Recherche fondamentale

La finalité est de constituer chaque année une bibliothèque d'anticorps monoclonaux dirigés contre une quarantaine de cibles, destinés à des tests de diagnostic déjà déployés à l'international. 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à sept injections d'immunogène sur animal vigile et des prélèvements sanguins sous anesthésie toutes les deux à trois semaines, quatre souris étant affectées à chaque cible. La rate est prélevée après la mise à mort, et le porteur reconnaît que des anticorps peuvent être produits sans animaux tout en jugeant ces méthodes moins performantes que l'immunisation in vivo.

Objectifs

Ce projet vise à produire des anticorps monoclonaux destinés à des applications diagnostiques et thérapeutiques ciblant des agents infectieux émergents ou multirésistants, ainsi que des biomarqueurs immunitaires clés, en réponse à des enjeux majeurs de santé publique. Les anticorps monoclonaux, par leur haute spécificité et affinité, sont des outils essentiels pour détecter précocement des pathologies sévères telles que le sepsis, ou pour neutraliser des pathogènes difficiles à contrôler par les traitements classiques. Notre laboratoire s’inscrit dans de nombreux programmes de développement d’outils immunologiques ou d’immunothérapie, avec plusieurs tests rapides de diagnostic déjà déployés internationalement, notamment pour la détection de résistances bactériennes. Ce projet se concentre sur un panel limité et prioritaire d’une quarantaine de cibles annuelles, choisies selon leur impact sanitaire avéré. Par ce projet, nous visons à renforcer la capacité nationale et internationale à détecter rapidement et précisément des agents infectieux critiques et à développer des thérapies ciblées innovantes. Si la quasi-totalité des étapes de production d’anticorps monoclonaux (de leur criblage à leur caractérisation fonctionnelle) peut aujourd’hui être réalisée sans recours aux animaux, la première étape cruciale de leur création reste, en l’état actuel des connaissances, largement dépendante d’un recours à l’animal. L’immunisation in vivo permet en effet une maturation naturelle indispensable à la génération de clones à haute affinité, que les banques synthétiques ou les méthodes alternatives ne parviennent pas encore à égaler en termes de qualité et diversité. Ainsi, le recours minimal à l’animal est strictement limité à cette phase initiale de génération des anticorps. Toutes les étapes suivantes s’appuient sur des systèmes in vitro robustes, avec production en bioréacteurs, assurant une production fiable, reproductible et de haute qualité, sans recourir aux méthodes anciennes par ascite désormais non autorisées.

Bénéfices attendus

À court terme, le projet permettra de générer une bibliothèque d’anticorps dirigés contre une quarantaine de cibles prioritaires sélectionnées en fonction de leur impact clinique et épidémiologique. Ces anticorps seront utilisés pour valider des tests de diagnostic actuellement en développement, notamment des tests de type « point-of-care » destinés à être utilisés directement auprès des patients pour une orientation thérapeutique rapide. Ils aideront aussi à mieux comprendre les interactions immunitaires dans des contextes critiques, comme la réponse inflammatoire liée au sepsis. À plus long terme, les anticorps développés pourront être intégrés dans des dispositifs diagnostics améliorés, combinant rapidité, sensibilité et spécificité, facilitant ainsi la détection précoce d’infections difficiles à contrôler ou de résistances bactériennes émergentes. Par ailleurs, certains anticorps candidats pourront servir en immunothérapie, par exemple pour neutraliser directement des agents pathogènes ou moduler la réponse immunitaire dans des syndromes inflammatoires sévères, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront immunisés en vigile par plusieurs injections brèves (30 à 60 secondes) d’une molécule appelée immunogène, qui correspond à la cible d’intérêt. Des prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, seront ensuite réalisés à intervalles réguliers (toutes les 2 à 3 semaines) afin de suivre la réponse immunitaire des animaux, c’est-à-dire la production d’anticorps en réaction à l’immunogène. Chaque animal recevra une injection initiale, suivie de trois rappels et de trois injections de boost soit un maximum de sept injections au total. Pour chaque prélèvement, la durée sera très brève (60 secondes par animal).

Impact sur les animaux

Une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injections sont susceptibles de survenir : la douleur sera très brève et l’infection peut survenir jusqu’à quelques heures après l’injection. Une douleur légère est possible lors des prélèvements sanguins. Les manipulations peuvent entrainer un stress de certains animaux pendant quelques minutes.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la fin du protocole. La production d’anticorps monoclonaux nécessite en effet de prélever la rate des animaux immunisés.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes de laboratoire pour produire des anticorps sans utiliser d’animaux. Ces techniques permettent de fabriquer des anticorps à partir de grandes banques artificielles, en sélectionnant ceux qui semblent capables de reconnaître une cible donnée. Cependant, ces méthodes ont encore des limites importantes : - D’abord, les anticorps produits en laboratoire de cette façon reconnaissent souvent moins bien leur cible que ceux générés naturellement par le système immunitaire d’un animal. En effet, le système immunitaire d’un animal est capable d’améliorer progressivement ses anticorps après contact avec la cible d’intérêt. Ce processus naturel, très complexe, n’est pas encore reproductible en laboratoire avec la même efficacité. Résultat : les anticorps produits par ces méthodes sont souvent moins bons. - Ensuite, ces anticorps sont souvent incomplets (il ne s’agit que d’un fragment), ce qui peut poser problème pour leur stabilité, leur fonctionnement, ou leur utilisation dans des tests standards. Ils sont aussi plus sensibles aux variations de température, de pH ou de conditions biologiques. Leur performance reste donc largement insuffisante dans des situations réelles, comme par exemple pour détecter un agent pathogène dans un échantillon biologique complexe. Dans ce projet, nous avons besoin d’anticorps très efficaces, capables de détecter précisément certaines cibles infectieuses, y compris à de très faibles concentrations. Pour cela, la méthode la plus fiable reste encore l’immunisation d’un animal. Il est important de souligner que l’utilisation d’animaux est strictement limitée à cette première étape de production. Toutes les étapes suivantes sont réalisées en laboratoire par des techniques entièrement in vitro, maîtrisées et reproductibles, sans recourir aux méthodes anciennes par ascite désormais non autorisées.

