Recherche fondamentale

Nourries d'un régime riche en cholestérol pendant huit, quatorze ou vingt-quatre semaines, injectées par voie intraveineuse, passées à l'IRM avant l'injection puis six et vingt-quatre heures après, 1 790 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris génétiquement modifiées développent des plaques dans les artères, un groupe non modifié constituant le témoin sain. Le porteur présente l'IRM comme une imagerie "sans risques" tout en décrivant des variations du rythme cardiaque et respiratoire pendant l'examen, une hypothermie possible en imagerie optique, et des injections répétées susceptibles de provoquer inflammation, douleur et caillots au point de piqûre. Le prélèvement sanguin final se fait sous anesthésie profonde suivie de la mise à mort, les organes étant ensuite prélevés.

Objectifs

L'athérosclérose est une maladie inflammatoire systémique, chronique et progressive qui touche les artères . Elle se développe lentement et provoque des dépôts de graisses (appelés plaques) dans les parois des vaisseaux sanguins. L’athérosclérose crée les conditions pathologiques de l'infarctus du myocarde, l'angine de poitrine, l’accident vasculaire cérébrale et des problèmes circulatoires. Le plus souvent, ces plaques dangereuses ne causent pas de symptômes avant qu’il ne soit trop tard. C’est pourquoi il est essentiel de mieux les détecter avant qu’elles ne se rompent. Notre recherche vise à développer un outil combiné de diagnostic et de traitement (appelé théranostic). Ce système permet à la fois de voir les plaques à l’aide de l’IRM (imagerie par résonance magnétique) et de délivrer un médicament ciblé directement sur la zone concernée. Ces outils seront développés à partir d’anticorps humains afin de minimiser les réactions d’allergie lors de l’injection chez l’homme. L’IRM est une modalité d’imagerie « sans risques » qui offre la possibilité d’utiliser des agents de contraste sûrs. Avant d’envisager une utilisation chez les patients, ces outils doivent être testés dans des études précliniques sur des souris présentant des lésions similaires à celles de l’homme. Un groupe de souris « saines » sert de comparaison. Ces modèles permettent de comprendre comment le corps entier réagit, et d’analyser précisément les tissus.

Bénéfices attendus

Les outils de diagnostic, de traitement et de prévention développés dans cette étude permettront de créer de nouveaux systèmes d’évaluation, utiles pour repérer les personnes les plus à risque et mieux cibler celles qui pourraient bénéficier d’immunothérapies. Aujourd’hui, le traitement de l'athérosclérose est souvent mis en place trop tard, uniquement après l’apparition de symptômes ou d’un accident cardiovasculaire. Ce projet offre une opportunité unique de changer cette approche, en mettant en place un suivi précoce et préventif des personnes à risque, même si elles ne présentent encore aucun signe. Cela permettrait de proposer des traitements personnalisés en amont, afin de réduire le nombre de complications cardiovasculaires tout en diminuant les coûts pour le système de santé

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types de régimes riches en cholesterol pendant trois périodes distinctes de 8, 14 et 24 semaines. Des images seront prises lors des injections (une injection unique par bionano-objet, anticorps ou serum physiologique) à l'aide de l'IRM (30 minutes), avant et après injection (6 et 24 heures après injection) sous anesthésie (30 min), ou via imagerie optique (durée : 4 minutes), en pré et post-injection sous anesthésie (10 min). La durée des injections correspondra au temps nécessaire pour administrer une piqûre à une souris anesthésiée. Dans les expérimentations d'efficacité thérapeutique avec les bionano-objets, deux injections hebdomadaires pendant deux semaines d’anticorps ou de serum physiologique sont réalisés , un prélèvement sanguin unique sera effectué au début, à mi-parcours (durant 1-2 mins ) et à la fin du protocole ( durant 2-5min), sous anesthésie profonde avec euthanasie. Lors des études ex-vivo des prélèvements d’organes, seront réalisée après euthanasie.

Impact sur les animaux

Les injections intravéneuses répétées des différents composés peuvent susciter une réaction inflammatoire, une douleur, la formation de caillots au point d'injection. Le test du régime avec la nouvelle souche de souris peut entrainer une perte ou un gain de poids excessif, une léthargie, un changement dans la consommation d'eau ou d'aliments, une teinte jaune des muqueuses (ictère, signe de dysfonctionnement hépatique), grattage excessif, léchage.L'IRM est une technique non-invasive cependant, durant l'examen un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire , mesurés grâce à un capteur placé entre l'animal et le lit IRM, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux de la sensibilité aux anesthésiques. L'imagerie optique de fluorescence est une méthode non invasive largement utilisée peut présenter certains effets indésirables comme l’hypothermie. L’anesthésie utilisée lors des injections ou lors des imageries pourrait affecter la fréquence respiratoire, la température corporelle, induire du stress, léthargie si répétitions.

