénotypique et comportementale plus proche de celle observée chez l’humain, essentielle pour identifier des sous-groupes (par exemple, sensibles vs résistants à la punition), ce qui est au cœur des objectifs du projet. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).
Étude de l’implication de cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Le cœur prélevé chez les unes, greffé au niveau du cou chez les autres en une opération d'environ soixante minutes : 1 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une greffe d'îlots pancréatiques au niveau du rein, puis un contrôle de glycémie par prélèvement sanguin à la queue deux fois par semaine, l'expérience pouvant durer 56 jours. Le porteur écrit que ces procédures sont "bien tolérées" et n'affectent pas l'état général des animaux, après avoir listé la gêne au réveil, la douleur malgré le traitement, les difficultés de mouvement et les démangeaisons pendant la cicatrisation. Toutes sont tuées par dislocation cervicale, pour prélever le sang, les organes lymphoïdes et les greffons.
Objectifs
La transplantation est souvent le traitement le plus efficace, voire le seul, pour les patients en insuffisance terminale d'organe. Elle permet de remplacer un organe malade par celui d’un donneur génétiquement différent.Cependant, son efficacité à long terme est limitée par le rejet, principal facteur de perte de greffon. Ce rejet survient car le système immunitaire du receveur reconnaît le greffon comme un tissu étranger. Actuellement, le rejet est attribué à la reconnaissance du greffon par la réponse immunitaire adaptative. Nos recherches récentes explorent le rôle d’un autre bras du système immunitaire, l’immunité innée, révélant un potentiel thérapeutique inédit pour éviter et traiter le rejet du greffon. Le projet consiste à étudier l’implication des cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe. Les ojectifs du projet sont : 1) tester une nouvelle approche thérapeutique visant à modifier le greffon pour limiter l’activation de cellules innée et donc le rejet de greffe ; 2) analyser les intéractions entres cellules de l’immunité adaptatives et les cellules innée impliquées dans le rejet de greffe. Cette approche optimiserait la sélection des donneurs et prolongerait la survie des greffons, tout en améliorant la qualité de vie des receveurs. Le projet est divisé en 2 procédures, une pour chaque objectif. Des études récentes montrent que le type de rejet varie selon les cellules immunitaires impliquées et le type de greffe. Nous utiliserons donc diffèrents modèles de greffes. D’une durée de 5 ans, le projet pourrait impliquer jusqu’à 1184 souris, avec des expériences réalisées en séquence et arrêtées en cas d’hypothèse invalidée.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires dans le rejet de greffes et de leurs échanges avec d’autres cellules du système immunitaire. Ces connaissances permettront d’identifier de nouvelles stratégies pour limiter les réponses immunitaires indésirables après transplantation. L’évaluation de différentes approches aidera à sélectionner les plus prometteuses pour réguler ces interactions. Les résultats obtenus serviront de base à des études mécanistiques complémentaires, ouvrant la voie au développement de stratégies innovantes pour améliorer la survie des greffons et la prise en charge des patients transplantés.
Procédures
Chez les souris donneuses, une anesthésie et une analgésie sont administrées par injection abdominale (5 secondes), puis le cœur est prélevé (durée : 15 minutes). Chez les souris receveuses de greffon cardiaque, une anesthésie et une analgésie sont réalisées par injection abdominale (5 secondes). La greffe est effectuée au niveau du cou et dure environ 60 minutes. La douleur est prise en charge par trois injections abdominales d’analgésique (15 secondes chacune), complétées par un traitement supplémentaire (injection derrière l’œil, 5 secondes). L’expérience peut durer jusqu’à 56 jours. Chez les souris receveuses de greffon d’îlots pancréatiques, un traitement préparatoire est administré par injection abdominale (5 secondes). Une anesthésie et une analgésie sont ensuite pratiquées par injection abdominale (5 secondes). La greffe est réalisée au niveau du rein, sous anesthésie, et dure une dizaine de minutes. Un traitement complémentaire est administré par injection abdominale (5 secondes). Une seconde intervention est réalisée au niveau de l’abdomen pour la greffe (15 minutes), avec un suivi de la douleur assuré par trois injections abdominales d’analgésique (15 secondes chacune). Le suivi de la glycémie est effectué deux fois par semaine à l’aide d’un glucomètre (prélèvement sanguin à la queue, durée maximale : 5 secondes par prélèvement). L’expérience peut durer jusqu’à 56 jours.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements de sang peuvent provoquer du stress et une légère douleur. Les greffes de cœur et de cellules pancréatiques sont des interventions connues, et les problèmes éventuels sont surtout liés à l’anesthésie ou aux sutures pendant la chirurgie. Chaque opération peut causer une gêne au réveil, de la douleur malgré le traitement, ainsi que des difficultés de mouvement ou des démangeaisons pendant la cicatrisation. De manière générale, ces procédures sont bien tolérées et n’affectent pas l’état général des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure par dislocation cervicale, avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Les mécanismes de rejet d’organe ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
Un nombre suffisant de souris sera utilisé par groupe (prévu initialement 12 animaux pour obtenir 8 souris analysables par groupe), afin de permettre une analyse statistique fiable des données. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1280 souris (mus musculus).
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l’isolement. Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général et points limites associés à chaque chirurgie). Différents traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés au cours de la chirurgie pour prévenir tout douleur. Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées dans un environnement stérile pour éviter toute infection. Les animaux sont placés en armoire chauffante durant la phase de réveil. Les animaux sont suivis dans les 4-6 h post chirrugie, le lendemain, puis 2 à 3 fois par semaine. La fréquence sera augmentée selon l’apparition des signes cliniques.
Choix des espèces
La souris, grâce à sa similarité génétique et physiologique avec l’homme, est idéal pour étudier la réponse immunitaire allogénique. Notre projet utilise diverses lignées de souris génétiquement modifiées, afin d’étudier le rejet de greffe. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées (age de la maturité sexuelle) Age maximum 6 mois en fin de procédure.
Etude de l’activation de la réponse immunitaire anti-tumorale après électro-chimiothérapie combinée à l’électro-transfert de plasmides codant des inhibiteurs de points de contrôle utilisés en immunothérapie chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 152 souris vont être utilisées, dont 4 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir une greffe tumorale, deux injections suivies d'une électroporation, puis une séance d'imagerie allant jusqu'à deux heures. Pour une partie d'entre elles, la pose d'une chambre dorsale par une chirurgie de 45 minutes précède l'observation, et l'hébergement devient individuel à partir de l'opération. Le porteur qualifie de légère la douleur des injections et des impulsions électriques, qui contractent les muscles de la peau entre les électrodes. Il justifie la mise à mort de toutes les souris par des prélèvements de tumeurs et de sang qu'il déclare "indispensables", et chiffre ses groupes à 6 animaux pour le suivi tumoral et 9 pour la cytométrie, sans expliquer comment on passe de ces effectifs à 4 152.
