Recherche fondamentale

Irradiées en une dose unique, injectées jusqu'à quatre fois dans l'abdomen, piquées à la veine faciale jusqu'à dix fois au cours de leur vie, 2 838 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart. Une partie, dépourvue de système immunitaire fonctionnel, reçoit des cellules prélevées sur des patients atteints de leucémie, ce qui suppose une préparation entraînant jusqu'à 8 % de perte de poids. Le porteur décrit une anémie provoquée par les procédures, qu'il présente comme transitoire et réversible, et écrit dans la même rubrique qu'aucun signe de souffrance n'est attendu. Toutes sont tuées, la grande majorité pour prélever leurs organes.

Objectifs

Ce projet s'intéresse à l’érythropoïèse, processus essentiel conduisant à la production des globules rouges. Au cours des dernières années, notre compréhension de l’érythropoïèse ainsi que des processus par lesquels des cellules normales du sang deviennent cancéreuses (transformation leucémique) a beaucoup progressé. Cependant, de nombreux facteurs régulateurs et gènes, impliqués ou non dans l’apparition des cancers, restent à identifier et à caractériser fonctionnellement. Nous savons désormais que certaines maladies ne sont pas seulement liées à des anomalies dans les gènes eux-mêmes, mais aussi dans les petites séquences d’ADN qui contrôlent leur activité. Cela montre à quel point ces éléments régulateurs sont importants pour un fonctionnement physiologique normal. En étudiant le mécanisme de formation des globules rouges, nous cherchons à mieux comprendre comment certains éléments du génome influencent l’activation ou l’inactivation des gènes chez les mammifères. Nous voulons aussi identifier les perturbations qui peuvent conduire à des pathologies graves, comme certaines formes rares et agressives de leucémie (cancer du sang). L’anémie, qui se caractérise par un manque de globules rouges fonctionnels, est un problème de santé majeur à l’échelle du globe. Pourtant, malgré les avancées scientifiques, de nombreux aspects liés aux gènes (et à leur fonctionnement) du contrôle de la production des globules rouges restent encore mal connus. Avec des technologies de pointe, ce projet vise à : • Découvrir comment les gènes sont régulés dans les cellules du sang, • Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans ce contrôle, • Comprendre comment ces mécanismes fonctionnent normalement et ce qui se passe lorsqu’ils sont altérés dans certaines maladies. En explorant ces aspects, nous espérons mieux comprendre les causes génétiques des leucémies érythroïdes (un type particulier, rare et agressif de cancer touchant les globules rouges), et ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent la production des globules rouges, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Il comprend également l’étude de certaines mutations génétiques pouvant entraîner un cancer rare du sang, appelé leucémie érythroïde, afin de mieux comprendre comment ce type de maladie se développe. À long terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles pistes de traitement pour traiter ces leucémies en ciblant plus précisément les anomalies génétiques responsables de la maladie

Procédures

Les interventions sur animal vigile prévues dans cette étude sont des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins et une irradiation. Les injections intrapéritonéales seront limitées à un maximum de 4 par animal, soit 2 injections sur 2 jours consécutifs, soit 4 injections espacées de 48 heures chacune. Sur la base de notre expérience, ce geste est rapide et maîtrisé et ne dure pas plus de 20 secondes, après quoi l’animal est immédiatement replacé dans sa cage. Pour les prélèvements sanguins, ils sont effectués au maximum 10 fois au cours de la vie de l’animal. Notre pratique régulière de ce geste nous montre que la piqûre à la veine faciale est unique et rapide, et la collecte du sang ne nécessite que 20 secondes. Concernant l’irradiation, les animaux seront exposés à une dose unique. Tous les prélèvements d’organes seront réalisés après anesthésie et euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales peuvent provoquer un stress et une gêne temporaire chez les animaux. Notre pratique régulière de ces injections nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Les cages restent sous surveillance rapprochée au moins 20 minutes après toute injection pour détecter le plus rapidement possible les signes de souffrance éventuelle chez les animaux (prostration). L’anémie induite par les procédures constitue un autre effet indésirable. Toutefois, elle est transitoire et réversible : en moins d’une semaine, le taux de globules rouges revient à environ 80 % du niveau normal. Un suivi hebdomadaire des paramètres sanguins permet de s’assurer du caractère temporaire de cette anémie. Enfin, la préparation des animaux en vue de la greffe de cellules issues de patients peut entraîner une perte de poids transitoire, limitée à un maximum de 8 % du poids initial.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés, la grande majorité en vue de prélèvement d'organes.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps effectué des expériences in vitro sur des lignées cellulaires de souris et humaines. Cependant, comme ces cellules ont été modifiées pour se multiplier indéfiniment en laboratoire, il est difficile de savoir si elles se comportent comme des cellules normales dans le corps, et surtout ces modèles ne permettent pas de prendre en compte le contexte tissulaire. Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour évaluer avec précision et pertinence physiologique le rôle des nouveaux gènes de notre étude. Nous utiliserons le modèle souris, permettant l’inactivation des gènes d’intérêt. Concernant l’étude de certaines formes de cancers du sang (leucémies aigües érythroïdes), compte tenu du nombre restreint de cellules d’intérêt, une amplification des cellules tumorales via une greffe chez la souris est nécessaire pour pouvoir effectuer les analyses détaillées des mécanismes de la maladie au niveau des gènes et des molécules.