Réduction

Chaque production d’anticorps monoclonal sera réalisée avec un nombre restreint d’animaux : 4 souris seront utilisées par immunogène. Ce nombre a été défini à partir de notre expérience dans ce type de protocole et correspond au minimum nécessaire pour garantir un bon taux de réussite. En effet, une réponse immunitaire insuffisante chez un ou plusieurs animaux peut empêcher la production d’anticorps de qualité. Si trop peu d’animaux sont utilisés au départ, ce risque augmente, ce qui pourrait conduire à répéter toute la procédure, longue et contraignante, avec de nouveaux animaux. Cela irait à l’encontre de l’objectif de réduction. Par ailleurs, les étapes amont du projet (sélection des cibles antigéniques, mise au point des protocoles) ont été réalisées en laboratoire à l’aide de méthodes in vitro, ce qui a permis de limiter le recours aux animaux aux seules phases indispensables de production des anticorps. De plus, toutes les étapes après l’immunisation : criblage sélection, caractérisation fonctionnelle et production à grande échelle sont réalisées sans recours aux animaux, grâce à des techniques in vitro parfaitement maîtrisées et éprouvées. Cette stratégie globale garantit que le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire, tout en assurant la qualité et la fiabilité des anticorps produits.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des cages collectives, favorisant leurs interactions sociales. Leur environnement sera enrichi avec des abris, des tunnels en carton, du matériel pour construire un nid, et des bâtonnets à ronger. Les procédures susceptibles de causer de la douleur seront réalisées sous anesthésie. Le niveau d’inconfort après l’intervention sera similaire à celui d’une vaccination humaine. Les animaux seront surveillés chaque jour par du personnel qualifié, en charge notamment de détecter rapidement tout signe éventuel de douleur, stress ou malaise. Un ensemble de points limites et de critères d’arrêt est mis en place. Si l’un de ces indicateurs révélait un état anormal, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix largement reconnu pour la production d’anticorps monoclonaux. Elle a été retenue pour sa capacité à induire une réponse immunitaire robuste et reproductible, indispensable pour obtenir des anticorps de haute qualité. Les animaux utilisés seront des souris adultes, car à ce stade le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour assurer une réponse immunitaire optimale. De plus, les souris sont des petits animaux pour lesquels il est facile d’assurer des conditions de vie stables et contrôlées, et de limiter les situations potentiellement stressantes de par leur environnement, répondant ainsi aux critères éthiques et pratiques.

Anesthésiés, opérés pendant une heure au maximum, porteurs de deux dispositifs implantés de part et d'autre du dos, 39 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une prise de sang sur animal vigile suit chaque mois, six au maximum sur les six mois d'implantation. Le porteur indique que la non-biocompatibilité d'un dispositif peut provoquer irritation, inflammation, infection ou réaction immunitaire par cytotoxicité, ce que l'étude cherche précisément à mesurer pour un implant cérébral destiné aux patients parkinsoniens. Tous les rats sont tués à la fin, les tissus prélevés servant à juger la tenue de l'enrobage dans le temps.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la seconde maladie neurodégénérative, touchant 10 millions de personnes dans le monde, surtout caractérisée par la mort de neurones induisant d’importants troubles moteurs. Les traitements médicamenteux actuels, comme les solutions chirurgicales permettent d’atténuer les symptômes de la MP, mais n’ont aucun effet curatif et ne ralentissent pas son développement. En conséquence, la neuroprotection dans la MP est une piste importante de recherche, afin d’enrayer ou de ralentir la perte des neurones. Plusieurs études ont souligné le fort potentiel neuroprotecteur de la lumière proche infra-rouge dans le cadre de la MP. L’objectif de notre projet est de valider un implant cérébral, destiné aux patients souffrant de la MP, comprenant à la fois une source électrique et une source optique à sa partie distale. La partie optique de cet implant permettra de stimuler optiquement une région du cerveau afin de réduire la mort des neurones dès les phases précoces de la MP et de suivre cette dernière. La partie électrique permettra de corriger les troubles moteurs dans les phases tardives de la MP. Nos 2 défis majeurs sont d’intégrer des composants optiques non biocompatibles à son extrémité et d’en réduire au maximum les dimensions. Pour cela, il convient d’encapsuler les composants optiques, afin de constituer une barrière hermétique et assurer une biocompatibilité. La solution classique utilisant le titane, le saphir et la céramique n’est pas optimale de par son caractère rigide et cassant et de par la nécessité de la miniaturisation de l’implant. C’est pour cela que nous voulons évaluer une solution alternative de dépôts en couches minces successives de 2 composants biocompatibles : un polymère et la céramique. Cette association devrait assurer une composante de flexibilité au dispositif grâce au polymère et assurer une barrière hermétique stable grâce à la céramique en offrant une épaisseur réduite au dispositif. Une autre solution serait d’ajouter à ce dépôt en couches minces successives un surmoulage à l’époxy biocompatible. Enfin, si ces 2 solutions ne répondent pas aux exigences nécessaires à l’implant, la solution plus classique d’encapsulation sera utilisée. Ces 3 solutions pourront être évaluées dans notre projet chez le rat, afin de garantir à la fois la biocompatibilité du dispositif, suite à cette encapsulation, et sa fonctionnalité tout comme son intégrité à long terme dans un organisme vivant.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra de valider une nouvelle approche d’encapsulation de matériaux non biocompatibles afin de pouvoir les intégrer dans le nouveau dispositif bimodal, miniaturisé, destiné aux patients parkinsoniens, mais qui pourra aussi être utilisés dans de futurs dispositifs implantables. Les bénéfices attendus du projet à court terme sont de mettre en place un nouveau dispositif pour la MP, le plus petit possible, pouvant traiter et suivre la maladie en validant l’intégrité et la biocompatibilité du dispositif.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sur une durée maximale estimée de 1 heure. Une fois par mois une prise de sang sur animal vigile sera effectuée (durée maximale estimée de 5 minutes, 6 prélèvements au maximum pendant la procédure).