Objectifs
L’immunothérapie, avec l’utilisation d’inhibiteurs de points de contrôle immunitaires, a révolutionné le traitement des cancers chez les patients. En les bloquant, elle permet aux cellules immunitaires de réagir à nouveau contre les cellules cancéreuses. Ces inhibiteurs sont utilisés dans de nombreux types de cancers. Cependant, un grand nombre de patients ne répondent pas à ces thérapies ou acquièrent une résistance au traitement. L’absence d’entrée de lymphocytes T dans certaines tumeurs contribuerait à cette inefficacité. Une connaissance du fonctionnement de la réponse immunitaire anti-tumorale lors de ces thérapies est donc essentielle pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques et en améliorer l’efficacité. Lorsque les cellules tumorales meurent suite à une thérapie, leur façon de mourir peut activer cette réponse. C’est le cas de la mort immunogénique. La reconnaissance des antigènes tumoraux par les cellules dendritiques participe à une réponse anti-tumorale efficace. L’électrochimiothérapie (ECT), une technique d’ablation locale efficace, est capable d’induire la mort immunogénique, mais a peu d’effets à distance, du fait parfois, du microenvironnement tumoral immunosuppressif. Cependant, des études ont montré, qu’en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, on pouvait passer d’un effet local à un effet à distance, améliorant ainsi la réponse anti-tumorale, par une ré-activation du microenvironnement tumoral. Ces inhibiteurs sont souvent administrés via le sang bien qu’une délivrance locale montre des concentrations plus élevées dans la tumeur et moindres dans le sang, limitant ainsi la toxicité inhérente à ces inhibiteurs. Dans ces deux approches, des injections répétées sont nécessaires. Délivrer ces inhibiteurs localement et durablement est donc pertinent. L’électro-transfert de gènes a déjà été utilisé pour délivrer des plasmides codant pour ces inhibiteurs dans des tumeurs chez la souris, réussissant à déclencher une réponse immunitaire systémique antitumorale. L’objectif de ce projet est donc 1) de comprendre les mécanismes induits par l’ECT sur le microenvironnement tumoral, 2) de combiner l’électrochimiothérapie avec l’électrotransfert de plasmides codant des inhibiteurs de points de contrôle, au moment où la mort immunogénique est optimale, pour potentialiser les effets des deux traitements et comprendre les mécanismes induits par cette combinaison localement et en systémique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre les mécanismes immunologiques induits par l’électrochimiothérapie sur le microenvironnement tumoral, en combinaison avec l’électrotransfert d’inhibiteurs de points de contrôle, au moment où la mort immunogénique est optimale pour améliorer son efficacité. Ces inhibiteurs de points de contrôle utilisés en immunothérapie jouant un rôle crucial dans le traitement des cancers, potentialiser les effets des deux traitements et comprendre les mécanismes induits par cette combinaison permettra d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Des souris auront une injection de cellules sous anesthésie (
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales en sous cutanée ainsi que la croissance tumorale peuvent induire une douleur légère. L’injection de l’agent de chimiothérapie peut induire une douleur légère le temps de l’injection (
Devenir
A l'issue de certaines procédures, les animaux seront mis à mort pour les prélèvements et les analyses des tumeurs ainsi que du sang. L’étude de ces tissus est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux ainsi que l’efficacité du transfert de molécules.
Remplacement
Les procédures réalisées sur l’animal ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. Il n’est pas possible à l’heure actuelle de mimer in vitro la dynamique d’une réponse immunitaire anti-tumorale de façon satisfaisante. Cependant, les types et cinétiques de mort cellulaire et de relargage de molécules induits par les différents agents de chimiothérapie utilisés dans ce projet ont pu été définis par nos collaborateurs in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini, à l’aide d’un logiciel d'assitance au design expérimental (EDA), comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Pour le suivi de croissance tumorale, il ressort que 6 animaux par groupe seront nécessaires. Pour les analyses de cytométrie, 9 animaux par groupe seront nécessaires. Pour chaque expérience, tous les groupes de traitement seront présents et affectés de façon aléatoire pour permettre d’avoir la souris comme unité expérimentale et éviter un effet cage. Les expériences seront répétées pour atteindre le nombre minimum nécessaire par groupe. Si le nombre de populations immunitaires analysées en cytométrie le permet, l’utilisation d’un analyseur spectrale permettra de reduire le nombre de panels et ainsi de diviser le nombre d’animaux par deux. Le suvi de la mobilisation des cellules dendritiques dans le modèle in vivo avec chirurgie permettra de réaliser l’imagerie intravitale dans un même animal au cours du temps, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
L’injection des cellules tumorales, de l’agent de chimiothérapie et du plasmide, l’électroporation et l’imagerie seront réalisés sous anesthésie. Pour certaines injections, un anesthésique local sera préalablement appliqué sur l’œil ou la peau respectivement. Pour le suivi des animaux avec les tumeurs sous cutanées, un suivi journalier sera mis en place avec une table de suivi de soins comportant des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques de la procédure. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et sous lampe chauffante. Un antalgique sera administré avant et après la chirurgie ainsi qu’un anti-inflammatoire après la chirurgie. Pour évaluer la douleur, nous nous baserons sur une table de suivi de soins comportant des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques de la procédure. Le suivi des animaux se fera tous les jours par observation et remplissage de la grille de suivi. L’expérience sera arrêtée si l’animal présente une inflammation post chirurgicale ou s’il y a dégradation de l’état général de l’animal, sinon, les souris seront mises à mort 9 jours après la chirurgie. Les animaux seront hébergés individuellement à partir de la chirurgie pour éviter qu’ils ne se blessent entre eux mais avec les autres animaux visibles et à proximité dans les autres cages. Pour les séances d’imagerie, les souris seront maintenues dans une enceinte chauffante.
Choix des espèces
La souris est une espèce génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. Cette espèce a un système immunitaire bien caractérisé. Elle permet de reproduire le développement tumoral, le développement des vaisseaux et la mise en place d’une réponse immunitaire similiaire à celle de l’espèce humaine. Enfin, les lignées transgéniques et les outils nécessaires à ce projet sont disponibles dans cette espèce et ont servi pour d’autres projets déjà menés chez la souris avec ces mêmes lignées. Des souris adultes de 6-8 semaines seront utilisées. Ceci correspond à l’âge de maturation du système immunitaire. De plus, il s’agit des stades de développement communément utilisés dans notre laboratoire pour ce type d’expérience, donc dans un souci de comparaison des résultats de ce projet avec les travaux précédemment réalisés nous souhaitons utiliser des animaux dans la même tranche d’âge
Rôle de HSP110 dans la formation de métastases du cancer colorectal EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Ouvertes au niveau de l'abdomen sous anesthésie pour recevoir une implantation de cellules tumorales dans la paroi du caecum, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après l'opération, elles reçoivent des traitements trois fois par semaine pendant trois semaines et passent deux séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, avec un transfert entre deux établissements à chaque fois. Le projet vise à tester un inhibiteur d'HSP110 sur la formation de métastases hépatiques du cancer colorectal, étape que le porteur présente comme une condition de la validation préclinique avant un essai clinique renvoyé au "long terme". Il reconnaît que la chirurgie et les métastases peuvent provoquer souffrance, perte de poids ou infection, tout en écrivant que le foie est un organe "silencieux" qui ne fait pas mal lorsqu'il est colonisé.