Réduction

Nous avons réalisé une étude préalable pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires dans chaque groupe, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux tout en obtenant des résultats fiables. Cette estimation repose sur des outils statistiques et sur nos expériences précédentes. Ainsi, nous avons montré qu’un nombre de 10 souris par groupe suffisent pour détecter des différences significatives entre les groupes, tout en tenant compte des variations possibles d’un animal ou d’une expérience à l’autre.

Raffinement

Les procédures expérimentales sont clairement définies et publiées. Toutes les manipulations susceptibles d’induire une gêne sont réalisées sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques appropriés, afin de prévenir toute douleur ou inconfort. Des critères stricts de surveillance sont mis en place pour garantir le bien-être des animaux. Aucun signe de souffrance n’est attendu. En cas d’anémie, bien que non douloureuse, un point limite est fixé : si le taux de globules rouges ne remonte pas à au moins 80 % de la valeur normale après une semaine, l’animal sera euthanasié à titre préventif pour éviter toute souffrance prolongée. Un suivi individuel est assuré tout au long de l’expérimentation. Les animaux immunodéprimés sont hébergés dans des conditions très strictes d’hygiène et de sécurité : matériel et eau stériles, manipulations en environnement protégé, afin de limiter les risques infectieux liés à leur fragilité.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris pour lesquelles le système de production de toutes les cellules du sang est très proche de celui de l’homme, et extrêmement bien connu. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire fonctionnel et complet ainsi que de plusieurs souches dérivées dont les animaux ont été génétiquement modifiés. Une souche dont le système immunitaire est non fonctionnel sera également utilisée pour permettre les greffes de cellules primaires humaines issues de patients chez la souris. A noter que cette dernière souche nécessite un hébergement confiné afin d’éviter tout risque d’infection ou de contamination. Nous utiliserons à la fois : - des animaux en cours de développement (avant la naissance) afin de comprendre le rôle des gènes étudiés pendant une étape clé de la fabrication des globules rouges, qui se déroule dans le foie du fœtus. - des animaux âgés de 2 ou 3 mois. Nous analyserons le tissu responsable de la formation de toutes les cellules du sang afin de comprendre comment certaines modifications génétiques influencent son bon fonctionnement.

Pour mesurer si les hormones sexuelles femelles accélèrent la réparation du muscle après une lésion provoquée par l'exercice, 2 877 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur tissu musculaire. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré pour 2 817 d'entre elles et léger pour 60. Chaque animal subit un changement de régime alimentaire, jusqu'à trois lavages vaginaux, une séance d'électrostimulation de quinze minutes sous anesthésie générale et jusqu'à quatre mesures de force musculaire, le porteur rattachant les nuisances attendues au "cumul d'actes" plutôt qu'à un geste en particulier. Les points limites qui déclenchent la mise à mort listent l'infection vaginale, le gonflement anormal de la patte, une perte de poids supérieure à 10 %, la prostration et la mobilité réduite.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Il a été montré que ce processus est plus efficace chez les souris femelles par rapport aux souris mâles. Cette différence pourrait être liée, au moins en partie, aux variations des hormones sexuelles femelles au cours du cycle ovarien. Le projet vise à i) mettre en évidence l’influence du sexe sur la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par l’exercice ; ii) identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’identifier i) l’influence du sexe sur la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par l’exercice ; ii) les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques affectant la production/disponibilité des hormones sexuelles femelles (ménopause, cancer…).