Devenir

Notre étude porte sur le théranostic de l'athérosclérose, à savoir offrir la possibilité d'effectuer une imagerie non invasive par résonance magnétique (IRM) pour établir le diagnostic et d’administrer un médicament au niveau du site d'intérêt pour le traitement. Ces outils de diagnostic seront développés à partir d’anticorps humains afin de minimiser les réactions d’allergie lors de l’injection chez l’homme. L’IRM est une modalité d’imagerie « sans risques » qui offre la possibilité d’utiliser des agents de contraste sûrs. Il est cependant nécessaire de tester ces outils de diagnostic dans des études pré-cliniques. Ces études sont réalisées sur 3 modèles animaux d’athérosclérose et un modèle témoin « sain ». En effet, afin de nous permettre de répondre aux questions cliniques, des modèles animaux de la pathologie sont nécessaires afin d’avoir une représentation complète de la physiologie du corps entier. A l'issue des différentes procédures, les animaux seront mis à mort et des analyses sur les tissus de ces groupes seront également effectuées afin de valider nos études in vivo.

Remplacement

L'athérosclérose est une maladie systémique, multifactorielle et évolutive, influencée par des facteurs hémodynamiques, immunitaires et métaboliques, qui jouent un rôle clé dans la formation et la progression des plaques athéromateuses. Les modèles in vitro montrent des limites majeures, telles que l'absence d'interactions systémiques, de circulation sanguine réelle, de contraintes mécaniques naturelles, et l'impossibilité de reproduire l'évolution temporelle des plaques et les réponses immunitaires complexes. En revanche, les modèles animaux offrent un environnement physiologique réaliste, intégrant les interactions biologiques, les contraintes mécaniques et l'évolution dynamique des lésions. Ils restent essentiels pour une compréhension complète de la pathologie, la validation de cibles thérapeutiques et le développement d'approches diagnostiques et préventives efficaces et transposables à l'humain.

Réduction

Pour l’établissement des modèles pathologiques se fera par une étude pilote, le nombre d’animaux calculé est le nombre nécessaire pour valider statistiquement l’étude avec une prise en compte du taux de mortalité mort et/ou d’exclusion lié au modèle de plaque développée. Par ailleurs, le nombre d’animaux reste modéré car lors des étapes de mises au point des séquences IRM in vivo ou imagerie optique de fluorescence, les souris seront imagées plusieurs fois. Le nombre d’animaux utilisé sera nécessaire et suffisant pour détecter statistiquement la pathologie et la biodistribution des biomolécules injectées. Ceci permettra de valider les résultats obtenus et d’évaluer les différences entre animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi par des objets (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, coton, maisonnette, tubes en carton) contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté. Pour éviter toute douleur ou stress lors des expériences, une anesthésie gazeuse sera utilisée. Des dispositifs comme un tapis chauffant ou un système de chauffage par l’eau aideront à maintenir leur température corporelle. La respiration, et parfois le rythme cardiaque et la température, seront surveillés grâce à un ballon posé sur leur abdomen ou à des électrodes autocollantes placées sur leurs pattes. Cela permettra d’ajuster la dose d’anesthésique si nécessaire. Si le rythme cardiaque ou respiratoire varie de plus de 50 %, l’expérimentation sera arrêtée. Un gel ophtalmique sera appliqué pour protéger leurs yeux. Après les expériences (IRM ou imagerie optique), les animaux seront surveillés attentivement à leur réveil pour détecter tout signe de douleur, d’inconfort ou de stress. Ils resteront sous lampes chauffantes jusqu’à leur rétablissement complet et recevront une réhydratation si besoin. Si un animal montre des signes de souffrance après une injection, il recevra un traitement antidouleur ou anti-inflammatoire toutes les 6 à 12 heures selon son état. Si nécessaire, il sera euthanasié selon le protocole de mise à mort décrit. Les doses des biomolécules injectées respecteront les références scientifiques disponibles, mais une attention particulière sera portée à tout signe de souffrance, même minime. Les animaux seront surveillés chaque jour par les techniciens et chercheurs du laboratoire, y compris les week-ends et jours fériés, afin d’assurer leur bien-être et leur suivi en accord avec le protocole de recherche et les règles éthiques.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l’étude de l’athérosclérose, notamment grâce à la possibilité d’utiliser des techniques d’imagerie avancées comme l’IRM ou la fluorescence. Pour reproduire cette maladie, marquée par l’accumulation de plaques de cholestérol dans les artères, on utilise des souris génétiquement modifiées, chez lesquelles certains gènes impliqués dans le transport ou le métabolisme des lipides ont été inactivés. Certaines de ces souris, déficientes en protéines transportant les lipides, développent rapidement des plaques athéromateuses. Cela permet de suivre les différentes étapes de la maladie et de tester l’efficacité des outils d’imagerie. Ce modèle est particulièrement adapté à l’étude du diagnostic et des approches thérapeutiques, car les plaques formées y sont complexes, inflammatoires et instables – un contexte idéal pour évaluer des traitements visant à les stabiliser ou à les faire régresser. D’autres modèles murins, dont le profil lipidique est plus proche de celui de l’humain, présentent une progression plus lente et contrôlée de la maladie. Ces souris sont mieux adaptées aux études de prévention, car elles permettent de tester l’effet de traitements à long terme pour retarder ou empêcher la formation des plaques. Les souris sont incluses dans le protocole à l’âge de 6 semaines, un moment clé où les vaisseaux sanguins sont suffisamment développés pour détecter les premières lésions, tout en restant sensibles aux facteurs de risque comme une alimentation riche en graisses ou certaines altérations génétiques. Cela permet d'étudier les stades précoces de l’athérosclérose et d’évaluer précocement l’impact de traitements. De plus, cet âge est largement utilisé dans la recherche, ce qui facilite la comparabilité et la reproductibilité des résultats entre différentes études.