Objectifs
Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Bien que la plupart des patients atteints de CCR survivent à une chirurgie de la tumeur primitive, la principale cause de décès est la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme. Lorsque le CCR est détecté à un stade précoce et localisé, le taux de survie à cinq ans est d'environ 90 % ; cependant, après l'apparition de métastases, ce taux chute à moins de 12 %. Le principal organe cible est le foie. Environ 20 à 25 % des patients atteints de CCR présentent des métastases hépatiques au moment du diagnostic, et au moment du décès, jusqu'à 70 % des patients atteints de CCR présentaient des métastases hépatiques. L’objectif de notre recherche est de comprendre les mécanismes métastatiques dans le CCR. Nous nous intéressons en particulier au rôle d’une protéine de choc thermique, HSP110. HSP110 possède un rôle essentiel dans la prolifération des cellules cancéreuses de CCR et leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, cependant son rôle dans le développement des métastases hépatiques n’est pas connu. Nous utiliserons un composé chimique inhibiteur spécifique de HSP110 ayant déjà montré son efficacité sur le ralentissement de la croissance tumorale de CCR lors de greffes sous-cutanées nonmétastatique. Nous envisageons de tester l’efficacité de ce composé sur l’inhibition de la formation des métastases de CCR, seul et en association avec la chimiothérapie standard et des traitements plus novateurs appelés immunothérapie. Cela constituera une étape préclinique supplémentaire pour ce candidat médicament. En résumé, nous souhaitons explorer dans ce projet le rôle de HSP110 dans la formation des métastases et étudier l’impact de son inhibiteur seul ou associé aux traitements chimiothérapeutiques standards et aux immunothérapies sur ces métastases. Le projet se déroulera entre 2 etablissemnts utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires mis en jeu par la protéine HSP110 dans la croissance tumorale sont maintenant bien connus in vitro. Cependant, il est nécessaire d’étudier le rôle de HSP110 dans un contexte in vivo pour évaluer son impact dans la formation de métastases hépatiques. Ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de l’inhibiteur spécifique de HSP110 in vivo dans la prévention des métastases et d’identifier la meilleure combinaison thérapeutique avec une immunothérapie innovante. A terme, ce projet est une condition de la validation pré-clinique de l’utilisation de cet inhibiteur d’HSP110 dans le cancer colorectal dans une perspective d’essai clinique à long terme
Procédures
Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 (5 minutes de trajet) pour réaliser les traitements (1 minutes par souris) 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semain
Impact sur les animaux
Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. L’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes, principalement en raison de la perturbation de la fonction hépatique. A noter que le foie est un organe « silencieux » qui ne fait pas mal lorsqu’il est colonisé par des métastases.
Devenir
Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience.
Remplacement
Nous avons réalisé les expériences possibles in vitro (capacité de migration en présence ou absence de HSP110 et mécanisme d’action de HSP110) et nous devons valider ces fonctions maintenant dans un organisme entier. Nous continuerons à explorer les mécanismes moléculaires dans le modèle in vivo.
Réduction
Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possibles. Pour chacune des combinaisons thérapeutiques réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 5 souris ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques. Les expériences seront réalisées 3x pour contrer la variabilité inter-individus et la possible non prise métastatique. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.
Raffinement
imitation du stress. Pour limiter le stress, les souris sont placées par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en plastique leur permettant de se regrouper (nid). Elles seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Les animaux seront transférés rapidement pour éviter un stress de l’EU1 à l’EU2 dans un sac de transport (temps de trajet de 5 minutes). Procédures d’étude non invasives (imagerie) : Le gène de la luciférase exprimée par les cellules tumorales injectées permettra d’évaluer par émission de lumière la présence de métastases sur animaux vivants. Procédure d’injection des cellules tumorales : Les souris seront anesthésiées. Elles recevront du gel ophtalmique (évite le dessèchement des yeux) et injection de burpénorphine et application lidocaine. L’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse (réduction inconfort pour raffinement de l’étude). Au cours d’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Des tapis chauffants seront utilisés pendant l’expérimentation afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales pour vérifier le retour à une activité normale (confort, vivacité). Les injections de molécules d’intérêt thérapeutique se feront sur animaux vigiles. Surveillance de l’état général des animaux : Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire et une prise en charge antalgique adaptée en pré- et post-opératoire 2X/jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire et la prise de boisson sera installé (nourriture gélifiée). Nous avons une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Au cours des différentes étapes de la procédure et pour chaque animal, la masse pondérale des animaux ne devra pas dépasser ± 20 pour cent de leur poids initial. En cas de dépassement de cette limite de poids, ils seront sacrifiés
Choix des espèces
Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris femelles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel. Les souris seront hébergées en groupe afin de diminuer le stress induit par l’isolement.
Etude de la mitophagie dans la neurodégénérescence liée à la sclérose latérale amyotrophique chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue ou de l'oreille au sevrage, à 21 jours, puis un suivi qui s'étend jusqu'à 14 mois : 3 319 souris porteuses d'une mutation liée à la maladie de Charcot vont être utilisées, dont 3 100 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une prise de poids ralentie dès 3 mois, puis une perte de poids, une baisse de mobilité et des tremblements possibles entre 10 et 14 mois, la mise à mort intervenant au-delà de 15 % de poids perdu. Les souris sont étudiées à quatre stades, dont le stade final défini par l'incapacité à se retourner sur le flanc en moins de quinze secondes. Toutes sont tuées pour prélever les organes, et les reproducteurs de la lignée le sont dès qu'ils atteignent un âge trop avancé pour engendrer.