Procédures

Les souris sont soumises à un changement de régime alimentaire, à des lavages vaginaux (3 au maximum, durée 1 minute maximum), un protocole d’exercice (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum), une mesure de force musculaire sous anesthésie (4 maximum).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (contention, lavages vaginaux, électrostimulation, anesthésies) qui peut engendrer un stress pour les animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Le laboratoire a déjà démontré in vitro par la culture cellulaire le rôle des hormones sexuelles femelles sur la prolifération des cellules musculaires. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectuées précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser un dommage musculaire induit par l’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. L’enchaînement des procédures est construit sur une stratégie de type GO/NO GO qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis). Le raffinement inclut également l’administration de tamoxifène dans la nourriture plutôt que par injections. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués (infection vaginale, gonflement anormal de la patte, perte de poids > 10%, non utilisation persistante de la patte, prostration de l'animal, démangeaison, mobilité réduite)

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont âgés de 10-14 semaines.

Les souris de ce projet sont privées d'un récepteur aux lipoprotéines par cinq injections dans l'abdomen, puis nourries vingt semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour développer des plaques d'athérome. 112 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, l'autre d'un niveau modéré. Elles subissent onze prises de sang à la queue, un jeûne de seize heures, un gavage à l'huile d'olive dont le porteur reconnaît le risque de fausse route, cinq prises de sang supplémentaires et deux échographies cardiaques sous anesthésie. Toutes sont tuées à la fin, pour le prélèvement des artères et du sang.

Objectifs

L’accumulation de plaques riches en gras au niveau des artères (plaques d’athérome) et l’inflammation chronique accélèrent le vieillissement cardiovasculaire et contribuent à la mortalité et à la morbidité en France. Nous avons récemment observé que l’inflammation modifie la quantité d'un récepteur au gras dans les cellules immunitaires des vaisseaux. Notre objectif est d’induire la formation des plaques d’athérome chez la souris dépourvue de ce récepteur afin de mieux comprendre le rôle de ce dernier dans les mécanismes de la maladie qui sera induite par un régime riche en graisse de 20 semaines.

Bénéfices attendus

La réussite de cette étude permettra de déterminer l’implication du récepteur des lipides dans le processus d'inflammation et le développement de maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les 5 injections au niveau ventral de 5 secondes de la molécule permettant de supprimer le récepteur ou du contrôle. Les 11 prises de sang à la veine de la queue de 10 secondes pour le contrôle de l’évolution de la santé de l’animal (1 toutes les 2 semaines). Le gavage (avec de l'huile d'olive) de 15 secondes, suivi de 5 prises de sang au niveau de la veine de la queue de 10 secondes. Les 2 imageries cardiaques (imagerie non invasive) sous anesthésie en début et en fin de régime d’environ 30 minutes.

Impact sur les animaux

Douleur comme une piqure d’aiguille, répétées lors des administrations intrapéritonéales sur l'animal vigile, qui peuvent induire une petite inflammation sur le site d'injection. Stress liés aux prises de sang à la veine caudale. Faim liée à la mise à jeun pendant 16h. Gavage à l’huile d’olive peut provoquer une gêne et un stress, malgré l’expérience des utilisateurs il existe toujours un risque de fausse route sur le geste qui sera réalisé avec précaution sur chaque animal. Diminution de la fréquence cardiaque lors des échographies sous anesthésie. MODIFICATION – Stress liés à la mise en contention.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude puisque différents organes seront récupérés, notamment les artères afin d'étudier le développement de plaques d'athérome et le sang pour des études de la santé de l’animal. L'animal est inconscient lors de sa mise à mort.

Remplacement

De précédentes études sur le rôle du récepteur ont déjà été réalisées in vitro au laboratoire sur des modèles cellulaires de cellules immunitaires notamment une observation des caractéristiques et du fonctionnement des cellules de ces derniers. Cependant, pour étudier l'effet de la formation de dépôts lipidiques, de plaques d’athérome au niveau de l’aorte et l’inflammation associée sur le système cardiovasculaire lorsque le récepteur des lipides est diminué, nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.