Impact sur les animaux

Tout acte chirurgical, visant à poser un implant qui doit être testé pour confirmer sa biocompatibilité, peut engendrer chez les animaux : douleur, faibles pertes de poids, hypothermie, déshydratation, risque d’infection au niveau du site d’incision ou d’implantation. Le réveil après une anesthésie générale peut induire une désorientation et un stress de courte durée. La non biocompatibilité d’un dispositif implantable peut induire une irritation, une réaction inflammatoire, une infection ou encore une réaction immunitaire suite à une cytotoxicité. Les prises de sang au niveau de la veine de la queue peuvent induire un inconfort pour l’animal, de courte durée (moins de 5 minutes).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure sont concernés, soit 39 rats au maximum. Les animaux seront euthanasiés selon un protocole approprié, afin d’obtenir les prélèvements requis pour les analyses histologiques pour compléter scientifiquement l’étude. L’étude des tissus est indispensable pour valider la biocompatibilité de l’implant à long terme.

Remplacement

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe à ce jour aucun modèle permettant de réaliser nos travaux sans perte d’informations scientifiques. Nous devons évaluer et valider à long terme l’intégrité et la biocompatibilité de composants du dispositif implantable qui ne peuvent être étudiées de façon complète que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En revanche, en amont, des premiers tests de cytotoxicité pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs seront réalisés in vitro, à l’aide de lignées cellulaires, pour réduire le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum, tout en permettant d’obtenir des conclusions scientifiques significatives. Nous avons utilisé un test statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. La pose de 2 implants chez un animal (un de chaque côté de l’animal, en dorsal) permet de diviser par 2 le nombre de groupes d’animaux, tout comme le choix de la zone d’implantation qui permet de ne pas constituer de groupe contrôle spécifique mais que chaque animal soit son propre contrôle. Les études préalables in vitro, permettent également de réduire le nombre d’animaux utilisés. Comme l’étude sera démarrée avec la moitié des effectifs du lot, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats fiables et homogènes (tolérance et intégrité de l’implant) avec la première moitié d’animaux, après validation avec un test statistique. Si la première solution d’encapsulation répond aux exigences requises pour l’élaboration de l’implant humain, les second et troisième lots ne seront pas réalisés et l’étude prendra fin. Dans le cas contraire, la solution 2 sera évaluée et si cette dernière répond aux besoins de l’implant la solution 3 ne sera pas testée. Si les 2 solutions alternatives d’encapsulation ne sont pas satisfaisantes, la solution 3 plus classique sera réalisée afin de vérifier si elle convient aux exigences de l’implant. Ceci pourrait conduire à une réduction notable du nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les rats seront hébergés à l’animalerie en groupes sociaux de 2, dans un environnement enrichi adapté à leur espèce. En cas de bagarre, induisant des blessures, les animaux seront séparés pour garantir leur bien-être et leur environnement enrichi sera augmenté. Les animaux seront habitués à la manipulation, par des personnes expérimentées, afin d’assurer leur bien-être pendant les changes, les pesées, les prises de sang ou tous soins nécessaires post chirurgie. Pour chaque chirurgie, l’animal sera sous anesthésie générale et analgésie, il sera placé sur un tapis chauffant pour maintenir sa température et un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter son inconfort. Des soins post opératoires adéquates seront adaptés pour chaque animal et des antalgiques et/ou antiinflammatoires non stéroïdiens seront utilisés le temps nécessaire. Lors des prélèvements de sang un anesthésique local sera appliqué pour limiter la douleur due à l’insertion d’une aiguille et le prélèvement se fera au niveau de la veine de la queue (la méthode avec le moins d’effets négatifs sur le bien-être du rat). Si, l’inconfort de l’animal est trop important, ce prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie gazeuse de courte durée. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience, avec une surveillance accrue en sortie de chirurgie et tout sera mis en œuvre pour que les animaux aient un niveau d’inconfort aussi limité que possible. L’utilisation de points limites adaptés à chaque étape de la procédure sera mise en place tout au long de l’étude. En cas d’effets inattendus, de perte importante de poids ou d’observation d’un phénomène douloureux, des traitements appropriés seront immédiatement mis en œuvre et/ou il pourra être décidé d’interrompre l’expérimentation. En parallèle, le vétérinaire en charge du bien-être des animaux sera alerté.