Objectifs
La maladie de Charcot (Sclérose Latérale Amyotrophique, SLA) est une maladie conduisant à la mort des neurones permettant la contraction musculaire : les motoneurones (MN). La mort des MN mène progressivement à une paralysie musculaire qui aboutit au décès du patient via insuffisance respiratoire. A l'heure actuelle, aucun traitement n'est disponible pour cette pathologie. Dans une cohorte de patients atteint de SLA, nous avons identifié une nouvelle mutation située dans une protéine localisée au niveau de la mitochondrie, l'usine énergétique de la cellule. Nous avons démontré que cette mutation affectait la bonne efficacité des mitochondries et donc engendrait une délivrance d’énergie moins performante au sein de la cellule. L'objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment les dysfonctions mitochondriales causées par cette mutation peuvent être à l'origine de la mort des MN. Dans nos études, nous sommes parvenus à créer des souris atteintes de SLA. Ces souris miment très fidèlement les symptômes des patients. Or les mitochondries défectueuses peuvent devenir toxiques si accumulées dans la cellule, et pourraient participer à la mort des MN. La dégradation de ces mitochondries défectueuses est alors cruciale. Afin d'étudier ce processus de dégradation, les souris SLA ont été croisées avec des souris permettant de visualiser ces processus de manière experimentale. Ces souris, appelées "rapportrices" nous permettent de suivre, par un mécanisme indolore, le processus de dégradation des mitochondries defecteuses dans les tissus de la souris. Ces souris nous ont permis de démontrer que les souris SLA avaient une augmentation pathologique et moins efficace de la dégradation des mitochondries défectueuses. Le but précis de ce projet est de tenter d'améliorer ce processus. Pour se faire, nous allons croiser les souris SLA rapportrices avec des souris dépourvues d'une protéine importante pour l'élimination des mitochondries defectueuses. Le but étant de tenter de retrouver des taux basaux de dégradation, et plus efficaces. Ces souris nouvellement générées nous permettront d'étudier ce processus d'élimination des mitochondries dans les différents tissus de ces souris, et à différents stades de vie afin de comprendre si la modulation de ce processus permettrait d’améliorer les symptômes de la maladie.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, aucune solution thérapeutiques n’existe pour lutter contre la SLA. Il est donc capital de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à la mort des motoneurones (MN) afin de pouvoir les cibler. Moduler le processus d'élémination des mitochondries défectueuses pourrait être une approche thérapeutique prometteuse.
Procédures
Une biopsie de peau sera réalisée afin de connaitre leur patrimoine génétique, indispensable aux expériences de ce projet. Ce geste rapide se résume au prélèvement d'un bout de la queue ou sur l’oreille de l'ordre d'1mm et n'aura lieu qu'une seule fois dans la vie de l'animal. Les groupes de souris destinés à des analyses de tissus par coloration subiront une injection d'analgésique suivie d'une injection d'anesthésique. Ce groupe de souris subira donc deux injections juste avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Certaines souris auront des symptômes de SLA : myopathie mitochondriale, avec atteinte des MN et cardiomyopathie conduisant à la mort des animaux avant l’âge de 14 mois. Ces atteintes se traduiront par une prise de poids moins importante en comparaison des souris contrôles dès l’âge de 3 mois, ce qui marque l’apparition du premiers signes d’atteinte clinique. A un stade plus avancé, cela se traduira par une perte de poids et/ou une diminution de la mobilité des souris avec ou non présence de tremblements (10-14 mois). Ce phénotype pourrait être plus tardif en fonction des souris étudiées (le but de l’étude étant de voir si la modulation de la mitophagie permet d’améliorer les signes cliniques développés par ces souris SLA). Au moment du sevrage (21 jours), la biopsie au niveau de la queue ou de l'oreille réalisée sur l’animal afin d’identifier son patrimoine génétique entrainera une douleur légère et de courte durée.
Devenir
Une partie des souris prévue pour ce projet ne subira qu’un degré de gravité expérimental léger; cela concerne 219 individus (la moitié des souris générées lors de l'élevage, sans symptômes). L'autre partie des animaux subira un degré de gravité expérimental sévère. Cela concerne 220 + 2880 = 3100 animaux (Ce nombre comporte l’autre moitié des souris générées lors de l'élevage, avec symptômes de la maladie de Charcot + les souris nécessaires pour la partie expérimentale). Néanmoins, tous les animaux étudiés seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de prélever les organes pour les analyser. Les animaux utilisés pour l’élevage seront utilisés pour la reproduction jusqu’à ce qu’ils atteignent un âge trop avancé pour le pouvoir, ce qui engendrera également une mise à mort.
Remplacement
A des fins de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées sur des cellules prélevées dans la peau de patient souffrant de la maladie de Charcot (SLA) et porteurs de la mutation d’intérêt. De même, une biopsie de cerveau étant impossible, des études ont également pu être menées sur des motoneurones (MN) qui ont été produits à partir de ces cellules de peau de patients. Malgré l’apport scientifique notable de ces études, l’évolution de ce projet vers un environnement plus intégré est nécessaire. En effet, les modèles cellulaires ne nous permettent pas une visibilité globale des dysfonctions affectant à la fois plusieurs types cellulaires et plusieurs organes. Le seul moyen de disposer de ces informations est l’utilisation d’un modèle animal afin d’étudier l’atteinte multiple de cette maladie. De plus, afin de savoir à quels âges débutent les premières dysfonctions biologiques, nous avons besoin d’un organisme capable de croissance et de vieillissement. Cette étude nous permettra de mieux comprendre l’implication de la dégradation des mitochondries défectueuses dans la mort des MN.
Réduction
A des fins de réduction, les études sur cellules continueront d’être menées en parallèles de cette étude sur modèle plus intégré afin d’éviter l’utilisation d’un trop grand nombre d’animaux. Les dysfonctions biologiques seront donc aussi étudiées dans les motoneurones produit à partir des cellules de peau de patients afin de compléter les résultats obtenus, les deux approches étant complémentaires. De plus, des statistiques prédictives ont également été menées à l’aide du logiciel G*Power afin de prévoir le nombre strictement nécessaire d’animaux permettant l’obtention de résultat statistiquement significatifs. Enfin, des études préliminaires sur la dégradation des mitochondries défectueuses menées au sein de l’équipe nous ont servi de travaux prospectifs afin d’accorder plus de crédit aux résultats attendus en réduisant le nombre de procédures nécessaires à la mise en œuvre de ce projet, et donc le nombre d’animaux requis.
Raffinement
-A des fins de raffinement, les souris en processus d’élevage seront maintenues en conditions réglementaires d’hébergement et se verront introduites en environnement sur-enrichi en cas d’agressivité et d’effets de dominances (buchettes, cartons, matériel de nidification supplémentaire). -Concernant les souris en phénotype dommageable ou risquant d’exprimer des signes cliniques grave de la maladie, un suivi hebdomadaire sera réalisé. Ce suivi consiste à lire l’identification de l’animal, suivi d’une pesée puis d’une préhension permettant l’évaluation de l’état de la souris. Cette manipulation fréquente (une fois par semaine) permettra la réduction progressive du stress infligé à l’animal, ainsi qu’une observation minutieuse de l’animal par l’expérimentateur afin d’identifier toute affection et comportement pathologique. Une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. Tout signe clinique sera repris dans une fiche de score en lien avec les symptômes attendus qui a été établi préalablement pour le suivi des souris utilisées au sein de notre équipe. -Toute perte de poids située entre 5 et 15%, ainsi qu’une perte de mobilité (affaiblissement des membres) engendrera un suivi plus fréquent (de bi hebdomadaire à quotidien dans les cas sévères) ainsi que l’ajout de nourriture et d’eau gélifiée dans la cage afin de faciliter l’accès à de la nourriture appètente. Toute perte de poids supérieur à 15%, la présence de tremblements avec mobilité réduite et comportement pathologique entrainera la mise à mort de la souris. -Préalablement à la mise à mort pour la récuperation de tissus pour analyse par coloration, une analgésie suivie d’une anesthésie profonde sera administrée avec vérification par absence de reflexe au pincement.