Réduction

Toutes les mesures seront réalisées sur chaque animal, ce qui en réduit le nombre. De plus le nombre de souris nécessaires a été calculé pour permettre les analyses statistiques à postériori. Par expérience, le développement des plaques d'athérome dépend du type animalerie et du sexe (plus rapide chez les femelles). Ces analyses statistiques seront donc faites sur les groupes mâles et sur les groupes femelles séparément. Au total 112 animaux seront utilisés sur ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe avec de l’enrichissement. Les souris sont surveillées très régulièrement (prise de poids, zone d'injection). Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pendant l’échographie des vaisseaux et du cœur et du gel ophtalmique est déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement. Un anesthésique local est appliqué avant chaque prise de sang à la queue. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étape de la procédure.

Choix des espèces

Les souris qui seront utilisées et mises sur régime riche en graisse développeront une obésité proche de celle de l’homme. Des souris adultes mâles et femelles de 8 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet, âge où elles seront injectées avec une molécule permettant la suppression du récepteur solubilisée dans de l’huile ou d’huile seule (contrôle), puis ces mêmes souris seront soumises à l'âge de 12 semaines, âge où l'appareil vasculaire à atteint sa pleine maturité, à un régime riche en lipides et en cholestérol pendant 20 semaines.

Des sons à 110 décibels et des chocs électriques sur les pattes, des souriceaux isolés deux fois cinq minutes pour enregistrer leurs cris, des femelles gestantes soumises à un stress par contention trois fois 45 minutes pendant six jours : 3872 souris vont être utilisées, 2064 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1808 d'un niveau modéré. D'autres gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie profonde de 45 minutes pour une électroporation in utero, suivie de trois jours d'injections analgésiques. Le porteur écrit qu'aucun phénotype dommageable n'a été observé ni décrit pour les génotypes concernés, et qualifie de modérées les réactions de freezing que ces tests provoquent. Sur les 3872 souris, 1680 sont tuées après avoir achevé leur "rôle de reproduction", les autres pour des analyses histologiques, épigénétiques, électrophysiologiques ou comportementales.

Objectifs

Notre étudions une molécule sécrétée dans le milieu extracellulaire qui contrôle des étapes cruciales du développement du cerveau. En effet, des altérations de niveaux de cette protéine d’intérêt sont observés dans de nombreuses pathologies psychiatriques dont l’autisme, la schizophrénie et la dépression mais aussi la lissencéphalie et l'épilepsie. Or plusieurs populations cellulaires sécrètent cette protéine lors d'étapes successives du développement du cerveau. L'objectif du projet est d’identifier les rôles respectifs de ces populations sources de notre potéine d'intérêt dans le développement du cerveau et l’étiologie des troubles du neuro-développement en combinant des approches moléculaires, histologiques, électrophysiologiques et comportementales.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’étiologie des troubles du neurodéveloppement, pour envisager de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.

Procédures

Tous les souriceaux de plus de 7 jours subiront un stress léger lié à la contention et au tatouage (1 min) ainsi qu’une douleur légère liée au prélèvement à la queue (10 sec) entre P7 et P10. Cette intervention n’aura lieu qu’une fois, sauf cas exceptionnel de prélèvement dégradé. Lot1: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec); Lot 2: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) en juvénile puis perfusion intracardiaque à P25 (2 injections de 10 sec); Lot 3 : Tatouage (1min), isolation pour vocalisations (2x5min) et prélèvement (10sec) en juvénile, puis OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d'inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour x 4 jours). Lot 4a: perfusion intracardiaque à P4 ou P7 (2injX10 sec); Lot 4b: Eléctroporation in utero (1injX10sec, chirurgie sous anesthésie générale profonde 35min, suture 10min, 2 injX10secX3 jours), tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) puis perfusion intracardiaque (2injX10sec); Lot 5: stress prénatal (3X45minX6jrs). Modification : Les animaux du lot 3 subiront en plus un test d’hyperlocomotion induite par la d-amphétamine (1h30 dont 2 inj x 10 sec). Les animaux du lot Lot 5 subiront soit un stress prénatal par inflammation maternelle (1 x 10sec, ip), soit un stress prénatal dû aux injections d’antidépresseur fluoxetine ou de saline de la mère (1x 10 sec injection ip x 6jrs) soit un stress postnatal dû aux injections d’antidépresseur des nouveaux nés ( 1X 10 sec d’injection sous cutanéex 3jrs puis 1x 10sec d’injection ip x 3jrs) .