132 rats, jeunes d'un mois et âgés de dix-huit mois, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever le contenu de l'intestin, les muscles de la patte et le cerveau. Ils passent cinq semaines seuls en cage du lundi au vendredi, un hébergement dont le porteur reconnaît qu'il induit un stress modéré et empêche l'expression des comportements sociaux. S'y ajoutent des jeûnes de douze à quatorze heures avant les tests de satiété et de préférence alimentaire, deux prises de sang sur animal vigile emmailloté dans un tissu, deux injections et vingt-quatre heures en cage automatisée. L'enjeu déclaré est de positionner une protéine de maïs, la zéine, dans l'offre alimentaire humaine, le porteur affirmant qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut intégrer l'ensemble des paramètres étudiés.

Objectifs

Le vieillissement de la population s’accompagne d’une augmentation de la dépendance et des limitations fonctionnelles, dont la perte de masse et de force musculaire est l’une des causes principales. L’apport en protéines de qualité constitue un levier essentiel pour prévenir cela et les protéines du lactosérum sont aujourd’hui considérées comme optimales grâce à leur richesse en leucine, un acide aminé indispensable favorisant la synthèse protéique. Bien que les protéines végétales aient un équilibre en acides aminés de moindre qualité, l’utilisation de protéines végétales de diverses origines permet aujourd’hui de produire des mélanges présentant un profil d’acides aminés globalement satisfaisant. Cependant, il est difficile d’enrichir ces mélanges en leucine. Une protéine végétale se distingue pourtant par sa richesse en leucine : la zéine du maïs. Mais cette protéine est actuellement écartée de l’offre alimentaire car elle est peu soluble et très peu digestible. De nouveaux système de production de zéine ont été développés et permettent d’obtenir une meilleure solubilité et digestibilité (zéine optimisée). L’objectif du projet est ainsi d’étudier l’impact d’un mélange végétal protéique contenant la zéine optimisée sur la digestibilité, la synthèse protéique et le comportement alimentaire chez le rat jeune et âgé.

Bénéfices attendus

La zéine est une protéine peu étudiée mais avec un potentiel important en nutrition humaine du fait de sa richesse en leucine. Son utilisation en nutrition est bloquée par sa faible digestibilité. La production d’une zéine optimisée dont la digestibilité et la solubilité est augmentée permet de lever ce verrou. Le projet permettra d’obtenir les premiers résultats concernant l’effet de ce nouveau produit sur la synthèse protéique dans la population cible, l’individu âgé. D’autres paramètres évalués, comme le comportement alimentaire et la digestibilité, permettront de comparer les effets de la zéine par rapport à d’autres sources protéiques végétales et de la positionner dans l’offre de protéine végétale actuelle. Ce projet participe à promouvoir une transition vers une alimentation plus végétalisée et durable, tout en répondant aux besoins spécifiques des personnes âgées.

Procédures

Pesées. Les animaux sont pesés 5 fois par semaine. La pesée est réalisée en 2 minutes environ. Des régimes comportant des protéines végétales répondant aux besoins des rats sont donnés aux animaux pendant 4 semaines. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile sont réalisés au cours du projet sur l’ensemble des rats, la durée ne dépassant pas 3 minutes par prise. L’ensemble des animaux reçoit également, une injection d’analgésique, réalisée sur rat vigile en moins de 30 s (une injection par rat). Tous les animaux reçoivent une injection réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes. Mises à jeun : les tests de satiété et de préférence alimentaire sont réalisés après un jeun modéré (soit privation de nourriture pendant la période de repos (maximum 14h), n’entrainant pas de perte de poids, soit après suppression du premier repas en période d’activité. Caractérisation du comportement alimentaire : les animaux sont placés dans des cages automatisées permettant de suivre l’évolution de leur consommation alimentaire pendant 24h. Pour cela les animaux sont préalablement habitués à ces cages, pendant 1h quelques jours avant le test.