Choix des espèces
Ce projet se base sur le modèle Mus Musculus car cette espèce possède un cycle de vie et de reproduction court avec un fort taux de natalité, ce qui en fait un modèle d’étude pratique à utiliser. De plus, leurs similarités génétiques avec l’homme nous permettent des études translationnelles. De la même manière, les similitudes anatomiques et biologiques nous permettront d’identifier les organes affectés en disposant d’une grande quantité de matériel biologique. Les animaux seront utilisés aux stades de développement suivants : - Au stade d'apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie - Au stade intermédiaire précoce = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer l’effet de la mitophagie sur la mort des motoneurones) - Au stade intermédiaire tardif = 9 mois de vie (stade également nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer l’effet de la mitophagie sur la mort des motoneurones) - Au stade final = Moment où les signes cliniques graves de la maladie sont atteints (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédente et/ou à la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes)
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de cellules CAR-T anti-GD3 dans un modèle murin de glioblastome sous-cutané.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Immunodéficientes par construction, 84 souris NSG reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de glioblastome humain, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune est anesthésiée pour la greffe, puis deux fois pour l'injection de cellules CAR-T directement dans la tumeur. Le porteur reconnaît que le développement de la tumeur jusqu'à son point limite occasionne une gêne, et que les manipulations et les injections provoquent stress et douleur. Toutes seront tuées au titre d'études de survie, la croissance tumorale étant suivie jusqu'au terme fixé.
Objectifs
Notre projet consiste à évaluer l’efficacité de cellules immunitaires modifiées conçues pour cibler une molécule fortement exprimée à la surface de certaines cellules cancéreuses, dans un modèle animal de tumeur cérébrale (glioblastome). En laboratoire, ces cellules immunitaires modifiées ont déjà démontré leur capacité à freiner la croissance des cellules tumorales. Nous cherchons maintenant à savoir si elles peuvent, chez la souris, ralentir la croissance de la tumeur et ainsi ouvrir la voie à une nouvelle approche thérapeutique contre ce cancer du cerveau particulièrement agressif.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur du cerveau particulièrement agressive, dont le pronostic reste très défavorable. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, et la survie médiane des patients dépasse rarement un an. Évaluer, in vivo, l’efficacité antitumorale de cellules CAR-T ciblant la molécule GD3, fortement exprimée à la surface de certaines cellules cancéreuses, pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques contre ce cancer du cerveau.
Procédures
Tous les animaux recevront une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de glioblastome (84 animaux, une seule intervention de 1 minute environ). Pour cela, ces animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) (84 animaux, une seule intervention de 5 minutes environ). Tous les animaux recevront un traitement intratumoral de cellules CAR-T (84 animaux, intervention de 2 minutes environ, 2 interventions / animal). Pour cela, ces animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) (84 animaux, une seule intervention de 5 minutes environ).
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. Le développement de la tumeur sous-cutanée jusqu'à son point limite occasionne une gène pour l'animal. Les souris NSG sont immunodéficientes.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie.
Remplacement
L'efficacité de nouvelles thérapies sur la croissance tumorale du glioblastome nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique du glioblastome. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenus in vitro et ex vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au strict minimum requis pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 4 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les animaux seront hébergés en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). Les animaux seront anesthésiés avant les procédures de greffes sous-cutanées ou les injections intratumorales (anesthésie gazeuse). La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines. En effet, nous souhaitons réaliser l’étude sur de jeunes souris adultes. A cet âge optimal de 6 semaines, l’organisme de l’animal est parfaitement mature sur le plan métabolique, hormonal et tissulaire, ce qui assure une bonne vascularisation tumorale après la greffe ainsi qu’une croissance tumorale plus régulière et prévisible.
Développement d’une méthode utilisant les isotopes stables du carbone et de l’azote comme indicateur de l’efficacité alimentaire chez le bar et la dorade
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Autres poissons : 100
Améliorer l'efficacité alimentaire des élevages de bars et de dorades, pour abaisser le coût de l'aliment et les rejets des fermes aquacoles : 200 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chacun subit trois prélèvements d'un bout de nageoire et d'écailles sous anesthésie, aux mois 0, 1 et 3, après avoir été identifié par une puce. Le porteur indique que les zones prélevées se régénèrent en moins de deux semaines, et qu'aucun poisson ne peut être relâché, leurs fonds génétiques restreints l'interdisant. Il affirme qu'un caractère aussi complexe que l'efficacité alimentaire mesurée individu par individu n'a "pas d'alternative" non animale disponible.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer une méthode pour mesurer l’efficacité alimentaire ( le poids de nourriture ingéré divisé par le gain de poids ) d’un poisson d’aquaculture en utilisant des marqueurs naturellement présents dans les aliments. Pour cela, le projet combine deux types de mesures : La quantité de nourriture mangée par chaque poisson, obtenue grâce à des vidéos de poissons élevés en petits groupes. La vitesse à laquelle ces marqueurs passent de l’aliment au poisson. L’analyse vidéo permettra de savoir précisément combien chaque poisson mange. En y ajoutant la mesure de sa croissance, on pourra calculer son efficacité alimentaire individuelle. Avant l’expérience, les poissons seront habitués à un aliment A. Pendant l’évaluation, ils recevront un aliment B. Ces deux aliments auront des compositions différentes (par exemple des proportions différentes d’huile ou de farine de poisson), ce qui leur donnera des signatures distinctes pour les marqueurs étudiés. Ces signatures seront ensuite mesurées dans différents tissus des poissons, comme les écailles ou les nageoires, grâce à une technique d’analyse spécialisée. Enfin, on vérifiera s’il existe un lien entre la manière dont chaque poisson absorbe ces marqueurs et sa capacité à utiliser efficacement la nourriture.
Bénéfices attendus
Cette nouvelle méthode pour évaluer l’efficacité alimentaire, basée sur l’analyse de la façon dont les poissons absorbent certains marqueurs naturels présents dans l’aliment, permettra d’estimer facilement les performances individuelles de plusieurs milliers de poissons élevés en groupe. Grâce à un simple changement d’aliment et à un prélèvement léger de tissu (comme des écailles ou une nageoire), il sera possible de mesurer l’efficacité alimentaire des bars et des dorades. Cette approche rendra plus simple et plus pratique la sélection des poissons qui utilisent le mieux leur nourriture. Ainsi, il deviendra possible de mettre en place une sélection ciblée dans une ferme pour choisir les animaux les plus performants et améliorer ce caractère sur le plan génétique. Améliorer l’efficacité alimentaire apporte à la fois des avantages économiques (réduction du coût de l’alimentation) et des bénéfices environnementaux (moins de rejets dans le milieu naturel).