Impact sur les animaux

Les souriceaux subiront après la naissance une contention pour permettre un tatouage des coussinets des phalanges et un prélèvement à la queue qui peuvent entrainer un stress et une douleur légers. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. A noter que l'étape d’anesthésie en elle-même peut également provoquer un stress chez l’animal. Pour réaliser l’enregistrement des vocalisations, certains souriceaux devront être isolés pendant 2 fois 5min , ce qui est une source de stress. De même, les tests comportementaux successifs adultes sont une source de stress, notemment les tests d’inhibition du réflexe de sursaut ou de conditionnement par la peurqui imposent aux animaux de subir des sons à très hauts décibels (110db) et des chocs électriques sur les pattes, qui même si modérés, induisent une réaction de stress notable (posture de freezing). Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique, certaines femelles gestantes subiront un stress répété par contention. Afin de marquer les astrocytes, certaines autres gestantes subiront une analgésie (voie sous-cutanée) et une anesthésie générale profonde (par voie respiratoire) de 45 minutes, suivies d’un acte chirurgical comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Aucun phénotype dommageable n’a été observé ou décrit dans la littérature pour les génotypes décrits.Modification : Les animaux réalisant les tests comportementaux subiront un stress additionnel à la fin pour étudier leur hyperlocomotion induite par l’exposition à la d-amphétamine. Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique certaines femelles subiront soit un stress prénatal de contention maternelle (3x45min x6jrs) ou un stress dû aux injections répétées d’antidépresseurs. De même, pour l’étude des conséquences du stress postnatal, les souriceaux subiront un stress lié aux injections répétées d’antidépresseurs.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le cadre de l'étude seront mis à mort, soit à des fins d'études histologiques (lot 2, 384 animaux; lot 4, 368 animaux), épigénétiques (lot 5, 224 animaux), électrophysiologiques (Lot 1b, 384 animaux) ou comportementales (lot 3, 384 animaux), soit après avoir achevé leur rôle de reproduction (lot 1a, 1680 animaux). Modification : le lot 5 comprend maintenant 675 animaux qui seront mis à mort à des fins d'études épigénétiques.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité du cortex en développement et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part, ce qui rend l’utilisation d’un modèle murin indispensable à la réalisation de ce projet. Notamment, les effets du stress périnatal impliquent des interactions précises, transitoires et adaptatives entre les hormones, les neurotransmetteurs et les neuro-modulateurs, mais aussi avec les systèmes inflammatoires, digestifs et sanguins qui sont encore mal connues et ne peuvent être reproduites in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniquespour obtenir un pourcentage maximal d’animaux d’intérêt et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, un test de puissance G réalisé à partir de résultats antérieurs sur un autre modèle de souris nous préconise une taille de groupe de 6 individus par genre. Pour les études comportementales, nos résultats antérieurs préconisent une taille de groupe de 12 individus. Les analyses statistiques seront réalisés par un test adapté.

Raffinement

Des points limites strictes et spécifiques à chaque procédure sont appliqués. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton de nidification et bâtonnet de bois) et sont regroupés en groupes sociaux de 2 à 6 individus par cage. La mise à mort par perfusion de paraformaldéhyde est réalisée sous anesthésie générale profonde et après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine. La chirurgie d’électroporation in utero est réalisée sous anesthésie profonde préalable par l’isoflurane (4% pour l’induction et 2% pour le maintien de l’anesthésie) et sur une plaque chauffante (37°C), et ce après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine, la désinfection du site d’incision et l’ajout d’une gel ophtalmique pour la protection des yeux. Après l’opération, l’animal reçoit à 24 et 48h l’analgésique Meloxicame en sous-cutané.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence précoce des cellules sécrétant notre protéine d’intérêt à la surface du cortex. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés sont disponibles chez la souris. Le génotypage et les prélèvements seront réalisés sur les souriceaux entre 4 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges sans douleur. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Pour étudier les rôles des sous-populations cellulaires sources de Reln dans la formation des couches corticales nous allons étudier les stades embryonnaires E12.5, E14.5 et E16.5, puis les stades postnataux P0 et P25. En effet, les neurones corticaux sont générés entre E12.5 et E16.5, atteignent majoritairement leur position à P0 mais continuent à migrer et à se différencier dans les couches corticales jusqu’à P25. Les effets des quantités de Reln sur la prolifération et la maturation des astrocytes seront analysés aux stades post-nataux P4 et P7 (avant et après la phase de prolifération) et P25 (pour pouvoir visualiser une arborescence mature). Les effets du stress prénatal sur l’expression de Reln seront évalués à P0, quand les deux sources principales de Reln corticale sont simultanément présentes. Enfin les rôles spécifiques des sous-populations sur le comportement seront analysés à P6 pour les vocalisations néonatales (âge du pic de vocalisation induite par l’isolation) et à l’âge adulte (P60-P120) pour les autres tests comportementaux qui nécessitent une maturation achevée des circuits. Modification : Afin de différencier les effets du stress postnatal de ceux du stress prénatal, nous analyserons aussi des animaux à P8, quand les deux sources sont encore simultanément présentes.