Choix des espèces

Compte tenu des objectifs de cette étude pilote, les expériences peuvent être réalisées chez le rongeur de par leur proximité phylogénétique avec l’Homme. Du fait de la durée du protocole et de la taille l’implant, nous utiliserons le rat. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes compte tenu de la durée d’implantation (6 mois). Des animaux juvéniles âgés de 6 semaines (permettant une meilleure habituation à la manipulation et une meilleure constitution des groupes socieaux du fait de leur jeune âge) seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les chirurgies seront réalisées sur des animaux adultes d’environ 8 semaines. Les animaux seront utilisés en procédure à l’âge adulte (entre 2 et 8 mois).

Trente-six souris mâles subissent l'ablation des testicules et trente-six autres une opération fictive, vingt-quatre d'entre elles enchaînant six à huit échographies sous anesthésie gazeuse avant d'être gardées jusqu'à dix-huit mois. Elles seront 72 en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de mesurer l'effet de la testostérone sur le recrutement de macrophages dans un cancer de la corticosurrénale, la mise à mort servant à prélever les deux glandes surrénales et le sang. La lignée utilisée est une souris chez laquelle des gènes suppresseurs de tumeurs ont été invalidés, et le porteur indique que les lignées cellulaires disponibles ne répondent pas aux androgènes, ce qui le conduit à affirmer la "nécessité" de recourir à l'animal.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif, caractérisé par un pronostic défavorable. À son diagnostic, près de 50 % des patients présentent des métastases, ce qui explique un faible taux de survie à 5 ans. Actuellement, l’unique option curative pour les patients non métastatiques repose sur une exérèse complète de la tumeur primaire. Cependant, le risque de récidive est élevé (30 à 70 %), constituant la principale cause de décès. Pour les patients métastatiques, la chirurgie est inenvisageable, et les traitements existants, bien que lourds, n’améliorent pas la survie globale médiane, qui demeure autour de 15 mois. Les essais d’immunothérapie dans le carcinome corticosurrénalien ont donné des résultats décevants, probablement en raison de l’immunosuppression induite par l’hyperactivité endocrine observée dans environ 50 % des cas. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été récemment montré dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien, que la testostérone produite au moment de la puberté induit un recrutement de macrophages chez les souris mâles, ce qui conduit à une régression de la tumeur. De façon similaire, le traitement des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens avec de la testostérone conduit aussi à un recrutement de macrophages et à une diminution de la taille de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la testostérone possède un fort potentiel en tant qu’agent antitumoral dans le contexte du carcinome corticosurrénalien. Dans cette étude, l’objectif est d’approfondir la compréhension du rôle antitumoral de la testostérone dans le carcinome corticosurrénalien en utilisant une approche complémentaire de celle déjà réalisée dans nos modèles murins : Confirmation du rôle de la testostérone dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien : Des castrations seront réalisées afin d’évaluer l’impact de la suppression de la testostérone sur la progression tumorale. Cette approche permettra de confirmer son effet protecteur et de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents. L’objectif global de ces expériences est de comprendre l’importance de la testostérone et de comprendre également comment la testostérone est capable d’avoir un puissant effet antitumoral. Finalement ce projet a pour but de développer de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer le traitement et la survie des patients atteints de carcinome corticosurrénalien.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de confirmer l’importance de la testostérone dans le cancer de la cortico-surrénale. Cela permettra également de confirmer les données préliminaires obtenus concernant les mécanismes moléculaires antitumoraux sous-jacents. Cette étude a pour objectif de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients en utilisant la testostérone ou en ciblant les mécanismes moléculaires mis en évidence ici.

Procédures

Les 72 animaux soumis à l’intervention chirurgicale subiront une injection unique d’anesthésiant/analgésiant qui dure moins d’une minute. Une intervention chirurgicale permettant l'ablation des testicules chez 36 mâles sera pratiquée et 36 mâles subiront une opération fictive. Les interventions chirurgicales seront pratiquées 1 seule fois et durent environ 20 minutes chacune. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse afin d’effectuer le suivi échographique. Chaque échographie dure environ 20 minutes. 48 animaux subiront 2 échographies sous anesthésie gazeuse et 24 animaux (opérés à 4 semaines et conservés jusqu’à 18 mois) subiront entre 6 et 8 échographies.

Impact sur les animaux

L’injection de l’anesthésiant/analgésiant peut engendrer une douleur locale, légère, de courte durée. L'opération chirurgicale peut entraîner une douleur post-opératoire qu'il est indispensable de prendre en compte et traiter. Les opérations chirurgicales peuvent également entraîner une perte de poids limitée et temporaire chez les animaux. L’échographie, effectuée sous anesthésie, ne provoque pas de douleur, mais peut induire un stress léger chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de la testostérone et de ses mécanismes sous-jacents dans le développement du corticosurrénalome et ainsi pouvoir potentiellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des corticosurrénalomes