Procédures
Pour réaliser ce projet, les animaux seront prélevés à trois reprises d'un bout de nageoire et d'écailles. Chacun de ces prélèvements prend moins d'une minute et sera réalisé sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Le projet n'implique qu'une procédure légère. Les petites blessures causées par les prélèvements d’écailles ou de fragments de nageoires guérissent rapidement. En quelques semaines, les poissons régénèrent entièrement les zones prélevées. Les prélèvements répétés sur les nageoires n’ont pas d’effet négatif sur leur façon de nager. Les prélèvements de nageoires sont réalisés avec un emporte-pièce de petite taille (3 mm de diamètre), ce qui permet une repousse complète du tissu en moins de deux semaines. Ces prélèvements auront lieu aux mois 0, 1 et 3. Enfin, chaque poisson sera identifié grâce à une petite puce d’identification, ce qui permettra de suivre ses performances individuelles tout au long de l’étude.
Devenir
Tous les poissons seront euthanasiés à l'issue de la procédure. La réutilisation et le replacement de ces individus n'est pas possible. Leurs fonds génétiques restreints ne permettent pas de les relacher dans le milieu naturel.
Remplacement
Ce type d'expérimentation, où la variation observée et recherchée est liée à l'individu, ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n'y a donc pas de remplacement possible. La mesure de l'efficacité alimentaire (ingéré/gain de poids) est un caractère complexe mettant en jeu une multitude de mécanismes comme la capacité à assimiler les nutriments, le métabolisme énergétique, l'activité de nage des poissons, la microflore intestinale. Ce caractère complexe étudié au niveau individuel n'a pas d'alternative non animale disponible du fait de ses nombreuses composantes et des variabilités individuelles qu'explore l'étude.
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes sur le bar pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés. Les modèles linéaires qui serviront à analyser les données de corrélation entre l'efficacité alimentaire individuelle et la signature isotopique des tissus prélevés seront réalisés à partir d'un logiciel de statistique.
Raffinement
Pour limiter la souffrance et l'angoisse des animaux, toutes les mesures individuelles et tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie profonde. Les prélèvements de nageoire et d'écailles seront réalisés à chaque fois à une localisation différente. Tout au long de l'expérimentation, les poissons seront hebergés entre congénères et seront surveillés quotidiennement.
Choix des espèces
Le bar et la dorade sont deux espèces majeures en aquaculture et pour lesquels la question de l'efficacité alimentaire se pose avec un vif intérêt. Ces élevages consomment aujourd'hui, à quantité de production égale, près de deux fois plus d'aliments qu'un élevage de truite ou de saumon. Les animaux seront au stade juvénile (entre 50 et 200g de poids moyen) pour pouvoir mesurer des croissances significatives.
Étude du rôle de la carbamylation dans l’hémostase et la thrombose dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésiées pour la totalité des procédures, les souris ne reprennent jamais conscience: prélèvement de sang ou accès à un vaisseau pour y placer un dispositif, puis mise à mort immédiate. 253 souris vont être utilisées, 232 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 21 un niveau modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem sur organes. Il s'agit de mesurer l'effet de la carbamylation du collagène sur l'agrégation des plaquettes, le temps de saignement et la thrombose artérielle, à la suite d'une étude déjà menée sur des plaquettes humaines. Le RNT ne nomme ni le dispositif introduit dans le vaisseau ni le modèle de thrombose employé, et le porteur affirme que ce modèle n'a été associé à aucun signe de souffrance chez les animaux traités.
Objectifs
Selon les données de l'Organisation Mondiale de la Santé, d'ici à 2030, une personne sur six dans le monde aura 60 ans ou plus. Cet allongement de la durée de vie engendre une explosion des maladies chroniques telles que les affections cardiovasculaires. Du point de vue biologique, le vieillissement est le produit de l’accumulation d’un vaste éventail de dommages moléculaires et cellulaires au fil du temps. Au niveau vasculaire, le vieillissement conduit à des modifications des constituants des vaisseaux, dont le collagène. Le collagène voit ses propriétés structurales et fonctionnelles altérées en partie à cause de modifications chimiques appelées réactions de carbamylation. Ces réactions de carbamylation sont amplifiées lors de l'insuffisance rénale chronique, pathologie conduisant à des complications thrombotiques mais aussi hémorragiques qui font intervenir les plaquettes sanguines. Ce projet a donc pour but d'étudier les effets de la carbamylation du collagène sur les fonctions des plaquettes sanguines dans l'hémostase et la thrombose artérielle dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Ce projet d'expérimentation animale permettra de déterminer quels sont les impacts de la carbamylation du collagène et/ou des plaquettes sur l'agrégation plaquettaire, l'hémostase et la thrombose artérielle grâce à l'utilisation de modèles animaux parfaitement maîtrisés par le laboratoire porteur du projet. En d'autres termes, les résultats de ce projet permettront de déterminer si la carbamylation du collagène, qui survient au cours du vieillissement, constitue un facteur de risque d'évènements cardiovasculaires (thrombose, hémorragie) chez les patients insuffisants rénaux, dont le taux de mortalité dû aux maladies cardiovasculaires chez les personnes dialysées est de 10 à 30 fois plus élevé que dans la population générale. L'objectif etant de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques au cours du viellisssement.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. À l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour à la conscience. Trois types de procédures de courte durée (10 à 60 minutes maximum) seront menées. Elles incluront des manipulations limitées visant soit à obtenir un prélèvement sanguin, soit à permettre l’accès transitoire à un vaisseau sanguin pour la mise en place d’un dispositif exploratoire, avant euthanasie immédiate.
Impact sur les animaux
Durant l’anesthésie, une surveillance attentive sera assurée afin de détecter tout signe suggérant une dégradation irréversible de l’état général. En cas d’apparition d’un critère indiquant une souffrance ou une détresse non contrôlable, l’animal sera immédiatement euthanasié. La profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée afin de garantir l’absence de perception de douleur ou d’inconfort pendant toute la durée des procédures. En cas de signe de réveil, l’anesthésie sera ajustée afin de maintenir une sédation adéquate jusqu’à la fin de l’expérience. Des mesures seront prises pour prévenir l’hypothermie et assurer un confort optimal pendant l’anesthésie. Enfin, le modèle utilisé a déjà été validé dans des travaux antérieurs et n’a pas été associé à l’apparition de signes de souffrance ou d’effets indésirables chez les animaux traités.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale pour analyses post-mortem sur organes.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans la continuité d'une étude réalisée ex vivo à partir de plaquettes humaines ayant montré que la carbamylation du collagène modifie l'adhérence des plaquettes. Ce projet vise donc à valider les effets de la carbamylation dans les processus d'hémostase et/ou de thrombose in vivo chez la souris. La formation de thrombose artérielle est un phénomène complexe, multifactoriel, multicellulaire, qui nécessite l'utilisation de modèles intégrés. Par ailleurs, aucun modèle de substitution n'existe pour mesurer l'effet d'une substance sur le prolongement du temps de saignement. Des mesures d'agrégation plaquettaire et du temps de thrombose artérielle seront également réalisés.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire dans les procédures expérimentales est de 253. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Les souris sont anesthésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons scientifiques, pratiques et éthiques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris mâles seront agées entre 8 à 20 semaines correspondant à des souris adultes dont les parramètres hémostatiques et vasculaires sont biens définis.