Six sessions de deux heures, une prise de sang à l'extrémité de la queue toutes les quinze minutes, précédées d'un jeûne de 6 à 16 heures : 733 souris rendues obèses et diabétiques par leur alimentation vont être utilisées, 66 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 667 d'un niveau modéré. L'objectif déclaré est de savoir si un réseau de neurones hypothalamiques peut devenir une cible thérapeutique contre ce que le porteur nomme la "diabésité". Les souris passent aussi par un gavage et par un hébergement individuel en cage d'enregistrement métabolique, avant d'être tuées pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur admet que cet isolement constitue une nuisance, qu'il dit minorer en raccourcissant le test et en tuant l'animal immédiatement après.

Objectifs

Depuis plus de vingt ans, il est clairement établi que des systèmes de régulation situés dans l’hypothalamus jouent un rôle central dans le contrôle de l’équilibre énergétique et glycémique de l’organisme. Un dysfonctionnement de l’un de ces systèmes pourrait ainsi contribuer au développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Ces pathologies sont étroitement liées, donnant naissance au terme « diabésité ». Aujourd’hui elles touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et constituent un enjeu majeur de santé publique. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces maladies permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux traitements pour leur prévention et leur prise en charge. Néanmoins, notre connaissance des réseaux de neurones et systèmes moléculaires impliqués dans ces processus de régulation reste encore très limitée. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à une population de neurones hypothalamiques impliqués dans la régulation de la balance énergétique et glucidique. Ces observations nous ont conduits à proposer le présent projet. Celui-ci vise à étudier chez des souris rendues obèses et diabétiques les altérations de ce réseau de neurones, ainsi que son fonctionnement. L’objectif est donc de déterminer si ce circuit neuronal peut représenter une cible thérapeutique pertinente pour améliorer le contrôle de la balance énergétique et glycémique dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2.

Bénéfices attendus

De récentes études ont permis d’élucider le rôle et le fonctionnement d’une population neuronale dans la régulation de la balance énergétique et glucidique en condition physiologique. L’objectif de cette présente étude est donc d’étudier les potentielles altérations fonctionnelles et anatomiques de cette population de neurones en condition pathologique d’obésité/diabète. Ces recherches apparaissent cruciales non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi dans la lutte contre la pandémie de « diabésité », afin de proposer des solutions innovantes dans la prévention, la prise en charge et le traitement de ces maladies.

Procédures

- Pour établir le profil glycémique des souris, leur glycémie sera suivie par un prélèvement sanguin à l’extrémité de la queue, pendant moins de 10 secondes toutes les 15 minutes, au cours de sessions expérimentales de deux heures. Chaque animal sera soumis à 6 expérimentations au maximum, chacune espacée d’une semaine de repos. Durant l'un de ces tests, les souris recevront une administration orale d'un composé avec l'aide d'une sonde de gavage : ce test s'ajoute aux autres tests de suivi de glycémie que les souris subiront. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages d’enregistrement, permettant d'évaluer les paramètres métaboliques, avant d’être réunis avec leurs congénères préalablement connus.