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux mis à mort sans manipulation préalable. Cependant, l’ensemble des lignées cellulaires de corticosurrénalome disponibles ne répondent pas aux androgènes. De plus, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour des analyses transcriptomiques et l’autre pour des analyses protéiques. De même, le sang des animaux mis à mort sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de coton dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Après l’opération de la nourriture et du gel d’hydratation seront placés au sol pour éviter l’inconfort de l’animal lorsqu’il essaiera de se nourrir ou de boire. La réalisation de la procédure sera effectuée par du personnel qualifié sensibilisé au travail de chirurgie en conditions aseptiques afin de réduire au maximum la durée de l’opération et le risque d’infection. En plus de l’analgésie peropératoire, un protocole d’analgésie post-opératoire a été mis en place, avec une injection sous-cutanée d’anti-inflammatoire à la fin de l’opération. Durant les premiers jours, les animaux seront placés en cage individuelle afin d’éviter d’éventuelles agressions. Cependant, les cages étants transparentes et fermées par une grille, cela permet de maintenir une interaction visuelle et olfactive avec les autres animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant le cancer de la cortico-surrénale. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Au cours de ce projet, une lignée de souris est utilisée. Cette lignée est un modèle préclinique murin de corticosurrénalome reposant sur l’invalidation de gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients. Nous réaliserons nos analyses aux 2 stades de développement tumoral identifiés chez les femelles dans le modèle murin. Un stade d’hyperplasie à 6 semaines, un stade de corticosurrénalome métastatique à 18 mois. Chez les mâles, nous avons montré que la régression tumorale s’installe à partir de 6 semaines et se maintient jusqu’à 18 mois sans dissémination métastatique. Afin d’évaluer le rôle de la testostérone dans ce processus, nous réaliserons une castration avant l’initiation de la régression, soit à 4 semaines. Une partie des animaux sera gardée jusqu’à 6 semaines pour vérifier si l’absence de testostérone conduit à une hyperplasie, et l’autre jusqu’à 18 mois afin de déterminer si une privation androgénique prolongée favorise l’émergence de métastases. Par ailleurs, nous réaliserons également une castration sur des animaux âgés de 16 mois, qui seront gardés jusqu’à 18 mois. Cette approche nous permettra de tester si le maintien de la régression tumorale reste dépendant de la testostérone à un âge avancé, ou si cette régression devient irréversible et indépendante des androgènes.

2 200 souris dépourvues de système immunitaire fonctionnel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une inoculation de cellules tumorales puis jusqu'à cent manipulations pour mesurer sa tumeur, la moitié des animaux subissant en plus une infection par un virus oncolytique et l'autre moitié jusqu'à cent injections de traitement, avec un risque de péritonite que le porteur signale. Il affirme que seul un "organisme entier", où les cellules circulent, permet d'étudier la complexité du système immunitaire et ses interactions avec l'infection virale. Les souris retenues pour cela sont immunodéficientes, et l'étude porte notamment sur les mécanismes immunomodulateurs de la virothérapie.

Objectifs

La virothérapie oncolytique est une nouvelle approche dans la thérapie anti-cancéreuse. Elle implique l’utilisation de virus non-pathogènes capables d’infecter, de se répliquer et de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans affecter les tissus sains. Le but de ce projet consiste à évaluer l’efficacité de la virothérapie oncolytique associée à la chimiothérapie et à l’immuno-thérapie anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Malgré les efforts de la recherche, qui ont permis des progrès notables en matière de prévention, de dépistage et de traitements, le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Sa prévalence continue d’augmenter : en France, on estime à plus de 430 000 le nombre de nouveaux cas par an. L’utilisation des virus oncolytiques représente une approche thérapeutique innovante et prometteuse dans la lutte contre le cancer. Ce projet permettra de démontrer l’efficacité de ces virus à cibler sélectivement les cellules tumorales tout en préservant les cellules saines, réduisant ainsi les effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes d’action antiviraux et immunomodulateurs, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies combinées avec l’immunothérapie ou la chimiothérapie. De plus, ce projet pourrait déboucher sur le développement de biomarqueurs prédictifs de réponse, facilitant la personnalisation des traitements et améliorant les chances de survie des patients.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à une inoculation de cellules tumorales (1 injection sous anesthésie gazeuse, 1 minute par souris par injection) et à un suivi de la croissance tumoral incluant une mesure de la taille de la tumeur de manière non invasive (manipulation de l’animal vigile, pour moins d’une minute, tous les 2-3 jours, pour un maximum de 100 fois). La moitié des animaux du projet sera soumis à une infection virale (une injection sous anesthésie gazeuse, 1 minute par souris par injection). La moitié des animaux du projet recevra des traitements tous les 2 jours (une injection sur animal vigile, 1 minute par souris par injection pour un maximum de 100 fois). Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes, à cause de leur patrimoine génétique, présentent une sensibilité accrue aux infections. Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent engendrer un stress. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et une détresse respiratoire. La croissance tumorale peut entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’administration de virus pourrait induire une fièvre transitoire. Un risque de péritonite est associé aux administrations fréquentes.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité de l’association virothérapie oncolytique, immunothérapie et chimiothérapie. Nous avons au préalable testé in vitro la sensibilité des lignées cellulaires aux traitements qui seront appliqués dans les expériences in vivo. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour étudier la complexité du système immunitaire et de ses mécanismes sous-jacents in vivo ainsi que les interactions avec les infections virales. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2200 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 5 et de 10 souris (selon les procédures) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Une veille bibliographique attentive et continue sera réalisée afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet présentent un phénotype considéré comme dommageable du fait de leur immuno-déficience. Elles seront hébergées donc, afin d’assurer leur protection, au sein de notre structure dans une zone d’expérimentation dédiée aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous hotte pour ne pas perdre leur statut et éviter que le développement de maladies indésirables. Des tests de statut sanitaire réguliers montrant l’absence d’infection des animaux par des pathogènes opportunistes sont réalisés chaque mois dans l’animalerie, dans le cadre de l’hébergement de ces animaux. Les animaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, désinfection, ...). Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteint des points limites prédéfinis.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire complet.