Statut parental en sélénium et tolérance au mercure chez les alevins de truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Évaluer si des coproduits de thon, chargés en méthylmercure, peuvent entrer dans l'alimentation des poissons d'élevage: l'objet du projet est la faisabilité d'une ressource pour la filière aquacole. 6 000 alevins de truite arc-en-ciel d'environ 100 milligrammes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués dans un bain de tricaïne puis prélevés. Pendant 21 jours, ils reçoivent un aliment contenant 2 milligrammes de mercure par kilo, avant une privation alimentaire de 16 heures la veille de la mise à mort. Cette dose représente quatre fois la limite légale pour les aliments aquacoles, le porteur la décrivant comme un "stress physiologique contrôlé" choisi pour provoquer un stress oxydant mesurable sans provoquer de mortalité.
Objectifs
Afin d’assurer la durabilité de l’aquaculture, il est nécessaire de réduire la dépendance aux farines et huiles de poissons. Les aliments alternatifs à base de protéines et huiles végétales peuvent limiter la croissance des poissons. Les coproduits de thon, représentant jusqu’à 65 % du poisson non commercialisé, constituent une ressource alternative intéressante et ont montré leur efficacité sur les performances des poissons. Cependant, le thon et ses coproduits peuvent contenir du mercure, souvent sous forme de méthylmercure, en quantité supérieure aux seuils réglementaires pour l’alimentation humaine et animale. Ce composé, facilement absorbé et lentement éliminé, s’accumule dans les tissus et exerce une toxicité liée à son effet pro-oxydant. Il perturbe les défenses antioxydantes, induit un stress oxydant et une réponse pro-inflammatoire, en particulier durant les stades précoces du développement. Chez les poissons, peu d’études ont examiné les conséquences d’une exposition alimentaire précoce au méthylmercure sur les mécanismes de défense antioxydante et inflammatoire. Le sélénium, élément trace essentiel présent également dans le thon, joue un rôle clé dans la régulation du stress oxydant et pourrait limiter la toxicité du méthylmercure. Il favorise la déméthylation du méthylmercure, accélère son excrétion et stimule l’expression de gènes antioxydants et de détoxication. Le statut en sélénium des géniteurs pourrait ainsi moduler la sensibilité de leur descendance à l’exposition au mercure. Mieux comprendre cette interaction est essentiel pour évaluer les risques liés à l’incorporation de coproduits de thon dans les aliments aquacoles, dans une perspective de durabilité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’acquérir des connaissances nouvelles sur les interactions entre mercure et sélénium, notamment sur les mécanismes antioxydants et les voies de détoxication impliquées. Les résultats attendus contribueront à : 1) mieux comprendre les effets d’une exposition alimentaire au méthylmercure chez les poissons pendant les stades précoces du développement ; 2) préciser le rôle du sélénium parental dans la tolérance et la protection de la descendance ; 3) évaluer la faisabilité d’utiliser des coproduits de thon dans les régimes destinés à l’aquaculture sans compromettre la sécurité sanitaire ni la performance des poissons. Au-delà des retombées pour la filière aquacole, ces travaux apporteront également des éléments utiles à l’évaluation des risques liés à l’exposition alimentaire au méthylmercure dans les populations humaines, en particulier chez les jeunes enfants. L’expérimentation proposée s’inscrit ainsi dans une démarche de durabilité intégrant à la fois la santé animale, la santé humaine et la protection de l’environnement.
Procédures
Les alevins, d’un poids moyen initial d’environ 100 mg, seront exposés pendant 21 jours à un aliment expérimental contenant du méthylmercure, à une concentration de 2 mg de mercure par kg d’aliment. À l’issue de cette période, ils seront soumis à une privation alimentaire de 16 heures avant l’échantillonnage, correspondant à un dernier repas distribué à 17 h, suivi d’une nuit sans alimentation. Le lendemain matin à 9 h, les animaux seront euthanasiés dans un bain de tricaïne (150 mg/L), puis pesés et prélevés.
Impact sur les animaux
Les alevins seront exposés à un aliment supplémenté en méthylmercure à une concentration de 2 mg/kg, correspondant à quatre fois la limite légale pour les aliments aquacoles et à environ quatre fois la teneur maximale attendue pour un aliment intégrant des coproduits de thon faiblement contaminés. Cette concentration a été choisie pour provoquer un stress oxydant et inflammatoire mesurable tout en évitant la mortalité et des effets sévères sur le métabolisme. Les effets indésirables potentiels sur les poissons incluent un stress oxydant léger, une possible altération temporaire du métabolisme antioxydant et des réponses inflammatoires légères. Aucun effet grave n’est attendu, car la dose a été validée par des essais antérieurs chez la truite à différents stades de développement. La survie, la croissance et le comportement alimentaire devraient rester globalement normaux. Ainsi, les effets indésirables attendus sont jugés légers et transitoires, correspondant à un stress physiologique contrôlé permettant d’atteindre les objectifs scientifiques.
Devenir
Les 6000 poissons mis en expérimentation seront euthanisés et prélevés pour analyse afin d’évaluer le rôle protecteur du statut parental en sélénium vis-à-vis de la toxicité du méthylmercure chez les alevins de truite arc-en-ciel.
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible, car l’étude des effets d’un régime alimentaire chez un animal ne peut pas se faire in vitro ou par des systèmes de mesures informatiques.
Réduction
Le nombre d’alevins a été calculé pour obtenir des données fiables sur la croissance, le métabolisme et la biodynamique du mercure tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. La conception expérimentale, incluant la répartition des lots parentaux et des régimes testés dans plusieurs bassins, permet de maximiser l’information obtenue par animal et de limiter le nombre total de poissons utilisés.
Raffinement
Toutes les conditions d’élevage ont été optimisées pour le bien-être des alevins : température contrôlée (17 ±1 °C), photopériode naturelle, densité conforme aux recommandations physiologiques, renouvellement continu de l’eau, et alimentation à satiété visuelle plusieurs fois par jour. Le suivi du bien-être animal sera réalisé par la mise en place d'une fiche d'évaluation et de points limites adaptés. Les manipulations seront limitées au strict nécessaire et effectuées par du personnel formé. Les prélèvements pour analyses seront réalisés après euthanasie et conforme aux recommandations en vigueur, afin de limiter la souffrance. Les mesures de l’environnement et de l’aliment permettent de minimiser l’exposition au mercure et de réduire le risque de stress supplémentaire pour les poissons.