Impact sur les animaux

Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun de 6 à 16 heures avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test. Une semaine de repos minimum leur sera donnée entre chaque expérimentation. - Toujours pour suivre la glycémie, les animaux subiront une incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. Un test de suivi de glycémie supplémentaire sera ajouté, les nuisances prévues sont similaires aux autres tests. De plus, durant ce test, les souris recevront une administration orale d'un composé avec l'aide d'une sonde de gavage. Nuisance prévue : potentiel stress, diminué par habituation - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés dans des cages d’enregistrement permettant d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : hébergement individuel inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.

Remplacement

Afin de mieux comprendre la physiopathologie de l’obésité/diabète, de caractériser les altérations neuroanatomiques ainsi que du fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme, l’utilisation d’un modèle in vivo intégré est obligatoire. Il est nécessaire de pouvoir étudier la communication qu’il existe entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second ; dans notre cas l’influence du réseau de neurones à 26RFa/orexines sur la régulation de la glycémie et du métabolisme énergétique (tel le comportement alimentaire ou l’activité physique). La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. Il n’existe alors à ce jour pas d’alternative non-animale.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, une planification expérimentale a été réalisée en amont. De plus, pour chaque expérience, le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé afin d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés. Anticiper ainsi les effectifs adaptés permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, de diminuer le risque de devoir répliquer une expérience avec de plus gros effectifs ainsi que le double emploi. Ces estimations ont été réalisées avec un site en ligne qui calcule le nombre d’animaux requis en fonctions de plusieurs paramètres : la force de l’effet attendu, la variabilité entre individus, et les paramètres statistiques souhaités.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Ils seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter l’isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. La taille des cages est réglementaire. L’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement. L’établissement de points limites nous permettra de veiller au bon suivi des animaux et de leur apporter au besoin les soins adéquats. Si les points limites sont dépassés, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et l’animal sera en fonction des cas, écarté des expérimentations ou mis à mort.

Choix des espèces

Seul un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre d’étudier la physiopathologie de l’obésité/diabète. Nous pourrons ainsi explorer dans un contexte d’obésité/diabète, les altérations des réseaux de neurones hypothalamiques, des systèmes moléculaires d’intérêts, et de leurs répercussions sur leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.

Toutes tuées à l'issue, soit au terme d'une procédure terminale soit pour le prélèvement de leur cerveau, 4026 souris vont être utilisées dans l'étude des effets de la nicotine et de l'alcool sur le circuit de la récompense. 420 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 3606 d'un niveau modéré. Une partie subit deux chirurgies sans réveil, dont une de cinq heures, d'autres une opération avec réveil, avant des tests comportementaux de dix minutes à deux heures, jusqu'à vingt sessions par animal. Nicotine ou éthanol arrivent dans l'eau de boisson pendant trois semaines, sucrée pour masquer l'amertume, ou par injections, le porteur signalant une anxiété au sevrage et écrivant que les mises à mort garantiront "une fin de vie sans douleur ni stress".

Objectifs

L’addiction au tabac et à l’alcool constitue un problème majeur de santé publique. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la consommation excessive de ces substances, malgré leurs conséquences négatives, restent encore mal compris. De même, nous ne sommes pas tous égaux face à l’addiction, et les raisons pour lesquelles un individu progresse vers une consommation excessive d’alcool ou de tabac demeurent peu étudiées d’un point de vue neurobiologique.Dans ce projet, nous étudierons comment les interconnexions réciproques entre les différents éléments du circuit de la récompense du cerveau sont à l’origine des effets à la fois gratifiants et aversifs induits par les drogues d’abus les plus communément consommées : la nicotine et l’alcool. Nous analyserons comment l’action de ces drogues modifie l’activité des circuits dopaminergiques pour produire des effets de récompense à l’origine de la consommation, et comment, en retour, la libération de dopamine dans le nucleus accumbens et l’amygdale modifie l’activité des neurones dopaminergiques eux-mêmes pour induire des effets anxiogènes et aversifs. Ce projet aborde donc le problème de comprendre comment notre cerveau réagit et s’adapte lorsqu’il est soumis à un stimulus engendrant à la fois des effets gratifiants mais également anxiogènes et aversifs. Les effets positifs et négatifs des drogues étant intimement liés l'un a l'autre, ce projet représente un effort unique pour comprendre leurs rôles réciproques dans l'addiction.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les drogues détournent les mécanismes d'apprentissage par renforcement naturel de notre cerveau en altérant les circuits neuronaux activés par les récompenses naturelles. Il permettra notamment de clarifier le rôle des effets négatifs des drogues dans l’établissement de l’addiction ou la résistance à celle-ci.