Impact sur les animaux

Afin d’évaluer la prise alimentaire (aliments et boisson en libre accès), il est nécessaire d’héberger les rats en cages individuelles du lundi au vendredi pendant 5 semaines. L’hébergement individuel peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. Pour limiter ce stress, les rats sont placés à 2/cage lors des week-end, toujours avec le même partenaire et dans une cage ayant conservé leur odeur. Pour préciser les modalités de la prise alimentaire au cours du cycle de 24h, chaque rat est placé pendant 24h, une fois au cours de l’expérimentation, dans une cage de mesure automatisée du comportement alimentaire. Le changement d’environnement peut induire un stress léger pour les animaux. Pour le test de satiété (1 test par rat au cours de l’expérimentation) et pour le test de préférence alimentaire (1 test par rat pendant l’expérimentation), les rats sont mis à jeun au maximum pendant 12 à 14h, au cours de leur période de repos (période d’éclairage) pendant laquelle ils ne s’alimentent pas ou peu, ce qui peut être considéré comme un jeune physiologique (pas de perte de poids). Deux prises de sang (à jeun et après l’ingestion d’un repas calibré) sont réalisées pour évaluer les concentrations plasmatiques post-prandiales des hormones de la satiété. Ces prises de sang sont effectuées rapidement (< 3 min), le rat étant maintenu emmailloté dans un tissu. Cette opération peut provoquer un stress modéré. Une injection est réalisée sur rat anesthésié. Cette injection peut provoquer une douleur de piqure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car la détermination de la digestibilité des protéines, et de la synthèse protéique dans le muscle, et l’analyse de marqueurs cérébraux en lien avec la prise alimentaire nécessitent la collecte des contenus de l’intestin, des muscles de la patte et du cerveau.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer l’effet d’une nouvelle source protéique pour l’alimentation humaine, la zéine optimisée, sur le comportement alimentaire, la digestibilité et la synthèse protéique chez des rats jeunes et âgés. Cette approche nécessite d’utiliser des modèles in vivo, permettant de prendre en compte les adaptations comportementales de l’individu et les effets physiologiques sur la digestion et le métabolisme protéique. Aucun modèle in vitro ou in silico ne peut intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, le cerveau, l’intestin et les organes associés.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé par un logiciel statistique à 10 rats/groupe à partir de données comparables obtenues lors d’études précédentes réalisées dans notre laboratoire afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre eux à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

A leur arrivée dans l’animalerie, les rats ont une période d’habituation de 7 jours à leur nouvel environnement. Tout au long du projet, le bien-être animal est pris en compte avec un hébergement enrichi et un suivi quotidien des rats par des agents qualifiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages individuelles sont en plexiglas transparent permettant les interactions visuelles entre les animaux. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif et auditif (vocalises). Afin de limiter encore l’impact de l’isolement, les cages sont enrichies au moyen de tunnels (opaques ou transparents). Un enrichissement social est également prévu : les rats sont regroupés par 2 (rats de même sexe, âge et groupe) dans des cages collectives durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’interaction sociale. Pour déterminer les modalités de la prise alimentaire sur 24h, les rats sont au préalable habitués aux cages de mesure automatisée de la prise alimentaire. Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. De plus, l’animal est habitué régulièrement à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors de l’injection permettant l’évaluation de la synthèse protéique, les rats sont anesthésiés par anesthésie gazeuse et ont reçu une dose d’analgésique au préalable. Enfin, des points limites sont appliqués, au-delà desquels les animaux sont temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère dont la physiologie digestive (c’est un monogastrique) et le comportement alimentaire (c’est un omnivore), notamment la prise quotidienne en plusieurs repas séparés, sont comparables à ceux de l'Humain. Le rat est un modèle reconnu et utilisé par les laboratoires étudiant les mécanismes régulateurs du comportement alimentaire, mais aussi la digestibilité des protéines et le métabolisme protéique. L’objectif du projet est d’évaluer les effets du mélange zéine optimée et isolat de protéines de pois chez l’individu âgé. Ces effets sont comparés à ceux obtenus chez l’individu jeune. Pour cela, des rats jeunes (1 mois) et âgés (18 mois) sont inclus.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lignée étudiée porte une forme de lipofuscinose neuronale céroïde de type 7, une maladie héréditaire de l'enfant, et les souris atteintes perdent peu à peu la vue, la motricité et leurs capacités cognitives, avec une paralysie qui débute vers huit mois. Pendant dix mois, elles passent toutes les cinq semaines une batterie de tests : réflexes visuels devant des écrans, barre rotative pour l'équilibre, grille pour la force de préhension, suspension par la queue, deux heures seules en cage pour mesurer l'activité, et un examen de l'œil sous anesthésie à 20 semaines. Le porteur n'annonce qu'un "stress léger" lié à l'accumulation des tests, alors que l'étude se poursuit jusqu'à dix mois d'âge, environ deux mois après le début de la paralysie, pour savoir "à quel moment il serait le plus efficace de commencer un traitement".