18 000 souris, 2 000 rats et 2 050 hamsters dorés vont recevoir pendant jusqu'à soixante semaines une nourriture riche en graisses et en sucres, et une eau sucrée, afin de développer obésité, diabète, dyslipidémie et stéatose hépatique. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 240 piqûres de la veine caudale par animal pour mesurer la glycémie, et le porteur reconnaît que la maladie induite peut aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie. La majorité de ces 22 050 rongeurs part ensuite vers le laboratoire d'un client qui les utilisera dans son propre projet, les cinquante hamsters servant à entraîner le personnel au prélèvement sanguin étant, eux, tués. Rendre malades des rongeurs par lots pour les livrer comme modèles d'évaluation de médicaments : le porteur compte ce travail parmi les bénéfices pour l'animal, au titre de "l'amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimé à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la NASH (stéatose hépatique non- alcoolique) sont provoqués par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la NASH. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète et NASH. Ces rongeurs avec syndromes métaboliques seront utilisés chez nos clients pour évaluer les effets de médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesurer la glycémie pourront être faits, et consisteront en un prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale, avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum), sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements sur toute la durée du protocole). La durée du prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucres et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.

Devenir

La majorité des animaux sont expédiés à un laboratoire de recherche pour une utilisation dans son projet de recherche. Les animaux qui auront servi à l’entrainement au prélèvement sanguin seront mis à mort, ne pouvant être utilisés dans une autre procédure.

Remplacement

L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.

Réduction

Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Le nombre d’animaux pour chaque espèce est estimé selon un prévisionnel de demandes basé sur les années précédentes. Les animaux dédiés à l’entraînement ne concernent que les hamsters, car la maîtrise du prélèvement sur la veine saphène nécessite une phase d’apprentissage préalable avant toute manipulation sur les animaux du protocole.Un nombre de 5 hamsters pourra être utilisé pour l’entrainement des personnes au prélèvement à la veine saphène avant chaque lot. Avec 2 lots par an, il sera utilisé 50 hamsters sur les 5 ans.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

Les souris, rats et hamsters sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Pour les hamsters syriens dorés, ils ont un métabolisme des lipoprotéines imitant la dyslipidémie humaine car il exprime la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle.

Maintenus autour de 90 % de leur poids de forme pour rester motivés par la récompense alimentaire, 114 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyse de leur cerveau. Ils apprennent une tâche une heure par jour, au moins cinq jours sur sept pendant deux à trois mois, avant une opération d'une heure trente pour implanter des électrodes dans deux régions cérébrales, puis un à deux mois d'enregistrement. Le porteur qualifie cette restriction de temporaire et affirme qu'elle "impacte très peu" leur bien-être, tout en ajustant la ration dès que le poids passe deux jours de suite sous le seuil. L'objectif premier reste fondamental, comprendre quand le cerveau décide d'agir, les indications sur les troubles cognitifs humains venant en second et sans échéance.

Objectifs

Le comportement est adapté s'il est géré correctement et de façon flexible dans le temps, et décider quand agir est un processus fondamental dont la base neurobiologique reste largement inconnue. Le projet vise à analyser l'organisation fonctionnelle de deux zones du cerveau, et leur modulation, dans le contrôle flexible de l'action dans le temps. Sur la base de données récentes, nous faisons l'hypothèse que la coordination d'un comportement adapté dans le temps nécessite une interaction précise au sein des circuits neuronaux. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’implication de ces réseaux grâce à l’enregistrement de neurones de deux régions du cerveau afin de caractériser la signature neuronale et l’interaction entre les deux zones cérébrales lors de l’adaptation comportementale à différentes règles spatiotemporelles. Cette étude nous apportera des informations importantes et nouvelles sur le rôle de ces circuits dans la flexibilité temporelle.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la flexibilité comportementale. Outre son intérêt en recherche fondamentale (objectif premier de l’étude), ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements préfrontaux avec des altérations des fonctions exécutives (dont les flexibilités cognitives) ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions).

Procédures

Dans ce projet, tous les rats seront entraînés à réaliser une tâche comportementale qui nécessite une légère restriction alimentaire initiale (~1 semaine) suivie d'un apport de nourriture contrôlé quotidien (2-3 mois). L'apprentissage est réalisé à raison d’une séance d’une heure par jour au moins 5 jours sur 7, puis subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée environ 1h30) pour implanter des électrodes dans deux régions d’intérêt. Les animaux sont isolés d'un à trois jours maximum après la chirurgie pour permettre une bonne cicatrisation, puis remis en cages collectives. Après une semaine de récupération post-chirurgie, ils seront ré-entrainés à la même tâche comportementale (2 semaines) puis enregistrés pendant la réalisation de cette dernière (un à deux mois).

Impact sur les animaux

La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense alimentaire). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Cependant, pour amorcer leur motivation à effectuer la tâche, les animaux seront restreints dans les premiers jours de la tâche comportementales de façon à les maintenir autour de 90% de leur poids. Le poids de l’animal est vérifié quotidiennement juste avant la tâche (donc au moment le plus éloigné de la dernière ration) et la quantité de nourriture est ajustée si le poids descend en dessous de 90% deux jours consécutifs, critère basé sur nos expériences précédentes. La nourriture sera ensuite progressivement augmentée de manière à ce que les rats réatteignent leur poids de forme théorique. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’implantation des électrodes est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un changement de règle spatiotemporelle nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas déterminer les codes neuronaux sous-tendant le comportement sans faire appel à l’implantation d’électrodes qui ne peut se faire chez des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les oiseaux. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise localisation des électrodes, mauvais signal d’enregistrement).