Procédures

Certains animaux subiront deux interventions chirurgicales sans réveil : l’une d’une durée de 5 heures, l’autre de moins de 5 minutes. D'autres animaux subiront une seule intervention chirurgicale avec réveil, dont la durée n’excédera pas une heure. Les animaux seront répartis en quatre groupes, chacun associé à un seul type de test comportemental. Chaque animal ne participera qu’à un seul type de test. Selon le protocole, les tests auront une durée variable allant de 10 minutes à 2 heures et comporteront entre 1 et 20 sessions, à raison d’une session par jour. Pour certains protocoles ne comportant qu’une seule session, celle-ci sera répétée une seconde fois à une semaine d’intervalle sur le même animal. (nb de test par animal: 1 à 2, fréquence des test: 1 semaine, nombre de session 1 à 20, durée des sessions: 10 min à 2 h, fréquence des sessions: 1 par jour). Par ailleurs, certains animaux seront exposés à de la nicotine ou à de l’éthanol via leur eau de boisson pendant une période de trois semaines. D'autres seront exposés de manière aiguë, en recevant des injections instantanées de nicotine ou d’alcool. Des prélevements de tissus seront réalisés chez certains animaux une fois par animal.

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales avec réveil entraînent des douleurs modérées. Les procédures comportementales ne provoquent pas de douleurs physiques, mais certaines peuvent induire une nuisance légère sur l’état émotionnel des souris (anxiété) durant la durée du test (10 min à 2 heures). Les traitements par voie orale (eau de boisson) ne causent pas d’effets indésirables pendant les trois semaines d’exposition. Toutefois, l’arrêt du traitement peut entraîner une nuisance émotionnelle légère (anxiété) dans les deux jours suivant le sevrage. Les injections de drogues peuvent occasionner une douleur légère au moment de la piqûre d'une courte durée (quelques minutes). Les prélevements de tissus peuvent entrainer une douleure légère de quelques heures.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de toutes les procédures, soit immédiatement après une procédure terminale, soit pour permettre le prélèvement des cerveaux à des fins d’études histologiques. Toutes les euthanasies seront réalisées dans le respect des normes éthiques et réglementaires les plus strictes, afin de garantir une fin de vie sans douleur ni stress pour les animaux.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l'impacte fonctionnel des drogues d'abbus sur un cicruit neuronale et le comportmentaux. La corrélation et le lien de causalité entre comportement et neurophysiologie est donc une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Les procédures ont été conçues pour qu'une même souris puisse participer à un maximum d'expériences, limitant ainsi le recours à de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Les effectifs sont déterminés de manière à fournir des résultats analysables par des méthodes statistiques scientifiquement adaptées.

Raffinement

Ces protocoles sont conçus pour minimiser l’inconfort et garantir le bien-être des animaux tout en assurant des conditions optimales pour l’étude scientifique. Les tests comportementaux sont d’une durée limitée, et les traitements par drogues sont administrés via l’eau de boisson, avec une augmentation progressive des doses. La solution est enrichie en sucre pour masquer l’amertume et encourager la consommation. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux et régulièrement manipulés pour réduire leur anxiété lors des tests de comportements. Enfin, afin de définir des points limites précoces permettant la mise en œuvre rapide de mesures adaptées en cas de douleur ou de mal-être, une grille de suivi graduée sera utilisée. Celle-ci prendra en compte plusieurs critères, tels que les signes de douleur, la perte de poids et l’altération de l’état général.

Choix des espèces

Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Les récepteurs nicotiniques et les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. Par ailleurs, les comportements d'addiction sont clairement établis chez les rongeurs. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Si les modèles d’invertébrés et poisson peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de renforcement aux drogues, l’organisation anatomique est trop différent pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation nicotinique du système dopaminergique. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte - adulte. En effet, les procédures qui nécessitent des injections virales se feront sur l'animal entre 4 et 6 semaines afin d'observer un temps d'infection nécessaire par le virus concerné (entre 3 et 6 semaines d'expression). Les souris qui se verront implanter des fibres optiques ou des électrodes d'enregistrement subiront une chirugie à partir de 8 semaines (âge adulte pour une souris). Les expériences comportementales se feront aussi à partir de 8 semaines d'âge.