Objectifs

Ce projet porte sur l’étude d’une maladie rare et grave du cerveau qui touche de jeunes enfants. Les enfants atteints commencent à perdre leurs capacités motrices (comme marcher ou tenir des objets), leurs capacités visuelles, puis leurs capacités intellectuelles, dès l’âge de deux ans. Ils décèdent souvent avant l’âge de dix ans, car il n’existe pas encore de traitement pour traiter cette maladie. La maladie est causée par une modification d'un gène, qui fabrique une protéine entrant dans la composition du lysosome, un organite qui évacue les déchets des cellules. Quand ce système ne fonctionne plus, des déchets s’accumulent dans les cellules, ce qui les abîme, en particulier dans le cerveau. Pour mieux comprendre comment cette maladie évolue et pourquoi elle provoque ces dégâts, nous voulons étudier une souris porteuse d’une version similaire de la maladie. Cette souris, encore jamais décrite dans les publications scientifiques, présente les mêmes symptômes que les enfants malades : elle perd peu à peu ses capacités à bouger, ses capacités visuelles et ses capacités cognitives et nerveuses, puis meurt prématurément. Nous allons notamment observer son comportement et sa vision, afin de mieux comprendre le développement de la maladie. Les tests réalisés seront : une évaluation des réflexes visuels à l’aide d’écrans, un test ophtalmique avec une imagerie de l’œil, un test d’équilibre avec une barre rotative, un test de force et de préhension à l’aide d’une grille, une observation de l’activité dans une cage individuelle et un test neurologique par suspension par la queue. Ce travail fait suite à une première étude qui s’était intéressée à ce qui se passe dans les cellules et qui avait commencé à tester une première piste de traitement en laboratoire.

Bénéfices attendus

Cette étude va nous aider à mieux comprendre cette maladie rare (la céroïde lipofuscinose neuronale de type 7) chez la souris. Après avoir testé en laboratoire un traitement Invitro (sur des cellules porteuses de cette maladie), nous voulons maintenant observer comment les symptômes apparaissent et évoluent chez les animaux. Cela nous aidera à savoir à quel moment il serait le plus efficace de commencer un traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une batterie de tests de comportement et de vision non invasif durant 10 mois. Les tests sont espacés de 5 semaines et sont étalés sur 2 semaines. Un test de vision sera effectué une fois à l'âge de 20 semaines nécessitant une anesthésie par injection et l'application d'un collyre afin de dilater la pupille. Les tests comportementaux que subiront les animaux sont : un test d'évaluation de la vision (20 min, 2 fois), un test de force (15 min, 5 fois), un test de coordination (15 min, 4 fois), un test neurologique (1 min, 5 fois), un test d'activité (2h, 5 fois). Lorsque plusieurs tests sont prévus la même semaine, un temps de repos entre les tests sera prévu afin de permettre à l’animal de récupérer et d’obtenir des résultats fiables.

Impact sur les animaux

L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger. Un léger stress des animaux pourra résulter de l'anesthésie ainsi que des deux injections nécessaires à celle-ci.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Une première étude a été réalisée sur des cellules de souris de la céroide lipofuscinose de type 7 pour étudier cette maladie et tester une possibilité de traitement. Cependant, l'étude présente a pour objectif l'observation des modifications du comportement, l'apparition de symptômes, ne peuvent être réalisé que sur un organisme complet. Le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d'une maladie neurodégénérative chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, posture, présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Notre étude étant réalisé sur des animaux développant un phénotype dommageable à partir de 8 mois, un tableau de suivi sera mis en place à ce moment pour tous les animaux. Ce tableau établit un score sur base de paramètre tel que la perte de poids, l'apparence physique, le comportement à distance et le comportement à la manipulation. Selon les résultats des scores, les animaux pourront être retirés de l'étude voir être euthanasiés selon l'état d'avancement des symptômes observés. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Les animaux disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris comme modèle d'étude est particulièrement pertinente en raison de sa similitude génétique avec l'humain, de la possibilité de manipulations génétiques précises et de son utilisation largement validée dans la recherche sur les maladies neurodégénérative telle que celle de ce projet mais aussi Alzheimer par exemple. Le modèle murin de lipofuscinose céroïde neuronale avec lequel nous avons choisi de travailler récapitule assez bien les phénotypes observés dans la pathologie humaine. Les symptômes de la maladie (baisse de la vision, paralysie progressive) apparaissent tout le long de la vie de l'animal jusqu'à 11 mois d'âge, âge auquel les animaux sont trop atteints pour les tests expérimentaux. L'étude commencera à 11 semaines d'âge, âge auquel les animaux ont une taille suffisante pour passer les tests de comportement. Elle se prolongera jusqu'à 10 mois car l'apparition des symptômes de paralysie commencent vers 8 mois et se terminera à 10 mois soit avant que les symptômes ne soient trop importants pour le bien-être des animaux.