Choix des espèces
En plus d'être la principale espèce piscicole produite en France, la truite arc-en-ciel est un poisson à gros oeufs riches en sélénium. Les animaux utilisés seront des alevins de truite arc-en-ciel, qui commencent à s'alimenter, avant que les réserves vitellines endogènes ne soient totalement épuisées. Les alevins seront nourris avec les régimes expérimentaux pendant 3 semaines, jusqu’à résorption complète des réserves vitellines. Ce stade de développement a été choisi car : -Les stades précoces sont particulièrement sensibles aux effets du méthylmercure, notamment en termes de stress oxydant et de réponse inflammatoire, ce qui permet de mettre en évidence des différences liées au statut en sélénium parental. -Les réserves vitellines fournies par la mère permettent un apport initial en sélénium, ce qui est nécessaire pour étudier l’influence du statut parental sur la tolérance à l’exposition alimentaire au mercure. -L’alimentation exogène à ce stade permet un contrôle précis de l’apport en méthylmercure et en sélénium, ce qui est essentiel pour évaluer la biodynamique d’accumulation et d’élimination du mercure. Ainsi, l’utilisation des alevins à ce stade permet de répondre directement aux objectifs du projet tout en limitant l’exposition à des stades plus avancés et donc en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.
Validation de l’impact intrinsèque de la déficience en HELIOS sur l’activation, la prolifération, l’état d’épuisement et le recrutement des lymphocytes T CD8 dans un modèle de tumeur MC38 sous‑cutanée chez la souris CD45.1.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la tumeur, les ganglions et la rate. Chacune reçoit une injection de cellules de cancer colorectal dans le flanc droit, puis un transfert de lymphocytes T sept jours plus tard, la tumeur devenant palpable au cinquième jour et l'expérience s'arrêtant entre le dixième et le treizième jour. Le porteur indique que les travaux in vitro sur le rôle de la protéine HELIOS ont déjà été menés et que l'activation des lymphocytes ne peut pas être reproduite hors de l'organisme. Il classe le projet en recherche fondamentale et renvoie au conditionnel les applications en immunothérapie, qui pourraient à terme rendre les traitements existants plus efficaces.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier chez la souris le rôle d’une protéine appelée HELIOS dans le fonctionnement des cellules immunitaires appelées lymphocytes T CD8. Ces cellules sont essentielles pour éliminer les cellules cancéreuses. Nous voulons savoir si la déficience d’HELIOS dans les cellules CD8 rend ces cellules plus actives ou, au contraire, moins efficaces. Pour cela, des lymphocytes T CD8 normaux ou dépourvus de HELIOS seront transférés dans des souris atteintes d’une tumeur appelée MC38, un modèle bien établi du cancer colorectal. Nous observerons ensuite comment les cellules immunitaires (les lymphocytes T CD8) s’activent, se multiplient et se déplacent dans la tumeur afin de comprendre l’influence directe de HELIOS sur leur comportement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire dans le cancer afin d’améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Nous avons mis en évidence une combinaison de traitement dans notre équipe qui améliore grandement l’efficacité des immunothérapies. Cette amélioration semble être dépendante de la protéine HELIOS. Notre étude, aidera à déterminer si la protéine HELIOS limite ou favorise l’action des lymphocytes T CD8, qui jouent un rôle majeur dans la lutte antitumorale. Les connaissances acquises pourraient servir de base au développement de nouvelles approches d’immunothérapie, c’est-à-dire des traitements visant à renforcer les défenses immunitaires des patients atteints de cancer. Ces travaux relèvent de la recherche fondamentale, mais ils pourraient à terme contribuer à rendre les thérapies existantes plus efficaces ou à en concevoir de nouvelles, mieux ciblées et moins toxiques. Les résultats permettront d’identifier si HELIOS agit comme un modulateur intrinsèque limitant la prolifération et la persistance des CD8 dans le microenvironnement tumoral. Ces données sont essentielles pour concevoir des stratégies d’immunothérapie plus ciblées, capables d’améliorer la réponse antitumorale sans la suppression de la réponse immunitaire anti-tumorale. En outre, ce modèle expérimental apportera une base de connaissances utile à la recherche translationnelle sur la régulation des réponses immunitaires dans le cancer.
Procédures
Les souris seront soumises à deux types de manipulations principales : Implantation tumorale : Chaque souris recevra, sous anesthésie gazeuse, une injection de cellules tumorales dans le flanc droit. Cette injection de 3 secondes provoque la formation d’une petite tumeur localisée, généralement palpable à partir du 5ᵉ jour. Cette phase dure environ 10 à 13 jours avant l’euthanasie des animaux. Transfert adoptif de lymphocytes T CD8 : Sept jours après l’implantation tumorale, les souris recevront une injection de lymphocytes T CD8 (cellules du système immunitaire), soit normales, soit dépourvues du facteur d’intérêt. Cette injection est rapide (moins de 10 secondes) et réalisée sous anesthésie pour éviter toute douleur.
Impact sur les animaux
La procédure est classée en sévérité modérée. La classification modérée signifie que les animaux peuvent ressentir un inconfort temporaire, mais pas de douleur prolongée ni de souffrance sévère. L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite mais ne semble pas attendue étant donné que l’expérience sera stoppée 10 et 13 jours après injections des cellules tumorales. Les animaux atteignant les points limites seront immédiatement mises à mort selon la note de la grille de score. L’ensemble des procédures sera conduit sous anesthésie gazeuse, et les animaux bénéficieront d’un enrichissement environnemental pour réduire le stress.
Devenir
Les 90 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les organes
Remplacement
Avant de réaliser les expériences sur les animaux, des études en laboratoire (in vitro) ont déjà été menées pour évaluer le rôle de HELIOS dans les lymphocytes CD8. Cependant, les phénomènes d’activation et de migration de ces cellules dépendent de nombreux échanges entre différents types de cellules et ne peuvent pas être reproduits correctement hors de l’organisme. L’expérimentation animale reste donc nécessaire pour répondre à la question scientifique posée.
Réduction
Trois groupes expérimentaux avec des effectifs de n=15 (N=5 x 3 répétitions) à J10 et n=15 à J13 seront utilisés. L’expérience sera donc répétée 3 fois. Le nombre d’animaux a été limité à 90 souris au total (3 groupes de (5 *2 temps *3 répétitions)), soit le minimum permettant une analyse statistique valide. Chaque souris fournira plusieurs échantillons (tumeur, ganglions, rate), maximisant la quantité de données par individu. Les analyses multiparamétriques réduisent le besoin de répétitions supplémentaires. Chaque souris fournira plusieurs types de données (cytométrie, histologie, mesure tumorale), ce qui maximise la quantité d’informations recueillies sans augmenter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis quotidiennement par les personnels animaliers ils seront suivis au min 3 fois par semaine par les techniciens de l’étude et quotidiennement si une des variables mesurées dans la grille des points limites montrent une possible dégradation de l’animal (perde de poids, modification du comportement) Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe.
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.