Raffinement

Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés quotidiennement au moins une semaine avant le début de l’entraînement à la tâche comportementale, afin de les habituer à l’expérimentateur et de laisser les rats s’habituer à la quantité contrôlée de nourriture. Pour la procédure chirurgicale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes. Nous avons aussi optimisé les équipements comportementaux pour permettre aux animaux porteurs d’implants cérébraux de se mouvoir avec le maximum de confort (mangeoire de haute taille, écran tactile à toucher avec le nez au lieu d’un trou où mettre son nez ce qui donne le risque de cogner l’implant). De plus, nous utilisons un cache des implants permettant de loger les animaux à deux par cage et nous avons dessiné et imprimé à l’imprimante 3D des supports d’implants cérébraux améliorant là aussi le confort des animaux en réduisant les possibilités d’accroches dans l’environnement de test. L’enrichissement des rats implantés est aussi modifié (maison en carton à la place des tunnels de plastique) pour empêcher les rats de se faire mal en se coinçant l’implant. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs, largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences, pour s’assurer que le cortex préfrontal et sa connectivité soient matures dès le début de l’apprentissage de la tâche comportementale.

Tuées quatre heures après une injection de lipopolysaccharide qui les laisse fébriles, confuses et apathiques, 54 souris mâles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatre jours précédents, chacune reçoit par gavage un extrait de la plante Satureja nepeta, sous contention d'une à deux minutes, et se retrouve isolée une demi-heure pour que ses fèces soient recueillies. Le projet cherche à savoir si l'infusion, la décoction, le macérat ou l'huile essentielle de cette plante limitent l'inflammation du tissu adipeux, présentée comme une "alternative naturelle" aux traitements conventionnels. Sur la prise en charge de la douleur, le RNT est explicite : aucune analgésie n'est prévue pour ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier les effets préventifs de divers extraits de la plante médicinale aromatique Satureja nepeta (Infusion, décoction, macération hydroéthanolique à 60% et huile essentielle), dans un modèle murin d’inflammation aiguë induite par le lipopolysaccharide (LPS).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier les extraits de Satureja nepeta les plus efficaces pour prévenir l’inflammation aiguë induite par le lipopolysaccharide (LPS) dans le tissu adipeux, tout en explorant les modifications du microbiote intestinal. Il permettra ainsi de mieux comprendre les mécanismes d’action anti-inflammatoires de cette plante médicinale et de valoriser son potentiel en tant qu’alternative naturelle aux traitements conventionnels.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention quotidienne de gavage oral pendant 4 jours consécutifs, correspondant à l’administration des différents extraits de Satureja nepeta. Chaque gavage nécessitera une mise en contention de l’animal pendant environ 1 à 2 minutes. Une injection de LPS sera réalisée le 5ᵉ jour, également sous contention d’environ 1 à 2 minutes. Par ailleurs, des collectes de fèces seront effectuées avant et après induction de l’inflammation, nécessitant un isolement temporaire de l’animal (environ 30 minutes) pour permettre le recueil dans des conditions standardisées.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du recueil de fèces (environ 30 minutes). Stress lié aux gavages (5 minutes). Douleurs possibles lors de l’administration des extraits et lors des injections du LPS (2 minutes). Suite à l'injection de LPS, les animaux seront fébriles (augmentation de la température corporelle), ils peuvent montrer des signes de confusions et d’apathie (durant 4 heures, jusqu'à la mise à mort). Jeune de 3 heures. Prise de température au niveau rectal (1 minute).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés et de démontrer les effets anti-inflammatoires des différents extraits de la plantes Satureja nepeta

Remplacement

L’étude de l’effet des différents extraits de la plante médicinale Satureja nepeta sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle largement utilisé et reconnu pour les études portant sur l’inflammation et le métabolisme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

Nourries pendant quatre mois d'un régime riche en sucres et en graisses jusqu'à devenir obèses, une partie des 664 souris de ce projet passe ensuite sur la table d'opération pour un arrêt puis une reprise de la circulation sanguine dans le foie, sous anesthésie, pendant quatre-vingt-dix minutes. Toutes subissent trois à quatre prélèvements sanguins, certaines reçoivent deux administrations de molécules agissant sur les lipides, et les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. L'enjeu déclaré est de rendre greffables des foies stéatosiques aujourd'hui écartés, et le projet sert aussi à la formation professionnelle. Toutes les souris sont tuées, le porteur précisant que les prélèvements d'organes prévus sont "incompatibles avec le maintien en vie des animaux".

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients lorsqu'un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé comme l’obésité ou le diabète. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion, inévitable en transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Les organes dits marginaux, comme les foies avec stéatose, sont encore plus sensibles à ces lésions d’ischémie reperfusion, d’où la nécessité d’évaluer des molécules pour les protéger et pouvoir les utiliser en transplantation. Des recherches récentes ont montré une altération précoce du métabolisme des lipides après une ischémie dans le foie avec apparition de lipides toxiques. Le but de notre projet est de déterminer si l'ischémie du foie sain ou avec stéatose conduit aussi à l'apparition de lipides dits toxiques et s'il est possible de limiter les lésions du foie après ischémie reperfusion en utilisant des molécules qui agissent sur les lipides toxiques.