Injectées sous la peau avec des cellules de cancer du sein, du poumon, du pancréas ou du cerveau, 896 souris subissent une mesure de leur tumeur tous les trois jours pendant vingt à quarante jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit quatre à huit injections de traitement et une à deux séances d'imagerie par bioluminescence par semaine, sous anesthésie. Le porteur note chaque geste comme réalisé "sans douleur" tout en décrivant des tumeurs sous-cutanées inconfortables et, en cas de propagation du cancer, un essoufflement et des tremblements. La mise à mort intervient à la fin des procédures, ou plus tôt si la tumeur devient trop grosse, et passe par une ponction cardiaque sous anesthésie profonde.

Objectifs

Ce projet cherche à développer une nouvelle immunothérapie contre un type particulier de cellules appelées cellules souches cancéreuses. Ces cellules jouent un rôle clé dans l’apparition, la progression et la dissémination des cancers, mais aussi dans les rechutes après traitement. Elles sont très résistantes aux traitements classiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie, ce qui les rend particulièrement difficiles à éliminer. Les vaccins anticancer existants ciblent certains marqueurs présents à la surface des cellules tumorales, mais leur efficacité est limitée car ils ne prennent pas en compte les cellules souches cancéreuses. Notre approche propose de s’attaquer directement à ces cellules, responsables de la résistance et de la récidive. Pour cela, nous utilisons un procédé innovant basé sur des cellules souches spéciales de souris (appelées iPSCs), qui partagent de nombreux marqueurs avec les cellules souches cancéreuses mais pas avec les cellules normales. Ces cellules permettent de fabriquer un « mélange d’antigènes » capable de déclencher une réponse immunitaire forte et ciblée contre les cellules souches cancéreuses. L’objectif est de stimuler à la fois les défenses immunitaires cellulaires (lymphocytes capables de détruire les cellules tumorales) et humorales (anticorps), afin d’obtenir une action complète et efficace. Les grandes étapes du projet sont : - Vérifier que cette stratégie déclenche bien une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre les cellules souches cancéreuses. - Tester son efficacité en prévention (empêcher l’installation de la tumeur) et en traitement (réduire une tumeur déjà installée). - Évaluer son impact sur la survie, la propagation des métastases et la tolérance générale. - Étudier l’effet de la combinaison de ce vaccin avec d’autres immunothérapies déjà disponibles. En résumé, ce projet vise à ouvrir une nouvelle voie thérapeutique contre les cancers résistants et récidivants, en ciblant leur véritable « racine ».

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mettre au point de nouvelles solutions pour traiter des cancers particulièrement agressifs et qui se propagent dans l’organisme (métastatiques). Ces cancers sont souvent résistants aux traitements habituels comme la chimiothérapie, la radiothérapie ou certaines thérapies ciblées, ce qui laisse aujourd’hui très peu d’options aux patients. L’originalité de notre approche est de s’attaquer à un type de cellules appelé cellules souches cancéreuses. Ces cellules sont à l’origine de la progression des tumeurs, de leur résistance et des rechutes après traitement. En les ciblant spécifiquement, nous espérons obtenir pour la première fois une véritable réponse thérapeutique là où les méthodes classiques échouent. À court terme, ce projet permettra de tester une stratégie vaccinale innovante et de mieux comprendre comment ces cellules parviennent à échapper au système immunitaire. À moyen terme, il s’agira d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la réponse aux traitements et de définir les meilleures combinaisons thérapeutiques (par exemple, associer le vaccin à d’autres immunothérapies déjà utilisées en clinique). À plus long terme, l’objectif est de développer un vaccin anticancer capable de limiter les rechutes et la formation de métastases. Si les résultats obtenus sont confirmés, ils ouvriront la voie à un premier essai clinique chez l’être humain (phase I/IIb). Ce projet représente donc une étape clé pour proposer de nouvelles chances de traitement à des patients aujourd’hui sans alternative.

Procédures

Les gestes réalisés sur les souris comprennent : - Injections de cellules cancéreuses (cancer du sein, du poumon, du pancréas ou du cerveau) : Voie : sous-cutanée. Conditions : sous anesthésie légère (1 minute, sans douleur). - Injections des différents traitements (lysats, ICIs, PBS): Nombre d’interventions : 4 et 8 injections. Voie : sous-cutanée ou IP. Conditions : sous anesthésie légère (1-2 minute, sans douleur). - Mesures de la taille des tumeurs : Nombre d’inerventions : tous les trois jours pendant 20-40 jours. Conditions : vigile. - Imagerie (Bioluminescence par IVIS) : Nombre d’interventions : 1-2 fois par semaine pendant 20-40 jours. Conditions : sous anesthésie légère (20 à 30 minutes, sans douleur). - Ponction cardiaque : Nombre d’interventions : 1 fois en fin d’expérience. Conditions : sous anesthésie profonde (2-3 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets possibles liés aux procédures sont les suivants : • Apparition de petites tumeurs sous la peau, qui peuvent causer un inconfort modéré. • Injections répétées : elles peuvent causer une légère gêne locale (similaire à une piqûre). • Anesthésies courtes et surveillées lors des imageries : sans effet durable sur l’animal. • Propagation éventuelle du cancer : atteintes respiratoires de type essoufflement, et neurologiques de type tremblements.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures, soit pour effectuer les analyses scientifiques nécessaires, soit de manière anticipée si leur état de santé le justifie (par exemple, si une tumeur devient trop grosse ou douloureuse). Cela permet d’éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Notre projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire peut lutter contre des tumeurs très agressives qui se propagent facilement. Ces phénomènes sont extrêmement complexes car ils impliquent de nombreuses interactions entre les cellules cancéreuses, leur environnement et les défenses naturelles de l’organisme. Aujourd’hui, aucun modèle « en tube » ou sur cellules isolées ne permet de reproduire cette complexité de façon fiable. Toutefois, avant de passer aux expériences sur animaux, nous avons réalisé des tests préliminaires en laboratoire pour sélectionner uniquement les approches les plus prometteuses. Par ailleurs, pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous exploitons au maximum chaque prélèvement grâce à des analyses complémentaires sur les tissus et l’ARN conservés, ce qui évite de devoir recommencer les expériences.

Réduction

Tout est mis en œuvre pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en garantissant la fiabilité scientifique des résultats. Pour cela, les souris choisies sont homogènes (même âge, même sexe), ce qui réduit les différences individuelles et donc le nombre nécessaire d’animaux par groupe. Un calcul statistique a permis de déterminer précisément l’effectif requis : 7 souris par groupe suffisent pour obtenir des résultats fiables, sans recourir à un surnombre. De plus, toutes les données collectées (imagerie, analyses cellulaires, histologie, génétique) sont exploitées et les échantillons sont systématiquement conservés, ce qui permettra de répondre à de futures questions de recherche sans devoir utiliser de nouveaux animaux.

Raffinement

Des mesures spécifiques ont été prévues pour améliorer le bien-être des animaux et limiter leur inconfort. Le suivi des tumeurs se fera principalement par imagerie non invasive (bioluminescence), une technique sensible, indolore et nécessitant seulement une courte anesthésie par inhalation d’isoflurane, bien tolérée et de faible impact. Les animaux seront observés quotidiennement et des critères stricts permettront d’arrêter l’expérience en cas de souffrance ou de détresse. Enfin, si des interventions chirurgicales sont nécessaires, des soins adaptés seront apportés pour réduire la douleur et favoriser une bonne récupération. L’ensemble de ces mesures vise à minimiser les nuisances tout en assurant la validité scientifique des résultats.

Choix des espèces

Nous avons choisi des souris adultes car elles possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour évaluer correctement les effets du traitement. D’autres méthodes, comme les cultures cellulaires en laboratoire, ne permettent pas d’observer l’ensemble des interactions entre le cancer, le système immunitaire et les médicaments. Les souris constituent un modèle bien connu et largement utilisé en recherche, car de nombreux outils sont disponibles pour étudier leur système immunitaire et les pathologies associées. Cela permet de mieux comprendre comment le traitement agit dans un organisme vivant, dans des conditions proches de celles de l’être humain.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, trente d'entre elles nourries pendant trente-huit semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour les rendre obèses. Vingt subissent un jeûne nocturne allant jusqu'à quinze heures, puis une injection de glucose et six prélèvements sanguins à la queue en deux heures, sur animal conscient. Le porteur écrit que ces souris prendront du poids et deviendront moins actives à cause de l'obésité, et qu'elles pourront ressentir la faim pendant le jeûne. Le bénéfice annoncé, un traitement contre la fibrose du foie, reste au futur, tandis que les tissus prélevés après la mise à mort alimenteront aussi d'autres projets de l'équipe sur l'obésité, le prédiabète et les atteintes cardiaques et rénales.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent un enjeu majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Parmi ces maladies, la stéatose hépatique non alcoolique, qui correspond à une cirrhose du foie sans consommation d’alcool, est en forte progression à cause de l’augmentation de l’obésité ou encore du diabète de type 2. Dans cette maladie, il y a une accumulation importante de graisses dans les cellules du foie ,ce qui entraine une cicatrisation du foie appelée fibrose hépatique. Cette fibrose va rigidifier des parties du foie conduisant progressivement à une perte de fonction du foie et pouvant évoluer vers une insuffisance hépatique terminale. De plus, la fibrose hépatique chronique peut être responsable du développement de cancer du foie, ce qui accentue la gravité de cette pathologie. La stéatose hépatique non alcoolique est souvent diagnostiquée à un stade avancé, lorsque les lésions dans le foie sont déjà présentes. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace pour inverser ou ralentir cette fibrose. Le développement de traitements efficaces contre la fibrose étant un enjeu majeur en santé, l’objectif principal de ce projet est de tester chez la souris un nouveau composé pour traiter la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement d’un traitement efficace pour lutter contre la progression de la fibrose hépatique. De plus ce projet permettra de mieux connaitre les mécanismes biologiques encore mal connus responsables du développement de la maladie.