Bénéfices attendus

A court terme, cette étude permettra de mieux comprendre les modulations précoces du métabolisme lipidique après ischémie sur foies sains et stéatosiques et leurs implications dans la genèse des lésions hépatiques. A long terme, ce projet vise à réhabiliter des greffons stéatosiques aujourd’hui récusés pour la transplantation en mettant au point des stratégies thérapeutiques limitant la production d’espèces lipotoxiques, dont le nombre va croitre massivement dans les années à venir en raison de la pandémie d’obésité, et ainsi répondre à la pénurie de greffons que subit aujourd’hui la France.

Procédures

Certains animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois pour provoquer une stéatose hépatique. Tous les animaux subiront 3 à 4 prélèvements de sang (durée de moins de 5 minutes) faits sous anesthésie pour mesurer différents paramètres biologiques et une chirurgie pour réaliser l'ischémie-reperfusion du foie (durée de 90 minutes) sous anesthésie également. Les prélèvements de sang seront espacés d'un minimum de 20 heures. Parmi la totalité des souris, une partie n’aura aucune administration de molécules et d’autres souris auront 2 administrations de molécules agissant sur le métabolisme lipidique (durée de moins de 5 minutes). Les 2 administrations seront espacées au moins de 90 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre une obésité. Les prélèvements sanguin (acte

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles de foie in silico ou in vitro, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la complexité cellulaire du foie, le métabolisme des lipides et les lésions d’ischémie reperfusion. De plus, les modèles de perfusion de foies ex vivo ne nous permettent pas non plus d’étudier le remodelage du lipidome hépatique et plasmatique.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition sera de 3 à 5 souris par cage. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie, sous anesthésie générale, avec un maintien de la température corporelle.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène chez la souris, qui mime une obésité environnementale chez l’homme, est validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité chez cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques déjà présents au laboratoire. 4) La souche de souris sélectionnée offre moins de variabilité dans la réponse au régime occidental que d'autres souches de souris et développe moins de shunt porto-systémique comme mis en évidence dans notre précédente saisine

480 souris vont être utilisées, toutes tuées pour collecter et analyser leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent neuf jours seules en cage, une nuit sans nourriture, et subissent une injection sous anesthésie générale ainsi que trois contentions dans un tube d'analyse de la composition corporelle. Le porteur indique avoir déjà reproduit l'état nourri et l'état à jeun sur des cellules de foie en culture, et retient malgré cela l'animal entier pour ses échanges entre organes. Le bénéfice annoncé tient en une phrase et reste suspendu au long terme, ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour les maladies du foie ou le diabète.

Objectifs

Le but de ce projet de comprendre le rôle d'une famille de protéine dans la fonction des cellules du foie. En effet, des résultats du laboratoire montrent que la quantité de ces protéines varient entre l’état de jeûne et l’état nourri et que diminuer leur expression modifie l'adaptation de l'organisme pour répondre à la modification d'apport nutrionel. D'autre part, nous avons montré que la quantité de ces protéines étaient modifiées dans le cas de pathologie du foie ou de diabète.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle de ces protéines permettrait à long terme d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour les pathologies du foie ou du diabète..

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection sous anesthésie générale (4 min maximum) - 9 jours d'hebergement individuel (1 fois) - 1 nuit sans accès à la nourriture mais accès à la boisson - 3 pesées sur animal vigile (

Impact sur les animaux

L’analyse du métabolisme énergétique recquiert que les animaux soient hébergés individuellement pour une durée maximum de 9 jours, la privation de congénères peut générer un stress modéré. Pour la détermination de la composition corporelle des animaux, les animaux sont placés pour une très courte durée (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter et analyser les tissus.

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous avons mis au point des conditions de culture permettant de mimer l'état nourri / à jeun avec des cellules de foie. Cependant, afin de mieux comprendre le fonctionnement de ces cellules, nous avons besoin d'étudier des animaux entiers avec leur physiologie et les échanges inter-organes. Seules les protéines ayant montré un impact sur le métabolisme des cellules du foie en culture seront étudiés chez l'animal.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires. Nous optimiserons également la collecte de tissus post- mortem à l’issue de chaque procédure afin de créer une « bibliothèque d’échantillons » pouvant être utilisés pour de futures analyses.

Raffinement

Le stress subit par les animaux par l'hébergement individuel est atténué par le fait qu’ils conservent un contact visuel et olfactif et sonore avec leurs congénères. Ces cages d'analyse présentent une grande surface au sol et sont équipées (litière, mangeoire, biberon et maisonnette suspendus) de manière à offrir des occasions accrues d'interaction avec l'environnement, qui compensent les effets de l’hébergement individuel. Pour l’injection, les souris seront anesthésiées quelques minutes afin de réaliser le geste sans stress pour l'animal. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet et qu’ils redeviennent mobiles. Puis un suivi sera réalisé les jours suivant l’injection pour vérifier qu’aucune lésion n’est apparue. Nous avons mis en place des points limites adaptés avec une surveillance des animaux (comportement, poids, site d'injection) permettant de déceler tous signe de mal-être ou de souffrance de façon précoce.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études métaboliques, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Par ailleurs, ce sont des mammifères dont l'utilisation du sucre et du gras est proche de celui de l'Homme. Nous espérons ainsi pouvoir extrapoler les conclusions de notre étude à l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 10 et 25 semaines. A cet âge, les souris auront un foie mature.