Procédures

Pendant 38 semaines, 30 souris seront nourries avec un régime riche en graisses et cholestérol pour les rendre obèses et 10 souris recevront un régime standard. Pour tester la glycémie au cours du régime, 20 souris parmi les 40 souris du projet seront mis à jeun sur la nuit (maximum 15h). Le lendemain, une injection de glucose (moins de 20 secondes) sera réalisée sur l'animal conscient et des prélèvements de sang se feront au niveau de la queue. Les prélèvements seront réalisés sur un temps court (durée inférieure à 2 minute) et de façon répétée en 6 fois sur une période de 2h dans la même journée. Un autre prélèvement sanguin au niveau de la queue (une seule prise) sur la totalité des 40 souris sera réalisé 11 semaines plus tard.

Impact sur les animaux

Les souris qui recevront sur 38 semaines le régime riche en graisses et cholestérol vont prendre du poids et devenir un peu moins actives à cause de l'obésité. Durant la période de jeûne de 14-15h sur la nuit, les souris privées de nourriture pourront ressentir une sensation de faim. Lors de l’injection de glucose, le passage de l’aiguille de petite taille au travers de la peau sera de très courte durée (moins de 20 secondes) et entrainera un inconfort chez les souris. Des prélèvements sanguins à la queue seront pratiqués sur animaux conscients après 16 et 27 semaines de régime. Ces prélèvements bien que rapides (durée < 2 minutes) sont susceptibles d’induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Après les 38 semaines de régime, tous les animaux seront mis à mort par une méthode d'euthanasie réglementaire pour prélever les tissus et le sang. L'analyse de ces prélèvements nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement dans le foie de la fibrose et d'identifier les cibles thérapeutiques de notre composé.

Remplacement

ll n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire de manière fiable l’environnement in vivo que l'on retrouve dans un organisme vivant et dans lequel plusieurs types de cellules interagissent entre elles et participent au développement de la fibrose . De plus, cette maladie se développe lorsqu’il y a des problèmes métaboliques (ex hausse de la glycémie) dans l’organisme entier suralimenté, ce qui justifie l’utilisation d’animaux. Enfin il n’existe pas de méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire pour tester l’efficacité d’un composé sur la fibrose hépatique.

Réduction

Le nombre total de souris a été calculé pour avoir un effet statistique significatif sur les paramètres étudiés. A la fin de l’étude, des tissus autres que le foie pourront être prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe en lien avec d’autres maladies étudiées dans notre laboratoire (obésité, pré-diabète, atteintes cardiaques, rénales). Pour l’analyse des données recueillies lors des différentes expériences nous appliquerons les tests statistiques appropriés en utilisant un logiciel d'analyse.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement et la litière des cages sera plus fréquemment changée. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel expérimenté. Pour diminuer le stress lors des prélèvements de sang, les animaux seront habitués au mesure de contention quelques semaines avant la prise de sang. Pour éviter d’avoir recours au gavage source de stress, le traitement sera administré quotidiennement (5 jours sur 7) dans de la nourriture constituée de beurre de cacahuète pour l’appétence. Le traitement avec le composé a déjà été administré chez le rongeur (rat et souris) dans de précédents travaux sans entrainer d’effets indésirables

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont très sensibles au régime riche en graisses et développe une obésité et une stéatose hépatique non alcoolique similaire à la maladie humaine. Les souris utilisées seront de jeunes mâles âgés de 5 à 6 semaines car la plupart des études sur le modèle murin pour étudier cette maladie sur une longue période utilisent de jeunes souris adultes. Ainsi, grâce aux nombreuses études scientifiques publiées, de nombreuses informations sur la souris sont disponibles et permettront de mieux comparer les résultats obtenus dans ce projet.